DE4216980C2 - Immunosensorisches Nachweisverfahren - Google Patents
Immunosensorisches NachweisverfahrenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein immunosensorisches Verfahren zum Nach
weis von blutgruppenspezifischen Antigenen der Erythrozytenober
fläche mittels immobilisierter spezifischer Bindungspartner
anhand von Stoffwechselreaktionen.
Immunologische Verfahren zur Bestimmung von Blutgruppen unter
Verwendung immobilisierter Bindungspartner sind dem Prinzip nach
bekannt. Beispielsweise beschreibt die US-P 4 943 522 Vorrich
tungen und Verfahren zur Durchführung spezifischer Bindungspaar
untersuchungen mit immobilisierten Antikörpern, wobei die be
schriebenen Vorrichtungen zum einmaligen Gebrauch bestimmt sind
und sich besonders für den qualitativen Nachweis durch visuelle
Beobachtung eignen. Weiterhin werden halb quantitative Bestim
mungen beschrieben, die auf dem Prinzip der Verdünnungsreihe
beruhen. Ferner sind nach der US-P 4 943 522 quantitative Mes
sungen der Farbe, Fluoreszenz oder Radioaktivität unter Einsatz
zusätzlicher Meßgeräte möglich.
Die DE-PS 36 17 763 beschreibt optische Vorrichtungen zur Durch
führung immunologischer Bestimmungen, die besonders zur Bestim
mung der ABO-Blutgruppen geeignet sind und bei denen Antikörper
auf optischen Leitern gebunden vorliegen. Die Vorrichtungen sind
zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern ge
eignet.
Verfahren und Vorrichtungen, die auf dem SPR-Prinzip (Surface
Plasmon Resonance) basieren und demnach ebenfalls den optischen
Verfahren zuzuordnen sind, werden in der WO 90/05303 und der
WO 90/05305 beschrieben. Bei der SPR-Technik werden Änderungen des
Brechungsindex in einer Schicht nahe eines dünnen Metallfilms
durch die resultierenden Änderungen der Intensität eines reflek
tierten Lichtstrahls gemessen. Die eigentliche Nachweisreaktion
kann hierbei auf einer immunochemischen Reaktion beruhen.
Aus der EP-A-215 669 ist ein Verfahren zum Nachweis von bioche
mischen Stoffen, Mikroben und Zellen bekannt, bei dem die nach
zuweisenden Analyte von biochemischen oder organischen Verbin
dungen auf der Oberfläche eines piezoelektrischen Kristallbio
sensors adsorbiert werden und der Nachweis der Analyte sowie die
Bestimmung der Konzentration derselben über die Messung der
Veränderung der Resonanzfrequenz des piezoelektrischen Kristalls
erfolgt. Als biochemische oder organische Verbindungen können
Antikörper, Antigene und Lektine eingesetzt werden.
In der DE-OS 39 16 432 ist ein Verfahren zur Konzentrationsbestimmung
eines Antikörper-Antigenpaares beschrieben, bei dem ein
Partner des Paares an eine Elektrode einer elektrochemischen
Meßkette in aktiver Form gebunden ist und die Bestimmung durch
Ermittlung der Zellspannungsänderung der Meßkette erfolgt, die
nach Zugabe des Reaktionspartners in die Meßlösung durch die
immunologische Reaktion zwischen den Partnern hervorgerufen
wird.
Ferner beschreibt die DE-OS 38 02 452 ein Verfahren zur Blut
gruppenbestimmung mit Hilfe der Festphasen-Methode unter Ver
wendung blutgruppenspezifischer Antikörper, welche sich an eine
Trägeroberfläche binden lassen.
