DE3886765T2

DE3886765T2 - Derivate von synergimycinen a und b.

Info

Publication number: DE3886765T2
Application number: DE3886765T
Authority: DE
Inventors: Carlo Cocito; Giambattista Mario Di; Andre Pecher
Original assignee: Anda Biologicals SA
Current assignee: Anda Biologicals SA
Priority date: 1987-10-22
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1994-06-01
Anticipated expiration: 2008-10-22
Also published as: US5200394A; BE1001013A4; WO1989003843A1; EP0386045A1; EP0386045B1; DE3886765D1

Description

Zweck der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Derivate von Virginiamycin S und Derivate von Virginiamycin M. Sie betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung dieser Derivate. Außerdem werden Verwendungen dieser Derivate in der Veterinärmedizin und/oder Humanmedizin und zur Herstellung von spezifischen Antikörpern beschrieben. Zusammenfassung des Standes der Technik Die Virginiamycine S und M gehören zu einer Familie von Antibiotika, die global unter den Bezeichnungen "Synergistine", "Synergimycine" und "Streptogramine" bekannt sind. Die Antibiotika dieses Typs, die von den Streptomyzeten erzeugt werden, enthalten zwei Arten von Substanzen, A und B, als Gemisch, die in vivo eine synergische Wirksamkeit haben. Die aus verschiedenen Organismen hervorgegangenen Verbindungen vom Typ A sind einander ähnlich, ebenso wie diejenigen vom Typ B; es besteht jedoch keine Ähnlichkeit zwischen den Formeln der Komponenten A und B.
Über diese Antibiotika wurden zahlreiche Veröffentlichungen gemacht, und auf dem Markt gibt es zahlreiche Produkte unter verschiedenen Handelsbezeichnungen (siehe : Merck Index, Ausgabe 10, 1983, Merck & Co., Inc. (Rahway, N.J., US), siehe Seite 1432, Kurzfassung Nr. 9810 "Virginiamycin".
Es sind auch Techniken zur Erzeugung einer antigenen Modifikation von Polypeptiden bekannt, die die Bildung von Antikörpern bewirken können (siehe : EP-A-0117934 (THE OHIO STATE UNIVERSITY) 12. September 1984 - Seite 1 bis 7.
In diesem Dokument wird jedoch die Anwendung der beschriebenen Techniken auf Virginiamycin, und folglich auch die besonders gesuchten Eigenschaften des erfindungsgemäßen Produkts nicht erwähnt.
In dem Dokument "Polymers in Medecine", Band 56 (1984), Springer-Verlag Berlin, S. 72-76 wird die Technik zur Zielausrichtung von pharmazeutisch wirksamen Produkten durch Bindung dieser Produkte an spezifische Transportsubstanzen allgemein beschrieben. Beispielsweise werden die Bindungen zwischen Zuckerresten und Antikörpern erwähnt.

Nachteile der bekannten Produkte

Trotz der Tatsache, daß das Gemisch aus S und M eine größere Wirksamkeit als die meisten Antibiotika hat, ist die Verwendung der Virginiamycine in der Medizin jedoch wegen ihrer geringen Löslichkeit in wäßeriger Umgebung begrenzt: In der Tat, das Assimilationsniveau aus dem Darm ist sehr gering, und der Aufteilungskoeffizient für die Aufteilung zwischen Blut und Geweben ist vernachlässigbar.

Von der vorliegenden Erfindung anvisierte Ziele

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Derivate der natürlichen Produkte vom Typ Virginiamycin S und M herzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Derivate von dem obenerwähnten Typ herzustellen, die eine verbesserte Löslichkeit in wäßeriger Umgebung aufweisen, und die daher höhere Niveaus in dem Blut und den Geweben erreichen.
Ein zusätzliches Ziel ist, Derivate von Virginiamycin S und M herzustellen, die in dem Fall von mikrobiellen Erkrankungen eine ausgeprägte therapeutische Wirkung haben, die sich aus ihren natürlichen Eigenschaften ergibt.
Gemäß einem anderen Aspekt zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, ein Verfahren anzugeben zur Herstellung dieser Derivate aus natürlichen Produkten, die mit den geeigneten Streptomyzeten gewonnen werden.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verwendungen dieser Antibiotika in der Humanmedizin und/oder Veterinärmedizin, und zur Herstellung von spezifischen Antikörpern.

