DE19917052A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung chem. und biochem. Analyten mittels amplifizierter mikro-elektrochem. Detektion - Google Patents

Abstract

Technische Aufgabe und Zielsetzung DOLLAR A Ein sensitives elektrochemisches Assay-System für die qualitative und/oder quantitative Bestimmung von Substanzen in einer komplexen Matrix soll entwickelt werden. DOLLAR A Lösung der technischen Aufgabe DOLLAR A Die Lösung erfolgt durch ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Diffusionskoeffizient einer redoxaktiven Spezies, die mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelt ist, durch Anbindung einer komplementären Erkennungsstruktur moduliert wird, und die Modulation des Diffusionskoeffizienten mit einem elektrochemischen Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies detektiert wird. Die Lösung der Aufgabe betrifft weiterhin die Konzeption von Vorrichtungen welche die Durchführung des Verfahrens ermöglichen, wobei zusätzlich das Verfahren sequentiell oder parallel auf mehrere Analytproben angewandt werden kann. DOLLAR A Anwendungsgebiet DOLLAR A Klinische Analytik, Umweltanalytik, Screeningverfahren

Description

1 Darstellung des technischen Gebietes

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur qualitativen und quantitati­ ven Bestimmung eines oder mehrerer chemischer und biochemischer Analyte. Durch selektive Bindung des Analyten an ein komplementäres spezifisches Erken­ nungselement, das mit einer elektroche­ misch aktiven Substanz (einem Redoxme­ diator) modifiziert ist, wird der Diffusions­ koeffizient dieses Redoxmediators modu­ liert. Die Veränderung des Diffusionskoef­ fizienten des Redoxmediators und damit der Massentransport zur Oberfläche einer geeigneten Elektrode wird mit Hilfe einer Meßelektrode detektiert. Eine Verstärkung des Meßeffektes wird durch die lokale elektrochemische Regenerierung des Redoxmediators an einer leitenden Ober­ fläche oder Elektrode in unmittelbaren Nähe der Meßelektrode erreicht.

2 Technischer Hintergrund 2.1 Bindungsassays

Die Erkennung und Quantifizierung von Bindungsereignissen zwischen komple­ mentären Erkennungsstrukturen wie Antigen/Antikörper, Hapten/Antikörper, Enzym/Substrat, Lectin/Kohlenhydrat, Rezeptor/Hormon, Oligonukleotid/DNA- oder RNA-Halbstrang dient als Grundlage sogenannter Assays, die einen wichtigen Bereich der klinischen, biochemischen und chemischen Analytik darstellen. Infolge der selektiven Erkennung der komplemen­ tären Strukturelemente können entspre­ chende Analyte zumeist ohne aufwendige Abtrennung in ihrer komplexen Matrix qualitativ und/oder quantitativ bestimmt werden. Der Einsatz solcher Assays wird durch ihre Selektivität, die im wesentlichen durch die Bindungskonstante für die dem Erkennungsvorgang zugrunde liegende Reaktion bestimmt ist, durch ihre Sensiti­ vität, den notwendigen Zeitaufwand, die notwendigen Reagenz- und Analytvolu­ mina, ihre Automatisierbarkeit und durch den Preis bestimmt.

2.2 Redoxreaktionen an Mikroelektroden

Wird eine Elektrode auf ein geeignetes konstantes Potential gegenüber einer Refe­ renzelektrode mit Hilfe eines Potentiosta­ ten polarisiert, kann eine sich in Lösung befindliche Redoxspezies entsprechend des Potentials oxidiert bzw. reduziert werden. Infolge des Umsatzes der Redoxspezies an einer Mikroelektrode entsteht ein Konzen­ trationsgradient vom Volumen der Lösung in Richtung der Elektrode, was den Aufbau eines hemisphärischen Diffusionsfeldes vor der Mikroelektrode zur Folge hat, in dem die Redoxspezies durch Diffusion zur Elektrodenoberfläche transportiert wird. Wird die Konzentration der umzusetzenden Redoxspezies am Ort der Elektrode gleich null, limitiert der diffusionelle Massen­ transport den Umsatz an der Elektrode, und man erhält als Maximalstrom den soge­ nannten Diffusionsgrenzstrom.

2.3 Elektrochemisches Recycling

Wird eine Mikroelektrode, an der diffu­ sionslimitiert eine Oxidations- oder Reduktionsreaktion eines im Elektrolyten gelösten Redoxmediators abläuft, an eine makroskopische, leitende Oberfläche so weit angenähert, daß das hemisphärische Diffusionsprofil vor der Mikroelektrode durch diese Oberfläche gestört wird, kann - bei geeignetem Potential an der makro­ skopischen Elektrode - die Rückreaktion der an der Mikroelektrode stattfindenden Reaktion ablaufen. Infolge dieser Rückre­ aktion werden im Volumenraum des Diffu­ sionsprofils in der Zeiteinheit die Zahl der an der Mikroelektrode umzusetzenden Redoxspezies vergrößert, so daß als Folge der Diffusionsgrenzstrom anwächst. Diese Amplifizierung ist abhängig von der Kon­ zentration der Redoxspezies, von der hete­ rogenen Elektronentransferkinetik an der Mikroelektrode und der leitenden Oberflä­ che, sowie insbesondere vom Abstand der Mikroelektrode zur gegenüberliegenden Oberfläche. Diese Amplifizierung durch Recycling der Redoxkomponente wird im Folgenden "positiver Feedback" genannt.

