DE4330960A1

DE4330960A1 - Kombination von DNA-Sequenzen, die in Pflanzenzellen und Pflanzen die Bildung hochgradig amylosehaltiger Stärke ermöglichen, Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und die daraus erhaltbare modifizierte Stärke

Info

Publication number: DE4330960A1
Application number: DE4330960A
Authority: DE
Inventors: Jens Dr Kosmann; Ivan Dr Virgin
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1993-09-09
Filing date: 1993-09-09
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 2013-09-10
Also published as: EP0719338A1; ATE242329T1; JPH09502098A; CA2171313A1; HU9600605D0; HUT74667A; AU7657394A; IL110916A0; DE4330960C2; EP0719338B1; AU694448B2; US6066782A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kombination von DNA-Sequenzen, die in transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen den Amylosegehalt der Stärke dahingehend verändert, daß eine hochgradig amylosehaltige Stärke gebildet wird. Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, die bezüglich des Amylosegehalts der natürlich enthaltenen Stärke infolge Expression künstlich eingeführter DNA-Sequenzen verändert sind, die über dieses Verfahren erhältlichen Pflanzen und die aus diesen Pflanzen erhaltbare hochgradig amylosehaltige Stärke.

Polysaccharide wie Stärke sind neben Ölen, Fetten und Proteinen die wesentlichen nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen.

Ein entscheidender Faktor, der der Verwendung von nachwachsenden Rohstoffen als industrielle Rohstoffe im Wege steht, ist der Mangel an Stoffen, die in Form Struktur oder sonstigen physikalisch-chemischen Parametern den Erfordernissen der chemischen Industrie genau entsprechen. Insbesondere wird von einem für die technische Verwendung geeigneten Rohstoff verlangt, daß er in hoher Reinheit vorliegt und chemisch einheitlich aufgebaut ist. Letzteres ist wichtig, um eine homogene Reaktionsführung bei der Verarbeitung zu gewährleisten.

Obwohl die Stärke ein Polymer aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glukosemolekülen, ist, ist sie ein komplexes Gemisch aus sehr unterschiedlichen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glukoseketten unterscheiden. Stärke stellt daher keinen einheitlichen Rohstoff dar. Insbesondere unterscheidet man die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4 verknüpften Glukosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus unterschiedlich verzweigten Glukoseketten darstellt. Die Verzweigungen kommen durch das Auftreten von zusätzlichen α-1,6 Verknüpfungen zustande.

In typischen Pflanzen für die Stärkeproduktion, wie zum Beispiel Mais oder Kartoffel, kommen die beiden Stärkeformen in einem Verhältnis von etwa 25 Teilen Amylose zu 75 Teilen Amylopektin vor.

Im Hinblick auf die Einheitlichkeit eines Grundstoffes wie Stärke für seine Anwendung im industriellen Bereich werden Pflanzen benötigt, die beispielsweise nur noch die Komponente Amylose enthalten. Es besteht daher ein großes Interesse an der Möglichkeit, natürlich in der Pflanze enthaltene Stärke dahingehend zu verändern, daß eine hochgradig amylosehaltige Stärke gebildet wird.

Es ist bereits bekannt, daß für bestimmte Pflanzenspezies, beispielsweise den Mais, durch Mutagenese, bei der einzelne Gene der Pflanze inaktiviert werden, Sorten erzeugt werden können, die nur noch Amylopektin enthalten. Für Kartoffel wurde durch chemische Mutagenese bei einer haploiden Linie ebenfalls ein Genotyp erzeugt der keine Amylose bildet (Hovenkamp-Hermelink et al., 1987, Theor Appl Genet 75 : 217-221). Haploide Linien, bzw. die daraus entwickelten homozygoten diploiden oder tetraploiden, sind landwirtschaftlich aber nicht einsetzbar. Für die landwirtschaftlich interessanten heterozygot tetraploiden Linien ist die Mutagenese- Technik nicht anwendbar, da wegen des Vorliegens von vier verschiedenen Erbgutkopien eine Inaktivierung aller Kopien eines Gens technisch nicht möglich ist.

Von Visser et al. (1991, Mol Gen Genet 225 : 289) ist bekannt, daß durch antisense- Inhibition des Gens für die Stärkekorn-gebundene-Stärkesynthase in Kartoffel Sorten erzeugt werden können, die weitgehend reine Amylopektinstärke bilden.

Ferner sind Mais- und Erbsensorten bekannt, die Amylosestärke produzieren können. Die Amylosekonzentration in diesen Pflanzen beträgt jedoch nur 60-80%. Das Mutageneseverfahren, das der Produktion dieser Sorten zugrundeliegt, ist auf andere Pflanzen, wie z. B. Kartoffel nicht anwendbar.

Aus der WO 92/14827 ist ein Verzweigungsenzym der Kartoffel bekannt. Dieses Enzym wird als Q-Enzym von Solanum tuberosum bezeichnet. Weiterhin ist bekannt, daß mit Hilfe von DNA-Sequenzen, die die Information für das in der WO 92/14827 beschriebene Verzweigungsenzym der Kartoffel enthalten, transgene Pflanzen hergestellt werden können, bei denen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis der Stärke verändert ist. Eine hochgradig amylosehaltige Stärke wird von den in der WO 92/14827 beschriebenen Pflanzen jedoch nicht gebildet.