Beschreibung der Prinzipien der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Virginiamycin-Derivate werden aus der Gruppe ausgewählt, die gebildet wird von den Verbindungen, die der allgemeinen Formel
Z-X-R
entsprechen, bei der Z ein Radikal von Virginiamycin vom Typ S oder vom Typ M repräsentiert, das bei seiner reaktiven Carbonyl-Position über einen Arm X vom Typ =N- oder =N-O an einen Substituenten R gebunden ist, der ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Alkyl-COOH-Gruppe, eine -Alkyl (α-NH&sub2;) COOH-Gruppe, eine
-Alk-COON
-Gruppe, eine -Alk-CONH
-N&sub3;-Gruppe, eine - (Alk-CONH)n- Prot-Gruppe oder eine -(Alk-CONH)n Rib- Gruppe repräsentiert, wobei n von der Anzahl der -NH&sub2; abhängt, die auf dem koppelnden Protein vorhanden sind, sowie von den pharmazeutisch annehmbaren Salzen, Estern und eventuellen Additionsverbindungen von Säuren.
Die Erfindung betrifft insbesondere Virginiamycin-Derivate von dem oben definierten Typ, bei denen Z das M-Virginiamycin-Radikal repräsentiert, das der Formel
entspricht, und das S-Virginiamycin-Radikal repräsentiert, das der Formel
entspricht, wobei X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben.
Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Derivate biologisch wirksam sind und einen vorteilhafteren Aufteilungskoeffizienten für die Aufteilung auf Wasser/organische Lösungsmittel als die Ausgangsprodukte haben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Derivate vom Typ Z=N-O-R bevorzugt, die in wässeriger Umgebung eine erhöhte Stabilität aufweisen.
Weiterhin ist anzumerken, daß die Wirksamkeit der so erhaltenen Antibiotika bei einem vorher ausgewählten Zielorgan in Abhängigkeit von den über den Arm X auf das natürliche Produkt aufgepfropften Substituenten R erhöht werden kann.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die oben angegebenen Derivate erhalten, wenn man eine Verbindung vom Typ NH&sub2;-R oder NH&sub2;-O-R, bei der R ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe, eine Alk-COOH-Gruppe oder eine Alkyl-(α-NH&sub2;)-COOH-Gruppe repräsentiert, mit der (den) von Streptomyzeten erzeugten Ausgangsverbindung(en) bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 30ºC, vorzugsweise bei einer Temperatur von ungefähr 20ºC während 1 bis 12 Stunden, vorzugsweise während ungefähr 4 Stunden, in einer Pyridin-Umgebung reagieren läßt.
Danach kann man das so erhaltene Produkt mit einer Verbindung vom Typ
bei einer Temperatur zwischen 10ºC und 30ºC, vorzugsweise von ungefähr 20ºC, während 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise während 24 Stunden, in Gegenwart von Triäthylamin reagieren lassen.
Das so erhaltene Produkt eignet sich besonders gut, um ein Virginiamycin an ein Protein oder ein Ribosom zu binden.
Man kann es ebenfalls mit jeder Verbindung, die eine NH2-Funktion besitzt, reagieren lassen.
Die erfindungsgemäßen Derivate können einzeln oder miteinander kombiniert, beispielsweise ein Derivat vom Typ A und ein Derivat vom Typ B, zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, eventuell in Kombination mit anderen kompatiblen wirksamen Prinzipien und mit pharmakologisch annehmbaren Trägersubstanzen, Exzipienten und/oder Lösungsmitteln.
Die erfindungsgemäßen Derivate, die ein Protein-Radikal enthalten, werden in vorteilhafter Weise verwendet, um spezifisch gegen das Antibiotikum gerichtete Antikörper zu erzeugen. Dies ermöglicht also, solche Verbindungen für die Diagnose und/oder die Bestimmung des Vorhandenseins und die quantitative Bestimmung des Antibiotikums zu verwenden, insbesondere durch enzymatische quantitative Bestimmung.

Ausführungsbeispiele der Erfindung

Die Erfindung wird nun mit Hilfe der nachfolgenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
Die verwendeten Lösungsmittel sind von analytischer Qualität.
Die Dünnschichtchromatographien werden auf Silikagel 60F254 von 0,2 mm Dicke (Aluminium) (Merck) ausgeführt.

BEISPIEL 1

Synthese des N-Hydroxysuccinimid-Derivats von Virginiamycin S (VS-ESTER).
Diese Synthese wird in drei Schritten durchgeführt:
1) die Synthese des SDPP-Reagens; 2) das Carboxylderivat von VS, und 3) der aktivierte Ester von VS. A. METHODE

REAKTION

Zu 0,01 Mol von (2) in 6 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (4 Å- Molekularsieb + P&sub2;O&sub5;) werden unter Bewegung bei 0ºC nacheinander langsam zugegeben: 0,01 Mol von (3) und 0,01 Mol von (1) in 6 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2;; die Bewegung wird noch während 15 Minuten bei 0ºC fortgesetzt. Das CH&sub2;Cl&sub2; wird unter vermindertem Druck bei 40ºC trocken verdampft. Der Rückstand wird dann mit 50 ml Äther behandelt, wobei ein weißer Niederschlag erhalten wird. Dieser Niederschlag wird filtriert und mit 20 ml Äther gewaschen, und dann getrocknet und in 100 ml Äthylacetat gelöst. Die organische Phase wird mit 10 ml H&sub2;O bei 0ºC dreimal gewaschen und auf einem 4 Å-Molekularsieb getrocknet. Das Äthylacetat wird unter vermindertem Druck bei 40ºC trocken verdampft. Das kristallisierte Produkt wird mit einer Ausbeute von 90% erhalten.

B. KENNZEICHNUNG

Dünnschichtchromatographie, ausgeführt auf Silikagel 60F254 von 0,2 mm Dicke (Aluminium) (Merck).
Die Synthese des SDPP (Verbindung 4) und seine Kennzeichnung sind in der Literatur beschrieben (Ogura H. et al., Tetrahedron Letters, 1980, 21, 1467-1468).

