DE3211263A1

DE3211263A1 - Human-interferon verwandte peptide, antigene und antikoerper, sowie verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE3211263A1
Application number: DE19823211263
Authority: DE
Inventors: Kenichi Itano Tokushima Imagawa; Yasukazu Tokushima Ohmoto; Fumio Tokishima Shimizu
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-03-31
Filing date: 1982-03-26
Publication date: 1983-01-27
Also published as: CH652411A5; FR2503145B1; GB2102810A; US4474754A; SE8202012L; DE3211263C2; FR2503145A1; GB2102810B; SE457352B

Description

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OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. TOKYO/JAPAN

Human-Interferon verwandte Peptide, Antigene und Antikörper sowie Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft Human-Interferon-oO- und -ß verwandte Peptide und Derivate davon, Verfahren zur Herstellung von Antigenen und Antikörpern,, hergestellt unter Verwendung der Peptide, sowie immobilisierte Antikörper, die für eine Äffinitätschromatografie verwendet v/erden. Die Erfindung betrifft auch neue Verfahren zur Bestimmung von Human-Interferon-oL·- und -ß.

In der vorliegenden Erfindung werden Aminosäuren, Peptide, Schutzgruppen, aktive Gruppen, etc., durch Abkürzungen und Symbole nach den Regeln der IUPAC

- 2

(International Union of Pure and Applied Chemistry) und IUB (International Union of Biochemistry) bezeichnet oder durch Symbole, wie sie bekannt sind. Im Zusammenhang mit optischen Isomeren von Aminosäuren wird im allgemeinen die 1-Form (Lävo-Form) dieser Isomeren erwähnt, wenn nicht anders angegeben. Beispiele für solche Abkürzungen und Symbole sind die folgenden:

Leu:	Leucin
He:	Isoleucin
AIa:	Alanin
GIn:	Glutamin
Thr:	Threonin
His:	Histidin
Ser:	Serin
GIy:	Glycin
Asn:	Asparagin
Met:	Methionin
Phe:	Phenylalanin
Tyr:	Tyrosin
GIu:	G3 utaminsäure
Lys:	Lysin
Arg;	Arginin
Asp:	Aspartinsäure
Pro:	Prolin
OBzI:	Benzyloxygruppe
NHS:	N-Hydroxysuccinimidogruppe
Z:	Carbobenzoxygruppe
Su:	Succinimidogruppe
Tos:	p-Toluensulfonylgruppe
Boc:	t-Butoxykarbonylgruppe

— 3 —

Ein Interferon ist ein Glykoprotein oder ein Protein mit einer Antivirusaktivität, das von einer Zelle als Antwort auf eine Vireninfektion freigegeben wird und man nimmt an, dass man durch Virusinfektionen verursachte Krankheiten verhindern und heilen kann, indem man Interferon verabreicht. Interferon hat deshalb seit einigen Jahren grosses Interesse gefunden.

Human-Interferone werden derzeit in drei Typen unterteilt, nämlich in Interferon-cv (Leucocyten-Interferon, Lymphoplastoid-Interferon), Interferon-ß (Fibroblast-Interferon) und Interferon-/^ (Immun-Interferon). Man hat bisher jedoch noch keine Technik entwickelt, um Interferon zu reinigen und die jeweiligen Bestandteile in Form eines einzelnen Glykoproteins oder Proteins zu isolieren.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 und 2 Kurven, welche die Spezifität des Interferon- cü-Antikörpers, der nach der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, angeben.

Fig. 3 und 4 Kurven, die die Spezifität eines gemäss

der Erfindung erhaltenen Human-Interferonß-Antikörpers anzeigen,

Fig. 5 eine Kurve, in welcher die Beziehung zwischen der Konzentration der ersten

bis zur dreizehnten Peptidkette von

-Jk-

Human-Interferon-ß- und dem relativ gebundenen Prozentsatz (%) hinsichtlich eines erfindungsgemäss erhaltenen Human-Interferon-ß-Antikörpers dargestellt ist,

Fig. 6 bis 10 Kalibrierungskurven bei einem Fluoreszenzpolar isations-Immunoassay-Systems gemäss der vorliegenden Erfindung. 10

Eine Aufgabe der Erfindung ist es_r neue Antikörper zur Verfügung zu stellen, die bei der Technologie zur Reinigung und Trennung von Human-Interferon-oC/, insbesondere von Lymphoblastoid-Interferon oder von Human-Interferon-ß verwendet werden können.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Antigene zur Herstellung der Antikörper zur Verfügung zu stellen.
10

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zum Erhalten von Haptenen, die zur Herstellung der Antikörper geeignet sind,, zu zeigen.

Schliesslich ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung,, ein neues Verfahren zur Bestimmung vom Human-Interferon-od und -ß unter Verwendung der Antigene und Antikörper aufzuzeigen.

Es wurde gefunden, dass man neue Antigene aus Human-Interferon-χ oder -ß herstellen kann, unter Verwendung von neuem N-terminierten Peptid oder C-terminierten Peptid von Human-Lymphoblastoid-Interferon oder unter Verwendung eines neuen N-terminierten Peptids von Human-Interferon-ßj- wobei das neue N-terminierte Peptid und C-terminierte Peptid von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung neu synthetisiert wurden. Es wurde weiterhin gefunden, dass man neue Antikörper mit einer Spezifität gegenüber Human-Interferon-Oj oder -ß unter Verwendung dieser Antigene herstellen kann. Weiterhin

wurde gefunden, dass man das beabsichtigte Human-Interow oder -ß unter Verwendung der neuen Antikörper

~ Ό —

durch Affinitätschromatografie reinigen kann. Schliesslich wurde ein Assay für Human-Interferon-cO oder -ß unter Verwendung der neuen Antigene und der neuen Antikörper gefunden.
5

Die vorliegende Erfindung beruht auf den vorerwähnten neuen Erkenntnissen. Erfindungsgemäss kann man die Antikörper, die gegenüber Human-Interferon-cki oder -ß spezifisch sind und die man zum Reinigen für die Bestimmung von Interferon verwendet, vorteilhaft technisch herstellen, indem man synthetische Peptide, die in grossem Masse hergestellt werden können, verwendet. Durch die vorliegende Erfindung werden deshalb neue Technologien zum Reinigen und ein Assay-System für Human-Interferon-Gw und -ß gezeigt.

Das neue synthetische, erfindungsgemäss erhaltene Peptid ist ein synthetisches Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid der allgemeinen Formel (I)

R¹-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I)

ι
(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel

H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-, eine Gruppe der Formel H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala- oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Acn-Arg-Arg-Alabedeutet),

ein Peptid der allgemeinen Formel (II)

R -Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Thr-Asn-Leu-Gln-, eine Gruppe der Formel H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-, eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Glnbedeutet), und

ein Peptid der allgemeinen Formel (III) R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Phe-, eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe-, eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- oder eine Gruppe der Formel H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phebedeutet)„

Das neue synthetische Peptid ist somit ein Peptid entsprechend einem K-terminierten Peptid von Human-Lymphoplastoid-Interferon oder ein Derivat davon (ein Peptid der allgemeinen Formel (I)), ein Peptid entsprechend einem C-terminierten Peptid von Human-Lymphoblastoid-Interferon oder ein Derivat davon (ein Peptid der allgemeinen Formel (II)) ₇ oder ein Peptid entsprechend einem N-terminierten Peptid von Human-Interferon-ß oder ein Derivat davon (ein Peptid der allgemeinen Formel (III)) .

Jedes der vorerwähnten synthetischen Peptide kann unter Verwendung von auf dem Markt erhältlichen Aminosäuren in einfacher Weise hergestellt werden. Das synthetische

-321126

Sr -

Peptid hat eine spezifische Aminosäurenanordnung,· so dass man aus einem Peptid der allgemeinen Formel (I) oder aus einem Peptid der allgemeinen Formel (II) ein Antigen mit einer klaren Erkennungsstelle (cognition site) zur Identifizierung von Human-Interferon-oC, und aus einem Peptid der allgemeinen Formel (III) ein Antigen mit einer klaren Erkennungsstelle zur Identifizierung von Human-Interferon-ß, sowie einen Antikörper mit hoher Selektivität in grossem Massstab herstellen kann.

Weiterhin kann man einen Antiköprer hoher Spezifität gegen Human-Interferon-c^ oder -ß stabiler und in grossem Massstab unter Verwendung eines aus dem vorerwähnten synthetischen Peptid erhaltenen Antigens als ein Hapten gewinnen, als unter Verwendung eines natürlichen Interf eron-ίλ/ oder Interf eron-ß.

Man kann neue synthetische Peptide gemäss der Erfindung nach einer allgemein zur Synthese von Peptiden angewendeten Methode herstellen, beispielsweise nach einem Verfahren, das in "The Peptides", Band 1 (1966) von Schröder und Luhke, Academic Press, New York, USA, oder in "Peptide Gosei" (Synthesis of peptide) von Izumiya et al., Maruzen and Co., Ltd. (1975), beschrieben wird. Beispiele für solche Verfahren sind die Azidmethode, die Chloridmethode, die Säureanhydridmethode, die Mischanhydridmethode, die Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)-methode, Aktivestermethode (p-Nitrophenylestermethode, N-Hydroxysuccinimidesterinethode, Cyanomethylestermethode und dergleichen), eine Methode

unter Verwendung von Woodward-Reagenz K, die Carbodiimidazolmethode, Oxidations-Reduktions-Methode, DCC/Additiv /N-Hydroxy-S-norbornen-^, 3-dicarboxyimid (HONB), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu]_-7-Methode und dergleichen.

Bei der Durchführung der vorerwähnten Methoden kann man entweder eine Festphasen-Synthesemethode oder eine Flüssigphasen-Synthesemethode anwenden, wobei die Synthesemethode in der Flüssigphase bevorzugt wird.

Neue synthetische Peptide der vorliegenden Erfindung erhält man nach einer der vorerwähnten Synthesemethoden für Polypeptide, z.B. durch eine "stufenweise" Methode, bei welcher man eine Aminosäure schrittweise mit der endständigen Aminosäure in dem Peptid kondensiert oder indem man Peptide,die in verschiedene Fragmente aufgeteilt sind, kuppelt. Insbesondere kann man solche Peptide herstellen, indem man ein Ausgangsmaterial mit reaktiven Carboxylgruppen, entsprechend dem einen Fragment, das man bei der Aufteilung in zwei Teile an der gewünschten Position erhält,- mit einem anderen Ausgangsmaterial kondensiert, das reaktive Aminogruppen hat, die .dem anderen Fragement entsprechen. Wenn dieses kondensierte Produkt Schutzgruppen aufweist, kann man das gewünschte Peptid herstellen, indem man die Schutzgruppen in üblicher Weise entfernt. Verwendet man Aspartinsäure. Lysin oder /arginin bei der Reaktionsstufe zur Herstellung eines Peptids der vorliegenden Erfindung, so kann die Aminosäure vorteilhaft durch Schutzgruppen bei der letzten Stufe geschützt werden, wobei die

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■"■-"■3 21 H 6

gesamten Schutzgruppen dann von dem geschützten PoIypeptid, bei dem wenigstens eine konstitutionale Aminosäure-Restgruppe geschützt ist, entfernt werden.

Bei den Reaktionsschritten zur Synthese der erfindungsgemässen Peptide kann man jede funktioneile Gruppe, die nicht an der Synthesereaktion teilnimmt, mit einer Schutzgruppe versehen und die Schutzgruppe wird von der geschützten Gruppe nach der Umsetzung entfernt.

Weiterhin wird eine an der Reaktion teilnehmende funktionelle Gruppe im allgemeinen aktiviert. Verfahren zur Durchführung dieser Reaktionen sind bekannt und ebenso sind auch Reagentien, die man für diese Reaktionen anwenden kann, bekannt.

Als Schutzgruppen für Aminosäuren kommen beispielsweise eine Carbobenzoxygruppe, eine t-Butyloxycarbonylgruppe, eine t-Amyloxycarbonylgruppe, eine Isobornyloxycarbony!gruppe, eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, eine 2-Chlorobenzyloxycarbonylgruppe_r eine Adamantyloxycarbonylgruppe, eine Trifluoroacety!gruppe, eine Phthalylgruppe, eine Formy!gruppe, eine o-Nitrophenylsulfenylgruppe, eine Diphenylphosphinothioylgruppe und dergleichen in Frage.

Als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe kommt beispielsweise ein Alkylester (z.B. eine Estergruppe von Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl oder dergleichen), ein Benzylester, ein p-Nitrobenzylester, ein p-Methoxybenzylester, ein p-Chlorobenzylester, ein Benzhydrylester, Carbobenzoxyhydrazid, t-Butyloxycarbonylhydrazid,

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Tritylhydrazid und dergleichen in Frage«

Als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arginin kommt beispielsweise eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe, eine p-Methoxybenzolsulfonylgruppe, eine Carbobenzoxygrbppe, eine Isobornyloxycarbonylgruppe_f eine Adamantyloxycarbonylgruppe und dergleichen in Frage. Weiterhin kann die Guanidinogruppe auch in Form eines Salzes mit einer geeigneten Säure geschützt werden, z.B. mit Benzolsulfonsäuren Toluolsulfonsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure.

Die Hydroxygruppe von Threonin und von Serin muss z.B. erforderlichenfalls durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Geeignete Schutzgruppen für eine Veresterung sind solche mit Niedrigalkanoylgruppen, wie eine Äcetylgruppe, eine Aroy!gruppe, eine Benzoy!gruppe, eine Gruppe, die sich von einer Karbonsäure ableitet, wie eine Benzoyloxycarbony!gruppe, eine Ethyloxycarbonylgruppe und dergleichen. Als Schutzgruppe für eine Veretherung ist beispielsweise eine Benzylgruppe, eine t-Hydropyranylgruppe oder eine t-Butylgruppe geeignet.

Methionin kann in Form des Sulfoxids geschützt werden.

Als aktivierte Carboxylgruppe kommt beispielsweise ein entsprechendes Säurechlorid, Säureanhydrid oder Mischanhydrid oder ein Azid, ein aktivierter Ester (ein Ester von Methylalkohol, Ethylalkohol_r Benzylalkohol, Pentachlorophenol, p-Nitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid und dergleichen) in Frage.

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-Vl-

Die Peptidbindungsbildungsreaktion kann durchgeführt werden in Gegenwart eines Kondensierungsmittels, z.B. eines Carbodiimidreagenzes, wie Dicyclohexylcarbodiimid, Carbodiimidazol oder dergleichen, oder von Tetraethylpyrophosphit.