Während für andere Spezies, z. B. Mais, das Vorkommen mehrerer Q-Enzyme bekannt ist (Singh & Preiss, 1985, Plant Physiol 79 : 34-40), konnte bei Solanum tuberosum nur das in der WO 92/14827 beschriebene Verzweigungsenzym nachgewiesen werden. Welche weiteren Enzyme der Kartoffel an der Synthese von verzweigter Stärke beteiligt sind, ist nicht bekannt.

Die Synthese von Stärke erfolgt durch die Wirkung der Stärkesyntase, die im wesentlichen ADP-Glukose als Substrat für eine Übertragung eines Glukoserestes auf das nicht-reduzierende Ende eines Polyglucans nutzt.

An der Modifikation und dem Abbau der Stärke sind mehrere Enzyme beteiligt.

Die Stärkephosphorylasen, die anorganisches Phosphat als Kosubstrat nutzen, bauen α-1,4 Bindungen bis vier Einheiten vor einer α-1,6 Verzweigung ab und arbeiten vom nicht-reduzierenden Ende her. Die β-Amylase hat als Exoamylase eine hohe Spezifität für α-1,4 Bindungen. Das am geringsten polymerisierte Substrat ist Maltotetraose. Verzweigungsstellen bewirken ein Ende des Kettenabbaus, wobei die letzte α-1,4 Bindung vor der Verzweigungstelle bestehen bleibt (Whelan, 1961, Nature 190 : 954-957). Die verbleibenden Polyglukane können von Transglykosylasen bearbeitet werden, die gleichzeitig hydrolytische und synthetisierende Enzymaktivität besitzen.

An der Modifikation der Stärke arbeiten als Transglykosylasen das Q-Enzym, das T- Enzym und das D-Enzym. Das Minimalsubstrat für die vom T-Enzym katalysierte Reaktion ist α-1,4 Maltose, die zum Trisaccharid Panose und Glukose umgesetzt wird, wobei eine α-1,6 Bindung entsteht (Whelan, 1961; Abdullah & Whelan, 1960, J Biochem 75 : 12P). Das Q-Enzym katalysiert die gleiche Transglykosylierung ausschließlich an Glukanen einer Kettenlänge von mindestens 40 Einheiten. Das D- Enzym wurde 1953 erstmals beschrieben (in: Nature 172 : 158). Peat et al. (1956, J Chem Soc, Part XX: 44-55) beschreiben es als eine Transglykosylase, die Maltodextrin-Substrate mit zwei oder mehr Einheiten überträgt und dabei ausschließlich α-1,4 Bindungen erzeugt. Das Substrat muß aus mindestens drei Einheiten aufgebaut sein, bezüglich des Akzeptors besteht eine geringe Spezifität. Takaha et al. (1993, J Biol Chem 268 : 1391-1396) beschreiben die Reinigung des D- Enzyms von Kartoffel (EC 2.4.1.25) sowie die Klonierung einer cDNA. Das gereinigte Enzym akzeptiert Glukose als Empfänger der zu übertragenden Kette, jedoch muß der Donor aus mindestens drei Glukoseeinheiten aufgebaut sein. Die Autoren beschreiben nicht, welche Art von Bindung bei der Transglykosylierung entsteht und gehen davon aus, daß das D-Enzym oder "Disproportionierende Enzym" am Stärkeabbau beteiligt ist.

Es ist bisher nicht bekannt, wie eine Pflanze gezielt dahingehend verändert werden kann, daß in ihr eine hochgradig amylosehaltige Stärke produziert werden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Kombination von DNA-Sequenzen bereitzustellen, mit deren Hilfe Pflanzen dahingehend verändert werden können, daß, sie eine hochgradig amylosehaltige Stärke produzieren. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, transgener Pflanzen mit hochgradig amylosehaltiger Stärke sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen bereitzustellen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß durch eine Kombination bekannter DNA- Sequenzen eines Verzweigungsenzyms (WO 92/14827) mit DNA-Sequenzen eines Disproportionierungsenzyms und Einführung dieser Kombination in ein pflanzliches Genom unter Verwendung rekombinanter Plasmide, Pflanzen erzeugt werden können, die befähigt sind, eine hochgradig amylosehaltige Stärke zu produzieren.