3 Stand der Technik

Die bisher beschriebenen Sensoren und Testverfahren zur Erkennung und Quanti­ fizierung von Bindungsereignissen zwischen komplementären biologischen oder chemischen Strukturen beruhen über­ wiegend auf dem Nachweis einer Markie­ rung (Enzym, Floureszenzmarker, Radio­ isotop), die durch aufwendige Synthese­ schritte an kompetitiv wirksamen Erken­ nungsstrukturen angebracht werden müssen. Diese markierten Analytderivate müssen bei einem kompetitiven Assay der Probe zugesetzt werden, so daß sie ver­ braucht werden. Obwohl die Analysevo­ lumina sehr stark reduziert wurden, stellt der Verbrauch der markierten Analytmole­ küle bei kompetitiven Assays einen wesentlichen Kostenfaktor dar.

Direkte Meßverfahren, also solche, bei denen das Bindungsereignis ohne Zugabe markierter Analytmoleküle detektiert werden kann, beruhen überwiegend auf optischen Detektionsmethoden unter Nutzung des evaneszenten Feldes elektro­ magnetischer Wellen an Grenzflächen unterschiedlicher Brechungsindizes (Ober­ flächen-Plasmon-Spektroskopie, Gitter­ koppler, Interferometrie, Ellipsometrie) oder der Beobachtung von Massenän­ derungen mit einem Schwingquarz oder Oberflächenwellensensor (SAW). Im Allgemeinen ist dabei ein Partner der komplementären Erkennungsreaktion an der Oberfläche des Meßsystems immobili­ siert, da Brechungsindexänderungen nur in der Abklingdistanz des evaneszenten Feldes (ca. 100 nm) detektiert werden können, bzw. die Resonanzfrequenz bei Mikrowaagen nur durch oberflächenge­ bundene Strukturen wirksam moduliert werden kann. Derartige Assays sind häufig apparativ aufwendig und müssen zumeist für jeden Anwendungsfall optimiert werden.

Obwohl elektrochemische Verfahren hin­ sichtlich der apparativen Anforderungen einfach sind, wurden sie aufgrund der geringen Sensitivität nur wenig für Assays eingesetzt. Insbesondere mikroelektroche­ mische Assays auf der Basis der besonde­ ren Eigenschaften von Ultramikroelektro­ den sind bisher wenig untersucht.

Sugawara et al. beschrieben direkte elek­ trochemische Assays für das Biotin- Avidin-System. Entweder wurde Biotin mit Daunomycin (Talanta, 1997, 44, 357-363; Analytleal Chemistry, 1995, 67, 299-302) oder mit Nil-Blau (Bioelectrochemistry & Bioenergetics, 1996, 41 (2), 167-I 72) als elektrochemisch aktiver Gruppe markiert oder Biotin-Hy­ drazid wurde als elektrochemisch aktives Biotinderivat (Bioelectrochemistry & Bioenergetics, 1994, 33, 205-207) benutzt. Binden die oben genannten Biotinderivate an Avidin, so werden die elektrochemisch aktiven Molekülteile mit in die Bindungs­ tasche des Avidins gezogen, was in allen beschriebenen Fällen zu einem Verlust der elektrochemischen Aktivität führt. Die Nachteile dieser Verfahren sind, daß der beschriebene Mechanismus auf das Avidin-Biotin-System beschränkt ist und somit nicht auf beliebige Analyten zu übertragen ist. Weiterhin ist, infolge der notwendigen intensiven Vorbehandlung der Meßelektroden vor jeder Messung, die schnelle Untersuchung einer großen Anzahl von Proben nicht möglich.

Elektrochemische Verstärkung als Folge von Recyclingprozessen wurde für Interdi­ gitalstrukturen (Paeschke et al.: Sensors & Actuators B-Chemical. 1995, 27, 394-397; Paeschke et al.: Analytica Chimica Acta, 1995, 305, 126-136; Hintsche et al.: Bio­ sensors & Bioelectronics, 1994, 9, 697-­ 705) und als Methode zur Abbildung der elektrochemischen Aktivität von Oberflä­ chen mittels der elektrochemischen Rastermikroskopie (SECM) (Horrocks et al.: Anal. Chem., 1993, 65, 3605-3614; Pierce et al.: tat Chem., 1992, 64, 1795) beschrieben.

Interdigitalelektroden besitzen aufgrund des konstanten Abstandes zwischen den Elektrodenkämmen ein festes Verstär­ kungsverhältnis. Der positive Feedback- Effekt beim SECM wurde bisher nicht zur Entwicklung amplifizierter Assays genutzt.

4 Aufgabe der Erfindung

Der hier beschriebenen Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein sensitives elektro­ chemisches Assay-System für die qualita­ tive und/oder quantitative Bestimmung von Substanzen in einer komplexen Matrix zu entwickeln. Die Selektivität wird durch die molekulare Erkennung zwischen Struktur­ bereichen der zu analysierenden Substanz und einem komplementären, mit einer redoxaktiven Gruppe modifizierten Bin­ dungspartner gewährleistet. Das Verfahren und die zur Durchführung des Verfahrens notwendigen Vorrichtungen sollen prinzi­ piell die Analyse beliebiger komplementä­ rer Bindungsereignisse erlauben, über eine variable Verstärkung zur Anpassung des Meßbereiches verfügen, und in sehr klei­ nen Reaktionsvolumina durchgeführt werden können. Die Möglichkeit zur Miniaturisierung impliziert gleichzeitig die Parallelisierung der Verfahren und der Vorrichtungen sowie den extrem geringen Verbrauch notwendiger Reagenzien.