C. REAKTION

Zu 0,001 Mol von (5) in 20 ml Äthanol werden nacheinander zugegeben; 250 ul Pyridin, dann langsam 0,004 Mol von (6) in 20 ml Äthanol. Die Bewegung wird während 4 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt.
Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck bei 40ºC trocken verdampft. Der Rückstand wird dann in 25 ml HCl 0,25 N verdünnt. Die wässerige Phase wird mit 4 Mal 25 ml Chloroform extrahiert. Die organische Phase wird mit 4 Mal 25 ml destilliertem H&sub2;O gewaschen, und dann auf einem 4 Å-Molekularsieb getrocknet. Das Chloroform wird schließlich unter vermindertem Druck bei 40ºC trocken verdampft. Das kristallisierte Produkt wird mit einer Ausbeute von 80% erhalten.

D. KENNZEICHNUNG

Dünnschichtchromatographie

CHCl&sub3;/MeOH/HAC (5) (VS) C5 = 0 : 0,62
95 : 4 : 4 (8) VSCOOH : 0,32
¹H-RMN: 4.52-4.56 ppm (2H, α-COOH)

E) REAKTION

Zu 0,0001 Mol von (8) in 1 ml Acetonitril werden unter Bewegung nacheinander zugegeben: 0,0005 Mol von (3), und langsam 0,0005 Mol von (4) in 2 ml Acetonitril.
Die Bewegung wird bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt während 24 Stunden fortgesetzt.
Das Produkt wird vor Licht geschützt in dem Acetonitril bei 4ºC aufbewahrt.

F. KENNZEICHNUNG

1) Dünnschichtchromatographie

CHCl&sub3;/MeOH/HAC (8) VSCOOH : 0,32
95 : 4 : 4 (4) SDPP : 0,57
(9) VS-ESTER : 0,50
2) ¹H RMN: 2.86 ppm (4H,O-Succinimid)

BEISPIEL 2:

Koppelung von Virginiamycin S an Rinderserumalbumin

Rinderserumalbumin (BSA) ist ein Molekül, das ungefähr 52 Lysinreste pro Mol (52 &epsi;-aminierte Funktionen) besitzt, die ausgezeichnete Reaktionsstellen gegenüber dem "aktivierten Ester" von Virginiamycin S sind.
Das verwendete Rinderserumalbumin weist eine Reinheit von 99% auf. METHODE

A. REAKTION

Zu 1,43 uMol von (9) in 100 ul Acetonitril werden unter Bewegung nacheinander zugegeben: 2 ul von (3); 150 ul EtOH, 150 ul Borax-Puffer 0,025 M pH 8,5; 100 ul einer Lösung mit 10 mg/ml BSA (14,3 nMol), und 200 ul EtOH.
Die Bewegung wird vor Licht geschützt bei Raumtemperatur und unter CaCl&sub2; während 48 Stunden fortgesetzt.

B. REINIGUNG VON (VS)x BSA (Fig. 1)

Am Ende der Reaktion wird das Koppelungsprodukt (VS)x BSA während einer Stunde bei -70ºC ausgefällt, wobei zu dem Reaktionsmedium 50 ul KCl 2 M und 8 ml EtOH zugegeben werden.
Nach Zentrifugation wird der Überstand entfernt und das Sediment getrocknet.
Das Sediment wird dann in 1 ml destilliertem H&sub2;O gelöst.
Der Vorgang wird zweimal wiederholt (Ausfällung, Zentrifugation, Trocknung des Sediments).
Das Sediment wird dann in 1 ml destilliertem H&sub2;O und 40 ul Harnstoff 10 M gelöst.
Diese Probe wird an der Spitze der S phadex G150-Säule aufgebracht und mit einer Lösung aus NaH&sub2;PO&sub4; 4,8 10&supmin;² M/NH&sub4;Cl 0,1 M eluiert.
Fraktionen von 1 ml werden aufgefangen, und diejenigen, die eine A&sub2;&sub6;&sub0;-Absorption aufweisen, werden auf einem PEG- Teppich auf ungefähr 1 ml konzentriert. Die Probe wird dann während 12 Stunden bei 4ºC gegen 500 ml NaCl 0,1 N dialysiert.
Das Dialysat wird schließlich lyophilisiert und bei -20ºC aufbewahrt.

C. ABSCHÄTZUNG DER KOPPELUNGSAUSBEUTE

1) Das Lyophilisat wird in 1 ml destilliertem H&sub2;O gelöst; die Bestimmung der gesamten Proteine (BSA) wird nach der Methode von Lowry (24) ausgeführt, wobei eine BSA-Standardeichung zwischen 4 und 20 ug/ml verwendet wird.
2) Mit Hilfe eines Aminco-Bowman-SPF-Ratio II-Spektralfluorometers: λ Erregung 330 nm, und λ Emission 420 nm; die Fluoreszenz (relative Einheit) der Probe wird gemessen und unter den gleichen Analysenbedingungen mit der Fluoreszenz einer Probe von Virginiamycin S von bekannter Konzentration verglichen. Die Gesamtkonzentration der Probe an Virginiamycin S wird daraus abgeleitet.
3) Die Ausbeute der Koppelung wird dann wie folgt berechnet:
Ausbeute = Gesamtkonzentration an VS/Gesamtkonzentration an BSA = Mol VS/Mol BSA
4) Eine Untersuchung über die Koppelungsausbeute in Abhängigkeit von dem zu Beginn der Reaktion vorhandenen Verhältnis [VSE]/[BSA] wurde durchgeführt (Fig. 1).
Diese Ausbeute variiert zwischen 5 und 35 Mol VS/Mol BSA.
Unter den bei A beschriebenen Reaktionsbedingungen wird im allgemeinen eine Ausbeute von 15 ± 3 Mol VS/Mol BSA erhalten.