Neue synthetische Peptide der vorliegenden Erfindung können insbesondere nach einer der nachfolgenden Methoden A bis C hergestellt werden.
10

METHODE A

Verfahren_zur_Herstellun2_eines_Peptids_der_all2emei-15

A-(I): Wenn R ein Wasserstoffatom bedeutet

A-AIa-B (2)

, H-GIn-OH (3)

A-Ala-Gln-OH (4)

H-Äla-Gln-OH (5)

A-Leu-B (6)

A-Leu-Ala-Gln-OH (7)

H-Leu-Ala-Gln-OH (8)

A-Leu-B (6)

A-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (9)

H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

J, A-IIe-B A-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

H-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

j A-Leu-B A-Leu-Ilc-Leu-Lcu-Ala-Gln-OH

ν
H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

(1	0)	4)
(1	D
(1	2)
(1	3)
(6)
(1

A-(II): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Alabedeutet.

A-Arg-B

J₇ H-AIa-B C

A-Arg-Ala-B

H-Arg-Ala-B C

A-Arg-B CC

A-Arg-Arg-Ala-3 (16) (17)

(18)

(19) (16) (20)

- 14 -

32T1263

- V4 -

C C

H-Arg-Arg-Ala-B A-Asn-B C C

A-Asn-Arg-Arg-Ala-B

H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH ν
A-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

I < (36)*

A-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Jila-Gln-OH

H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

(21) (22)

(23)

(24) (15) (25)

(26)

(27)

(28)

/worin (36)* durch die folgende Stufe hergestellt wird

A-Leu-B

H-GIy-B A-Leu-Gly-B

H-Leu-Gly-B

j A-Ser-B A-Ser-Leu-Gly-B

H-Ser-Leu-Gly-B

A-Thr-His-B A-Thr-His-Ser-Leu-Gly-B

(6)

(29) (30)

(31) (32) (33)

(34) (35) <36)*7

- 15 -

A-(III): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Alabedeutet.

A-Pro-B

H-GIn-B A-Pro-Gln-B

H-Pro-Gln-B

A-Leu-B-A-Leu-Pro-Gln-B

H-Leu-Pro-Gln-B

j A-Asp-B

Ψ A-Asp-Leu-Pro-Gln-B

Ä-Äsp-Leu-Pro-Gln-B

H-Asp-Leu-Pro-Gln-B

A-Ser-B A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B

H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-

Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg~Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala~Gln-OfI

H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Lcu-Leu-Ala-Gln-OH

(37) (38) (39)

(40)

(6)

(41)

(42) (43) (44)

(45)

(46) (32) (47)

(28) (48)

(49)

- 16 -

A-(IV): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Asp-Leu~Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu~Gly-Asn-Arg-Arg- AIa- bedeutet.

A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (47)

Jei

H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (50)

A-Tyr-B (51)

A-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (52) H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-

Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (28)

Ä-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-

Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (53)

H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (54)

Bei den vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV) ist A eine Schutzgruppe für die Aminogruppe, B_ eine aktive Gruppe für die Hydroxygr-ppe oder Carboxylgruppe, C eine Schutzgruppe für die Guanidinogruppe des Arginins und D eine Schutzgruppe für die Aspartinsäure.

Bei dem vorerwähnten Verfahren wird als Gruppe A eine t-Butoxycarbonylgruppe (Boc), eine Carbobenzoy!gruppe (Z) oder eine p-Methoxybenzyloxycarbony!gruppe oder dergleichen bevorzugt. Als aktive Gruppe der Carbony!gruppe, dargestellt durch B wird beispielsweise ein aktiver Ester, wie eine N-Hydroxysuccinimidogruppe, ein Mischsäureanhydrid, wie eine Isobutyloxycarbony!gruppe, eine

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Azidgruppe und dergleichen,, bevorzugt, und als Gruppe C wird eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe und dergleichen bevorzugt, während als Gruppe D eine Benzyloxygruppe bevorzugt wird.
5

Bei der vorerwähnten Methode A-(I) kann die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden» Als Lösungsmittel kann jedes verwendet werden,, das bei einer Peptidkondensationsreaktion verwendet werden kann, z.B. wasserfreies oder wasserhaltiges Dimethylformamid, Dimethyls-lfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, N-Methy!pyrrolidon, Hexamethylphosphotriamid oder Mischungen dieser Lö-5 sungsmittel.

Das Verhältnis, in dem die Aminosäure (3) mit einer Aminosäure (2) umgesetzt wird, ist nicht besonders begrenzt und kann in einem weiten Bereich liegen. Im allgemeinen verwendet man eine Äquivalente bis zur 5-fachen Menge und vorzugsweise eine Äquivalente bis zur 1,5-fachen Menge.

Die Reaktionstemperatur wird so ausgewählt wie sie bei einer Peptidbindungsbildungsreaktion geeignet ist. Sie liegt im allgemeinen bei -40 bis etwa 60⁰C und vorzugsweise bei etwa -20 bis etwa 4 0⁰C. Die Umsetzung wird im allgemeinen einige Minuten bis etwa 3 0 Stunden durchgeführt.
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Bei der vorerwähnten Methode A-(I) kann die Umsetzung

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eines Peptids (5) mit einer Aminosäure (6), die Umsetzung eines Peptids (8) mit einer Aminosäure (6), die Umsetzung eines Peptids (10) mit einer Aminosäure (11) und die Umsetzung eines Peptids (13) mit einer Aminosäure (6) in ähnlicher Weise wie die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) erfolgen.

Bei der vorerwähnten Methode A-(II) kann die Umsetzung einer Aminosäure (16) mit einer Aminosäure (17)/ die Umsetzung eines Peptids (19) mit einer Aminosäure (16), die Umsetzung eines Peptids (21) mit einer Aminosäure (22), die Umsetzung eines Peptids (24) mit einem Peptid (15), die Umsetzung eines Peptids (26) mit einem Peptid (36), die Umsetzung einer Aminosäure (6) mit einer Aminosäure (29), die Umsetzung eines Peptids (31) mit einer Aminosäure (32) und die Umsetzung eines Peptids (34) mit einem Peptid (35) in ähnlicher Weise wie die vorerwähnte Umsetzung erfolgen.

Bei der vorerwähnten Methode A-(III) kann die Umsetzung einer Aminosäure (37) mit einer Aminosäure (38) _c die Umsetzung eines Peptids (40) mit einer Aminosäure (6), die -Umsetzung eines Peptids (42) mit einer Aminosäure (43), die Umsetzung eines Peptids (46) mit einer Aminosäure (32) und die Umsetzung eines Peptids (47) mit einem Peptid (28) sowie bei der vorerwähnten Methode A-(IV) die Umsetzung eines Peptids (50) mit einer Aminosäure (51), die Umsetzung eines Peptids (52) mit einem Peptid (28) in ähnlicher Weise durchgeführt werden wie bei der vorerwähnten Umsetzung.

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Die Entfernung von Schutzgruppen von A bei den Peptiden (4), (7), (9), (12), (14), (18), (20), (25), (27), (30), (33), (39), (41), (45), (47), (48) und (53), wie sie nach den vorerwähnten Reaktionen erhalten werden, wird in bekannter Weise durchgeführt» Eine bekannte Entfernungsreaktion ist beispielsweise die reduktive Methode (eine Hydrierung unter Verwendung von Palladium, Palladiumschwarz und dergleichen als Katalysator; eine Reduktion unter Verwendung von metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak), eine Acidolyse (Acidolyse unter Verwendung von Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoff, Mothansulfonsäure, Bromwasserstoff oder dergleichen als starke Säure) und dergleichen.

Die vorerwähnte Hydrierung unter Verwendung eines Katalysators kann unter 1 Atmosphäre Wasserstoff bei 0 bis 40⁰C durchgeführt werden. Der Katalysator wird im allgemeinen in einer Menge von 100 mg bis 1 g angewendet und die Umsetzung wird im allgemeinen in 1 bis 48 Stun-0 den beendet.

Die vorerwähnte Acidolyse kann in Abwesenheit eines Lösungsmittels bei 0 bis 30⁰C und vorzugsweise 0 bis 20⁰C. durchgeführt werden und die Umsetzung ist im allcremeinen in 15 Minuten bis 1 Stunde beendet. Die Säure kann in einer 5- bis 10-fachen Menge, bezogen auf die Menge des Ausgangsmaterials, verwendet werden.

Bei der vorerwähnten Reduktion unter Verwendung von metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak wird das metallische Natrium in einer solchen Menge angewendet,

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dass die Farbe des Reaktionsgemisches ständig während 30 Sekunden bis 10 Minuten blau bleibt. Die Reduktion wird im allgemeinen bei -40 bis -70⁰C durchgeführt.

Die Schutzgruppe von C bei einem Peptid (23) und die Schutzgruppe von D bei einem Peptid (45) kann auch nach der vorerwähnten reduktiven Methode entfernt werden.

Die Aminosäuren (2), (6), (11), (16), (22), (32), (37),

(43) und (51), die für die vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV) verwendet werden, können bekannte, im Handel erhältliche Produkte sein. Peptide (18), (23), (35), (36), (44), (47) und (52)', wie sie bei den vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV) verwendet werden, können gleichfalls im Handel erhältliche Produkte sein oder solche, die man durch die Mischanhydridmethode oder durch die Azidbildungsmethode gewinnt. Die Mischanhydridmethode wird in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart einer basischen Verbindung unter Verwendung einer Alkylhalogenkarbonsäure durchgeführt. Geeignete Alkylhalogenkarbonsäuren sind beispielsweise Methylchloroformiat, Methylbromoformiat, Ethylchloroformiat, Ethylbromoformiat, Isobutylchloroformiat und dergleichen. Als basische Verbindung kommen beispielsweise organische Basen, wie Triethylamin, Trimethylamin, Pyridin, Dimethylanilin, N-Methylmorpholin, 1,5-Diazabicyclo/4,3,07nonen-5 (DBN), 1,5-Diazabicyclo/S,4,0?- undecen-5 (DBU), 1, 4-Diazabicyclo/2_jr 2, 2_7octan (DABCO) und dergleichen in Frage, sowie auch anorganische basisehe Verbindungen, wie Kaliumkarbonat, Natriumkarbonat, Kaliumhydrogenkarbonat, Natriumhydrogenkarbonat und

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dergleichen. Das bei dieser Umsetzung verwendete Lösungsmittel kann jedes Lösungsmittel sein, wie es bei einer Mischanhydridreakion verwendet wird. Beispiele hierfür sind halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan und dergleichen; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, Xylol und dergleichen; Ether, wie Diethylether, Tetrahydrofuran, Dimethoxyethan und dergleichen; Ester, wie Methylacetet, Ethylacetat und dergleichen; aprotisehe polare Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid_r Dimethylsulfoxid, Hexamethylphosphortriamid und dergleichen. Die Umsetzung wird bei -20 bis 100⁰C und vorzugsweise -20 bis 50⁰C durchgeführt und ist im allgemeinen in 5 Minuten bis 10 Stunden, vorzugsweise 5 Minuten bis 2 Stunden, beendet.

Bei der Äzidbildungsroaktion wird zunächst eine Karbonsäure mit einem Alkohol, wie Methylalkohol, Ethylalkohol, Benzylalkohol und dergleichen, aktiviert und die aktivierte Carboxylgruppe wird dann mit Hydrazinhydrat in einem geeigneten Lösungsmittel umgesetzt= Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Dioxan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Mischungen dieser Lösungsmittel. Hydrazinhydrat wird im allgemeinen in einer 5- bis 20-fachan molaren Menge und vorzugsweise 5- bis 10-fachen molaren Menge, bezogen auf die Menge der aktivierten Carboxylgruppe, angewendet. Die Umsetzung wird im allgemeinen unterhalb 50⁰C und vorzugsweise bei -20 bis 30⁰C durchgeführt. Auf diese Weise wird eine Verbindung erhalten, in welcher die CarboxyIgr-ppe der endständigen Aminosäure durch Hydrazin (Hydrazinderivat) substituiert

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-Vi-

ist. Eine Verbindung, bei welcher die Carboxylgruppe der endständigen Aminosäure durch ein Azid substituiert ist, erhält man, indem man in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart einer Säure das vorerwähnte Hydrazinderivat mit einer Salpetrigsäureverbindung umsetzt. Als Säure wird im allgemeinen Salzsäure verwemdet. Geeignete Lösungsmittel sind Dioxan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Mischungen dieser Lösungsmittel. Als Salpetrigsäureverbindung kommen Natriumnitrit, Isoamylnitrit, Nitrosylchlorid und dergleichen in Frage. Die Salpetrigsäureverbindung wird im allgemeinen in äquimolarer bis zur zweifachen molaren Menge und vorzugsweise in äquimolarer bis zur 1,5-fachen molaren Menge, bezogen auf das Hydrazinderivat, angewendet. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei -20 bis 0⁰C und vorzugsweise bei -20 bis 10⁰C durchgeführt und ist in etwa 5 bis 10 Minuten beendet.

23 -

METHODE B

Verfahren zur Herstellung eines Pegtids der allgemeinen Formel (II)

B-(I): Wenn R ein Wasserstoffatom ist. E

A-Lys-B

4/ H-GIu-G E F

I I

A-Lys-Glu-G

H-Lys-Glu-OH A-Ser-B

A-Ser-Lys-Glu-OH

E ν ι

H-Ser-Lys-Glu-OH

A-Arg-B C. E A-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

I ?

H-Arg-Ser-Lys-Glu-OH A-Ser-Leu-B E A-Ser-Leu-Arg--Ser-Lys~Glu-OH (55) (56) (57)

(58) (59) (60) (61) (62) (63)

(64) (65)*

(66)

- 24 -

33

E H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

F A-GIu-B

A-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (67) (68) (69) (70)

/worin Peptid (65)* durch die folgende Stufe hergestellt wird:

A-Ser-B

J, H-Leu-G A-Ser-Leu-G

A-Ser-Leu-B (59) (98) (99)

(65)*7

B-(II): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Thr-Asn-Leu-GInbedeutet.

H-GIn-G

A-Leu-B A-Leu-Gln-G

jer

H-Leu-Gln-G

A-Asn-B A-Asn-Leu-Gln-G (71) (72) (73)

(74) (75) (76)

- 25 -

10

H-Asn-Leu-Gln-G (77)

A-Thr-B (78)

A-Thr-Asn-Leu-Gln-G (79)

A-Thr-Asn-Leu~Gln-B E (80),

H-Glu-Ser-Leu-Ärg-Ser-Lys-Glu-OH (81)

A-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-

E
Lys-Glu-OH (82)

H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (83)

B-(III): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Ser-Leu-Ser-Thr~Asn--Leu-Ginbedeutet.