5 Erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe

Die erfindungsgemäße Lösung der Auf­ gabe erfolgt durch ein Verfahren zur Bestimmung von chemischen oder bio­ chemischen Analyten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Diffusions­ koeffizient einer redoxaktiven Spezies, die mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelt ist, durch Anbindung einer komplementären Erkennungsstruktur moduliert wird, und die Modulation des Diffusionskoeffizienten mit einem elektro­ chemischen Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies detek­ tiert wird. Dabei ist das Verfahren durch eine Meßelektrode gekennzeichnet, die als Makro- oder Mikroelektrode mit einem aktiven Durchmesser zwischen 0.1 und 500 µm, bevorzugt 1-100 µm, insbesondere 10-50 µm ausgebildet ist, wobei die aktive Scheibenelektrode von einem isolie­ renden Mantel aus Glas oder Polymeren umgeben ist, der die Diffusion von Redox­ spezies zur aktiven Elektrodenoberfläche moduliert. Die Meßelektrode wird mittels Positionierelementen einer makroskopi­ schen leitenden Oberfläche soweit angenä­ hert, daß das Diffusionsprofil der mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelten Redoxspezies durch diese Oberfläche verändert wird. Das an den Redoxmediator gekoppelte Erkennungs­ element kann alternativ Biotin, ein Hapten, ein Antigen, ein Antikörper, ein Lectin, ein Kohlehydrat, ein DNA-Fragment, ein DNA-Halbstrang, ein RNA-Fragment, ein Oligonucleotid, ein Hormon, ein Rezeptor oder ein künstliches Wirtsmolekül sein, für das eine komplementäre Erkennungs­ struktur existiert, die selektiv gebunden werden kann. Alternativ kann auch über eine Zwischenstruktur mit mehr als einer Bindungsstelle der Redoxmediator und der Analyt spezifisch erkannt und gebunden werden kann, so daß ein Sandwich-Assay entsteht. Das Signal des zur Anwendung kommenden elektrochemischen Verfahrens muß durch den Diffusionskoeffizient der Redoxspezies bestimmt werden. Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe betrifft weiterhin die Konzeption von Vorrichtungen die die Durchführung des Verfahrens ermöglichen. In einer ersten Vorrichtung wird in einer Meßzelle mit Referenzelektrode, Gegenelektrode und makroskopischer Regenerationsoberfläche mit einem Volumen von 10 µl-1 ml, bevorzugt einem Volumen < 300 µl eine Mikroelektrode mittels Positionierele­ menten an die Regenerationsoberfläche angenähert. Eine zweite Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß die elek­ trochemische Meßzelle als ein Meß­ zellenarray ausgebildet ist, insbesondere nach Art von Mikrotiterplatten, dessen Boden eine gemeinsame leitende Regene­ rationsoberfläche bilden. Eine dritte Vor­ richtung benutzt einen Flüssigkeitstropfen als wandfreie "Meßzelle", in die die Redoxmediatorlösung über eine die Mikro­ elektrode umschließende Kapillare zudo­ siert wird, so daß sich ein das leitende Substrat und die Spitze der Mikroelektrode umgebender Tropfen bildet.

Prinzipiell ist es möglich, das Verfahren unter Nutzung der unterschiedlichen Vor­ richtungen sequentiell durch Repositionie­ rung der Mikroelektrode in verschiedenen Meßzellen eines Arrays durchzuführen, wobei mehrere Proben unter Nutzung einer gemeinsamen leitenden Regenerations­ oberfläche vermessen werden können.

Weiterhin gelingt es, mittels unabhängiger Positionierelemente mehrere Mikroelek­ troden parallel in mehreren Meßzellen oder Tropfen der Meßlösung an die jeweilige Regenerationsoberfläche anzunähern, so daß gleichzeitig mehrere Proben vermessen werden können.

6 Beschreibung der Erfindung

In dem erfindungsgemäßen Verfahren und den zugehörigen Vorrichtungen wurde ein neuartiges Assay-System konzipiert, das die Modulation des Diffusionskoeffizien­ ten einer mit einem Erkennungselement modifizierten redoxaktiven Spezies als Folge der Anbindung eines komplementä­ ren Bindungspartners nutzt, um qualitative und quantitative Informationen über das Vorhandensein und die Konzentration des Analyten zu erhalten. Als Detektions­ system wird dazu eine Mikroelektrode benutzt, an der bei einem geeigneten Potential der im Elektrolyt gelöste, mit dem Erkennungselement modifizierte Redoxmediator diffusionskontrolliert oxidiert bzw. reduziert wird. Die moleku­ lare Erkennung des Bindungspartners führt unter anderem zu einer Vergrößerung des Molekulargewichtes und damit verbunden zu einer Modulation des Diffusionskoeffi­ zienten der Redoxspezies, was durch eine Verminderung des Massentransports zur Mikroelektrode zu einer Verringerung des Diffusionsgrenzstromes führt. Die Detek­ tion des diffusionsabhängigen Fara­ day'schen Stromes an der Mikroelektrode kann statisch bei einem der Mikroelektrode aufgeprägten konstanten Potential oder dynamisch mittels cyclischer Voltamme­ trie, Differential-Puls-Voltammetrie, Potentialsprung-Techniken etc. erfolgen. Zur Signalamplifizierung als Vorausset­ zung für eine Erhöhung der Sensitivität und der möglichen Anpassung der Kali­ brierfunktion an die tatsächlich vorliegende Analytkonzentration wird die Meßelek­ trode (eine Mikroelektrode mit einem typischen Radius < 100 µm in einer Isola­ tionshülle mit einem mehrfachen Durch­ messer der aktiven Elektrodenscheibe (Abb. 1) mittels Verschiebeelemente (z. B. Schrittmotor-getriebene oder manu­ elle Mikrometerschrauben, Piezostapel) an eine gegenüberliegende, leitende Ober­ fläche angenähert, so daß das Diffusions­ profil der Redoxspezies vor der Mikroelek­ trode bis zur gegenüberliegenden leitenden Oberfläche reicht (Abb. 2). Die Regeneration des Redoxmediators an dieser Oberfläche ist entweder bedingt durch die Einstellung des Nernstpotentials in weiter Entfernung der positionierten Mikroelektrode oder wird durch das Auf­ prägen eines geeigneten Potentials mittels eines Bipotentiostaten erzwungen. Diese Regeneration des Redoxmediators führt zu einer durch den Abstand der Mikroelek­ trode in weiten Grenzen wählbaren Ampli­ fizierung des Stromes in Abhängigkeit des Diffusionskoeffizienten der an der Mikro­ elektrode umgesetzten Redoxspezies.