Eine Kombination von DNA-Sequenzen, die ein Verzweigungsenzym kodieren mit solchen, die ein Disproportionierungsenzym kodieren, zur genetischen Veränderung von Pflanzenzellen und Pflanzen mit dem Ziel, eine hochgradig amylosehaltige Stärke in den genetisch veränderten Pflanzen zu bilden, wurde bisher nicht beschrieben. Der Effekt, den die Einführung der neuen Kombination von DNA- Sequenzen in ein pflanzliches Genom auf den Amylosegehalt der Stärke ausübt, ist überraschend, da es bislang keinen Anhaltspunkt für eine Beteiligung des D-Enzyms an der Produktion verzweigter Stärke gibt. Nach den Befunden von Peat et al. (1956) besitzt das D-Enzym nämlich nicht die Fähigkeit zum Aufbau von α-1,6 Bindungen. Bei der Untersuchung der enzymatischen Aktivität des D-Enzyms wurde eine Proteinpräparation aus Kartoffelknollen verwendet, die neben dem Disproportionierungsenzym auch das Q-Enzym enthält. Eine Trennung der beiden enzymatischen Aktivität war nicht möglich. Die Unterscheidung der beiden Aktivitäten beruhte auf der Bestimmung unterschiedlicher Temperaturoptima für die katalysierten Reaktionen, wobei die Zunahme der Absorption eines Glukan/Jod- Komplexes bei Inkubation von Maltopentaose als spezifisch für die Aktivität des Disproportionierungsenzyms angesehen wurde. Die Aktivität des Q-Enzyms wurde demgegenüber am Rückgang der spezifischen Färbung des Jod/Amylose- Komplexes nachgewiesen.

Ein Nachweis der Beteiligung des D-Enzyms an der Amylopektinproduktion ist in Kartoffelpflanzen, die eine Q-Enzymaktivität aufweisen, nicht möglich, da eine eindeutige Zuordnung der α-1,6 Bindungen synthetisierenden Aktivität zu einem der beiden Enzyme nicht möglich ist.

Mit der erfindungsgemäßen Kombination von DNA-Sequenzen, die aus

a) der Kodierregion eines Verzweigungsenzyms und
b) der Kodierregion eines Disproportionierungsenzyms

besteht, die jeweils derart in antisense Orientierung an geeignete Promotoren fusioniert sind, daß deren Transkription in transgenen Pflanzen zu Transkripten führt, kann der Amylosegehalt natürlich in Pflanzen enthaltener Stärke dahingehend verändert werden, daß eine hochgradig amylosehaltige Stärke gebildet wird.

Die Kombination der DNA-Sequenzen besteht vorzugsweise aus den Kodierregionen des Verzweigungs- und Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum, wobei die Kodierregion des Verzweigungsenzyms die auf dem rekombinaten Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) lokalisierte Sequenz und die Kodierregion des Disproportionierungsenzyms die auf dem rekombinanten Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) lokalisierte Sequenz ist.

Die rekombinanten DNA-Sequenzen führen bei gleichzeitiger oder aufeinanderfolgender Einführung in ein pflanzliches Genom in transgenen Pflanzen zur Bildung von Transkripten, die die Bildung von Enzymen des Stärkemetabolismus dahingehend verändern, daß bei der Stärkebiosynthese die Bildung von Amylopektin unterdrückt ist und dadurch die Bildung einer hochgradig amylosehaltigen Stärke ermöglicht wird.

Es ist auch möglich, die Kodierregionen des Verzweigungs- und des Disproportionierungsenzyms mit Hilfe eines Plasmids in das pflanzliche Genom einzuführen.

Transgene Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden, können über

A) ein einstufiges Verfahren hergestellt werden, daß die folgenden Schritte beinhaltet:
- a) Herstellung einer Kombination von DNA-Sequenzen aus folgenden Teilsequenzen:
  - i) je einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
  - ii) je einer Kodierregion eines Verzweigungsenzyms und eines Disproportionierungsenzyms, derart an den unter i) genannten Promotor fusioniert, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
  - iii) je einer 3′-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3′-Ende der RNA führt, derart an die unter ii) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3′-nicht-translatierte Sequenz an das 3′-Ende des unter ii) genannten nicht kodierenden Stranges anschließt,
- b) Transfer und Einbau der Kombinationen von DNA-Sequenzen in ein pflanzliches Genom unter Verwendung rekombinanter Plasmide zur Erzeugung transgener Pflanzenzellen und
- c) Regeneration von intakten, ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen,
oder
B) ein zweistufiges Verfahren hergestellt werden, bei dem zunächst eine DNA- Sequenz, bestehend aus den Teilstücken:
- iv) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgeweben oder den Zielzellen sicherstellt,
- v) einer Kodierregion eines Verzweigungs- oder Disproportionierungs enzyms, das derart an den unter iv) genannten Promotor fusioniert ist, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
- vi) einer 3′-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3′-Ende der RNA führt, derart an die unter v) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3′-nicht-translatierte Sequenz an das 3′-Ende des unter v) genannten nicht-kodierenden Stranges anschließt,
in das Genom einer Pflanzenzelle unter Verwendung eines rekombinanten Plasmids transferiert und eingebaut wird, aus der so genetisch veränderten Pflanzenzelle eine ganze Pflanzenzelle regeneriert und anschließend in Zellen dieser genetisch veränderten Pflanzen durch erneute Transformation eine weitere DNA-Sequenz, bestehend aus den Teilstücken:
- vii) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgeweben oder den Zielzellen sicherstellt,
- viii) einer Kodierregion eines Disproportionierungs- oder Verzweigungs enzyms, derart an den unter vii) genannten Promotor fusioniert, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense Fusion) und
- ix) einer 3′-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3′-Ende der RNA führt, derart an die unter viii) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3′-nicht-translatierte Sequenz an das 3′-Ende des unter viii) genannten nicht-kodierenden Stranges anschließt,
ebenfalls in das Genom einer Pflanzenzelle unter Verwendung eines rekombinanten Plasmids transferiert und eingebaut wird und schließlich die so transformierten Pflanzenzellen, die beide Teilstücke enthalten, abermals zu einer ganzen Pflanzen regeneriert werden.