D. KENNZEICHNUNG VON (VS)&sub1;&sub5; BSA

1) Dünnschichtchromatographie

2) Chromatographie bei der G150-Sephadex-Säule (Fig. 2)

a) Die Standardprobe von Virginiamycin S wird bei den Fraktionen zwischen 30 und 70 ml zurückgewonnen.
b) Die Standardprobe von BSA (4 mg/ml) wird unter den gleichen Bedingungen zwischen 10 und 30 ml zurückgewonnen. In diesem Fall wird keine Fluoreszenz festgestellt.
c) Die gereinigte Probe von (VS)&sub1;&sub5; BSA (4 mg/ml) wird unter den gleichen Bedingungen zwischen 10 und 30 ml zurückgewonnen.
In diesem Fall wird eine Fluoreszenz festgestellt. Diese Analyse ermöglicht uns, die Stabilität von (VS)&sub1;&sub5; BSA herauszustellen (es hat allen Schritten der Reinigung widerstanden).

3) Elektrophorese auf SDS-Polyacrvlamid-Gel (Fig. 3)

a) Verschiedene Proteine von bekannter molarer Masse (darunter BSA) werden auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel getrennt (25). Je mehr ein Protein bei einem starken Rf wandert, desto kleiner ist seine molare Masse.
b) (VS)&sub1;&sub5; BSA wird den gleichen Analysenbedingungen unterworfen. Der für dieses erhaltene Rf ermöglicht, seine molare Masse abzuschätzen (79.200).
c) Diese molare Masse, verglichen mit der molaren Masse von BSA, und unter Berücksichtigung der molaren Masse von Virginiamycin S, ermöglicht, eine Koppelungsausbeute von 15 ± 3 Mol VS/Mol BSA abzuleiten, was die Ergebnisse bei C 4) bestätigt.

BEISPIEL 3:

Herstellung von spezifisch gegen Virginiamycin S gerichteten Antikörpern.

A. IMMUNISIERUNG

1) Die Anti-VS-Antikörper werden durch Immunisierung von zwei Kaninchen von neuseeländischer Rasse mit (VS) BSA erzeugt.
2) Die Injektionen werden subkutan gemäß dem folgenden Protokoll ausgeführt:
a) Als erste Dosis werden 0,5 mg in 500 ul physiologischem H&sub2;O und 500 ul vollständiges Freud-Adjuvans verabreicht (10 Injektionen von 100 ul).
b) Am 8. Tag wird eine doppelte Dosis verabreicht, das heißt, 1 mg in 500 ul physiologischem H&sub2;O und 500 ul unvollständiges Freund-Adjuvans.
c) Eine neue Dosis von 0,5 mg gemäß b) wird am 15. und 22. Tag verabreicht.
3) Das Blut wird aus einer Ohrvene entnommen:
a) 20 ml vor jeglicher Injektion (Kontrollserum).
b) 50 ml 7 Tage nach der zweiten Injektion.
c) 50 ml 7 Tage nach jeder alle 3 Wochen ausgeführten Wiederholung.
4) Das Serum wird durch Zentrifugation des Blutes bei 3000 Upm während 5 min erhalten. Der Überstand wird entnommen.
Das Serum wird bei -20ºC aufbewahrt.

B. EXTRAKTION DER GESAMTEN ING DES SERUMS

1) Dazu wird eine Säule mit DEAE Affi-gel blue (Bio-Rad) vorbereitet. Um ein ml Serum zu reinigen, wird ein Volumen von 7 ml Träger verwendet.
2) Diese Säule wird ins Gleichgewicht gebracht mit 2 Volumina eines Puffers A, das heißt, 0,02 M Tris.HCl pH 8,0; 0,028 M NaCl; 0,02% NaN&sub3;.
3) Das Serum wird gegenüber dem Puffer A dialysiert.
4) Das Dialysat wird an der Spitze der Säule aufgebracht und mit 3 Volumina Puffer A eluiert. Fraktionen von 1 bis 2 ml werden aufgefangen und mit dem Spektrophotometer bei 280 nm analysiert. Die Fraktionen, die eine Absorption aufweisen, werden vereinigt und auf einem PEG-Teppich bis auf ungefähr 1 ml konzentriert.
5) Die Säule wird dann mit 2 Volumina einer 6 M Guanidin.HCl-Lösung oder einer 6 M NaSCN-Lösung, und danach mit 2 Volumina Tampon A regeneriert.