A-Leu-B

I H-Ser-G ν

Ä-Lcu-Ser-G

H-Leu-Ser-G

A-Ser-B A-Ser-Leu-Ser-G

A-Ser-Leu-Ser-B

H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-•Lys-Glu-OH

A-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH
E

(72) (84) (85)

(86) (59) (87)

(88) (89)

(90)

- 26 -

H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

(91)

B-(IV): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Glnbedeutet.

A-Ser-Leu-Ser-G

H-Ser-Leu-Ser-G

A-Tyr-B A-Tyr-Ser-Leu-Ser-G

A-Tyr-Ser-Leu-Ser-B

H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

A-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

(87)

(92) (93) (94) (95) (89)

(96) (97)

Bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) bedeutet E eine Schutzgruppe für eine £-7uninogruppe des Lysins , F eine Schutzgruppe für eine ^Carboxylgruppe der Glutaminsäure und G eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe und A, B und C haben die vorher angegebenen Bedeutungen.

- 27 -

Bei den vorerwähnten Methoden wird als Gruppe E eine Tosylgruppe oder dergleichen bevorzugt, als Gruppe F eine Benzyloxygruppe oder dergleichen und als Gruppe G bevorzugt man eine Alkylester-Restgruppe, t-Butoxycarbonyl und dergleichen. Bei der vorerwähnten Methode B-(I) erfolgt die Umsetzung der Aminosäure (55) mit einer Aminosäure (56), die Umsetzung eines Peptids (58) mit einer Aminosäure (59) , die Umsetzung eines Peptids (61) mit einer Aminosäure (62), die Umsetzung des Peptids (64) mit einer Aminosäure (65), die Umsetzung eines Peptids (67) mit einer Aminosäure (68) und die Umsetzung einer Aminosäure (59) mit einer Aminosäure (98), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(II) die Umsetzung einer Aminosäure (71) mit einer Aminosäure (72), die Umsetzung eines Peptids (74) mit einer Aminosäure (75), die Umsetzung eines Peptids (77) mit einer Aminosäure (78) und die Umsetzung eines Peptids (80) mit einem Peptid (81), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(III) die Umsetzung einer Aminosäure (72) mit einer Aminosäure (84), die Umsetzung eines Peptids (86) mit einer Aminosäure (59) und die Umsetzung eines Peptids (88) mit einem Peptid (89), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(IV) die Umsetzung eines Peptids (92) mit einer Aminosäure (93) und die Umsetzung eines Peptids (95) mit einem Peptid (89) in ähnlieher Weise wie bei der Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) bei der vorerwähnten Methode A.

Die Entfernungsreaktion der Schutzgruppe A oder C von den Peptiden, die man nach den vorerwähnten Reaktionen erhält, wird in ähnlicher Weise durchgeführt wie dies für die vorerwähnte Methode A erklärt wurde. Weiterhin

- 28 -

kann man die Entfernungsreaktion der Schutzgruppen E, F und G in ähnlicher Weise durchführen, wie dies für die Entfernung der Schutzgruppe C vorher erläutert
wurde.
5

Aminosäuren (55), (56), (59), (62), (68), (71), (72), (75), (78), (84), (93) und (98), wie sie bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) verwendet werden, können bekannte, im Handel erhältliche Produkte sein . Peptide (65) , (80) , (88) und (95), wie sie bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) verwendet werden, können ebenfalls bekannte, im Handel erhältliche Produkte sein oder solche, die man nach der Mischanhydridmethode*

Peptid (81), das bei der vorerwähnten Methode B-(II) erwähnt wird, kann man erhalten, indem man die Schutzgruppen A und F von Peptid (69) entfernt, und das
Peptid (89), das bei der vorerwähnten Methode B-(III) verwendet wird, erhält man durch Entfernen der Schutzgruppe A vom Peptid (82) . Die Entfernungsreaktionen für die Schutzgruppen können nach den vorerwähnten Methoden erfolgen.

* oder der Azidmethode erhält. Solche Methoden sind
bereits in der vorerwähnten Methode A erläutert
worden.

- 29 -

,2-9 -

METHODE C

nen Formel _(IIi!

C-(I): Wenn R ein Wasserstoffatom bedeutet.

A-Leu-Gln-B

C H~Arg-Ser-Ser-OH

C A-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

H-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (101)* (102) (103) (104)

/worin das Peptid (101)* durch die folgende Stufe hergestellt wird:

A-Ser-B

H-Ser-OR^ ν 4 A-Ser-Ser~OR

H-Ser-Ser-OR* C

^ A-Arg-B C

A-Arg-Ser-Ser-OR^/: C

A-Arg-SGr-Ser-OH

C
H-Arg-Ser-Ser-OH (121) (122) (123) (124) (125) (126) (127) (101)*/

- 30

C-(II): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Phe- bedeutet.

H~.Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (105)

A-Phe-B (106)

A-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (107)

H-Pne-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (108)

C-(III): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe™ bedeutet.

H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH A-Leu-Gly-B

A-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

(10)
(110) (111) (112)

C-(IV): Wenn R eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phebedeutet.

H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (113)

A-Tyr-Asn-Leu-B (114)*

C A-Tyr-Äsn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (115)

0 H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (116)

- 31 -

/worin das Peptid (114)* durch folgende Stufe hergestellt wird:

A-Asn-B (128)

ι H-Leu-OR⁴ (12)

A-Asn-Leu-OR⁴ (130)

H-Asn-Leu-OR⁴ (131)

A-Tyr-B (132)

A-Tyr-Asn-Leu-OR⁴ (133)

A-Tyr-Asn-Leu-OH (134)

A-Tyr-Asn-Leu-B (114)*/

C- (V) : Wenn R eine Gruppe der Formel H-Met-Ser-Tyr-Asn-

Leu-Leu-Gly-Phe- bedeutet.
20

C H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (117)

I^ A-Met-Ser-B (118)

A-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser~OH (119)

H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (120)

- 32 -

Bei den vorerwähnten Methoden C-(I) bis C-(V) bedeutet

R eine Niedrigalkylgruppe und A, B und C_ haben die vorher angegebenen Bedeutungen.

Die Umsetzung eines Peptids (100) mit einem Peptid (101), eines Peptids (105) mit einer Aminosäure (106), eines Peptids (109) mit einem Peptid (110), eines Peptids (113) mit einem Peptid (114), eines Peptids (117) mit einem Peptid (118), einer Aminosäure (121) mit einer Aminosäure (122), eines Peptids (124) mit einer Aminosäure (125), einer Aminosäure (128) mit einer Aminosäure (129), und eines Peptids (131) mit einer Aminosäure (132) kann in ähnlicher Weise erfolgen wie die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) bei der vorerwähnten Methode A.

• Die Entfernungsreaktion der Schutzgruppen A oder C von den jeweiligen Peptiden, wie man sie bei den vorerwähnten Reaktionen erhält, kann in ähnlicher Weise erfolgen, wie dies für die Methode A schon erläutert wurde.

Die Hydrolyse eines Peptids (126) oder (133) zur Herstellung der Peptide (127) oder (134) kann in Gegenwart einer Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, oder von Alkali, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, in einem Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Dioxan, erfolgen. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei 20 bis 50°C während 30 Minuten bis 3 Stunden durchgeführt.

Das bei der vorerwähnten Methode C-(II) verwendete

- 33 -

Peptid (105) erhält man, indem man die Schutzgruppe A vom Peptid (102) entfernt. In gleicher Weise kann man das bei der Methode C-(III) verwendete Peptid (109) durch Entfernen der Schutzgruppe A vom Peptid (107) und das Peptid (113), wie es bei der Methode C-(IV) verwendet wird, durch Entfernen der Schutzgruppe A von dem Peptid (111) herstellen, und das Peptid (117)_f das bei der Methode C-(V) verwendet wird, erhält man durch Entfernen der Schutzgruppe A von dem Peptid (115). Die Entfernungsreaktion der Schutzgruppen wird in ähnlicher Weise durchgeführt, wie schon vorher dargelegt.

Bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Peptids (114) aus dem Peptid (134) sind beispielsweise die Mischsäureanhydridmethode, Die Azidbxldungsmethode, wie dies auch für die Methode A schon erwähnt wurde.

Die erfindungsgemäss nach den vorerwähnten Methoden erhaltenen Peptide können in üblicher Weise aus den Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt werden, z.B. durch Extraktion, Teilung und Säulenchromatografie.

Wie erwähnt, erhält man nach der vorliegenden Erfindung synthetische Peptide, nämlich N-terminierte Peptide von Human-Lymphoblastoid-Interferon, C-terminierte Peptide von Human-Lymphoblastoid-Interferon, N-terminierte Peptide von Human-Interferon-ß und Derivate davon.

Die erhaltenen synthetischen Peptide können als markierte

- 34 -

Antigene für eine Radio-Immuno-Assay (RIA) oder bei einer Fluores-zenzpolarisations-Immuno-Assay verwendet werden, indem

man ein übliches Markierungsmittel, z.B. radioaktives

125 131
Jod, wie J oder J, oder ein Fiuorochrom,- wie Fluoreszinisothiocyanat (FITC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), ein substituiertes Rhodaminisothiocyanat (XRITC), Rhodamin B-isothiocyanat, Dichlorotriazin fluoreszein (DTAF), ein Enzym oder dergleichen, einführt.

Die Einführung von radioaktivem Jod erfolgt, indem man ein Peptid mit einer Tyrosylgruppe unter den synthetischen Peptiden, die vorher erwähnt wurden, mit einer üblichen Jodierungsmethode behandelt, z.B. durch eine oxidative Jodierung unter Verwendung von Chloramin T (cf. W. M. Hunter und F. C. Greenwood: Nature, 194, •Seite 495 (1962); Biochem. J., 8_9, Seite 114 (1963)). Diese Jodierungsmethode wird in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. 0,2M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) in Gegenwart von Chloramin T bei Raumtemperatur während 10 bis 3 0 Sekunden durchgeführt. Das radioaktive Jod kann in einer Menge von etwa 1 Millicurie pro 1 Nanomol Tyrosinmolekül, das in dem Peptid enthalten ist, zusammen mit 10 bis 100 Nanomolen Chloramin T verwendet werden, wenn ein Atom des radioaktiven Jods in das Tyrosinmolekül eingeführt wird. Werden zwei Atoma an radioaktivem Jod in das Tyrosinmolekül eingeführt, dann kann man 2 Millicurie radioaktives Jod pro 1 Nanomol des in dem Peptid enthaltenen Tyrosinmoleküls einführen, zusammen mit 10 bis 100 Nanomolen Chloramin T.

- 35 -

- «as -

Das mit dem radioaktiven Jod markierte Peptid kann in üblicher Weise isoliert und gereinigt werden, z.B. durch Extraktion, Teilung, Säulenchromatografie oder Dialyse etc.. Erforderlichenfalls kann man das markierte Peptid im lyophilisierten Zustand aufbewahren.

Ein mit einem Fluorochrom markiertes Peptid erhält man, indem man das Fluorochrom in die endstänidge oder Aminogruppe des Moleküls des synthetischen Peptids in einer geeigneten Pufferlösung und unter alakalischen Bedingungen, vorzugsweise bei pH 8 bis 12, einführt. Die Pufferlösung ist nicht besonders beschränkt und kann in einem weiten Bereich gewählt werden, soweit der pH der Pufferlösung sich im obigen Bereich bewegt.

Als Pufferlösung kommen beispielsweise in Frage eine ■Boratpufferlösung, eine Bikarbonatpufferlösung, eine Glyzinpufferlösung, eine Barbitalpufferlösung, eine Trispufferlösung, eine Ammedxolpufferlösung, Ringer's-Pufferlösung und dergleichen. Falls das Peptid und/oder Fluorochrom in der Pufferlösung nicht löslich ist, kann man die Markierungsreaktion auch durch Zugabe eines gemeinsamen Lösungsmittels, z.B. Methanol/ Ethanol, Aceton, Dimethylformamid und dergleichen, zu dem Reaktionssystem durchführen.

Die Markierungsreaktion verläuft im allgemeinen bei etwa 0 bis 4 0°C und vorzugsweise 0 bis 20⁰C und ist in einigen Minuten bis etwa 48 Stunden beendet. 30

Es besteht keine besondere Beschränkung hinsichtlich

36 -

SA

- 34 -

der Menge des Fluorochroms. Dieses Verhältnis kann in einem weiten Bereich gewählt werden und im allgemeinen verwendet man die 1- bis 10-fache molare Menge und vorzugsweise 2- bis 4-fache molare Menge des Fluorochroms pro eine in dem Peptid enthaltene Aminogruppe. Das so mit einem Fluorochrom markierte Peptid kann isoliert und gereinigt und gelagert werden, in ähnlicher Weise wie ein mit einem radioaktiven Jod markiertes Peptid.

Bisher sind Interferone indirekt durch biologische Messmethoden auf Basis ihrer physiologischen Aktivität bestimmt worden (Finter, N. B. in Interferon and Interferon Inducers, herausgegeben von Finter, N. B., Seiten 135 bis 170, Nord-Holland, Amsterdam 1973). Die biologische Messmethode erforderte lebende Zellen und lebende Viren, welche die Zellen infizieren können, und die " Wirksamkeit der Interferone wurde untersucht indem man direkt oder indirekt das Ausmass der getötigen Zellen, verursacht durch die Vireninfektion, mass. Eine solche biologische Messung ergibt jedoch unstabile und streuende Ergebnisse, weil die bei dieser Methode verwendeten Materialien lebende Organismen sind. Wenn ausserdem irgendeine Substanz mit Antivirenaktivität ausser den zu untersuchenden Interferonen in den Testproben vorhanden ist, dann werden solche biologischen Messmethoden zur Bestimmung von Interferonen bedeutungslos. Weiterhin kann man mit diesen biologischen Messmethoden keine selektive Bestimmung von Human-lnterferon-ou oder Human-Interferon-ß durchführen. Darüber hinaus fordert eine biologische Messmethode einige Tage Zeit, um anhand der ablaufenden komplizierten Verfahrensweisen

37 -

Ergebnisse zu erzielen und eine solche Methode entspricht nicht den Erfordernissen der Medizin.