Die in der Kombination zur Anwendung kommenden und unter den Verfahrensschritten i), iv) und vii) genannten Promotoren sind vorzugsweise der 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus mit den Nukleotiden 6909 bis 7437 oder der B33 Promotor eines Patatingens von Solanum tuberosum mit den Nukleotiden -1512 bis +14. Es ist aber auch die Verwendung anderer Promotoren denkbar.

Die im Verfahren als Kombination zur Anwendung kommenden rekombinanten Plasmide sind vorzugsweise das Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) und das Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) oder Derivate davon.

Die durch das Verfahren erhältlichen transgenen Pflanzen, die befähigt sind, hochgradig amylosehaltige Stärke zu bilden, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Als Pflanzen, auf die das Verfahren zur Anwendung kommt sind Nutzpflanzen, bei denen an der Synthese von Amylopektin ein Verzweigungs- und ein Disproportionierungsenzym beteiligt sind. Vorzugsweise ist dies die Nutzpflanze Kartoffel.

Die Teilsequenzen aus der neuen Kombination von DNA-Sequenzen, die das Verzweigungsenzym und das Disproportionierungsenzym von Solanum tuberosum kodieren, können durch Klonierung in Vektorplasmide in Bakterien vermehrt werden. Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC Serien, m13 mp Serien usw. Die DNA Sequenzen können mit Linkern versehen werden, die ein einfaches Umklonieren in andere Plasmide erlauben. Zum Zwecke der Einführung in Pflanzen (s. Ausfüh rungsbeispiel 3) können bevorzugt, aber nicht ausschließlich, binäre Plasmide verwendet werden, die ein Replikationssignal, beispielsweise für Escherichia coli und für Agrobacterium tumefaciens, enthalten. Wenn die binären Plasmide T-DNA Elemente enthalten, ist eine Übertragung der Kombination von DNA-Sequenzen in das Genom von dikotylen Pflanzen besonders einfach. Es stehen jedoch auch andere Methoden zur Verfügung, beispielsweise die Transformation mit Hilfe ballistischer Verfahren, die zur Transformation von Monokotylen eingesetzt wird (Potrykus, 1991, Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol 42 : 205-225).

Um eine Expression der übertragenen Kombination von DNA-Sequenzen in genetisch veränderten Pflanzen sicherzustellen, werden die Kodierregionen des Verzweigungsenzyms und des Disproportionierungsenzyms jeweils an einen Promotor fusioniert. Grundsätzlich kommen alle Promotoren in Betracht, die in Pflanzen aktiv sind. Präferenziell werden Promotoren eingesetzt, die in den stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Bei Mais sind dies die Maiskörner, während es bei Kartoffel die Knollen sind. Zur Transformation von Kartoffel kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, der knollenspezifische 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus oder der B33 Promotor eines Patatingens von Solanum tuberosum eingesetzt werden (s. o.). Die Kodierregionen von Verzweigungsenzym und Disproportionierungsenzym werden derart an den Promotor fusioniert, daß das 3′-Ende der Kodierregion an das 3′-Ende des Promotors angefügt wird. Diese Anordnung bezeichnet man als antisense Orientierung. Die antisense Orientierung bewirkt, daß bei der Expression des Transgens der nicht-kodogene Strang zur Synthese eines Transkripts abgelesen wird. Das nicht-kodierende Transkript kann in einer genetisch veränderten Pflanze das endogene, kodierende Transkript neutralisieren, so daß es nicht zur Translation in ein Peptid kommt. Dadurch entfällt die enzymatische Aktivität des Verzweigungs- und des Disproportionierungsenzyms in den genetisch veränderten Pflanzen. Der Erfolgt der Translationsinhibition hängt u. a. von der Menge der in der Zelle wirksamen antisense Transkripte ab. Zur Stabilisierung der Transkripte, die von der eingeführten Kombination von DNA-Sequenzen gebildet werden, wird daher an die Kodierregionen von Verzweigungsenzym und Disproportionierungsenzym ein Terminations- und Polyadenylierungssignal angehängt. Dies kann beispielsweise das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens sein.