Ein vollständiger analytischer Zyklus ist aus mindestens 4 Verfahrensschritte aufge­ baut (Abb. 3):

• - Bestimmung des durch Umsatz des mit der spezifischen Erkennungsstruktur modifizierten Redoxmediators erzeug­ ten Faraday'schen Stromes an der Mikroelektrode in Abhängigkeit des Abstandes Mikroelektrode/Regenera­ tionsoberfläche.
• - Zugabe der Probe zur Lösung des Redoxmediators und Inkubation für einen festgelegten Zeitraum, der im wesentlichen von der Bindungskon­ stante der komplementären Erkennungs­ strukturen bestimmt wird.
• - Bestimmung des durch Umsatz des mit dem Komplex zwischen den komple­ mentären Erkennungsstrukturen modifi­ zierten Redoxmediators erzeugten Faraday'schen Stromes an der Mikro­ elektrode in Abhängigkeit des Abstan­ des Mikroelektrode/Regenerationsober­ fläche.
• - Auswertung der Stromabnahme mittels Kalibrierfunktionen unter Berücksichti­ gung der Volumenveränderung des Elektrolyten nach Zugabe des Analyten und des durch Recycling des Redoxme­ diators erhaltenen Verstärkungseffektes.

Für die erfindungsgemäße Durchführung der Analysenverfahren wurden unter­ schiedliche Vorrichtungen konzipiert, die den verschiedenen Einsatzmöglichkeiten der Assays hinsichtlich Zahl der Proben und verfügbarem Probenvolumen Rech­ nung tragen.

• 1. Vorrichtung zur Bestimmung von chemischen oder biochemischen Ana­ lyten über die Anbindung an eine elek­ trochemisch aktive Substanz mit Hilfe von Mikroelektroden, welche gekenn­ zeichnet ist durch, eine elektrochemi­ sche Zelle mit einem Volumen ≦ 10 ml, bevorzugt ≦ 1 ml, insbesondere ≦ 300 µl mit Referenzelektrode, Gegenelektrode, Vorrichtungen zum Entgasen der Lösung und zum Überleiten von Schutzgas über die Lösung, sowie einer leitenden ebenen kontaktierbaren Elektrode auf dem Meßzellenboden. Die Vorrichtung ist darüberhinaus gekenn­ zeichnet durch eine Scheibenmikro­ elektrode mit einem Durchmesser der elektrochemisch aktiven Oberfläche von 0.1-1000 µm, bevorzugt 10-50 µm, einer mit Motoren bevorzugt Schritt­ motoren, manuell und/oder Piezoele­ menten getriebenen Feinverstelleinheit für die Höhenpositionierung der Schei­ benmikroelektrode relativ zur Regene­ rationsoberfläche auf dem Meßzellen­ boden, optional einer mit Motoren, bevorzugt Schrittmotoren, manuell oder mit Piezoelementen getriebenen Einheit zur lateralen Verschiebung der Meß­ zelle, einen Potentiostaten und einen Personal-Computer zur Steuerung des Potentiostaten und der Verstelleinhei­ ten, sowie zur Meßwertaufnahme und Meßwertverarbeitung (Abb. 4).
• 2. Vorrichtung zur schnellen sequentiellen Bestimmung von chemischen oder bio­ chemischen Analyten über die Anbin­ dung an eine elektrochemisch aktive Substanz mit Hilfe von Mikroelektro­ den, welche gekennzeichnet ist durch einen Meßzellenverbund (analog einer Mikrotiterplatte), deren Boden leitfähig beschichtet ist. Die Referenz- und Gegenelektrode werden zusammen mit der als Meßelektrode dienenden Schei­ benmikroelektrode in die jeweils zu vermessende Meßzelle des Verbundes eingetaucht. Da Größe, Zahl und Abstände zwischen den Meßzellen bekannt sind, lassen sich die einzelnen Meßzellen automatisiert sequentiell mit der Mikroelektrode über die lateralen Verstelleinheiten anfahren und vermes­ sen (Abb. 5).
• 3. Vorrichtung zur Bestimmung von che­ mischen oder biochemischen Analyten über die Anbindung an eine elektro­ chemisch aktive Substanz mit Hilfe von Mikroelektroden, welche gekennzeich­ net ist durch einen Meßzellenverbund (analog einer Mikrotiterplatte), deren Boden leitfähig beschichtet ist, und mehreren der Zeilen- oder Spaltenzahl des Meßzellenverbundes angepaßten und im Meßzellenabstand voneinander parallel angeordneten positionierbaren Mikroelektroden, die unabhängig von­ einander in ihrer Höhe variiert werden können. Diese Vorrichtung gestattet die automatisierte, simultane Durchführung des erfindungsgemäßen Analyseverfah­ rens (Abb. 6).
• 4. Vorrichtung zur Bestimmung von chemischen oder biochemischen Analyten über die Anbindung an eine elektrochemisch aktive Substanz mit Hilfe von Mikroelektroden, welche gekennzeichnet ist durch eine Positio­ nierung der Mikromeßelektrode und der Referenz- und Gegenelektrode, zumindest jedoch einer Referenzelek­ trode, in einem auf der Regenera­ tionsoberfläche aufgebrachten Tropfen unter Verzicht auf eine Meßzellenwand. Das Volumen des Tropfens ist nach oben durch die Oberflächenspannung des verwendeten Elektrolyten, nach unten durch die Positioniergenauigkeit der Mikroelektrode mit Referenzelek­ trode über der Regenerationsoberfläche begrenzt. Erfindungsgemäß beträgt das Tropfenvolumen bevorzugt 0.001-­ 500 µl, insbesondere 1-100 µl (Abb. 7). Die Vorrichtung ist optional weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersu­ chende Probenlösung entweder mittels einer Mikrokapillare durch iontopho­ retische Injektion, durch Kapillarkräfte, bzw. unter Verwendung von Mikro­ pumpen oder mittels einer Düse, bevorzugt einem Piezodispenser, als Mikrotröpfchen, eventuell auch berührungslos über einen Luftspalt, in den das Meßvolumen bestimmenden Elektrolyttropfen eingebracht wird.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren wird im folgenden beispielhaft unter Nutzung der Vorrichtung 1 und anhand der Cyclo­ voltammetrie als dem zur Anwendung kommenden elektrochemischen Verfahren erläutert; die Übertragung der Erläuter­ ungen auf andere elektrochemische Meß­ verfahren wie der Amperometrie bei kon­ stantem Potential, unterschiedlicher Puls- Voltammetrieverfahren, Chronoampero­ metrie etc. sind einem Fachmann möglich. Im cyclovoltammetrischen Experiment bewirkt ab einem bestimmten Potential­ wert eine weitere Potentialerhöhung keine weitere Erhöhung des Faraday'schen Stromes. Die Parameter, die diesen diffu­ sionskontrolliert fließenden Grenzstrom bestimmen sind die Elektrodengröße, die Konzentration der Redoxspecies, die Zahl der pro Formelumsatz übertragenen Elek­ tronen, sowie der Diffusionskoeffizient der Redoxspezies. Der Diffusionskoeffizient ist für das erfindungsgemäße Verfahren von besonderer Bedeutung, da die Regene­ ration des Redoxmediators durch seine wechselseitige Diffusion zwischen der Mikromeßelektrode und der Regenera­ tionsoberfläche bestimmt wird.