Zum Unterschied von einer solchen biologischen Messmethode verläuft die neue Methode zur Bestimmung von Human-Interferon gemäss der Erfindung, bei welcher man eine Radio-Immuno-Assay (RIA) oder eine Fluoreszenzpolarisations-Imrnuno-Assay unter Verwendung von markierten Antigenen (markierten Peptiden) anwendet, 0 Human-Interf eron-3./ oder Human-Interferon-ß selektiv, einfach und schnell und mit grosser Genauigkeit»

Eine Fluoreszenzpolarisations-Ummuno-Assay ist bekannt, jedoch war nicht bekannt, dass man eine solche Methode zur qualitativen Bestimmung von Interferonen anwenden kann. Dies beruht auf der Tatsache, dass ein gereinig-•tes, mit einem Fluorochrom markiertes Interferon bisher praktisch nicht hergestellt wurde und wenn man ein derartig gereinigtes, mit einem Fluorochrom markiertes Interferon hätte erhalten können, hätte eine solche markierte Substanz mit einem grossen Molekulargewicht nur eine kleine Veränderung hinsichtlich des Polarisationsgrades (P-Wert) ergeben und eine befriedigende empfindliche, qualitative Bestimmung wäre nicht möglich gewesen.

Dagegen kann mann mit den erfindungsgemässen, mit einem Fluorochrom markierten Peptiden eine grosse Änderung des Polarisationsgrades (P-Wert) erzielen und die erfindungsgemässen fluorochrommarkierten Peptide sind brauchbare markierte Substanzen zur Bestimmung von

- 38 -

Human-Interferon-cO oder Human-Interferon-ß und zwar mit einer befriedigenden qualitativen Genauigkeit. Aufgrund der Entwicklung von mit Fluorochrom entwickelten Peptiden wird eine qualitative Bestimmung von Human-Interferon-CV oder Human-Interferon-ß unter Anwendung der vorerwähnten Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay möglich.

Verfahren zur Bestimmung von Interferon durch eine Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay werden nachfolgend beschrieben.

Die Reihenfolge der Messverfahren und Operationen ist dabei nicht grundsätzlich von solchen verschieden, wie sie bei einer Fluoreszenzpolarisations-Immuno-Assay üblicherweise angewendet werden.

Das Verfahren zur Bestimmung von Interferqnen gemäss der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von Standard-Antigen

und der entsprechenden Antikörper sowie von mit Fluorochrom markierten Peptiden durchgeführt werden. Als Standardantigen kann ein natives Human-Interferonoder ein natives Human-Interferon-ß oder ein Peptid der allgemeinen Formeln (I) bis (III) mit einem Antigenitätsäquivalent gegenüber Human-Interferon-oC/ oder -ß verwendet werden. Verwendet man das Peptid, dann kann die X-iirksamkeit von Interferon in einer unbekannten Probe in einfacher Weise bestimmt werden, wenn man die Kreuzreaktivität von Human-Interferon-oO oder -ß und des Peptids gegen den Antikörper vor dem Test kennt.

- 39 -

3H

Berücksichtigt man die Mühen, Kosten und die Arbeitsweise, wie sie zur Erzielung eines gereinigten Produktes bei einem Standardantigen erforderlich sind, dann liegen die Vorteile bei der Verwendung des Peptids auf der Hand.

Als Antikörper zu dem Interferon, wie es bei der erfindungsgemässen Assay-Methode verwendet wird, kann jeder Antikörper gegenüber Human-Interferon--^' oder -ß oder ein Peptid der allgemeinen Formeln (I) bis (III) verwendet werden und vorzugsweise wird, wie später noch erklärt wird, ein Antikörper als Plapten verwendet, der eine hohe Spezifität gegenüber Human-Interferon-oO oder -ß aufweist und der unter Verwendung des Peptids der allgemeinen Formeln (I) bis (III) hergestellt wurde.

'Die Reihenfolge der Messverfahren ist so, dass zuerst eine Reihe von verdünnten Proben von Standardantigen durch Verdünnung des Antigens mit einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt wird. Hinsichtlich des Verdünnungslösungsmittels besteht keine besondere Begrenzung und man kann hier jeden geeigneten Typ verwenden. Insbesondere kann man eine Pufferlösung mit einem pH von 5 bis 10 und vorzugsweise 7 bis 8, z.B. eine Boratpufferlösung, eine Tris-HCl-Pufferlösung, eine Phosphatpufferlösung, eine Essigsäurepufferlösung, eine Zitronensäure-Phosphorsäure-Pufferlösung, eine Glyzinpufferlösung und dergleichen, verwenden. Um eine Adsorption zu inhibieren, kann man zu der Verdünnungslösung Rinderserumalbumin oder Natriumazid zugeben und als Konservierungsmittel EDTA, Natriumchlorid und dergleichen.

- 40 -

Dann gibt man vorbestimmte Mengen an Antikörper und vorbestimmte Mengen an mit einem Fluorochrom markierten Peptid zu den jeweiligen Proben der Verdünnungsserien des Standardantigens, wobei man jetzt Proben erhält, die man dann bei 0 bis 37⁰C 30 Minuten bis 48 Stunden stehen lässt, worauf man dann die Stärke der senkrechten, polarisierten Fluoreszenz (I_vg) und die Stärke der horizontalen polarisierten Fluoreszenz (I_rTO) in üblicher Weise misst. Die Messung der polarisierten Fluoreszenz kann in einfacher Weise unter Verwendung üblicher Vorrichtungen zur Messung der Stärke von polarisiertem Licht durchgeführt werden, z.B. mit der im Handel erhältlichen Vorrichtung "FS 501" (hergestellt von Union-Giken-Sha, Co., Ltd.).

Nach einem ähnlichen, wie dem vorstehend genannten Ver-■ fahren zur Herstellung von Verdünnungsserien von Standardantigenproben, kann man eine Reihe von Vergleichsproben herstellen, welche kein mit Fluorochrom markier- tes Peptid enthalten und die Stärke der senkrechten polarisierten Fluoreszenz (I_TTr)) und die Stärke der ho-

VK

rizontalen polarisierten Fluoreszenz (¹TTd) wird gemessen.

Man erhält dann eine Standardkurve des Polarisierungsgrades (P-Wert) gegen die Konzentration der Probe in der Verdünnungsserie des Standardantigens. Der Polarisierungsgrad (P-Wert) wird gemäss folgender Formel berechnet:

- 41 -

P = ^(IVS"^IHS⁾ " ^(IHS"^IHR⁾

(I -I ) + (I -I ) ^l ' ^K VS VR^{; l} HS HR^;

Anstelle einer Standaräantigenprobe kann man unter Verwendung von Proben, die Human-Interferon-^O oder -ß unbekannter Konzentration enthalten, das in den Proben enthaltene Human-Interferon-cx/ oder -ß aus der Standardkurve bestimmen, indem man in ähnlicher Weise den P-Wert berechnet.

Wird ein natives Human-Interferon-cO oder -ß als Standardantigen verwendet, so kann man die Stärke des Interferons in der Probe aus der Standardkurve erhalten.

Wird ein Peptid der allgemeinen Formeln (I) bis (III) 'als Standardantigen verwendet, so stellt man vor dem Versuch die Kreuzreaktivität von Human-Interferon-00 oder -ß und des Peptide gegenüber dem Antikörper fest und berechnet daraus die Stärke an Interferon.

Die synthetischen Peptide gemäss der Erfindung können als Haptene zur Herstellung von Human-Interferon- oG oder -ß-Antigen verwendet werden, 25

Verfahren zur Herstellung von Human-Interferon- oO oder -ß-Antigen werden nachfolgend erläutert.

Human-Interferon-00- oder -ß-Antigen erhält man, indem man ein als Hapten verwendetes synthetisches Peptid mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Trägergebundenen Reagenzes umsetzt.

- 42 -

5?

4-2 -

Als an das Hapten zu bindenden Träger, wie er für die vorerwähnte Methode verwendet wird, kommt ein natürliches oder synthetisches Protein mit hohem Molekulargewicht, wie es üblicherweise zur Herstellung von üblichen Antigenen verwendet wird, in Frage, z.B. tierisches Serumalbumin, wie Pferdeserumalbumin, Rinderserumalbumin, Rattenserumalbumin, Schafserumalbumin oder auch Humanserumalbumin, sowie auch animale Serumglobuline, wie Pferdeserumglobulin, Rinderserumglobulin, Rattenserumglobulin, Schafserumglobulin und Humanserumglobulin. Fernerhin auch animalische Thyroglobuline, wie Meerschweinchen thyroglobulin, Rinderthyroglobulin, Rattenthyroglobulin, Schafthyroglobulin oder Humanthyroglobulin oder animalische Hämoglobuline, wie Pferdehämoglobulin, Rinderhämoglobulin, Rattenhämoglobulin, Schafhämoglobulin und Humanhämoglobulin; animalische Hämo- *cyanine; Proteine, extrahiert von Ascarisen (Ascarisenextrakte selbst, wie sie in JA-OS 16 414/1.981, J. Immun., 111, 260-268 (1973); J. Immun., J_22, 302-308 (1979);

J. Immun., 9J3, 893-900 (1967) und Am. J. Physiol., 199, 575-578 (1960) beschrieben werden, oder Produkte, die man daraus durch weitere Reinigung erhält); Polylysin, eine Polyglutaminsäure, ein Lysin-Glutaminsäure-Copolymer, ein Copolymer enthaltend Lysin oder Ornitin.

Als Hapten-Träger-Bindungsmittel kommen die üblicherweise bei der Herstellung von Antigenen verwendeten in Frage, insbesondere aliphatisch^ Dialdehyde, wie Glyoxal, Malondialdehyd, Glutaraldehyd, Succinaldehyd, Adipoaldehyd usw., die Vernetzungsbindungen zwischen zwei Aminogruppen bilden können; Dimaleimidverbindungen, wie

- 43 -

-AZ-

N, N'-o-Phenylendimaleimid, N,N'-m-Phenylendimaleimid und dergleichen, und solche, die Vernetzungsbindungen zwischen zwei Thiolgruppen bilden können; Maleimidocarboxyl-N-hydroxysuccinimidoester-Verbindungen, wie Metamaleimidobenzoy1-N-hydroxysuccinimidoester, 4-(Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxy1-N'-hydroxysuccinimidoester und dergleichen, d.h. solche, die Vernetzungsbindungen zwischen Aminogruppen und· Thiolgruppen herstellen können? Dehydrokondensierungsraittel, wie NjN-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N-Ethyl-N¹-dimethylaminocarbodiimid, 1 -Ethyl-3-diisopropylaininocarbodiimid, 1-Cyclohexyl-3r(2-morpholinyl-4-ethyl)-carbodiimid und dergleichen, solche, die für eine gemeinsame Peptidbindungsbildungsreaktion, wie sie beispielsweise beim Kombinieren einer Aminogruppe mit einer Carboxylgruppe vorliegt, verwendet werden und ' weiterhin auch Diazoniumarylcarboxylsäuren, wie p-Diazoniumphenylessigsäure und dergleichen. Diese werden in Kombination mit einem üblichen Peptidbindungsbildungsmittel, z.B. dem vorerwähnten Dehydrokondensierungsmittel, verwendet.

Die Umsetzung zur Herstellung eines erfindungsgemässen Antigens wird beispielsweise in einer wässrigen Lösung oder in einer üblichen Pufferlösung mit einem pH von 7 bis 10 und vorzugsweise 8 bis 9 bei 0 bis 4 0⁰C und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Umsetzung erfolgt während 1 bis 24, vorzugsweise 3 bis 5 Stunden.

0,2M Natriumhydroxid - 0,2M Borsäure - 0,2M Kaliumchloridpufferlösung,

- 44 -

5a

4-4 -

0_f2M Natriumkarbonat - 0,2M Borsäure - 0,2M Kaliumchloridpufferlösung,

0,05M Natriumtetraborat - 0,2M Borsäure - 0_f05M Natrium-Chloridpufferlösung, und

0,1M Kaliumdihydrophosphat - 0,05M Natriumtetraboratpufferlösung .

Bei der vorerwähnten Umsetzung kann das Verhältnis der Mengen eines Haptens zu einem Haptenträgerbindungsmittel und einem Träger in geeigneter Weise bestimmt werden, wobei im allgemeinen die 2- bis 6-fache Gewichtsmenge und vorzugsweise 3- bis 5-fache Gewichtsmenge des Trägers, bezogen aus das Hapten, verwendet wird und die 5- bis 1 0-fache molare Gewichtsmenge des Hapten-" Träger-Bindungsmittels, bezogen auf das Hapten, verwendet wird. Gemäss der vorerwähnten Reaktion kann man ein Human-Interferon-cO- oder -ß-Antigen aus einem Träger und einem Hapten, die beide durch ein Hapten-Träger-Bindungsmittel vereint sind, erhalten.

Nach Beendigung der Umsetzung kann man das so erhaltene Antigen in einfacher Weise isolieren und reinigen, indem man eine übliche Dialyse oder Gelfiltration oder fraktionierte Fällung durchführt. Gewünschtenfalls kann man das Antigen in üblicher Weise in lyophilisierter Form aufbewahren.

Auf diese Weise erhält man Human-Interferon-ck- oder -ß-Antigen-Zusammensetzungen aus einem der erfindungsgemässen synthetischen Peptide und dem Träger. Das

Antigen ist eine Zusammensetzung, bei der im allgemeinen durchschnittlich 5 bis 20 Mole des Peptids mit 1 Mol des Proteins kombiniert sind und von dem Antigen kann man einen Antikörper mit einer hohen Spezifität gegenüber Human-Interferon-ci; oder -ß mit guter Wiederholbarkeit herstellen. Von den Antigenzusammensetzungen ist insbesondere ein solches mit einem Bindungsverhältnis von Protein zu Peptid von 1:8 bis 1:15 mit einer hohen Spezifität bevorzugt,? weil man daraus einen Antikörper mit hoher Wirksamkeit und hoher Empfindlichkeit herstellen kann.

Zubereitungen von Antikörpern unter Verwendung eines wie oben erhaltenen Antigens, kann man wie folgt herstellen. Hierzu wird das Antigen einem Säugetier verabreicht

und der in dem Säugetier erzeugte Antikörper wird dann "gesammelt.