Durch Fusion von Promotor, Kodierregion des Verzweigungs- bzw. des Disproportionierungsenzyms und Terminationssignals entstehen Konstrukte, die zur Transformation von Pflanzen in geeignete Plasmide integriert werden. Diese rekombinanten Plasmide können die Kombination der Fusion enthalten oder jeweils ein Element der Kombination. Wenn die rekombinanten Plasmide beide Elemente der Kombination enthalten, können transgene Pflanzen, die die erfindungsgemäße Kombination von DNA-Sequenzen enthalten, in einem einstufigen Verfahren hergestellt werden. Wenn die rekombinanten Plasmide jeweils ein Element der Kombination enthalten, können sie nacheinander zur Transformation eingesetzt werden, so daß transgene Pflanzen, die die erfindungsgemäße Kombination von DNA-Sequenzen enthalten, in einem zweistufigen Verfahren hergestellt werden können.

Für die Transformation werden die DNA-Sequenzen zunächst in Pflanzenzellen integriert, aus denen anschließend ganze Pflanzen regeneriert werden. Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäße DNA-Sequenz-Kombination enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Infolge der Übertragung der neuen Kombination von DNA-Sequenzen, die je einen Promotor, je eine Kodierregion des Verzweigungs- und des Disproportionierungs enzyms in antisense-Orientierung zum Promotor und je ein Terminations- /Polyadenylierungssignal enthalten, kommt es in den transgenen Pflanzen zur Bildung zweier RNA, die durch Wechselwirkung mit den endogenen mRNA des Verzweigungsenzyms und des Disproportionierenden Enzyms deren Synthese unterdrücken. Dadurch wird eine hochgradig amylosehaltige Stärke zugänglich.

Amylose zeichnet sich durch eine stark geordnete Raumstruktur aus, was insbesondere günstige Auswirkungen auf die Filmbildungseigenschaften hat. Besonders geeignet für die Produktion von Amylose unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Kombination von DNA Sequenzen des Verzweigungs- und des Disproportionierenden Enzyms ist Kartoffel. Die Anwendung der Erfindung ist aber nicht auf Kartoffel beschränkt, sondern kann auch an anderen stärkespeichernden Nutzpflanzen erfolgen (s. o.).

Die in den transgenen Pflanzen gebildete hochgradig amylosehaltige Stärke kann mit gängigen Methoden aus den Pflanzen oder aus den Pflanzenzellen isoliert und nach der Reinigung zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten verarbeitet werden.

Hinterlegungen

Am 20.08.1990 wurde das Plasmid p35-anti-BE (DSM 6144), am 26.08.1993 wurde das Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland hinterlegt.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das 13,6 kb große Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144). Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl- Mosaik-Virus (CaMV), Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
B = Fragment B (2909 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Verzweigungsenzyms von Solanum tuberosum
C = Fragment (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939

Fig. 2 zeigt das 12,165 kb große Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479). Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl- Mosaik-Virus (CaMV), Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
B = Fragment B (1474 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Kodierregion des Disproportionierenden Enzyms von Solanum tuberosum
C = Fragment (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungs beispiele werden vorab die wichtigsten eingesetzten Verfahren erläutert.

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC18 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119) benutzt.

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN19 (Bevan (1984) Nucl Acids Res 12, 8711-8720) kloniert.

2. Bakterienstämme

Für die pUC-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 24, 6342-6346) oder TB1 benutzt. TB1 ist ein Rekombinations-negatives, Tetracyclin-resistentes Derivat des Stammes JM 101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, pers. Mitteilung): F(traD36, proAB, lacl, lacZδM15, δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1::Tn10(Tcr).

Die Pflanzentransformation wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens- Stammes LBA4404 (Bevan (1984) Nucl Acids Res 12, 8711-8721), BIN19 Derivat) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Bei Bin19-Derivaten erfolgt die Einführung der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (1978, Mol Gen Genet 163, 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim et al. (1979, Nucl Acids Res 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.

4. Pflanzentransformation

10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem leichten Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al. (1989, EMBO Journal 8, 29) beschrieben.

5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Pflanzen

Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers et al. (1985, Plant Mol Biol 5, 69-76). Für die DNA-Analyse wurden 10-20 µg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersuchenden DNA-Sequenzen analysiert.

6. Analyse der Gesamt-RNA aus transgenen Pflanzen

Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (1987, Analytical Biochem 163, 16-20). Für die Analyse wurden je 50 µg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei zunächst die Konstruktion von binären Plasmiden und anschließend die Herstellung von transgenen Pflanzen, die die DNA-Sequenz- Kombination enthalten, gezeigt werden.

In analoger Verfahrensweise können auch andere Nutzpflanzen, bei denen ein Verzweigungs- und ein Disproportionierungsenzym an der Amylopektinproduktion beteiligt sind, transformiert werden.

Ausführungsbeispiel 1 Konstruktion des binären Plasmids p35S-anti-BE

Entsprechend der in der WO 92/14827 wiedergegebenen Vorschrift wurde das Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) hergestellt. Im einzelnen wurden dabei folgende Schritte ausgeführt:

Aus einer im Expressionsvektor λgt11 angelegten cDNA Bank von Knollengewebe aus Solanum tuberosum var. Desir´e wurden verschiedene Klone identifiziert, die von einem gegen das Verzweigungsenzym gerichteten Antiserum erkannt wurden (zur Durchführung der immunologischen Bestimmung s. Ausführungsbeispiel 3, "Western Blot"). Diese Klone wurden genutzt, um aus einer in der HindIII- Schnittstelle des Plasmids pUC19 angelegten cDNA Bibliothek aus wachsenden Knollen von Solanum tuberosum Vollängenklone zu isolieren. Ein Klon mit einer Insertion der Größe 2909 bp wurde für die weitere Klonierung verwendet.