C. REINIGUNG DER SPEZIFISCHEN (ANTI-VS-IgG)

1) Koppelung von Virginiamvcin S mit dem Affi-gel 102

Das Affi-gel 102 (Bio-Rad) ist ein Agarose-Gel, das Verzweigungen aufweist, die eine aminierte Endfunktion enthalten. Gemäß der Spezifikation gibt es 14 uMol dieser aminierten Gruppen pro ml Gel. a) Struktur b) Reaktionsschema
(WIRKSAMER LIGAND) (MATRIX) (LIGANG-MATRIX) (HARNSTOFF)

c) Reaktion

1) 30 mg VSCOOH werden in 5 ml EtOH und 1 ml H&sub2;O bei pH 4,5 (HCl 0,1 N) gelöst (Lösung A).
2) 21 mg EDC werden in 2 ml H&sub2;O bei pH 4,5 (HCl 0,1 N) gelöst (Lösung B).
3) Die Lösung A wird unter Bewegung und vor Licht geschützt zu 10 ml Affi-gel 102 zugegeben. Fraktionen von 200 ul der Lösung B werden dann alle 2 Minuten zugegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur unter Bewegung und vor Licht geschützt während 20 Stunden fortgesetzt.

2) VORBEREITUNG EINER AFFINITÄTSSÄULE (AFFI-GEL 102 VS)

a) 5 ml des Produktes der unter 1)c beschriebenen Reaktion werden in eine 10 ml-Säule gegeben.
b) Die Säule wird mit 50 ml EtOH/H&sub2;O (50 : 50), und danach 40 ml Puffer A (B 2) gewaschen und konditioniert.

3) GEWINNUNG DER SPEZIFISCHEN IgG VON VS

a) Die bei B erhaltene, an IgG gesamt konzentrierte Fraktion wird an der Spitze der Affinitätssäule aufgebracht und mit dem Puffer A eluiert, bis die aufgefangenen Fraktionen eine vernachlässigbare optische Dichte aufweisen (die nicht-spezifischen IgG sind eliminiert).
b) Die spezifisch gegen Virginiamycin S gerichteten IgG, die in der Säule absorbiert werden, werden mit Hilfe einer 50 mM Glycin.HCl-Lösung bei pH 2,8 abgelöst. Die Fraktionen, deren optische Dichte über 0 liegt, werden vereinigt und gegen den Puffer A dialysiert (12 Stunden, 4ºC). Die spezifischen IgG werden dann auf einem PEG-Teppich konzentriert.
c) Die Konzentration an Immunglobulinen G wird nach der Methode von Bradford abgeschätzt. Die Immunglobuline G werden bei -20ºC aufbewahrt.

D. KENNZEICHNUNG DER ANTI-VS-IMMUNGLOBULINE

1) IMMUNODIFFUSION (OUCHTERLONY) (Fig. 4)

a) Eine Lösung aus: 0,1 M NaCl; 0,05 M Tris-HCl pH 7,5; 0,1 mM EDTA; 1% Agarose wird in Form eines Films auf eine Glasplatte aufgebracht.
b) In gleichem Abstand werden 6 periphere Schächte um einen zentralen Schacht herum angeordnet.
c) 15 ug Anti-VS-Antikörper werden in den zentralen Schacht gegeben, und 7 bis 22 ug des Komplexes (VS)&sub1;&sub5; BSA und/oder (VS)&sub8; PA werden in die peripheren Schächte gegeben.
d) Nach Diffusion während 12 Stunden bei Raumtemperatur wird die Platte mit Hilfe einer 0,9% NaCl-Lösung gewaschen, und dann getrocknet und mit Coomassie-Blau (0,5% in MeOH/H&sub2;O/HAC/CHCl&sub3; - 42,5 : 45 : 10 : 2,5) gefärbt.

2) ELISA

a) Zu einer Mikrotitrationsplatte (Flow Laboratories), die 96 Schächte aufweist, werden 0,5 mg (VS)&sub1;&sub5; BSA (Fig. 5), oder (VS)&sub8; PA (Fig. 6), oder BSA allein zugegeben. Dieser Schritt wird (bei 4ºC, 12 h) in Gegenwart von 1% Glutaraldehyd in 0,15 M NaCl ausgeführt.
b) Der Komplexüberschuß wird eliminiert.
c) Die Platte wird dann gesättigt (1 h, bei Raumtemperatur) mit einer Lösung mit 1 mg/ml von Laktalbumin in einem Puffer B, das heißt: 0,15 M NaCl, 0,05% (V/V) Tween 80 : 0,15 M Phosphatpuffer pH 7,2.
d) Die Platte wird 5 Mal gewaschen mit dem Puffer B.
e) 50 ul einer Reihe von Verdünnungen der gesamten IgG oder gereinigten Anti-VS-Antikörper (in 0,9% NaCl) werden zu jedem Schacht hinzugegeben.
Die Platte wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
f) Die Platte wird fünf Mal mit dem Puffer B gewaschen.
g) 50 ul einer Verdünnung (1/800) von mit Peroxydase markierten Anti-Immunglobulinen von Kaninchen werden zu jedem Schacht hinzuzugegeben. Die Platte wird eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
h) Die Platte wird mit Puffer B erneut gewaschen.
i) 50 ul einer 0,2% Lösung von Orthophenylendiamin in 0,015% H&sub2;O; 15 mM Zitronensäure; und 60 mM eines Phosphatpuffers pH 6,3 werden schließlich zu jedem Schacht hinzuzugegeben, und das Ganze wird 30 Minuten bei 37ºC vor Licht geschützt inkubiert.
j) Die Reaktion wird gestoppt durch Zugabe von 50 ul H&sub2;SO&sub4; 4,5 M zu jedem Schacht.
k) Die optische Dichte jedes Schachts wird bei 492 nm mit Hilfe eines Elisa Platten-Spektrophotometers (Kontron Analytical SLT 210) gemessen.