Wird nun die komplementäre Erkennungs­ struktur (das heißt die zu bestimmende Substanz) zum am Redoxmediator gebun­ denen Erkennungselement zugegeben, so erfolgt die molekulare Erkennung unter Bildung eines Affinitätskomplexes zwischen den komplementären Strukturen mit einer für das gewählte Erkennungs­ system spezifischen Affinitätskonstanten (Bindungskonstante). Nach einer Inkuba­ tionszeit, die entweder ausreichend ist, um die Gleichgewichtskonzentration des Affi­ nitätskomplexes zu erhalten, oder die exakt reproduziert werden muß, ist der mittlere Diffusionskoeffizient des an der Mikro­ elektrode umzusetzenden Redoxmediators infolge der Vergrößerung des Molekular­ gewichtes erniedrigt. Wird die Erkennungsstruktur in fester Form zuge­ geben, so bleiben die Parameter Elektro­ dengröße, Abstand Mikroelektrode/Rege­ nerationsoberfläche, Zahl der ausge­ tauschten Elektronen und Konzentration des Redoxmediators konstant. Die erfolgte Abnahme des diffusionskontrolliert fließenden Faraday-Stromes im erneuten cyclovoltammetrischen Experiment ist somit ausschließlich auf die Modulation des Diffusionskoeffizienten als Folge der molekularen Erkennungsreaktion zurück­ zuführen. Die Abnahme des Stromes ist dabei ein Maß für die gebildete Menge des Affinitätskomplexes. Die Differenz der Diffusionsgrenzströme in den vor und nach der Zugabe des Analyten aufgenommenen Cyclovoltammogrammen stellt somit das auszuwertende Meßsignal des erfindungs­ gemäßen Verfahrens dar. Aufgrund der hohen Spezifität der molekularen Erken­ nungsreaktion besitzt dieses Verfahren eine geringe Querempfindlichkeit, so daß eine vorherige Probenaufbereitung zumeist entfallen kann.

Alternativ läßt sich das Erkennungselement auch in Lösung zugeben. Wichtig hierbei ist, daß sich nun neben dem Diffusions­ koeffizienten des Redoxmediators auch die Konzentration ändert. Um diesen Effekt möglichst gering zu halten, ist es erforder­ lich, das zugegebene Probevolumen im Vergleich zum Volumen der Redoxme­ diatorlösung in der Meßzelle möglichst gering zu halten, oder die Konzentrations­ abnahme durch die Volumenvergrößerung rechnerisch oder durch eine einmal aufge­ nommene Kalibrierfunktion, die nur den Volumenzuwachs berücksichtigt, zu elimi­ nieren.

Weiterhin ist es auch möglich, Probe und Redoxmediatorlösung vor der Messung zu vermischen und nach der Inkubationszeit mit nur einer elektrochemischen Messung zu untersuchen. Der Gehalt des Analyten in der Probe kann dann über eine mit Stan­ dardlösungen erhaltene Kalibrierfunktion erhalten werden.

Im Falle eines Analyten, der mehrere Bindungsstellen besitzt, kann das Meßver­ fahren auf ein Sandwich-Konzept erweitert werden. Bei identischen Bindungsstellen setzt man in einem ersten Reaktionsschritt einen Überschuß des Analyten zur Redox­ mediatorlösung zu. Aufgrund des Über­ schusses können nicht alle Bindungsstellen des Analyten mit Redoxmediator­ molekülen besetzt werden, so daß sta­ tistisch einige Bindungsstellen eines Analytmoleküls mit dem Redoxmediator besetzt sind und einige frei sind. Bei verschiedenen Bindungsstellen genügt eine Absättigung aller Bindungsstellen des Analyten, die den Redoxmediator binden können. Die erfolgreiche Anbindung kann durch das beschriebene Meßverfahren kontrolliert werden.