Es besteht keine besondere Beschränkung bei der Auswahl des Säugetiers für die Herstellung des Antikörpers, wobei man im allgemeinen jedoch Kaninchen oder Meerschweinchen bevorzugt. Bei der Bildung des Antikörpers wird eine vorbestimmte Menge des wie oben erhaltenen Antigens mit einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine geeignete Konzentration verdünnt und diese verdünnte Lösung wird dann weiter verdünnt, indem man Freund's Adjuvant (complete Freund's adjuvant) unter Herstellung einer Suspension abmischt und die Suspension dann dem Säugetier verabreicht. Beispielsweise kann man eine solche Suspension intrakutan einem Kaninchen in einer Menge von 0,5 bis 5 mg des Antigens pro Verabreichung verabreichen und die Verabreichungen werden

- 46 -

4« -

jede zweite Woche während 2 bis 10 Monaten und vorzugsweise 4 bis 6 Monaten durchgeführt, um eine Immunisierung zu bewirken. Zum Sammeln des Antikörpers nimmt man von dem immunisierten Tier zu dem Zeitpunkt, bei dem eine grosse Menge des Antikörpers nach der Verabreichung der Suspension in dem Tier gebildet wurde, im allgemeinen 1 bis 2 Wochen nach der letzten Verabreichung der Suspension, Blut ab. Das dem Tier entnommene Blut wird mit einer Zentrifuge behandelt und das Serum zum Erhalt des Antikörpers abgetrennt. Erfindungsgemäss kann man aufgrund der besonderen Eigenschaften des Antigens einen Antikörper mit einer ausgezeichneten Spezifität gegenüber Human-Interferon-c*/ oder -ß mit hoher Wirksamkeit und hoher Empfindlichkeit erhalten.

Die erfindungsgemäss erhaltenen Antikörper weisen eine ■ ausgezeichnete Spezifität gegenüber Human-Interferon-.^o oder -ß auf und sind zur Bestimmung von Human-Interferon-ou oder -ß in RIA-Methoden mit hoher Genauigkeit geeignet. Weiterhin kann man den Antikörper bei einer Enzym-Immuno-Assay (EIA)-Methode, einer Fluoreszenz-Immuno-Assay (FIA)-Methode oder bei einer ähnlichen Methode, bei welcher der Antikörper mit einem Enzym oder mit einem Fluorochrom markiert wurde, verwenden.

Weiterhin kann man den Antikörper als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines Adsorbens, der für die Affinitätschromatografie verwendet wird, anwenden, indem man den x^ntikörper auf einem geeigneten unlöslichen Träger immobilisiert.

Unter Verwendung eines Adsorbens für die Affinitätschromatografie kann man Human-Interferon-gt- oder -ß aus

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einem Rohprodukt des Interferons isolieren und reinigen, indem man die Art des verwendeten Antikörpers gezielt auswählt. Verwendet man ein Adsorbens, an dem Human-Interferon-oO -Antikörper immobilisiert ist, dann wird Human-Interferon-QO selektiv daran adsorbiert und in gleicher Weise wird dann, wenn man Human-Interferon-ß-Äntikörper auf einem Adsorbens immobilisiert das Human-Interferon-ß selektiv daran adsorbiert. Dann wird von dem Adsorbens das Human-Interfexon-cP oder -ß adsorbiert enthält, das Human-Interferon-.ji, oder ~ß unter milden Bedingungen in einfacher Weise desorbiert und auf diese Weise kann man ein hochreines Human-Interferon-dv/ oder -ß qualitativ ohne Aktivitätsverlust gewinnen.

Das Adsorbens für die Affinitätschromatografie kann ■ in der nachfolgend beschriebenen Weise erhalten werden.

Beim Immobilisieren von Human-Interferon-Antikörper auf einem unlöslichen Träger können übliche Methoden zum Immobilisieren eines Biomaterials angewendet werden. Eine bevorzugte Methode ist dabei die cyanogenbromidaktivierte Polysaccharidmethode. Bei der cyanogenbromidaktivierten Polysaccharidmethode wird zunächst ein unlöslicher Träger mit Cyanogenbromid behandelt und der so erhaltene aktivierte Träger wird dann mit einer Biosubstanz unter milden Bedingungen zum Immobilisieren der Biosubstanz behandelt. Bei der Behandlung des unlöslichen Trägers mit Cyanogenbromid kann die Behandlung bei einem pH von 11 bis 12 unter Verwendung

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einer basischen Verbindung, z.B. von Natriumhydroxid oder Natriumhydrogenkarbonat, bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel, z.B. Wasser, Acetonitril und dergleichen, während etwa 1 bis 12 Minuten durchgeführt werden. Das Mengenverhältnis von Cyanogenbromid zur Menge des unlöslichen Trägers liegt im allgemeinen bei gleichen Gewichtsmengen. Als unlöslicher Träger kann jeder unlösliche Träger verwendet werden, der eine niedrige nicht-spezifische Adsorptionsfähigkeit gegenüber Biosubstanzen aufweist, der eine hohe Porosität hat und der funktioneile Gruppen aufweist, die in der Lage sind, die Biosubstanz unter milden Bedingungen zu immobilisieren und dabei auch ausreichend chemisch und physikalisch stabil ist. Beispielsweise kann man einen zelluloseartigen Träger, wie Aminoethylzellulose, Carboxymethylzellulose, Bromoacetylzellulose, Paraani- *linozellulose und dergleichen, oder einen Träger vom Typ eines vernetzten Dextrans, wie Sephadex, CM-Sephadex (hergestellt von der Pharmacia Fine Chemicals Inc.) und dergleichen verwenden oder auch einen agaroseartigen Träger, wie Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals Ine.).

Beim kuppeln des so erhaltenen cyanogenbromidaktivierten Trägers mit Human-Interferon-Antikörper kann die 30- bis 80—fache Gewichtsinenge des cyanogenbromidaktivierten Trägers mit dem Human-Interferon-Antikörper in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einer wässrigen 0,1M Natriumhydrogenkarbonatlösung (enthaltend 0,5M Natrium-Chlorid, pH = 8,4), bei im allgemeinen 0 bis 40⁰C und vorzugsweise bei 2 bis 8°C während 10 bis 20 Stunden

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11263

angewendet werden. Auf diese Weise erhält man ein Adsorbens für eine Affxnitatschroraatografie gemäss der vorliegenden Erfindung. Dieses Adsorbens kann in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. in einer physiologischen Kochsalzlösung, aufbewahrt werden.

Zur näheren Erklärung der Erfindung und der Peptide werden Beispiele von Zubereitungen für Peptide, Antigene und Antikörper gezeigt, ohne dass die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt ist.

In den nachfolgenden Herstellungsbeispielen wird der Rf-Wert unter Verwendung der folgenden Mischlösungsmittel mittels einer Dünnschichtchromatografie auf Kieselgel bestimmt

"Rf": 1 -Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5) Rf¹¹: 1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12)

Synthese von Peptiden

Herstellungsbeispiel A-1
25

(1) Herstellung von Z-Ala-Gln-OH

Zu einer Lösung von 4,80 g Z-AIa-OSu in 60 ml Tetrahydrofuran wurde eine Lösung aus 2_r19 g H-GIn-OH in 40 ml Wasser und 2,10 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Wasser wurden abdestilliert und der Rückstand

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wurde mit n-Butanol extrahiert. Das n-Butanolextrakt wurde mit 2 %--iger Essigsäure gewaschen und dann wurde das Butanol abdestilliert. Die ausgefallene Substanz wurde durch Filtrieren gesammelt und aus Methylen-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 3,87 g Z-AIa-GIn-OH erhielt

Rf¹ : 0,41
Rf¹¹: 0,56
10

Elementaranalyse für C.gH .N₃O₆

Berechnet (%) C 54,69 H 6,02 N 11,96 Gefunden (%): 54,50 6,31 11,62 15

(2a) Herste_llung_von_H_::Ala-G_ln_::0H

3,50 g Z-Ala-Gln-OH wurden in 50 ml Wasser und 30 ml Methanol gelöst und die Mischung wurde katalytisch unter Verwendung von Palladium als Katalysator reduziert, wobei man H-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf¹: 0,04

(2b) Hg£:§tellun2„von_ Z-LeU₃AIa₁GIn-OH 30

3,97 g Z-Leu-OSu, das gemäss (2a) erhaltene H-Ala-Gln-OH und 1,39 ml Triethylamin wurden in 50 ml Dimethylformamid

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gelöst und die Mischung wurde 2 0 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure dreimal und mit Wasser fünfmal gewaschen. Ethylacetat wurde abdestilliert und zu dem Rückstand wurde Ether gegeben und der ausgefallene Niederschlag wurde filtriert und getrocknet und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,15 g Z-Leu-Äla-Gln-OH erhielt.
10

Rf¹ : 0,49
Rf¹¹: 0,62

Elementaranalyse für C~,J'¹ ο₂ ^Ν /\Ρη
15'

Berechnet (%) s C 56,88 H 6,94 N 12,06 .Gefunden (%): 65,41 6,80 12,18

(3a) Herstellung von_H~Leu-Ala-Gln-OH

Zu 2,10 g Z-Leu-Ala-Gln-OH wurden 20 ml einer 25 % Bromwasserstoff enthaltenden Essigsäurelösung gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde zum Reaktionsgemisch trockener Ether gegeben, wobei man H-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf¹: 0,10

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(3b)

196 g Z-Leu-OSu, 0,63 ml Triethylamin und das vorstehend erhaltene H-Ieu-Ala-Gln-QH wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde zum Rückstand 1M Zitronensäure gegeben und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Die Kristalle wurden bis zum Erhalt eines neutralen Filtrats gewaschen und dann getrocknet. Die getrockneten Kristalle wurden mit Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,63 g Z-Leu-Leu-Ala--Gln-OH erhielt.

Rf¹ : 0,58
Rf¹¹: 0,64

'Elementaranalyse für C₂₈H₄-N₅O₈

Berechnet (%): C 58.22 H 7„50 N 12,12 Gefunden (%): 57,85 7,90 11,96

(4a)

Zu 1,50 g Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden in 20 ml 25 % Bromwasserstoff enthaltende Essigsäure gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde trockener Ether gegeben und der ausgefallene Feststoff wurde durch Filtrieren gesammelt, wobei man H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf ^τ : 0,19

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(4b) SSEStCIlUnCJ_-VOn_-Z-IIe-LeU-LeU-AIa-GIn-OH

1,41 g Z-IIe-OSu, das vorstehend erhaltene H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH und 0,3 6 ml Triethylamin wurden in 50ml Dimethylformamid gelöst und die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt» Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde 1N Zitronensäure zum Rückstand gegeben und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit heissem Methanol gewaschen, wobei man 1,17 g Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf¹ : 0,61
Rf¹¹: 0,71

Elementaranalyse für C^H-.N^Oq

Berechnet (%)	: C	59,	11	H	7	,87	N	12	,16
Gefunden (%)		59,	23		7	,80		12	,.02

(5a)

Zu 1,10 g Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden15 ml Essigsäure, enthaltend 25 % Bromwasserstoff, gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

Nach Beendigung der Umsetzung wurde trockener Ether zum Reaktionsgcinicch gegeben, wobei man H-Ile-Leu-Leu-

Ala-Gln-OH erhielt.
30

Rf¹: 0,25

- 54 -

(5b)

0,69 g Z-Leu-OSu, das oben erhaltene H-Ile-Leu-Leu-Ala-GIn-OH und 0,22 ml Triethylamin wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestiliieren von Dimethylformamid wurde zum Rückstand 1N Bernsteinsäure gegeben und der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutral war, und dann getrocknet. Das trockene Material wurde mit heissem Methanol gewaschen, wobei man 1,10 g Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf¹ : 0,58
Rf¹¹: 0,71

■Elementaranalyse für C.X N-O..

Berechnet (%): C 59,75 H 8,15 N 12,19 Gefunden (%): 59,60 8,02 11,92

(6) S§£stellun2_von_H₌Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

0,50 g Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden in 50 ml Methanolund 10 ml 10 %-iger Essigsäure gelöst, und die Mischung wurde unter Verwendung von Palladium als Katalysator reduziert, wobei man H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-GIn-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid A bezeichnet.

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Rf¹ : 0,23 Rf¹¹: 0,61

Elementaranalyse für C₃₃H₅₉N₇Oo°2H₂O 5 Berechnet (%): C 54,45 H 8,99 N 13,89 Gefunden (%): 54,.3O 8,81 13,98

HerstelJ.ungsbeispiel A-2

(1) Herstellun2_von._Boc-Ala-NHNHZ

4,99 g Boc-Ala-OH, 4,36 g NH₂-NH-Z und 5,44 g Dicyclo- - hexylcarbodiimid wurden in 150 ml Tetrahydrofuran gelöst und die Mischung wurde 2 0 Stunden bei 4⁰C gerührt. Die .im Reaktionsgemisch gebildete feste Masse wurde abfiltriert und das Filtrat wurde destilliert und zu dem dabei erhaltenen Rückstand wurde Ether gegeben. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und aus Ether und Petrolether umkristallisiert, wobei man 7,03 g Boc-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf¹ : 0,79 Rf¹¹: 0,81

Elementaranalyse für C, _fiH„.-.N.,O_r 30 Berechnet (%): C 56,96 H 6,87 N 12,45 Gefunden (%): 56,81 6,49 12,34

- 56 -

- 5-β -

(2a)

3,00 g Boc-Ala-NHNHZ wurden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde die Trifluoressigsäure abdestilliert und getrocknet, wobei man H-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf¹¹: 0,51

(2b)

2,84 g Boc-Arg(NO₂)-OH wurden in 40 ml einer 0,91 ml

N-Methylmorpholin enthaltenden Tetrahydrofuranlösung gelöst und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu ■wurden unter kräftigem Rühren während 30 Sekunden 1,17 ml IsobutyIchloroformiat gegeben. Zu dem Reaktionsgemisch wurde eine Lösung von H-Ala-NHNHZ in 2 0 ml Dimethylformamid gegeben sowie 1,24 ml Triethylamin und dann wurde 1 Minute gerührt. Man liess das Reaktionsgemisch 5 Minuten bei 0⁰C stehen und erwärmte dann 2 Minuten auf 40⁰C und rührte anschliesserid 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure gewaschen und anschliessend mit einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und im Anschluss daran mit einer gesättigten Kochsalzlösung. Nach dem Abdestillieren des Ethylacetats wurde aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 3,70 g Boc-Arg(NO₀)-Ala-NHNHZ erhielt.