BEISPIEL 4

Affinitätsmarkierung der Ribosomen 70S durch Virginiamycin S "aktivierter Ester".

A. SPEZIFISCHE BINDUNG VON VIRGINIAMYCIN S "AKTIVIERTER ESTER" AN DAS RIBOSOM 70S

Virginiamycin S ist fluoreszierend in wässeriger Lösung in Gegenwart von zweiwertigen Ionen, wie Mg&spplus;&spplus; oder Ca&spplus;&spplus;. Die Änderung (Erhöhung) der Fluoreszenzausbeute von Virginiamycin S infolge seiner Bindung an das Ribosom wird ausgenutzt zur Messung der Assoziationskonstanten des gebildeten Komplexes, der Stöchiometrie der Reaktion, sowie des durch Virginiamycin M hervorgerufenen Synergismus, der sich durch eine Erhöhung der Assoziationskonstanten von VS um ungefähr einen Faktor 6 äußert.
Wenn der Ribosom-VS-Komplex in Gegenwart von Erythromycin oder eines anderen Makrolids inkubiert wird, kann die Kinetik der Verschiebung des Virginiamycins S des Komplexes verfolgt werden (Verminderung der Fluoreszenz).
Diese zwei Arten von mit dem Virginiamycin S "aktivier- Dter Ester" durchgeführten Versuchen zeigen, daß das Virginiamycin S "aktivierter Ester" eine ziemlich ähnliche Assoziationskonstante wie das Virginiamycin S hatte (1,5 10&sup6; M&supmin;¹ gegenüber 2,5 10&sup6; M&supmin;¹), daß seine Stöchiometrie immer noch 1 : 1 war, und daß das Erythromycin auch das Virginiamycin S "aktivierter Ester" verschob. Diese Reaktion läuft innerhalb von Minuten ab, während die kovalente Reaktion eine 10- bis 20mal größere Zeitdauer erfordert.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß das Virginiamycin S und das Derivat "aktivierter Ester" die gleiche Fixierungsstelle auf dem Ribosom haben.

B. SPEZIFISCHE KOPPELUNG VON VIRGINIAMYCIN S AN DAS RIBOSOM 70S

Diese Koppelung erfolgt mit Hilfe des "aktivierten Esters" des Virginiamycins S. In der Tat, eine große Anzahl von ribosomalen NH&sub2;-lys- und NH-his-Gruppen können mit diesem Derivat reagieren.
Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit groß, daß ein Lysin- oder Histidin-Rest in der Nähe der Fixierungsstelle von VS vorhanden ist, da diese Reste 10 bis 20% der gesamten Anzahl von Resten bei jedem ribosomalen Protein repräsentieren.

1) Material

- Die Ribosomen 70S von E. coli werden nach der Methode von Tissi res erhalten: 1 optische Dichte (OD) von Ribosomen 70S bei 260 nm entspricht 24 pMol.
- Das verwendete Erythromycin ist ein Produkt von Boehringer. 2) Methode
a) E nMol Ribosomen 70S werden 5 Minuten bei 40ºC reaktiviert in 1 ml Puffer C, das heißt: 10 mM MgCl&sub2;; 50 mM TEA pH 7,8; 100 mM KCl und 4% EtOH.

b) Reaktion Nr. 1

5 nMol reaktivierte Ribosomen 70S werden mit 50 nMol VS-Ester behandelt. Die Bildung des Komplexes erfolgt während 5 Minuten bei 4ºC. Die Reaktion wird bei 30ºC während 1 Stunde vor Licht geschützt inkubiert, dann durch Zugabe von 500 nMol Äthanolamin gestoppt, und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Reaktion Nr. 2

5 nMol reaktivierte Ribosomen 70S werden mit 50 nMol Erythromycin (Sättigung der Fixierungsstelle von VS) während 5 Minuten bei 4ºC behandelt. Dann werden 50 nMol VS-Ester zugegeben, und das Gemisch wird bei 4ºC während 5 Minuten, und dann bei 30ºC während 1 Stunde vor Licht geschützt inkubiert. Die Reaktion wird wie bei Nr. 1 beschrieben gestoppt.

Reaktion Nr. 3

5 nMol reaktivierte Ribosomen 705 werden mit 50 nMol VS-Ester (der vorher während 1 Stunde bei 30ºC durch 2500 nMol Äthanolamin hydrolysiert wurde) während 5 Minuten bei 4ºC behandelt. Das Gemisch wird danach bei 30ºC während 1 Stunde vor Licht geschützt inkubiert. Die Reaktion wird wie bei der Nr. 1 beschrieben gestoppt.