Die freien Bindungsstellen stellen die Grundlage für den Sandwich-Assay dar, da über diese ein weiteres zu dieser Bindungs­ stellen komplementäres Erkennungsele­ ment anbinden kann und somit die Mol­ masse des Redoxmediators weiter zunimmt, was zu einer weiteren Verringe­ rung des Diffusionskoeffizienten der Redoxspezies führt. Dieses läßt sich über resultierende Abnahme des Diffusions­ grenzstromes mit dem beschriebenen Meßverfahren detektieren.

Die Besonderheit des Meßverfahrens der vorliegenden Erfindung ist die zusätzliche Verstärkung des Meßeffektes durch den positiven Feedback-Effekt (Redoxme­ diatorrecycling) an der Regenerations­ oberfläche, der einfach durch Annäherung der Mikromeßelektrode an die Regenera­ tionsoberfläche erreicht werden kann, und über die Variation des Abstand zwischen Mikroelektrode und Regenerationsober­ fläche an die Erfordernisse von verschiedenen Analyten angepaßt werden kann. Hier liegt ein klarer Vorteil gegen­ über Verstärkungsmechanismen, die an aufwendig herzustellenden Interdigital- Elektroden zustande kommen, und an denen dieser Verstärkungseffekt nicht moduliert werden kann. Das erfindungs­ gemäße Analysenverfahren und die Vor­ richtungen weisen den Vorteil auf, daß lediglich ein Monopotentiostat benötigt wird, da im allgemeinen lediglich der Mikromeßelektrode Potentiale aufgeprägt werden müssen. Die zur Anwendung kommenden Mikroelektroden können durch Polieren mit Polierpasten gereinigt werden, so daß sie über eine große Zahl von Analysen reproduzierbar verwendet werden können.

7 Beispiele

Im folgenden wird das der Erfindung zugrunde liegende Prinzip anhand von Beispielen erläutert:

7.1 Biotin/Streptavidin Assay unter Verwendung von Vorrichtung 1

Als Redoxmediator wird ein mit Biotin modifiziertes Ferrocenderivat verwendet. Die Darstellung gelingt über die Umset­ zung eines wasserlöslichen Ferrocen- Alkylamins mit Hydroxysuccinimid- Biotin. Die Reaktionsprodukte werden mit Hilfe einer mit monomeren Avidin beschichteten Säule getrennt. Als Mikro­ elektrode dient eine glasummantelte Platinmikroelektrode mit einem Durch­ messer der aktiven Elektrodenoberfläche von 50 µm. Als elektrochemisches Detek­ tionsverfahren dient die cyclische Voltammetrie.

Abb. 8 (Kurve 1) zeigt ein Cyclo­ voltammogramm (Lösungsvolumen 300 µl; Vorrichtung 1) des biotinilierten Ferrocen-Komplexes (im folgenden Fc- Biotin genannt). Abb. 8 (Kurve 2) zeigt das Cyclovoltammogram nach Zugabe von 8 µl 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7). Die sehr geringe Abnahme des Faraday'schen Stromes ist auf die Volu­ menvergrößerung zurückzuführen. Die Kurven 3-5 zeigen die Cyclovoltammo­ gramme nach der Zugabe von jeweils 8 µl einer 0.15 mM Streptavidinlösung.

Aufgrund der Erniedrigung des Diffu­ sionskoeffizienten des Fc-Biotins durch die Anbindung des Streptavidins nimmt der Faraday-Strom an der Mikroelektrode ab.

Nach mehrfacher Zugabe des Analyten tritt Sättigung ein (Abb. 8, Kurve 5).

Abb. 9 zeigt eine analoge Messung unter Nutzung des Redoxrecycling an der der Mikromeßelektrode gegenüberliegen­ den Regenerationsoberfläche. Die im Vergleich zu Abb. 8 wesentlich höheren Ströme zeigen den erwarteten Verstärkungseffekt.

Dieser Verstärkungseffekt wird in Abb. 10 verdeutlicht, in der die Faraday'schen Ströme, normiert auf den Anfangsstrom vor der Zugabe von Streptavidin, gegen die Streptavidinkon­ zentration in der Meßzelle aufgetragen ist.

Die Messung mit Verstärkung durch Redoxrecycling zeigt eine um den Faktor 3 erhöhte Sensitivität. Für das hier gezeigte Beispiel lassen sich mit dem beschriebenen Verfahren Konzentrationen von Streptavi­ din von 1-10 µmol/l bestimmen.

7.2 Biotin/Streptavidin Assay unter Verwendung von Vorrichtung 4

Eine weitere Verringerung der einzuset­ zenden Substanzmengen läßt sich durch die Anwendung des Meßverfahrens in "freier" Umgebung ohne die Volumenbe­ grenzung durch Meßzellen erreichen.