- 57 -

Rf¹ : 0,68
Rf¹¹: 0,79

Elementaranalyse für C₀₀H₀.N₀O₀

49,	06	H	6,	36	N	20,	80
49,	40		6,	72		20,	43

Berechnet {%):
Gefunden (%):

(3a) Herstellung_von_H-ArgJNQ₂X₁

3,67 g Boc-Arg(NO₂)-AIa-NHNHZ wurden in 15 ml Trifluoressigsäure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stellen gelassen. Dann wurde trockener Ether zugegeben

und die auskristallisierten Kristalle wurden abfiltriert, ■wobei man Η-Arg (NO₂)-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf¹: 0,20

(3b) Herstellung von Boc-Arg (NO₀)-Arq (NO₀)_-AIa-NHNH_-Z

2,17 g Boc-Arg(NO₂)-OH wurden in einer Lösung von 50 ml Tetrahydrofuran, enthaltend 0,69 ml N-Methylmorpholin, gelöst und auf -15°C gekühlt und dazu wurden 0.-89 ml Isobutylchloroformiat gegeben und die Mischung wurde 30 Minuten kräftig gerührt. Zu der Mischung wurde das vorerwähnte Η-Arg (NO₀)-Ala-NHNHZ in 30 ml Dimethylformamid sowie 0_r95 ml Triethylamin gegeben und dann rührte

- 58 -

man 1 Minute. Die Reaktionsmischung wurde 5 Minuten auf 0⁰C und dann 2 Minuten auf 40⁰C erwärmt und anschliessend 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit "IN Zitronensäure und einer wässrigen gesättigten Natriumhydrogenkarbonatlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und dann wurde Ethylacetat abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Ethylacetat-Ether erhielt man 3,70 g Boc-Arg(NO₀)-Arg (NO₀)-Ala-NHNHZ.

Rf¹ : 0,58
Rf¹¹: 0,75

Elementaranalyse für C₀ „H . -N.. ,0. .

'Berechnet (%) : C 45,46 H 6,13 N 24,61 Gefunden (%): 45,13 5,71 24,51

(4a) Herstellung von Η-Arg (NO₀)-Arg (NO₀)-Ala-NHNHZ

— — — — — — — — — — -;_—— — __. — _ — __*<;___ ^-— — — Ji-— — / —— — — — — — — —

3,00 g Boc-Arg(NO₂)-Arg (NO₂)-Ala-NHNHZ wurden in 20 ml Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann aus trockenem Ether kristallisiert. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, wobei man Η-Arg-(NO₂)-Arg Ala-NHNHZ erhielt.
30

Rf¹: 0,11

- 59 -

-321Ί

(4b) Herstellung von Boc-Asn-Arg(NO₀)-Arg (NO₀) AIa-NHNHZ

Η-Arg (NO₂)-Arg (NO₂)-AIa-NHNHZ wurde in 50 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,56 ml Triethylamin und 2,17 g B0c-/\sn-0NHS gegeben und die Mischung liess man 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen, Diemthylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit 2 %-iger Essigsäure zweimal gewaschen und dann mit Ether ausgefällt und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol-Essigsäure umkristallisiert, wobei man 2,64 g Boc-Asn-Arg(NO₀)-Arg (NO₀)-Arg-NHNHZ erhielt.

	Rf¹ : 0,	: (%) :	se für	C₃₂	H₅₁N₁	5	°13	N 24	,60
	•Rf¹¹: O₁							24	,12
	:40		C 45,	01	H	6	,02
20	,72		44,	80		5	,85
	Elementaranaly

Berechnet
Gefunden

(4c) HerstelluncT von Boc-Asn-Arg^Arg-Ala-NHNH-

2,50 g Boc-Asn-Arg(NO₂)-Arg (NO₂)-AIa-NHNHZ wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30 %-iger Essigsäure gelöst und die Lösung wurde katalytisch unter Verwendung von Palladium als Katalysator reduziert, wobei

- 60 -

man 2,20 g Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH₂ erhielt

Rf¹ : 0,06
Rf¹¹: 0,40

Elementaranalyse für C₃₄H₄₇N ₃Ο_·2CH₃CO₃H'H₃

Berechnet (%): C 43,80 H 7,48 N 23,71 Gefunden (%): 43,51 7,62 23_r45 10

(5) Herstellung von Z-LeU-GIy-OC₀H₁-

1,86 ml N-Methylmorpholin wurden in 60 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu der Lösung wurden 4,85 g Z-Leu-OH ge- - geben. Die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dann wurdai während 30 Sekunden unter kräftigem Rühren 2,41 ml Isobutylchloroformiat zugegeben. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 40 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 2,54 g H-GIy-OC₃H₅ und 2,56 ml Triethylamin gegeben und 1 Minute gerührt Nach dem Erwärmen des Reaktionsgemisches während 5 Minuten auf O⁰CZ und 2 Minuten auf 40⁰C wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.

Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden abdestilliert und zu dem Rückstand wurde 1M Zitronensäure gegeben und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Die Kristalle wurden mit Wasser gewaschen bis das Filtrat neutral war und dann getrocknet und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 4,68 g Z-LeU-GIy-OC₃H₅ erhielt.

- 61 -

- 64* -

Rf¹ : 0,80
Rf¹¹: 0,77

Elementaranalyse für C₁ „EL· ,.N₀O,-5

Berechnet (%): C 61,70 H 7,48 N 7,99 Gefunden (%): 61,51 7,32 7,80

(6a) HgEstellung_von_H-Leu-GlY-OC₂H

3,12 g Z-LeU-GIy-OC₂H₅ wurden in 50 ml Methanol und 8,90 ml 1N Salzsäure gelöst und die Lösung wurde unter Verwendung von Palladium aid Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-LeU-GIy-OC₀H₅ erhielt«

Rf¹: 0,41
20

(6b) H£Estellung_von_Z-Ser-Leu-GlY-OC₂H₅

2,48 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 20 ml Dimethylformamid und 4,89 ml 6W Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Reaktionsmischung auf -15°C wurden 1,31 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt. Dann wurde durch Zugabe von 4,11 ml Triethylamin zum Reaktionsgemisch die Mischung neutralisiert. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 10 ml einer das oben erwähnte H-Leu-Gly-OC₂H₁-enthaltenden Dimethylformamidlösung sowie 1_f24 ml

- 62 -

Triethylamin gegeben und dann wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure und anschliessend mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und das Extrakt wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen von Ethylacetat erhielt man nach dem Umkristallisieren aus Ethylacetat 2,64 g Z-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅.

	Rf¹ : 0,78	für	C₂₁H	31^N3°7	14	N 9,	60
	Rf¹¹: 0,85				88	9,	63
	Elementaranalyse	C 57,	65	H 7,
15^-		57,	60	6,
	Berechnet (%):
	• Gefunden (%):

(7a) Herstellung von H-Ser-Leu-Gly-0C_oH_c.

2,50 g Z-Ser-Leu-Gly-0C₂H wurden in 10 ml Essigsäure und 50 ml Methanol gelöst und die Mischung wurde unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Ser-Leu-Gly-C^E^ erhielt.

Rf¹: 0,31

- 63 -

(7b) Herstellung von Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-OC^H,-

— — — — — — — — — — — — —, — — — — — —— — _— — —— — —— — — — — — —A-_—— ^- u,

2,54 g Z-Thr-His-NHNH- wurden in 20 ml Dimethylformamid und 4,19 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Mischung auf -15⁰C wurden 0,84 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 3,51 ml Triethylamin zugegeben. Zu diesem.Reaktionsgemisch wurden 20 ml einer das vorher erhaltene H-Ser-Leu-Gly-OC-H,-enthaltenden Dxmethylformamidlosung sowie 0,79 ml Triethylamin gegeben und dann wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert und das Extrakt mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol-Ethylacetat

umkristallisiert, wobei man 4,31 g Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly- -OC₂H₅ erhielt.

Rf¹ : 0,35
Rf¹¹: 0,71

Elemnetaranalyse für C₃^H.„Ν-Ο"H-O

Berechnet (%) : C 64,00 H 8,11 N 16,85 Gefunden (%): 64,48 8,10 16,54

(8a) Herstellung von Z-Thr-His-Ser-Leu-GlY-NHNEL· 30

4,30 g Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅ wurden in 20 ml Methanol gelöst und zu der Lösung wurden 3,18 ml Hydrazin-

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monohydrat gegeben und die Mischung liess man 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach Beendigung der Umsetzung gab man zum Reaktionsgemisch Ether und dann wurden die ausgefallenen Kristalle durch Filtrieren gesammelt und getrocknet. Die Kristalle wurden mit heissem Methanol gewaschen, wobei man 2,55 g Z-Thr-His-Ser-LeU-GIy-NHNH₂ erhie1t.

Rf¹ : 0,17
Rf¹¹: 0,57

Elementaranalyse für ^C29^H43^N9^Cq

Berechnet (%): C 52,64 H 6,55 N 19,05 Gefunden (%): 52,55 6,44 19,09

(8b)
Leu-Ala^Gln-OH

0,78 g Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH wurden in 8 ml Dimethylformamid und 1,03 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Lösung auf -15°C wurden 0,16 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches wurden 0,87 ml Triethylamin zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung aus dem Peptid A, d.h. aus H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, 0,87 ml Triethylamin, 20 ml Dimethylformamid und 10 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und die Mischung wurde dann 24 Stunden bei 4°C gerührt. Dann wurden

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0,39 g von Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNEL·, das in das Azid überführt worden war, zu der Mischung gegeben und 4 8 Stunden gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Ether umkristallisiert und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Das so erhaltene Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurde in 3 ml Trifluoressigsäure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde zum Ausfällen der Kristalle Ether zugegeben und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Nach dem Trocknen der Kristalle wurden diese unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluierungsmittel: 50 %-ige Essigsäure) gereinigt, wobei man ' 120 mg H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf¹ : 0,01
Rf¹¹: 0,35

Elementaranalyse für C,...H₉₄NLgO.. ₃ · 2CH₃COOH' 5H₂O

Berechnet (%) : C 47,95 H 8,19 N 18,30 Gefunden (%): 47,66 ,8,41 18,62

/Ö672⁵: -185,44 (C = 0,57, 1M Essigsäure)

— — L)

- 66 -

9>A

(9)

125 mg Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH₂ wurden in 1O ml Dimethylformamid und 0_Γ125 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und auf -15°C gekühlt und dann wurden 0,025 ml Isoamylnitrit zugegeben und 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 0,105 ml Triethylamin gegeben. Diese Mischung wurde dann zu einer Mischungaus 10 ml Dimethylformamidlösung, enthaltend 110 mg H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH sowie 0,013 ml Triethylamin gegeben und dazu gab man ausserdem 6 ml Hexamethylphosphortriamid und die ganze Mischung wurde dann 24 Stunden bei 4°C gerührt. Dann wurde das Az idprodukt aus 125 mg Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH„ zu der Reaktionsmischung gegeben und 48 h gerührt. Dimethylformamid wurde ab-" destilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert. Das so erhaltene Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurde in 50 ml Methanol und 10 ml 10 %-iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und Methanol wurde abdestilliert und der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluiermittel: 50 %-ige Essigsäure) gereinigt unter Erhalt von 125 mg H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid B bezeichnet.

- 67 -

21 1263

Rf¹ : 0,01 Rf¹¹: 0,38

Elementaranalyse für ^C72^Hi27^N25°20°^2CH3^COOK"4H„O 5 Berechnet (%): C 49,21 H 7,77 N 18,87 Gefunden (%): 49,60 7,92 18,54

UMJ^'· -66,76 (C = 0,42, 1M Essigsäure) 10

Herstellungsbeispiel A-3 15' (1a) Herstellun2_von_H-Gln-NHNHBoc

7,00 g Z-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator kata-Iytisch reduziert, wobei man H-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf¹: 0,3

(1b) HerstGllun2_vgn_Z-Pro₌Gln_::NHNIIBoc

4,41 g Z-Pro-OH wurden in 50 ml Tetrahydrofuran und 1,80 ml N-Methylmorpholin gegeben und die Lösung wurde auf -15°C gekühlt. Dazu wurden 2,3 4 ml Isobutylchloroformiat gegeben und dann wurde 30 Sekunden kräftig

- 68 -

gerührt. Dann wurden zu dem Reaktionsgemisch 3 0 ml einer Dimethylformamidlösung, die H-Gln-NHNHBoc, das gemäss Stufe (1a) erhalten worden war, enthielt, zugegeben und 1 Minute gerührt. Die gesamte Mischung wurde 5 Minuten auf 0⁰C erwärmt und weitere 2 Minuten auf 40⁰C und dann wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt _c Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat, enthaltend eine kleine Menge an Butanol, extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und dann nochmals mit heissem Ethylacetat gewaschen, wobei man 5,67 g Z-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf¹ : 0,60
-Rf¹¹: 0,76

Elementaranalyse für 023H₃₃NcO₇
20

Berechnet (%): C 56,20 H 6,77 N 14,25 Gefunden (%): 55,97 6,68 14,15

(2a)

5,50 g Z-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf¹: 0,09

- 69 -

12b) Herstellun2__von_Z-Leu₌Pro-Gln-NHNHBoc

4_f05 g Z-Leu-ONHS wurden zu 100 ml Dimethylformamidlösung von H-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach Stufe (2a) , gegeben und dann wurden 1,56 ml Triethylamin zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden stehen gelassen» Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure und anschliessend mit einer gesättigten wässrigen Natrxumchloridlösung gewaschen und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 3,72 g Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf¹ : 0,68
Rf¹¹: 0,80

-Elementaranalyse für C„_qH₄₄N,-Oo

Berechnet (%): C 57,60 H 7_r33 N 13,90 Gefunden (%): 57,21 7,08 13,58

(3a) Herstellung__von _H-Leu-Pro₌Gln-NHNHBoc

3,50 g Z-Leu-Pro-Gln-NI-INHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Leu-Pro-Gln-NZNHBoc erhielt.

Rf¹¹: 0,14

- 70 -

(3b) Herstellung von Z-Asp (OCH₀-C^H₁-) -Leu-Pro-Gln-NHNHBoc

2,27 g Z-Asp(OCH₂-CgH₅)-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran und 0,65 ml N-Methylmorpholin gelöst und nach Kühlen der Lösung auf -15⁰C wurden unter kräftigem Rühren während 30 sek. 0,84ml Isobutylchloroformiat zugegeben. Zum Reaktionsgemisch wurden 20 ml einer H-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach der obigen Stufe (3a),enthaltenden Dimethylformamidlösung sowie 0,81 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 1 Minute gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung 5 Minuten auf 0⁰C und 2 Minuten auf 40⁰C erwärmt und anschliessend 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden abdestilliert und der Rückstand=wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten "wässrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat und dann mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Ethylacetat-Petrolether erhielt man 4,00 g Z-C₆H₅)-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.

Rf¹ : 0,68
Rf¹¹: 0,77

Elementaranalyse für C₄₀Hj-J-N₇O...

Berechnet (%): C 59,32 H 6,84 N 12,11 Gefunden (%): 58,88 6,65 11,72

- 71 -

(4a)

2,00 g Z-Asp-(OCH₂-CgH₁-)-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol und 10 ml 10 %-iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf¹ : 0,08

(4b)

0,75 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 15 ml Dimethylformamid mit 1,48 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen 'der Lösung auf -15°C wurden 0,39 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt und anschliessend wurde das Reaktionsgemisch mit 1,24 ml Triethylamin neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung aus 1 0 ml einer Dimethylformamidlösungj- enthaltend H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten gemäss Stufe (4a), und 0,34 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol wurde abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Ethylacetat erhielt man 1,52 g Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.