Nachteilig an den bekannten Verfahren ist, daß beispielsweise
bei optischen Verfahren ihr Einsatz zur Untersuchung stark ge
färbter Flüssigkeiten, wie z. B. Blut, häufig mit Problemen be
haftet ist; der Einsatz von Radioaktivität erfordert besondere
Vorsichtsmaßnahmen, was eine allgemeine Anwendung erschwert.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren mit hoher Empfind
lichkeit für die Serologie zu schaffen, das den sicheren Nach
weis blutgruppenspezifischer Antigene anhand von Stoffwechselre
aktionen gestattet.
Zur Lösung der Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Verfahren gemäß
Hauptanspruch vorgeschlagen, bei dem elektrochemische Transduk
toren, beschichtet mit Lektinen und/oder Antikörpern, als Immu
nosensoren verwendet werden und der Nachweis anhand von Stoff
wechselreaktionen erfolgt. Bevorzugte Ausführungsformen des er
findungsgemäßen Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 und 3 ange
geben.
Das erfindungsgemäße Meßverfahren beruht auf der Bindung der
nachzuweisenden Antigene an eine Transduktoroberfläche und dem
Nachweis der Bindung der Antigene an die Transduktoroberfläche
durch elektrisch gemessene Größen am Transduktor, wie zum Bei
spiel den vom Transduktor abfließenden Strom oder die am Trans
duktor in Bezug auf eine Referenzelektrode meßbare Spannung.
Erfindungsgemäß wird derjenige Teil des Immunosensors Transduk
tor genannt, der den Meßeffekt erfaßt, wobei der Transduktor des
elektrochemischen Verfahren elektrisch leitende Materialien
umfaßt.
Bei dem erfindungsgemäßen elektrochemischen Verfahren wird das
Binden der nachzuweisenden Erythrozytenoberflächen-Antigene an
die Transduktoroberfläche des Immunosensors durch die Bildung
elektrodenaktiver Produkte nachgewiesen, die zu einer Strom-
oder Spannungsänderung führen. Wie nachfolgend näher erläutert,
werden die elektrodenaktiven Produkte durch Stoffwechselreak
tionen der Erythrozyten selbst gebildet und durch amperometri
sche oder potentiometrische Meßverfahren nachgewiesen.
Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfassen einen oder mehrere der beschriebenen Transduktoren in
Form von Immunosensoren, auf deren Oberfläche ein Bindungspart
ner, d. h. ein erythrozy
tenbindendes Lektin und/oder Antikörper, direkt oder auf einer
semipermeablen Membran angeordnet sind, welche sich unmittelbar
vor der Transduktoroberfläche befindet. Die Vorrichtung kann
ferner eine Meßkammer mit Probenzu- und -abführung sowie die
Auswertungselektronik umfassen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung von blutgruppenspezifi
schen Antigenen und damit die Bestimmung der Blutgruppen
auf die nachfolgend im einzelnen erläuterte Weise.
Ein mit einer erythrozytenbindenden Lektin- oder Antikörper
schicht überzogener Sensor wird mit der zu untersuchenden
Blutprobe in Kontakt gebracht. Das verwendete Lektin bzw.
der Antikörper bindet Erythrozyten abhängig von ihrer Blut
gruppe. Nach einer Inkubationszeit von 1 bis 20 Minuten
wird der Sensor aus der Blutprobe entfernt und abgespült.
Bei der Blutgruppe 0 erfolgt keine Bindung von Erythrozyten.
Bei den erfindungsgemäßen elektrochemischen Verfahren wird der Sensor zum
Nachweis der Blutgruppenantigene der gebundenen Erythrozyten
anschließend mit blutgruppenspezifischen
(monoklonalen) Antikörpern oder blutgruppenspezifischen
Lektinen in Kontakt gebracht, welche ggfs. enzymmarkiert sein können. Beispiele für
in Betracht kommende Lektine sind: Blutgruppe B: Lektin aus
Eunymus europaeus, Blutgruppe A: Lektin aus Helix aspera
oder H. Pomotia, Blutgruppe A1: Lektin aus Dolichos biflo
rus, Blutgruppe A2: Lektin aus Ulex europaeus. Dabei reagie
ren die ggfs. enzymmarkierten Antikörper oder Lektine mit dem
komplementären Antigenen auf der Zelloberfläche der gebunde
nen Erythrozyten (Abb. 1), indem sie den jeweils kom
plementären Partner binden. Zur Vermeidung der unspezifi
schen Adsorption wird der Sensor mit einer 2%igen Kälber
serum-Lösung "geblockt".