REINIGUNG VON RIB VS

Nach jeder Reaktion werden 5 nMol Erythromycin zugegeben, so daß der nicht kovalent an das Ribosom gebundene VS-Überschuß verschoben wird (10 Minuten bei 30ºC).
Jede der drei Proben (1, 2, 3) wird dann auf eine S cpharose 4B-Säule (25 ml) aufgebracht und mit dem Puffer C eluiert.
Die Fraktionen von 1 ml werden aufgefangen und bei 260 nm gemessen. Außerdem wird die Fluoreszenz gemessen (II, C, 2). Die Fraktionen, die die Ribosomen enthalten (OD > 0, F > 0) werden vereinigt und durch Zugabe von 0,7 Volumina EtOH ausgefällt und bei 5000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird eliminiert, und das Sediment in 1 ml Puffer C resuspendiert (der Schritt wird zweimal wiederholt: Ausfällung, Zentrifugation).
Die Affinitätsmarkierung der Ribosomen durch den aktivierten Ester von Virginiamycin S wird in dem gegebenen Zustand (Tafel A), oder nach Sättigung der Fixierungsstelle durch das Erythromycin (Tafel B) ausgeführt. Die erste Markierung bezieht sich auf eine Gesamtmarkierung (ein unspezifischer Teil + ein spezifischer Teil), und die zweite Markierung entspricht nur einer unspezifischen Markierung.
Die Tafel C repräsentiert eine Kontrolle, bei der der aktivierte Ester von Virginiamycin S vorher durch Äthanolamin hydrolysiert wird.
Die Reaktionsgemische werden dann durch Chromatographie mit einer Sepharose 4B-Säule getrennt.
Die Absorption A260nm (- o-) und die Fluoreszenz (- -) werden bei jeder der Fraktionen gemessen, wie dies bei' IV,B,3 beschrieben ist.

4) ABSCHÄTZUNG DER KOPPELUNGSAUSBEUTE (Fig. 8)

10 OD gereinigte Ribosomen 70S (dies entspricht 240 pMol), die von den Reaktionen Nr. 1 und Nr. 2 herrühren, werden mit dem Puffer C auf 1 ml aufgefüllt. Das Emissionsspektrum der zwei Proben wird dann zwischen 370 und 520 nm bei λ Erregung von 330 nm gemessen. Die Fluoreszenz beweist, daß VS in der Probe vorhanden ist. Die erhaltenen Koppelungsausbeuten sind 1,5 Mol VS pro Mol Ribosom für die Rekation Nr. 1 (unspezifisch + spezifisch), und 0,6 Mol VS pro Mol Ribosom für die Reaktion Nr. 2 (unspezifisch).
Nach Reinigung der Proben, die von zwei Markierungsarten (unspezifisch + spezifisch) und (unspezifisch allein) herrühren, wie dies für die Fig. 7 beschrieben wurde, werden die Fraktionen, die die Ribosomen enthalten, vereinigt.
Die Menge VS, die bei einer bekannten Ribosomenkonzentration vorhanden ist, wird gemessen durch Erzeugung eines Fluoreszenz-Emissionsspektrums (λ Erregung 330 nm) gemessen.
Die Kurve (- -) entspricht der ersten Markierungsart (unspezifisch + spezifisch), und die Kurve (-x-) der zweiten Markierungsart (nur unspezifisch).
Bezüglich eines VS-Standards werden die Ausbeuten auf 1,5 bzw. 0,6 Mol gebundenes VS pro Mol Ribosom geschätzt.

5) EXTRAKTION DER RIBOSOMALEN PROTEINE

Die ribosomalen Proteine werden durch Extraktion mit Essigsäure gemäß der Methode von Hardy et al. gewonnen.

6) ELISA (Fig. 9)

Der Elisa wird gemäß der oben beschriebenen Methode bei kontrollierten Ribosomen 705, und bei den daraus extrahierten, ribosomalen Proteinen ausgeführt. Er wird ebenfalls bei Ribosomen 70S-VS, die nach Reinigung der Reaktion Nr. 1 erhalten wurden, und bei daraus extrahierten, ribosomalen Proteinen ausgeführt.
Die enzymatische Bestimmung (Elisa) wird so ausgeführt, wie dies in der Fig. 5 beschrieben ist.
Die gereinigten ribosomalen Proteine, die von 10 pMol Ribosomen herrühren, die durch den aktivierten Ester von Virginiamycin S markiert wurden (- -), oder die nicht markierten Kontrollen (- -) werden als Antigen verwendet.
Das Diagramm gibt ebenfalls die mögliche Reaktion der markierten ganzen ribosomalen Partikel (- -) und der ribosomalen Partikel der Kontrollen (- -) wieder.