Rf¹ : 0,45
Rf¹¹: 0,67

- 72 -

(5)

116 mg Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden mit 2 ml Trifluoressigsäure (TFA) zur Entfernung der Butoxycarbonyl-* freier Ether zum Reaktionsgemisch, gegeben, wobei ein Niederschlag ausfiel. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt , getrocknet und in 5 ml Dime-

-jQ thylformamid zusammen mit 0,072 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst. Nach dem Kühlen der Reaktionsmischung auf -15°C wurden 0,019 ml Isoamylnitrit zur Mischung gegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt und anschliessend wurde die Mischung durch Zugabe von 0,081 ml Triethyl-

^c amin neutralisiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung aus 80 mg Peptid B, d.h. H-Thr-His-Ser-'Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, 5 ml Dimethylformamid und 6 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dann wurden zu

«Q dem Reaktionsgemisch 116 mg eines Azidproduktes von Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc gegeben und anschliessend rührte man 28 Stunden. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol vrarde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Petrolether umkristallisiert und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert. Das so erhaltene Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His.Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu- Leu-Ala-Gln-OH wurde in 30 ml Methanol mit 30 ml 10 %-iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als

*gruppe, behandelt und dann wurde wasser-

- 73 -

Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 und anschliessend LH-20 (Eluierlösungsmittel: 1/1000 N Salzsäure) gereinigt, wobei man 58 mg H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid C bezeichnet.

Rf Rf

¹¹

0,01 0,37

Elementaranalyse für C₉

Berechnet (%) : C 48,54 Gefunden (%) : 48,14

H 7,61
7,50

-2CH₃COOH'

N 17,72 17,48

: -85,70 (C = 0_r23, 1M Essigsäure)

Herstellungsbeispiel A-4

(1a)

L^ISEStellun2_von_H-Ser₌As£2Leu₌Pro-Gln-NHNHBoc

1,03 g Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Me thanol gelöst und dann unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-MHMHBoc erhielt.

Rf¹: 0,06

- 74 -

(1 b)

NHNHBoc

0,79 g Z-Tyr-ONHS wurden zu 20 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach Stufe (1a), gegeben und die Mischung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure und danach mit einer wässrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid gewaschen und Ethylacetat wurde abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Ethylacetat erhielt man 588 mg Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.

Rf¹ : 0,51 "Rf¹¹: 0,69

Elementaranalyse für Cj-pEL-gNgO,. _ 20

Berechnet	: C	58,	91	H	6,	56	N	1	1,	89
Gefunden		58,	53		6,	22		1	2,	28

(2) SgES tellun2_von_H₌TYr₌Ser-As2-Leu_::Pro-Glri₌

44 mg Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 3 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,0225 ml 6N Salzsäure/ Dioxan gelöst und nach Kühlen der Mischung auf -15°C

- 75 -

- us -

wurden 0,0060 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt und anschliessend wurde die Mischung mit 0,0252 ml Triethylamin neutralisiert.

Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Lösung, die aus 5 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 25 ml Peptid B,d.h. H - Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, und 2 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und die gesamte Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Anschliessend wurde das Azidprodukt von 44 mg Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc zum Reaktionsgemisch gegeben und 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit einer Mischung aus Butanol-Wasser extrahiert und dann aus Ether umkristallisiert und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Das so erhaltene Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-•Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Äla-Gln-OH wurde in 30 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und Methanol wurde abdestilliert und der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluiermittel: 50 %-ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (Eluiermittel: 1/1000N Salzsäure) gereinigt, wobei man 18 mg H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid D bezeichnet.

Rf¹ : 0,01
Rf¹¹: 0,38

- 76 -

- Te -

Elementaranalyse für

Berechnet (%): C 50,40 H 7,32 N 17,41

Gefunden (%): 50,72 7,67 17,03

/el??⁵: -77,88 (C = 0,22, 1M Essigsäure)

*■ — U

Herstellungsbeispiel B

-Ly_s (Tos]_»Glu_(OBzl^-OBzl

4,18 g H-GIu(OBzI)-OBzl-Tos wurden in 30 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und dazu wurden 1,21 ml Triethyl-' amin (TEA) gegeben und die Mischung wurde unter Kühlen gerührt. Weiterhin wurden 4,35 g Z-LysTos)-OH in . 30 ml Tetrahydrofuran und 0,98 ml N-Methylmorpholin zugegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und unter Rühren wurden tropfenweise 1,27 ml Isobutylchloroformiat zugegeben. 30 Sekunden nach der Zugabe wurde die oben hergestellte gekühlte DMF-Lösung zugegeben und diese Mischung wurde 5 Monuten bei 0⁰C, 1 Minute auf einem 40⁰C warmem Wasserbad und 30 Minuten bei 15°C gerührt.

THF und DMF wurden unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat und dann einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in der

- 77 -

"3 2 Π -2-6

genarmten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 5,37 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,96
Rf¹¹: 0,90
10

Elementaranalyse für C₄₀H₄₁-NoOgS

	Berechnet	O	C	64	,59	H	6,	10	N	5,	65
	Gefunden			64	,13		5,	95		5,	63
15		i) s
	's):

(2a)

5,21 g Z-Lys (Tos-)-Glu(OBzl)-Obzl wurden in einer Mischung aus 80 ml Methanol mit 20 ml einer 10 %-igen Essigsäure gelöst und eine geringe Menge an Palladiumschwarz wurde dazugegeben und dann wurde über Nacht unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Vakuumfiltration entfernt und das FiItrat wurde unter vermindertem Druck destilliert, wobei einen Rückstand erhielt. Zu diesem Rückstand wurde Wasser gegeben und dann wurde lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹ : 0,29

Rf¹¹: 0,52

- 78 -

.. -32Π2Β3

(2b)

2,13 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 20 ml DMF gelöst und dazu wurden 4,20 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt. Dazu wurden unter Rühren 1,13 ml Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest ergab, wurde zum Neutralisieren des Reaktionsgemxsches tropfenweise eine Lösung aus 3,53 ml Triethylamin in 1,20 ml DMP gegeben. Die das Azid enthaltende Mischung wurde zu einer kalten DMF-Lösung von H-Lys(Tos)-GIu-OH, erhalten gemäss Stufe (2a), zusammen mit 1,96 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde bei -10 bis -15°C 2 Stunden und dann 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde •mit 1N Zitronensäure und mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Ethylacetat wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 4,14 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,64
Rf¹¹: 0,65

Elementaranalyse für ^C29^H38^N4^O'1^S'^1//2H2°

Berechnet (%): C 52,80 H 5,96 N 8,49 Gefunden (%): 52,87 5,69 8,46

- 79 -

3ΠΊ263

(3a) S2£Stellung_vgn_H-Ser_::LYS_i(Tos)_-Glu-gH

4,03 g Z-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurden in einer Mischung aus 60 ml Methanol mit 40 ml 10 %-iger Essigsäure gelöst und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde über Nacht und unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Vakuumfiltration entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck αεί 0 stilliert und der Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹ : 0,23

Rf¹¹: 0,48

(3b) S§E§tellun2_von_Z₌Argj(N0₂ irSer-Lvjs jTos 2.-GIu-OH

Das gemäss voriger Stufe (3a) erhaltene H-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden unter Rühren und Kühlen 1,74 ml Triethylamin gegeben. Weiterhin wurden 2,41 g Z-Arg (NO₀)-OH in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und dazu wurden 0,70 ml N-Methylmorpholin gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dann gab man unter Rühren 0,86 ml Isobutylchloroformiat tropfenweise zu. 3 0 Sekunden nach der Zugabe wurde die oben erwähnte Kaliumdimethylformamidlösung zugegeben und die ganze Mischung wurde 5 Minuten bei 0⁰C und dann 30 Minuten bei 15°C gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden unter vermindertem Druck

- 80 -

- OT -

abdestilliert und der Rückstand wurde mit 2 % Essigsäure enthaltendem Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde fünfmal mit 2 % Essigsäure enthaltendem n-Butanol extrahiert und dann unter vermindertem Druck destilliert, wobei die Essigsäure entfernt und durch Wasser ersetzt wurde und anschliessend wurde Wasser durch Methanol ersetzt. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Methanol umkristallisiert, wobei man 4,09 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,42
Rf¹¹: 0,65

Elementaranalyse für C₃₅H₄₉N₉O₁₄S-1

■Berechnet (%): C 48.83 H 5,85 N 14,64 Gefunden (%) : 49,22 6,05 14,.11

(4) SS£Stellung_von_Z-Ser-Leu-NHNH₂

2,54 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 2QnlDimethylformamid gelöst und dazu wurden 5,00 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt. Dazu wurden 1,34 ml Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazintest ergab, wurde tropfenweise eine kalte Lösung von 1,40 ml Dimethylformamid mit 4,20 ml Triethylamin in geringen Mengen zugegeben, um die Reaktionsmischung zu neutralisieren. Das

- 81 -

- 8-1 -

Reaktionsgemisch, enthaltend das Azid, wurde zu 15 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend 1,96 g H-LeU-OC₂^₅'HCl und 1,40 ml Triethylamin, gegeben und die ganze Mischung wurde bei -10 bis -15°C während 2 Stunden und dann bei 4°C während 20 Stunden gerührt.

Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid, einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat und einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid in der genannten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann wurde Ethylacetat durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Petrolether gewaschen und dekantiert. Die ölige Substanz wurde .unter vermindertem Druck in einem Exikator getrocknet und das trockene Produkt wurde in 50 ml Methanol gelöst und dazu wurde unter Eiskühlung 100 %-iges Hydrazinmonohydrat gegeben und das Reaktionsprodukt liess man dann 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und in einem Exikator getrocknet. Das trockene Produkt wurde mit Wasser zur Entfernung des Überschusses an Hydrazinmonohydrat gewaschen und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,68 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,73
Rf¹¹: 0,76

- 82

a»

-9Z-

Elementaranalyse für C₁₇H₇-N₄O_n-

Berechnet (%): C 55,73 H 7,15 N 15,29 Gefunden (%): 55,72 7,01 15,42 5

(5a)

2,0Og Z-Arg(NO-)-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30 ml einer 50 %-igen Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine geringe Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde die Mischung 36 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Filtrieren im Vakuum entfernt und ' das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert. 18 Stunden nach der Lyophilisierung wurde das lyophilisierte Produkt in Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wurde nochmals unter Erhalt des gewünschten Produktes lyophilisiert.

Rf¹ : 0,05
Rf¹¹: 0,41

(5b)
30

1,03 g Z-Ser-Leu-NHNH₂ wurden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden 1,41 mg 6N Salzsäure/Dioxan

gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu wurden 0,38 ml Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest ergab, wurde eine kalte Lösung aus 0,40 ml Dimethylformamid mit 1,18 ml Triethylamin tropfenweise zugegeben, um das Reaktionsgemisch zu neutralisieren. Das das Azid enthaltende Reaktionsgemisch wurde zu 10 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH, erhalten in Stufe (5a), sowie 0,66 ml Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15⁰C und dann 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde mit n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, extrahiert und die Methanolschicht wurde fünfmal mit mit n~Butanol gesättigtem Wasser gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiertm wobei man 1,92 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,33
Rf¹¹: 0,69

Elementaranalyse für C₄₄H₆₆N₁₀O₁₅S^H₃O

Berechnet (%): C 50,66 H 6,76 N 13,43 Gefunden (%): 50,57 6,51 13,34

-Wr-

(6a) S2£§t§üHS2_Y22_Sl§^Eli;§ÜZ^Ar2~§§^r~^Ly^s (Tos) ^ GIu₁OH

1,84 g Z-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol und 30 ml 10 %-iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde 13 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert_f wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹ : 0,09
Rf¹¹: 0,53

(6b)

H-Ser-Seu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH, erhalten in Stufe (6a), wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden unter Eiskühlung 0,51 ml Triethylamin gegeben. Anschliessend gab man 0,95 g Boc-Glu(OBzI)-ONHS hinzu und die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert und die Butanolschicht wurde fünfmal mit mit n-Butanol gesättigtem Wasser gewaschen. Die Butanolschicht wurde

- 8-5 -

unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,70 g des gewünschten Produktes erhielt.

	Rf : 0,42	für	C₅₃H	₈₁N 0	•18^S'^:	2H₂O	55
	Rf¹¹: 0,60						47
	Elementaranalyse	51,	82	H 6,	97	N 12,
10		51,	27	6,	58	12,
	Berechnet (%): C
	Gefunden (%):

(7a) Herstellung_von_Boc-Glu2§er-Leu-Ar2-Ser2

150 mg Boc-Glu(OBzI)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30 ml 10 %-iger Essigsäure gelöst und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde unter Einleitung von Wasserstoffgas 18 Stunden gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

-ΪΟΛ

GIu₁OH

Boc-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten in Stufe (7a), wurde in Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung Hess man 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann wurden 30 ml wasserfreier Ether zugegeben und der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit wasserfreiem Ether gewaschen und dann wurde der Niederschlag unter vermindertem Druck in einem Exikator, enthaltend Kaliumhydroxid-Phosphorpentoxid als Trocknungsmittel, getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(7c)

GIu-OH

Das in Stufe (7b) erhaltene H-Glu-Ser-Leu-Ärg-Ser-Lys (Tos)-GIu-OH wurde in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dann wurden zu der Lösung unter Rühren kleine Stücke an metallischem Natrium gegeben, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung nach blau verfärbte und diese Bedingungen wurden 30 Sekunden bis 1 Minute beibehalten. Zum Reaktionsgemisch wurden Kristalle von NH₄Cl gegeben und der überschuss an metallischem Natrium wurde neutralisiert, nachdem man das Ammoniak vollständig durch Destillation bei Raumtemperatur entfernt hatte. Das Reaktionsprodukt wurde mit Sephadex

30

G-25-Gel unter Verwendung von 50 %-iger Essigsäure als Eluiermittel gelfiltriert, wobei man 58 mg des gewünschten Produktes erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid E bezeichnet.