Monoklonale Antikörper oder Lektine für die Blutgruppen A,
B′ AB und die Untergruppen A1, A2, Lewis und D(RH) sind käuf
lich erhältlich. Die Markierung der Antikörper bzw. Lektine
mit den Markerenzymen kann nach Standardverfahren der
Proteinchemie erfolgen.
Nach einer Inkubationszeit von etwa 5 Minuten wird die Sen
soroberfläche zur Entfernung nicht gebundener, ggfs. markierter
Antikörper abgespült.
Die Markerenzyme werden so gewählt, daß bei Zugabe des En
zymsubstrats ein elektrodenaktives Reaktionsprodukt gebildet
wird bzw. so, daß ein Substrat für die Enzymelektrode in der
Reaktion entsteht. Die elektrodenaktiven Reaktionsprodukte
lassen sich durch amperometrische oder potentiometrische
Meßverfahren nachweisen.
Werden die einzelnen Blutgruppen (A, B, AB) und Untergruppen
(A1, A2) nacheinander überprüft, kann für alle eingesetzten
Antikörper das gleiche Markerenzym verwendet werden.
Als Markerenzyme bieten sich alkalische Phosphatase, Oxida
sen und Peroxidasen an. Bevorzugte Oxidasen sind Glucose
oxidase und Lactatoxidase.
Geeignete Substrate sind im Fall der alkalischen Phospha
tase para-Aminophenylphosphat und im Fall der Peroxidase
Ferrocyanid. Als elektrodenaktive Produkte werden para-Ami
nophenol (alkalische Phosphatase), Wasserstoffperoxid (Oxi
dasen) bzw. Ferricyanid (Peroxidase) gebildet.
Vorteilhafterweise kann die Bestimmung aller Blutgruppen gleichzeitig
erfolgen. Hierbei müssen die blutgruppenspezifischen
Antikörper jedoch für jede Gruppe unterschiedliche Markeren
zyme tragen, die elektrochemisch unterscheidbare Produkte
liefern und deren Substrate nicht miteinander reagieren.
Für den gleichzeitigen Einsatz von drei Antikörperspezies
bieten sich z. B. alkalische Phosphatase, Lactatoxidase und
β-Galactosidase als Markerenzyme an. Die Anzeige des para-
Aminophenols erfolgt bei +200 mV, die Anzeige von para-Ami
nophenol und Wasserstoffperoxid bei +600 mV. Das Reak
tionsprodukt der β-Galactosidase wird mit einer Glucoseoxi
dase-Elektrode bei +600 mV angezeigt.
Für die elektrochemische Anzeige der Reaktionsprodukte wer
den die üblichen amperometrischen und potentiometrischen
Elektroden eingesetzt. Die Erythrozyten-bindende semiperme
able Membran befindet sich unmittelbar vor der Elektroden
oberfläche, um einen kurzen Diffusionsweg der elektroche
misch aktiven Produkte zu gewährleisten.
Bei gleichzeitiger Anzeige der Produkte mehrerer Markerenzy
me befindet sich für jedes Produkt jeweils eine elektrisch
separate Indikatorelektrode unmittelbar hinter der Lektin
membran.