Zur Herstellung des Plasmids p35S-anti-BE wurde die cDNA-Insertion mit dem Promotor der 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), sowie dem Polyadenylierungssignal der Octopinsynthase des Ti-Plasmids pTiACH5 versehen. Dabei wurde die Orientierung der cDNA so gewählt, daß ausgehend vom Promotor der nicht-kodierende Strang abgelesen wird (antisense-Orientierung). Das Plasmid p35S-anti-BE hat eine Größe von 13,6 kb und besteht aus den drei Fragmenten A, B und C, die in den Polylinker des Plasmids pBIN19 (Bevan, Nucl Acids Res 12 : 8711- 8721) insertiert sind (s. Fig. 1).

Fragment A (529bp) beinhaltet den 35S Promotor des CaMV. Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 (Franck et al., Cell 21 : 285-294). Es wurde als EcoRI/KpnI-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl Acid Res 14, 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoRI/KpnI-Schnittstellen des Polylinkers von pBIN19 ligiert. Dabei entstand pBIN19-A.

Fragment C (192bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J 3 : 835-846), Nukleotide 11749- 11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera- Estrella et al., Nature 303 : 209-213) isoliert und nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII Schnittstelle zwischen die SphI und die HindIII-Schnittstelle von pBIN19-A ligiert wurde. Dabei entstand pBIN19-AC.

Fragment B enthält die 2909bp große cDNA des Verzweigungsenzyms von Solanum tuberosum und wurde als HindIII/SmaI-Fragment aus dem oben beschriebenen pUC19 Derivat isoliert. Nach Auffüllen der HindIII-Schnittstelle mit Hilfe der DNA- Polymerase wurde das Fragment in die SmaI-Schnittstelle des zuvor beschriebenen Derivats pBIN19-AC ligiert (s. Fig. 1).

Ausführungsbeispiel 2 Konstruktion des Plasmids p35SH-anti-D

Unter Verwendung zweier synthetisch hergestellter DNA-Oligonukleotide der Sequenzen:

als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion an cDNA aus Knollengewebe von Solanum tuberosum wurde eine Kopie der Kodierregion des Disproportionierungs enzyms erzeugt, die wegen der spezifischen Sequenz der Oligonukleotide am 3′ Ende des kodogenen Stranges mit einer Kpnl-Schnittstelle und an dessen 5′ Ende mit einer Smal-Schnittstelle ausgestattet ist. Mit Hilfe dieser beiden Schnittstellen ist es möglich, die Kodierregion des Disproportionierungsenzyms in antisense Orientierung zwischen die Kpnl- und die Smal-Schnittstelle des binären Plasmids pBIN19-HYG zu klonieren. Das Plasmid pBIN19-HYG trägt das hphl-Gen für Hygromicinresistenz in der T-DNA. Die Verwendung dieses Plasmids ist notwendig, um Pflanzen, die bereits mit einem pBIN19-Derivat transformiert wurden, einer erneuten Transformation und Selektion unterziehen zu können. Für die Herstellung des Plasmids p35SH-anti-D wurde ein Derivat von pBIN19-HYG verwendet, das entsprechend der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise mit den dort beschriebenen Fragmenten A und C ausgestattet worden war. Dies hatte zu dem Plasmid pBin19-HYG-AC geführt.

Durch Ligation des mit Kpnl und Smal geschnittenen Produkts der Polymerase- Kettenreaktion zur Vervielfältigung der Kodierregion des Disproportionierungs enzyms zwischen die Kpnl- und Smal-Schnittstellen von pBIN19-HYG-AC entstand das Plasmid p35SH-anti-D (s. Fig. 2), das wie das in Ausführungsbeispiel 1 beschriebene Plasmid p35S-anti-BE aus drei Fragmenten A, B und C, insertiert in den Polylinker von pBIN19-HYG-AC, besteht. Die Fragmente A und C sind mit den entsprechenden in Ausführungsbeispiel 1 identisch, das Fragment B beinhaltet die Nukleotide 1777 bis 303 des Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum (Takaha et al., 1993).

Ausführungsbeispiel 3

Transformation von Agrobacterium tumefaciens mit binären Plasmiden und genetische Veränderung von Pflanzen mit Hilfe transformierter Agrobacterien.

Zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurden die binären Plasmide aus den Ausführungsbeispielen 1 bzw. 2 durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucl Acids Res 16 : 9877) in die Zellen eingeführt. Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim et al. (1979, Nucl Acids Res 7 : 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

Agrobakterien, bei denen die Integrität der in den Ausführungsbeispielen 1 und 2 beschriebenen binären Plasmide nach der Transformation durch Restriktionsanalyse nachgewiesen worden war, wurden zur genetischen Veränderung von Pflanzen eingesetzt.