BEISPIEL 5

Das gleiche Reaktionsschema wie bei dem Beispiel 1 wurde für die Synthese eines VS-Derivats, das eine (α-NH&sub2;)·COOH-Funktion aufweist, verwendet. Das für diese Reaktion verwendete Reagens, das Canalin, hat die Struktur
Das erhaltene Produkt (VS) C&sub5;=NO(CH&sub2;)&sub2;. H.COOH
weist eine basische und eine saure Gruppe auf, und kann daher an eine ganze Reihe von Reagenzien für die NH&sub2;-Gruppe und die COOH-Gruppe angekoppelt werden. Ein Beispiel ist die Reaktion der Lactobionsäure mit der NH&sub2;-Gruppe des obenerwähnten VS-Derivats. Ein anderes Beispiel ist die Koppelung des D-Glucamins mit der COOH-Gruppe des aktivierten VS-Esters. Diese zwei Arten von Derivaten haben Löslichkeiten in wässeriger Umgebung und Gewebe-Aufteilungskoeffizienten, die verschieden von denjenigen von VS sind.
Gemäß der Erfindung ist es den Anmeldern also gelungen, in einem einzigen Schritt (Antibiotikum + Reagens) auf einen Teil des spezifischen Antibiotikums einen Arm aufzupfropfen, der am Kettenende eine chemische Funktion besitzt, die danach mit Hilfe verschiedener synthetischer oder natürlicher Produkte (Aminosäure, Zucker, Proteine . . . ) modifiziert werden kann, und die daher zur Herstellung einer Reihe von Derivaten des Antibiotikums führen kann.
Daraus ergeben sich die folgenden Vorteile:
Die bei dem ersten Schritt (Oximation der Ketonfunktion) erhaltenen Produkte sind in wässeriger Umgebung stabil, im Gegensatz zu den mit Hilfe von Reagenzien vom Typ NH&sub2;-(CH&sub2;)x-X (Amine) erhaltenen Produkte.
Die Funktion am Kettenende kann außerdem leicht moduliert werden, wenn verschiedene oxoaminierte Derivate (NH&sub2;O- (CH&sub2;)n-NH&sub2;, NH&sub2;O-(CH&sub2;)n-COOH . . . .) verwendet werden.
Die Ausbeuten liegen nahe bei 100%, und parasitäre Reaktionen gibt es sozusagen nicht (< 5%).
Die chemische Funktion am Kettenende kann ebenfalls leicht modifiziert werden.
Die Anmelder haben in ihrer Anmeldung die Reaktion zur Bildung des aktivierten Esters des Virginiamycins S, sowie die Reaktion dieses Esters mit einem Makromolekül (BSA) angegeben, um die Leichtigkeit der Technik zu veranschaulichen.
Die Reaktion mit dem BSA wurde als Beispiel wiedergegeben und stellt keinen Selbstzweck dar. Die Möglichkeit, spezifische Antikörper herzustellen, beweist außerdem eindeutig die Stabilität der Bindung zwischen dem Antibiotikum und dem Trägerprotein.
Zum Vergleich ist anzumerken, daß die Verwendung von Derivaten vom Typ
NH&sub2;-(CH&sub2;)n-X mit X = COOH
= NH&sub2;
= OH
oder auch NH&sub4;Ac, NH&sub2;-NH&sub2; . . . . immer zu Gemischen aus mehreren Produkten, sowie zu nicht über 60% hinausgehenden Ausbeuten führt.
Die so erhaltenen Produkte erweisen sich im allgemeinen als wenig stabil in wässeriger Umgebung und regenerieren die Ausgangsreagenzien (Hydrolyse-Reaktion im Gleichgewicht).

Legende der Fig. 4

1. 22 ug (VS)&sub1;&sub5; BSA
2. 11 ug (VS)&sub1;&sub5; BSA
3. 7 ug (VS)&sub1;&sub5; BSA
4. 22 ug BSA
5. 15 ug Anti-VS-IgG.

Claims

1. Virginiamycin-Derivate, die der allgemeinen Formel

Z-X-R

entsprechen bei der Z ein Radikal von Virginiamycin vom Typ S oder vorn Typ M repräsentiert, das bei seiner reaktiven Carbonyl-Position über einen Arm X von Typ =N oder = N-O an einen Substituenten R gebunden ist, der ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Alkyl-COOH- Gruppe, eine -Alkyl-(α-NH&sub2;)COOH-Gruppe, eine -Alk-COON

-Gruppe, eine -Alk-CONH

-N&sub3;-Gruppe, eine (Alk-CONH)n-Prot-Gruppe, oder eine -(Alk-CONH)n- Rib-Gruppe repräsentiert, wobei n von der Anzahl der -NH&sub2; abhängt, die auf dem koppelnden Protein vorhanden sind, sowie die pharmazeutisch annehmbaren Salze, Ester und eventuellen Additionsverbindungen von Säuren.

2. Virginiamycin-Derivate gemäß Anspruch 1, bei denen Z das M-Virginiamycin-Radikal repräsentiert, das der Formel

entspricht, und das S-Virginiamycin-Radikal repräsentiert, das der Formel

entspricht, wobei X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben.

3. Verfahren zur Herstellung der Virginiamycin- Derivate gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung vom Typ NH&sub2;-R oder NH&sub2;-O-R, bei der R ein Wasserstoffatom, eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe, oder eine Alk-COOH-Gruppe repräsentiert, mit der oder den von Streptomyzeten erzeugten Ausgangsverbindungen bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 30ºC während 1 bis 12 Stunden, vorzugsweise während ungefähr 4 Stunden, in einer Pyridin-Umgebung reagieren läßt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene Produkt mit einer Verbindung vom Typ

bei einer Temperatur zwischen 10ºC und 30ºC, vorzugsweise von ungefähr 20ºC, während 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise während 24 Stunden, in Gegenwart von Triäthylamin reagieren läßt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene Produkt mit jeder Verbindung, die mit einer -NH&sub2;-Funktion versehen ist, reagieren läßt.

6. Pharmazeutisches Präparat, das die Derivate gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, oder die gemäß dem Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5 erhaltenen Derivate, einzeln oder miteinander kombiniert, enthält, eventuell in Kombination mit anderen kompatiblen wirksamen Prinzipien und mit pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanzen, Exzipienten und/oder Lösungsmitteln.

7. Verwendung der Derivate gemäß Anspruch 1, die ein Protein-Radikal enthalten, zur Erzeugung von spezifisch gegen das Antibiotikum gerichteten Antikörpern.