Für das oben beschriebene Verfahren lassen sich Sensoren
verwenden, an deren Oberfläche erythrozytenbindende Lektine
und/oder Antikörper fixiert sind. Lektine und Antikörper
werden entweder auf der Elektrodenoberfläche oder auf einer
semipermeablen Membran, welche sich unmittelbar vor der
Elektrode befindet, immobilisiert. Die Fixierung der Anti
körper für die Gruppen A, B, AB, A1, A2, Lewis und D(RH)
erfolgt dabei vorzugsweise über den FC-Teil mittels Protein
A oder durch etablierte Immobilisierungsverfahren über den
Kohlenhydratteil. Vorteil dieses Verfahren ist, daß die
hierbei verwendeten Antikörper bereits mit dem Markerenzym
markiert sein können. Auf diese Weise wird ein zusätzlicher
Reaktionsschritt zur Markierung gebundener Erythrozyten
überflüssig. Der Meßeffekt wird hierbei dadurch ausgelöst,
daß die Aktivität der gebundenen Markerenzyme durch die
Bindung der großen Antigene an die Antikörper erniedrigt
wird ("Enzym-modifizierender Immuntest"). Bei Blutgruppe 0
tritt demnach weder bei Anti A noch bei Anti B ein Meßsignal
auf. Dieser "Inhibitor-Effekt" ist auch in Gegenwart der
Blutprobe auswertbar, d. h. es ist kein Spülschritt vor der
Messung erforderlich. Der Meßeffekt tritt nur bei dem Sensor
auf, der die entsprechenden für die Blutgruppe spezifischen
Antikörper trägt. Bei Blutgruppe 0 wird demnach kein Meßsig
nal an den Enzym-Immunosensoren beobachtet.
Erfolgt die Bestimmung gebundener Erythrozyten durch den
Nachweis von Stoffwechselreaktionen der Blutkörperchen, kann
auf Markerenzyme ganz verzichtet werden (Abb. 2). Das
Vorhandensein gebundener Erythrozyten an den jeweiligen
Antikörper wird hierbei z. B. durch folgende Reaktion nach
gewiesen:
- - In Gegenwart von Glucose und Methylblau tritt ein star ker Sauerstoffverbrauch auf, der sich mittels Clark- Elektrode nachweisen läßt.
- - Erythrozyten enthalten Lactat-Dehydrogenase. Diese reduziert bei pH 9 in Gegenwart von Lactat und des Mediators Phenaziniummethosulfat, Ferricyanid zu Ferro cyanid, das bei +50 mV an einer Platinelektrode oxi diert werden kann.
- -Das Hämoglobin der Blutkörperchen besitzt peroxidanti sche Aktivität, die durch die Oxidation reduzierter Substrate quantifiziert werden kann. Bevorzugtes Sub strat ist Ferrocyanid, das sich bei -400 mV an einer Platinelektrode nachweisen läßt.
Nach der Anzeige der entsprechenden elektrochemischen Signa
le, die durch die Bindung der Erythrozyten hervorgerufen
werden, lassen sich die oben beschriebenen Sensoren durch
Abspalten der gebundenen Blutkörperchen regenerieren. Dazu
wird entweder der pH-Wert auf 2 erniedrigt oder die Ionen
stärke des Mediums erhöht. Die immobilisierten und gegebe
nenfalls enzymmarkierten blutgruppenspezifischen Antikörper
sind für die Messung von mindestens 100 Blutproben regene
rierbar, danach muß der Sensor erneut mit Antikörpern be
laden werden.
Das erfindungsgemäße immunosensorische Verfahren ermöglicht
es, blutgruppenspezifische Antigene sicher aus einer Blutgruppe
anhand von Stoffwechselreaktionen nachzuweisen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Figu
ren erläutert.