Zur Transformation z. B. von Kartoffel pflanzen werden beispielsweise 10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthält. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln werden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen werden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wird die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al. (1989, EMBO J l 8 : 29) beschrieben.

Um die erfindungsgemäße Kombination von DNA-Sequenzen in Pflanzen einzuführen und diese zur Produktion einer hochgradig amylosehaltigen Stärke zu veranlassen, wurden zwei aufeinanderfolgende Transformationen nach der oben angegebenen Vorschrift durchgeführt.

Dabei wurde zweckmäßig zunächst mit dem in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Plasmid transformiert, da der Erfolg der antisense-Inhibition der Bildung des Verzweigungsenzyms leicht mit dem in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Antiserum vorgenommen werden kann.

Solche Pflanzen, bei denen kein Verzweigungsenzym mehr nachweisbar ist, werden für eine Superinfektion mit dem Plasmid p35SH-anti-D eingesetzt. Anstelle des Kanamycins wird nun zur Selektion Hygromicin in einer Konzentration von 3 mg/l verwendet.

Die Überprüfung des Erfolgs der genetischen Veränderung der Pflanzen ist durch Analyse der Gesamt-RNA bezüglich des Ausbleibens der mRNA des Q- und des D- Enzyms möglich. Im Falle der mit dem Konstrukt 35SH-anti-D transformierten Pflanzen wurde diese Nachweismethode verwendet. Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgt nach Logemann et al. (1987, Anal Biochem 163 : 16-20). Für die Analyse werden je 50 µg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Abwesenheit des Q- und des D-Enzym-Transkripts untersucht.

Zur Überprüfung des Vorhandenseins des Q-Enzyms in transgenen Pflanzen erfolgte eine Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe und anschließende "Western Blot Analyse" mit einem entsprechenden Antiserum. Hierzu werden Proteinextrakte mittels Gelelektrophorese in SDS-PAAG nach Molekulargewicht getrennt. Nach SDS-PAAG-Elektrophorese (PAGE) werden Proteingele für 15-30 Minuten in Transfer-Puffer für Graphitelektroden (48 g/l Tris, 39 g/l Glycin, 0,0375% SDS, 20% Methanol) äquilibriert und anschließend bei 4°C auf einen Nitrozellulose- Filter mit 1,3 mA/cm2 für 1-2 Stunden transferiert. Der Filter wird für 30 Minuten mit 3% Gelatine in TBS-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5; 500 mM NaCl) abgesättigt. Anschließend wird der Filter für 2 Stunden mit dem Antiserum in geeigneter Verdünnung (1 : 1000-10 000 in TBS Puffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird der Filter jeweils für 15 Minuten mit TBS-, TTBS- (TBS-Puffer mit 0,1% Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonolaurat und TBS-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wird das Filter für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Alkalische- Phosphatase konjugierten Goat-anti-Rabbit (GAR)-Antikörpern (1 : 7500 in TBS) inkubiert. Anschließend wird das Filter wie obenstehend beschrieben gewaschen und in AP-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) äquilibriert. Die Alkalische-Phosphatase Reaktion wird durch Substratzugabe von 70 µl 4- Nitrotetrazolium (NBT)-Lösung (50 mg/ml NBT in 70% Dimethylformamid) und 35 µl 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP) (50 mg/ml BCIP in Dimethylformamid) in 50 ml AP-Puffer gestartet. Nach 5 Minuten können in der Regel erste Signale beobachtet werden.

Zur Bestimmung des Amylose/Amylopektin-Gehalts in der Stärke transgener Kartoffelpflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke produzieren, werden Blattstückchen mit einem Durchmesser von 10 mm unter Dauerlicht auf 6%iger Saccharoselösung 14 Stunden lang flotiert. Durch diese Lichtinkubation wird eine stark erhöhte Stärkebildung in den Blattstückchen induziert. Nach der Inkubation wird die Amylose- und Amylopektin-Konzentration nach Hovenkamp-Hermelink et al. (1988, Potato Research 31 : 241-246) bestimmt.

Die Bestimmung des Verzweigungsgrades (Gehalt an α-1,6 Bindungen), der Kettenlänge sowie der Größe der Stärkekörner erfolgt nach Morrison et al. (1990, Methods in Plant Biochemistry Academic Press Imtd. 2 : 323-352).

Claims

1. Kombination von DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Kombination aus

a) der Kodierregion eines Verzweigungsenzyms und
b) der Kodierregion eines Disproportionierungsenzyms besteht, die jeweils derart an einen Promotor und ein Terminationssignal fusioniert sind, daß deren Transkription in transgenen Pflanzen zu Transkripten führt, die den Amylosegehalt natürlich in Pflanzen enthaltener Stärke dahingehend verändern, daß eine hochgradig amylosehaltige Stärke gebildet wird.

2. Kombination von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kodierregionen des Verzweigungs- und Disproportionierungsenzyms von Solanum tuberosum stammen.