Eine Mikroelektrode wird senkrecht sehr dicht an eine makroskopische Elektrode angenähert. Anschließend werden 20 µl Redoxmediatorlösung zudosiert, so daß sich eine die Mikro- und Makroelektrode umschließender Tropfen bildet. In diesen werden zusätzlich ein chloridisierter Silberdraht als Pseudo-Referenzelektrode und ein Platindraht als Gegenelektrode eingetaucht. Der Meßvorgang kann nach dem bereits beschriebenen Meßprinzip mit oder ohne Redoxamplifizierung erfolgen. Die Zugabe der Probe erfolgt aufgrund der kleinen Gesamtvolumina in einer für feste und flüssige Proben unterschiedlicher Weise. Im Falle fester Proben wird diese in einer Redoxmediatorlösung, welche die gleiche Konzentration an Redoxmediator aufweist wie die Referenz-Meßlösung, gelöst. Im Falle flüssiger Proben wird durch Vermischung der Probelösung mit einer höher konzentrierten Redoxmedia­ torlösung eine Lösung hergestellt, welche die gleiche Konzentration an Redoxspezies wie die Referenz-Meßlösung des Tropfens besitzt. Volumina bis zu 50 µl dieser Probenlösungen können in den Tropfen injiziert werden. Da Meß- und Referenz- Probenlösung die gleiche Konzentration an Redoxspezies besitzen, müssen Verdün­ nungseffekte nicht berücksichtigt werden. Abb. 11 Kurve 1 zeigt ein mit dieser Versuchsanordnung aufgenommenes Cyclovoltammogramm von Fc-Biotin mit Redoxamplifizierung. Über das beschrie­ bene Verfahren wurden 0.1 mg Streptavi­ din in 15 µl Meßlösung in den freien Trop­ fen zudosiert. Das entsprechende Cyclo­ voltammogramm (Abb. 11 Kurve 2) zeigt die resultierende Stromabnahme des Diffusionsgrenzstromes. Bei einer weiteren Zugabe von Streptavidin befindet sich das System bereits im Sättigungsbereich, so daß keine weitere signifikante Abnahme des Diffusionsgrenzstroms zu verzeichnen ist (Abb. 11 Kurve 3).

7.3 Sandwich Assay Biotin/Streptavidin/Biotinderivat unter Verwendung von Vorrichtung 1

Zur Demonstration eines Sandwich-Assays wird auf das bereits beschriebene Biotin- Streptavidin-System zurückgegriffen. Als zusätzlicher Analyt zum Anbinden an die freien Bindungsstellen von Streptavidin wird beispielhaft mit Biotin modifizierte Glucoseoxidase (im folgenden GOD- Biotin genannt) verwendet. Die Darstel­ lung dieser Verbindung gelingt über die Umsetzung von Glucoseoxidase mit Hydroxysuccinimid-Biotin und anschlie­ ßender Trennung der Reaktionsprodukte über eine monomere Avidin-Säule. Die Durchführung der Messung erfolgt nach Annäherung der Mikroelektrode an die Regenerationsoberfläche unter Wirkung der Redoxamplifizierung (siehe Abschnitt 7.1). Abb. 12 Kurve 1 zeigt das Cyclovoltammogramm von Fc-Biotin mit Redoxamplifizierung. Abb. 12 Kurve 2 zeigt das Cyclovoltammogramm nach Zusatz eines Überschusses von Streptavi­ din. Das Cyclovoltammogramm in Abb. 12 Kurve 3 zeigt die auf die Volu­ menzunahme um 15 µl Phosphatpuffer zurückzuführende Stromabnahme. Abb. 12 Kurve 4 zeigt das Cyclovoltam­ mogramm nach Zugabe von 15 µl GOD- Biotin-Lösung. Die Abnahme des Faraday'schen Stromes ist wesentlich höher als die durch die Volumenzunahme verursachte Stromabnahme. Diese ist auf die weitere Abnahme des Diffusions­ koeffizienten der Redoxspezies zurückzu­ führen. Weiterhin zu bemerken ist, daß die Abnahme viel größer ist als im Falle des Biotin-Streptavidin-Systems. Zum einen ist die Molmasse von Glucoseoxidase mit ca. 186.000 Dalton fast um das 2.8-fache größer als die von Streptavidin (ca. 67.000 Dalton), zum anderen besitzt das Glucose­ oxidasemolekül mehrere Aminogruppen, die mit Biotin derivatisiert werden können. Dies kann dazu führen, daß durch die Verknüpfung von mehreren biotinilierten Glucoseoxidasemolekülen über ein Strept­ avidinmolekül oder ein "Streptavidin-Fc- Biotin"-Molekül mit mindestens zwei freien Bindungsstellen sehr große Redox­ mediatoren entstehen, die einen entspre­ chend niedrigen Diffusionskoeffizienten besitzen.

Claims (28)