An vier 2×2 cm große Stücke einer 20 µm dicken Zellulosemem
bran werden nach der Aktivierung mit Cyanbromid in bekannter
Weise monoklonale Antikörper gegen jeweils ein bestimmtes Blut
gruppenantigen (A, A1, A2, B) fixiert. Jede dieser mit Antikör
pern beladenen Membranen werden (wie bei Enzymelektroden üblich)
mit einem Haltering über eine Stabelektrode gespannt. Unmittel
bar hinter der Membran befindet sich die Platin-Indikatorelek
trode und eine breitflächige Gegenelektrode aus Silber, die mit
AgCl überzogen ist. Jede Stabelektrode mit Haltering wird in
eine Mikrodurchflußzelle eingesetzt, anschließend werden die
vier Durchflußzellen mit kurzen Schläuchen (Durchmesser etwa
1 mm) miteinander verbunden. Durch diese Meßzellenkombination
wird 2%iges Kälberserum zum Blocken der Membranoberfläche und
anschließend physiologische Kochsalzlösung (0,25 bis 0,5 ml/min)
gepumpt und die Platinelektrode auf -600 mV gegen die AgCl/Ag-
Elektrode mit einem Potentiostaten polarisiert. Nach einer Ein
laufzeit von 20 Minuten hat sich der Strom der Elektrode stabi
lisiert. Nun werden 200 µl unverdünntes Blut in die vier Meßkam
mern gepumpt und der Fluß für 10 Minuten gestoppt, um die spezi
fische Wechselwirkung der auf der Membran fixierten Antikörper
mit den Erythrozyten zu ermöglichen. Danach wird das Blut aus
den Meßzellen mit physiologischer Kochsalzlösung ausgespült.
Nach 2 Minuten wird 5 mM Glucose in physiologischer Kochsalzlösung,
die 1 mM Phenaziniummethosulfat enthält, durch die 4 Meß
kammern gepumpt. Nur bei der Immunoelektrode, an die Erythrozy
ten über die jeweiligen fixierten Antikörper gebunden sind,
tritt innerhalb von 30 s eine Erniedrigung des Sauerstoff-Reduk
tionsstromes auf. Dabei sinkt der Strom von einem Ausgangswert
von 80 bis 150 nA auf 20 bis 40 nA ab.
Aus der Kombination der vier Meßwerte ergibt sich die Blutgruppe
des untersuchten Bluts.
Blutgruppe A: nur Signal bei Elektrode mit Anti A
Blutgruppe B: nur Signal bei Elektrode mit Anti B
Blutgruppe 0: kein Signal bei Elektrode mit Anti A und Anti B
Blutgruppe AB: Signal bei Elektrode mit Anti A und Anti B
Blutgruppe A1: Signal bei Elektrode mit Anti A1
Blutgruppe B: nur Signal bei Elektrode mit Anti B
Blutgruppe 0: kein Signal bei Elektrode mit Anti A und Anti B
Blutgruppe AB: Signal bei Elektrode mit Anti A und Anti B
Blutgruppe A1: Signal bei Elektrode mit Anti A1
Nach der Messung erfolgt die Regenerierung der Immunomembran,
indem die Mikromeßkammern mit Glycin-HCl-Puffer pH 2 für zwei
Minuten gespült werden. Danach beginnt ein neuer Meßzyklus.
Auf die Oberfläche von Kohleelektroden (Querschnitt 1 mm) werden
nach der bekannten Carbodiimid-Methode blutgruppenspezifische
Antikörper gegen die Gruppen AB bzw. B fixiert. Diese Antikörper
tragen als Markerenzym alkalische Phosphatase, die nach bekann
ten Verfahren, z. B. mittels Glutaraldehyd, an das Antikörpermo
lekül gebunden wurden.
Die beiden Immunoelektroden werden in eine Durchflußzelle mit
einer antikörperfreien Vergleichs- und drei Gegenelektroden ein
gebracht. Die Meßzelle wird von physiologischer Kochsalzlösung
durchströmt, die 1 mM Aminophenylphosphat enthält und die Immu
no- und die Vergleichselektrode werden auf +200 mV polarisiert.
Nach etwa 10 Minuten erreicht der Strom einen stationären Wert
von 50 bis 200 nA. Nun erfolgt-die Injektion der zu analysieren
den Blutprobe, die ebenfalls 1 mM Aminophenylphosphat enthält.