3. Kombination von DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kodierregion des Verzweigungsenzyms auf dem Plasmid p35S-anti-BE (DSM 6144) und die Kodierregion des Disproportionierungsenzyms auf dem Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479) lokalisiert sind, die bei gleichzeitiger oder aufeinanderfolgender Einführung in ein pflanzliches Genom in transgenen Pflanzen Transkripte bilden, die die Bildung von Enzymen des Stärkemetabolismus dahingehend verändern, daß bei der Stärkebiosynthese die Bildung von Amylopektin unterdrückt ist und dadurch die Bildung einer hochgradig amylosehaltigen Stärke ermöglicht wird.

4. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden können, dadurch gekennzeichnet, daß man diese über

A) ein einstufiges Verfahren herstellt, daß die folgenden Schritte beinhaltet:
- a) Herstellung einer Kombination von DNA-Sequenzen aus folgenden Teilsequenzen:
  - i) je einem Promotor, der in pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
  - ii) je einer Kodierregion eines Verzweigungsenzyms und eines Disproportionierungsenzyms, derart an den unter i) genannten Promotor fusioniert, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
  - iii) je einer 3′-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3′-Ende der RNA führt, derart an die unter ii) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3′-nicht-translatierte Sequenz an das 3′-Ende des unter ii) genannten nicht-kodierenden Stranges anschließt,
- b) Transfer und Einbau der Kombinationen von DNA-Sequenzen in ein pflanzliches Genom unter Verwendung rekombinanter Plasmide zur Erzeugung transgener Pflanzenzellen und
- c) Regeneration von intakten, ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen,
  oder
B) ein zweistufiges Verfahren hergestellt, bei dem zunächst eine DNA- Sequenz, bestehend aus den Teilstücken:
- iv) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgeweben oder den Zielzellen sicherstellt,
- v) einer Kodierregion eines Verzweigungs- oder Disproportionie rungsenzyms, das derart an den unter iv) genannten Promotor fusioniert ist, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
- vi) einer 3′-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3′-Ende der RNA führt, derart an die unter v) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3′-nichttranslatierte Sequenz an das 3′-Ende des unter v) genannten nicht kodierenden Stranges anschließt,
in das Genom einer Pflanzenzelle unter Verwendung eines rekombinanten Plasmids transferiert und eingebaut wird, aus der so genetisch veränderten Pflanzenzelle eine ganze Pflanzenzelle regeneriert und anschließend in Zellen dieser genetisch veränderten Pflanzen durch erneute Transformation eine weitere DNA-Sequenz, bestehend aus den Teilstücken:
- vii) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgeweben oder den Zielzellen sicherstellt,
- viii) einer Kodierregion eines Disproportionierungs- oder Verzweigungsenzyms, derart an den unter vii) genannten Promotor fusioniert, daß ein Transkript vom nicht-kodierenden Strang gebildet wird (antisense-Fusion) und
- ix) einer 3′-nichttranslatierten Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Beendigung der Transkription sowie zur Addition von poly-A Resten an das 3′-Ende der RNA führt, derart an die unter viii) genannte Sequenz fusioniert, daß die 3′-nicht-translatierte Sequenz an das 3′-Ende des unter viii) genannten nicht kodierenden Stranges anschließt,
ebenfalls in das Genom einer Pflanzenzelle unter Verwendung eines rekombinanten Plasmids transferiert und eingebaut wird und schließlich die so transformierten Pflanzenzellen, die beide Teilstücke enthalten, abermals zu einer ganzen Pflanzen regeneriert werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der unter i), iv) oder vii) genannte Promotor der 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus mit den Nukleotiden 6909 bis 7437 ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der unter i), iv) oder vii) genannte Promotor der B33 Promotor eines Patatingens von Solanum tuberosum mit den Nukleotiden -1512 bis +14 ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Kombination verwendeten Plasmide die Plasmide p35S-anti-BE (DSM 6144) und p35SH-anti-D (DSM 8479) oder Derivate davon sind.

8. Pflanzenzellen, enthaltend eine DNA-Sequenz-Kombination gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.

9. Verwendung von Pflanzenzellen gemäß Anspruch 8, zur Herstellung von Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden.

10. Transgene Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden, erhältlich durch das Verfahren gemäß den Ansprüchen 4 bis 7.

11. Pflanzen gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nutzpflanze Kartoffel ist.

12. Verwendung der DNA-Sequenz-Kombination gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, zur Herstellung von Pflanzen, die hochgradig amylosehaltige Stärke bilden.

13. Verwendung der Plasmide p35S-anti-BE (DSM 6144) und p35SH-anti-D (DSM 8479) in Kombination, zur Transformation von Pflanzenzellen mit dem Ziel, in den Zellen die Bildung von hochgradig amylosehaltiger Stärke zu ermöglichen.

14. Hochgradig amylosehaltige Stärke, isolierbar aus Pflanzen gemäß den Ansprüchen 10 und 11.

15. Hochgradig amylosehaltige Stärke, isolierbar aus Pflanzenzellen gemäß Anspruch 8.

16. Verwendung der Stärke gemäß den Ansprüchen 14 und 15, zur Herstellung von Nahrungsmitteln und industriellen Produkten.