1. Verfahren zur Bestimmung von chemi­ schen oder biochemischen Analyten, gekennzeichnet dadurch, daß der Diffusionskoeffizient einer redoxakti­ ven Spezies, die mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelt ist, durch Anbindung einer komplementären Erkennungsstruktur moduliert wird, und die Modulation des Diffusionskoeffizienten mit einem elektrochemischen Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies detektiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Meßelektrode Makro- oder Mikroelektroden mit einem aktiven Durchmesser zwischen 0.1 und 500 µm, bevorzugt 1-­ 100 µm, insbesondere 10-50 µm eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßelektrode eine Scheibenelektrode ist, die von einem isolierenden Mantel aus Glas oder Polymeren umgeben ist, der die Diffusion von Redoxspezies zur aktiven Elektrodenoberfläche moduliert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßelektrode mittels Positionierelementen einer makroskopischen leitenden Oberfläche soweit angenähert werden kann, daß das Diffusionsprofil der mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelten Redoxspezies durch diese Oberfläche verändert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das an den Redoxmediator gekoppelte Erken­ nungselement Biotin, ein Hapten, ein Antigen, ein Antikörper, ein Lectin, ein Kohlehydrat, ein DNA-Fragment, ein DNA-Halbstrang, ein RNA-Frag­ ment, ein Oligonucleotid, ein Hormon, ein Rezeptor oder ein künstliches Wirtsmolekül ist, für das eine kom­ plementäre Erkennungsstruktur exi­ stiert, die selektiv gebunden wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestim­ mende Analyt Streptavidin, Avidin, Biotin, ein Hapten, ein Antigen, ein Antikörper, ein Lectin, ein Kohlehy­ drat, ein DNA-Fragment, ein DNA- Halbstrang, ein RNA-Fragment, Streptag I oder II modifizierte Proteine, His-Tag-modifizierte Proteine, ein Oligonucleotid, ein Hormon, ein Rezeptor oder ein künst­ liches Wirtsmolekül ist, vorausgesetzt, daß dieser Analyt durch komplemen­ täre Erkennung an den Redoxmediator­ modifizierten Partner spezifisch gebunden werden kann.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß über eine Zwischenstruktur mit mehr als einer gleichartigen oder unterschiedlichen Bindungsstelle der Redoxmediator und der Analyt spezifisch erkannt und gebunden werden kann, so daß ein Sandwich-Assay entsteht.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Anwen­ dung kommenden elektrochemischen Verfahren durch den Diffusionskoeffi­ zient der Redoxspezies bestimmt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die elek­ trochemischen Verfahren die cyclische Voltammetrie, die Chronoamperome­ trie, die Chronocoulometrie, die Diffe­ rential-Puls-Voltammetrie, die Normal-Puls-Voltammetrie, die Square-Wave-Voltammetrie, die Amperometrie bei konstantem Poten­ tial sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1, gekenn­ zeichnet dadurch, daß die Redoxspe­ zies, die mit dem spezifischen Erken­ nungselement gekoppelt wird, an einer Mikroelektrode mit hoher heterogener Durchtrittskinetik reversibel oxidierbar oder reduzierbar sind.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Redoxspezies ein Osmium-Komplex, ein Ferrocenderivat, eine Ferrocendendrimer ist.

12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß in eine Meßzelle mit Referenzelektrode, Gegenelektrode und makroskopischer Regenerationsoberfläche mit einem Volumen von 10 µl-1 ml, bevorzugt einem Volumen < 300 µl eine Mikro­ elektrode nach Anspruch 2 mittels Positionierelementen an die Regenera­ tionsoberfläche angenähert werden kann.

13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die elek­ trochemische Meßzelle als ein Meß­ zellenarray ausgebildet ist, insbeson­ dere nach Art von Mikrotiterplatten, dessen Boden eine gemeinsame oder mehrere getrennte leitende Regenerationsoberflächen bilden.

14. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die elek­ trochemische Meßzelle keine Wände aufweist, die von der Reaktionslösung berührt werden.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Redoxmediatorlösung über eine die Mikroelektrode umschließende Kapil­ lare zudosiert wird, so daß sich ein das leitende Substrat und die Spitze der Mikroelektrode umgebender Tropfen bildet.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare gleichzeitig als Referenz­ elektrode ausgebildet ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare ein Silberrohr bzw. ein mit Silber beschichtetes Rohr ist, das wiederum mit Silberchlorid beschich­ tet ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die benutzten Reaktionsvolumina in den Größenord­ nungen von Tropfen liegen, speziell im Bereich von 1 nl bis 100 µl, insbeson­ dere im Bereich von 5 µl bis 50 µl.

19. Verfahren nach Anspruch 1 unter Nutzung einer der Vorrichtungen nach Anspruch 14-17, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Probenlösung über eine Kapillare in den Tropfen der Redoxmediatorlösung dosiert wird.

20. Verfahren nach Anspruch 1 und 19 unter Nutzung einer der Vorrichtungen nach Anspruch 14-17, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenlösung mittels einer Mikrodosierpumpe oder durch iontophoretische Injektion in den Tropfen der Redoxmediatorlösung dosiert wird.

21. Verfahren nach Anspruch 1 unter Nutzung einer der Vorrichtungen nach Anspruch 14-17, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Probenlösung mittels eines Piezodispensers als Mikro­ tropfen, eventuell auch berührungslos über einen Luftspalt, in den Tropfen der Redoxmediatorlösung dosiert wird.

22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sequentiell mehrere Proben unter Nutzung einer gemeinsamen oder einzelner leitender Regenerationsoberflächen vermessen werden können.

23. Vorrichtung nach Anspruch 13 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroelektrode mittels Posi­ tionierelementen die Positionen des Meßzellenarrays sequentiell mit hoher Positioniergenauigkeit anfahren kann.

24. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß mittels unabhängiger Positionierelemente mehrere Mikroelektroden parallel in mehreren Meßzellen oder Tropfen der Meßlösung an die jeweilige Regenera­ tionsoberfläche angenähert werden können, so daß gleichzeitig mehrere Proben vermessen werden können.

25. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe nach Aufnahme einer Referenzmessung in fester Form zugegeben wird, in gelö­ ster Form hinzugegeben wird, oder vor dem Vermessen mit der Redoxmedia­ torlösung vermischt wird.

26. Vorrichtung nach Anspruch 12, 13, 14 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß mittels eines Potentiostaten an der oder den Mikroelektrode Potentialprofile für die in Anspruch 8 und 9 genannten elektrochemischen Verfahren aufge­ prägt werden können.

27. Vorrichtung nach Anspruch 12, 13, 14 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die makroskopische leitende Regene­ rationsoberfläche eine Scheibenelek­ trode, eine Metall- oder eine Metall­ bedampfte planare Oberfläche ist.

28. Vorrichtung nach Anspruch 12, 13, 14 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Regenerationsoberfläche entweder entsprechend der Nernst-Gleichung das durch den Oxidationszustand des Redoxmediators gegebene Potential annimmt oder mittels eines Bipotentio­ staten auf ein konstantes oder sich zeitlich änderndes Potential relativ zum Potential der Referenzelektrode polarisiert wird.