Durch die Bindung der Erythrozyten an die enzymmarkierten Anti
körper erfolgt eine deutliche Erniedrigung des Elektrodenstromes
bei der Elektrode, die die komplementären Antikörper auf den
Erythrozyten besitzt.
Auswertung und Regenerierung erfolgen analog zu Beispiel 1.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wird Lektin aus Sophora japonica
an eine Zellulosemembran gebunden und diese Membran vor eine
Stabelektrode in eine Durchflußkammer eingebracht. Nach Polari
sierung der Meßelektrode auf 600 mV und Stabilisierung des Stro
mes in physiologischer Kochsalzlösung, wird die zu untersuchende
Blutprobe für 10 Minuten mit der Lektin-Membran in Wechselwir
kung gebracht und dann mit physiologischer Kochsalzlösung ge
spült. Anschließend werden nacheinander mit Lactatoxidasen mar
kierte Antikörper, die spezifisch für die Blutgruppen A, B und
A1 sind, in die Meßkammer gepumpt. Nach 10minütiger Inkubation
wird mit einer 2 mM Lactatlösung gespült. Die Bindung der en
zymmarkierten Antikörper an die Erythrozyten vor der Meßelek
trode ruft einen signifikanten Stromabfall durch den O2-Verbrauch
bei der Lactatumsetzung hervor.
Auswertung und Regenerierung erfolgen analog zu Beispiel 1.
Fig. 1 zeigt eine mit einer Lektinschicht überzogene Transduk
toroberfläche. Das Lektin L bindet den Erythrozyten spezifisch
über das Blutgruppenantigen B auf der Oberfläche des Erythrozy
ten. Zum Nachweis der Blutgruppenantigene wird der Erythrozyt
mit einem enzymmarkierten blutgruppenspezifischen Antikörper in
Kontakt gebracht, der ebenfalls über ein Blutgruppenantigen B
auf der Oberfläche des Erythrozyten gebunden wird. Das Markeren
zym E katalysiert die Reaktion des Enzymsubstrats S zum trans
duktoraktiven Produkt P, das durch Diffusion an die Transduktor
oberfläche gelangt, wo es meßtechnisch erfaßt wird.
Fig. 2 zeigt die Bestimmung gebundener Erythrozyten durch
Stoffwechselreaktionen der Blutkörperchen. Der Erythozyt wird
durch das an die Transduktoroberfläche fixierte Lektin L spezi
fisch über ein Blutgruppenantigen auf der Oberfläche des Ery
throzyten gebunden. Stoffwechselreaktionen des gebundenen Ery
throzyten führen zur Umsetzung eines Substrates S zu einem
transduktoraktiven Produkt P.
Claims (3)
1. Immunosensorisches Verfahren zum Nachweis von blutgruppen
spezifischen Antigenen der Erythrozytenoberfläche mittels
immobilisierter, spezifischer Bindungspartner, dadurch ge
kennzeichnet, daß man
- (a) einen oder mehrere spezifische Bindungspartner auf der Oberfläche eines elektrochemischen Transduktors oder auf einer semipermeablen Membran, welche sich unmittel bar vor der Transduktoroberfläche befindet, immobili siert,
- b) die Transduktoroberfläche mit einem die Erythrozyten enthaltenden Medium unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bindung der Erythrozyten an die spezifischen Bindungspartner auf der Transduktorober fläche zulassen, und man
- (c) die Bindung der Erythrozyten an die Transduktoroberflä che anhand von Stoffwechselreaktionen nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
immobilisierten, spezifischen Bindungspartner blutgruppen
spezifische Antikörper oder Lektine sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man der Untersuchungsprobe Glucose und Methylenblau
zusetzt und die Bestimmung anhand des Sauerstoffverbrauchs
der gebundenen Erythrozyten oder anhand der in Erythrozyten
enthaltenen Lactatdehydrogenase oder durch die peroxidanti
sche Aktivität der Erythrozyten durchführt.
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