Rf¹ : 0,04
Rf¹¹: 0,34

Elementaranalyse für

>- 10

Berechnet	(	%) :	C	44,	95	H	7,	44	N	1	6,	02
Gefunden	(			45,	05		7,	11		1	5,	84

15

(8a) Herstellun2_vgn_H-Gln₌NHNHBoc

16,00 g Z-GIn-NHNIIBoC wurden in 100 ml Methanol suspendiert und eine kleine Menge an Palladiumschwar wurde dazugegeben und dann wurde 18 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermxndertem Druck destilliert und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹ : 0,37

Rf¹¹: 0,58

(8b)

Das in Stufe (8a) erhaltene H-Gln-NHNHBoc wurde in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst und dazu wurden unter Eiskühlung 5,51 g Z-Leu-ONHS gegeben und die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit 1N

-Q Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und dann wieder mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und anschliessend mit wasserfreiem

-c Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde durch Destillieren entfernt. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und die erhaltene Festsubstanz wurde aus Methanol-Ethylether umkristallisiert, wobei man 6,04 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,81
Rf¹¹: 0,86

Elementaranalyse für C_?4H_₇N,-O₇

Berechnet (%): C 56_r79 H 7,35 N 13,80 Gefunden (%): 56,67 7,15 13,75

4ΌΗ

(9a) Herstellun2_von_H₌Leu_::Gln_::NHNHBoc

2,79 g Z-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 80 ml Methanol suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 32 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator unter Erhalt des gewünschten Produktes getrocknet.

Rf¹ : 0,33

Rf¹¹: 0,66

(9b)

I-I-Leu-Gln-NIINHBoc, erhalten in der obigen Stufe (9a) , wurde in 3 0 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung wurde unter Rühren gekühlt. Weiterhin wurden 1,61 g Z-Asn-OH in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,62 ml N-Methylmorpholin gegeben und dann kühlte man auf -15°C und gab unter Rühren 0,80 ml Isobutylchloroformiat tropfenweise zu. 30. Sekunden nach Zugabe von Isobutylchloroformiat wurde die zuvor hergestellte Lösung von H-Leu-Gln-NHNHBoc zugegeben und die gesamte Mischung wurde dann 5 Minuten bei O⁰C, 1 Minute bei 40⁰C auf dem Wasserbad und weitere 30 Minuten bei 15°C gerührt. Vom Reaktionsgemisch wurde

Tetrahydrofuran und Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und wieder mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,55 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,63
Rf¹¹: 0,77

Elementaranalyse für C₂„Η.-N^Og

Berechnet(%): C 53,10 H 6,97 N 15,77 Gefunden (%): 53,67 6,63 15,68

(10a)
25

1,28 g Z-Thr-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,58 g N-Hydroxysuccinimid (NHS) gegeben und die Mischung wurde eisgekühlt und dazu wurden 1,05 g N,N-Dicyclohexylcarboddimid (DCC) gegeben. Die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C gerührt und der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert

und das Filtrat unter vermindertem Druck destilliert, und zu dem dabei erhaltenen Rückstand wurde Ethylether gegeben und dann wurde durch Dekantieren gewaschen. Die erhaltene ölige Substanz wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator unter Erhalt des gewünschten Produktes getrocknet.

(10b)

2,43 g Z-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 80 ml Methanol suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 18 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Piltrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹ : 0,31
Rf¹¹: 0,64

(10c) SSEStellung_von_Z-Thr_:;Asn-Leu-Gln-NHNHBoc

Das in Stufe (10b) erhaltene H-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 20 ml einer DimethyIformamxdlosung von

- 94 -

Z-Thr-ONHS, erhalten in Stufe (1Oa) unter Eiskühlung gegeben und die gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von 1N Zitronensäure verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,12 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,82
Rf¹¹: 0,79

Elementaranalyse für C^Hr^NnO..

Berechnet (%): C 53,18 H 6,97 N 15,50 Gefunden (%): 52,85 6,95 15,28

(11a)

0,91 g Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 8 ml TFA gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 80 ml wasserfreier Ether gegeben und der gebildete Niederschlag wurde schnell durch FiI-trieren gesammelt und mit wasserfreiem Ether gewaschen und dann unter vermindertem Druck in einem Kaliumhydroxid-Phosphorpen toxid enthaltenden Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹: 0,34

— 93 —

1,00 g Boc-Glu(OBzI)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurden in 8 ml TFA gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 80 ml wasserfreier Ether gegeben und der gebildete Niederschlag wurde schnell durch Filtrieren gesammelt, mit wasserfreiem Ether gewaschen und dann unter vermindertem Druck in einem Kaliumhydroxid-Phosphorpentoxid enthaltenden Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹ : 0,24
Rf¹¹: 0,44

(11c) Gerstel lung_von_Z-Thr-Asn~Leu-Gln-Glu_(OBzl)__;: SgilLeu-Arg-Ser^Lys J(ToS )_-Glu-OH

Das in Stufe (11a) erhaltene Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNE^ wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden 0,63 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu wurde unter Rühren Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktxonsmischung einen negativen Hydrazintest ergab, wurden 0,53 ml Triethylamin mit 0,40 ml einer kalten Dimethylformamidlösung tropfenweise in kleinen Mengen zum Neutralisieren der Reaktionsmischung zugegeben. Die die Azidverbindung enthaltende Lösung wurde zu 10 ml einer kalten

- 94 -

Dimethylformamidlösung, enthaltend H-GIu(OBzI)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(TOS)-GIu-OH, erhalten gemäss Stufe (11b) und 0,24 ml Triethylamin gegeben und die gesamte Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15°C und dann 18 Stunden bei 4⁰C unter Rühren umgesetzt. Dann wurde ähnlich wie beim Verfahren in der Stufe (11a) das Produkt das erhalten worden war durch Behandlen von 1,16 g Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc mit TFA, zu dem vorerwähnten Reaktionsprodukt gegeben und unter Rühren bei den gleichen Temperaturbedingungen 24 Stunden umgesetzt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der erhaltene Rückstand wurde mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol fünfmal gewaschen und dann wurde das Extrakt unter vermindertem Druck destilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert und der Niederschlag wurde mit heissein Methanol unter Erhalt des gewünschten Produktes gewaschen.

(11 d) S£i£§iiH2_Y2S

JToS]-GIu-OH

Z-Thr-As-Leu-Gln-Glu(OBzI)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH, erhalten in Stufe (11c), wurde in einer Mischung aus 50 ml Methanol und 50 ml 30 %-iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und dann rührte man 18 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat

JUO

-95 -

wurde unter vermindertem Druck destilliert und nachdem das Methanol vollständig abdestilliert war, wurde die konzentrierte Flüssigkeit einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-25 und von 50 %-iger Essigsäure als Eluierungsmxttel behandelt, wobei man durch Sammeln der gewünschten Fraktion 740 mg der obigen Verbindung erhielt.

Rf¹ : 0,17
Rf¹¹: 0,35

Elementaranalyse für C^HqqN., ₇0₉_, -C₉H₀O₀ · 2H₉O

Berechnet (%): C 48,91 H 7,08 N 15_r64 Gefunden (%): 48,82 6,63 15,74

(12)
20

51,0 mg H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurden in flüssigem Ammoniak, der zuvor über metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu wurden kleine Stücke an metallischem Natrium unter Rühren gegeben, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung nach blau verfärbte und diese Farbe 30 Sekunden bis 1 Minute beibehielt. Dann wurden Kristalle von NH,Cl zum Reaktxonsgemisch gegeben und der Überschuss an metallischem Natrium neutralisiert. Nachdem der Ammoniak vollständig bei Raumtemperatur abdestilliert

- 96 -

JUU

-gewar, wurde das Reaktionsprodukt über Sephadex G-25-Gel einer Gelfiltration unterworfen, unter Verwendung von 50 %-iger Essigsäure als Eluiermittel und die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und dann wurde die Fraktion durch Zugabe von Wasser nach dem Konzentrieren lyophilisiert, wobei man 32 mg des gewünschten Produktes (erfindungsgemässes Peptid) erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid F bezeichnet.

Rf¹ : 0,01
Rf¹¹: 0,37

Elementaranalyse für C₅₃H₉₃N₇O₂₁'C₂H₄O-SH O

Berechnet (%): C 46,57 H 7,32 N 16,79 Gefunden (%): 46,10 6,98 16,82

(13) Herstellun2_von_Z_::Leu_;;Ser-gCH₃

1,81 g H-Ser-OCH_-HCl wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung wurden 1,62 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde auf -10⁰C gekühlt. Zu dem Gemisch wurden unter Rühren 4,21 g Z-Leu-ONHS gegeben und dann wurde die Mischung 18 Stunden unter Rühren umgesetzt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschliessend wurde Ethylacetat unter vermindertem Druck abdestilliert.

- 97 -

Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 2,68 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,81
. Rf¹¹: 0,82

Elementaranalyse für C._oH_o,N„0_

I O ΔΌ <i D

Berechnet (%) : C 59,00 H 7,15 N 7,65 Gefunden (%) : 58,62 7,03 7,65

(14a)

4,20 g Z-Leu-Ser-OCH-, wurden in einer Mischung aus 40 ml Methanol mit 11,46 ml 1N Salzsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und dann wurde 18 Stunden unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat unter vermindertem Druck destilliert und zum Rückstand wurde Wasser gegeben und abermals unter vermindertem Druck destilliert und dies wurde dreimal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator, enthaltend Phosphorpentoxid als Trocknungsmittel, getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹: 0,38

- 98 -

- »er -

(14b) S§EStellun2_von_Z-Ser-Leu₌Ser2;OCH₃

3,19 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung wurden 6,30 ml 6N Salzsäure/ Dioxan gegeben und es wurde auf ~15°C gekühlt. Dazu wurden 1,69 ml Isoamylnitrit gegeben» Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazintest anzeigte, wurden 1,76 ml einer kalten Dimethylformamidlösung mit 5,29 ml Triethylamin tropfenweise in geringen Mengen zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches zugegeben.

Das das Azidprodukt enthaltende Reaktionsgemisch wurde zu 20 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Leu-Ser-OCH₃-HCl, erhalten in der obigen Stufe (14a), und 1,60 ml Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15°C und dann weitere 18 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Wasser verfestigt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 4,11 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : O,	für	Γ TJ* TJ ^C21^H31^N:	;°8	89	N 9,	27
Rf¹¹: 0,	C 55,	62 H	6,	92	9,	18
• 76	55,	48	6,
,79
Elementaranalyse
Berechnet (%):
Gefunden

(15) Her stellun2_von_Z-Ser₌Leu_;:Ser₌NHNH₂

2,00 g Z-Ser-Leu-Ser-OCH₂ wurden in 40 ml Methanol gelöst und dazu wurden 1,10 ml 100 %-NH₉NH₂·H₉O unter Eiskühlung gegeben und die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ether verfestigt und der überschuss an NH₉NH ·H₉O wurde entfernt. Das Produkt wurde durch Zugabe von Wasser verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,91 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,43
Rf¹¹: 0,73

Elementaranalyse für C₉₀H-.NcO„
20

Berechnet	(S):	C	52,	97	H	6,	89	N	1	5,	44
Gefunden	(%) :		52,	85		6,	70		1	5,	44

(16a)

70,4 2 mg Z-Ser-Leu-Ser-NHNH₉ wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,78 ml 0 einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf

- 100 -

AAS

-15°C gekühlt und dazu wurden 0,20 ml einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest ergab, wurden 0,65 ml einer 1 0-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin tropfenweise in geringen Mengen zum Neutralisieren der Reaktionsmischung zugegeben. Die das Az idprodukt enthaltende Reaktionsmischung wurde zu 5 ml einer kalten Dimethylformamidlösung,- enthaltend 151 mg von H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH und 0,29 ml einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde dann wurden 2 Stunden bei -10 bis -15°C und weitere 18 Stunden bei 4⁰C gerührt. Dann wurden 117,36 ng Z-Ser-Leu-Ser-NHNH₂ zugegeben und 24 Stunden umgesetzt.

Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der erhaltene Rückstand wurde mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert und das Extrakt wurde zehnmal mit mit n-Butanol gesättigtem Wasser und weitere fünfmal mit 2 %-iger Essigsäure, die mit n-Butanol gesättigt war, gewaschen und das Extrakt wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und unter vermindertem Druck destilliert. Nachdem n-Butanol vollständig abdestilliert war, wurde das Produkt lyophilisiert und das lyophilisierte Produkt wurde aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

- 101 -

(16b)

150 mg Z-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurden in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu wurden kleine Stücke von metallischem Natrium gegeben und die Lösung wurde gerührt, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung nach blau verfärbte und die Färbung 30 Sekunden bis 1 Minute beibehalten wurde. Dann wurden Kristalle von NH.Cl zu der Reaktionsmischung gegeben und das überschüssige metallische Natrium wurde neutralisiert. Nachdem man den Ammoniak vollständig durch Abdestillieren bei Raumtemperatur entfernt hatte, wurde das Reaktionsprodukt einer Gelfiltration mit Sephadex G-25~Gel unter Verwendung von 25 %-iger Essigsäure als Eluiermittel unterworfen und die gewünschte Fraktion wurde gesammelt und nach Zugabe von Wasser konzentriert und lyophilisiert, wobei man 94 mg des gewünschten Produktes (erfindungsgemässes Peptid) erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid G bezeichnet.

Rf¹ : 0_f02
Rf¹¹: 0,39

Elementaranalyse für C₆₅H₁₂η^Ν20^Ο26"^C2^H4°2*^H2°

Berechnet (%): C 48,19 H 7,24 N 16,78 Gefunden (%): 47,93 6,93 16,49

- 102 -

Ml

- V&2 -

(17a ) 2erstellung_yon_Z-T;£r~0Su

1,04 g Z-Tyr-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,38 g N-Hydroxysuccinimid gegeben und die Reaktionsmischung wurde ausgekühlt. Dazu wurden unter Eiskühlung 0,68 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und die gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei 4°C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und zu dem Rückstand wurde Ethylether und Petrolether gegeben und dann dekantiert und das erhaltene Produkt wurde dann getrocknet.

(17b)

1,00 g Z-Ser-Leu-Ser-OCEU, erhalten in der obigen Stufe (14b), wurde in 20 ml Methanol mit 20 ml 10 %-iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 15 Stunden unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat unter vermindertem Druck destilliert und zum Rückstand wurde Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf¹ : 0,35

Rf¹¹: 0,65

- tee

(17c)

H-Ser-Leu-Ser-OCH^c das gemäss der vorhergehenden Stufe (17b) erhalten worden war, wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst und unter Eiskühlung wurden 0,31 ml Triethylamin zugegeben. Zu dieser Mischung wurde eine kalte DimethyIformamidlösung von Z-Tyr-OSu, erhalten gemäss Stufe (17a) , unter Rühren gegeben. Die .gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand durch Zugabe von Wasser verfestigt, aus Methanol-Ether umkristallisiert, nochmals aus Methanol-Ethylacetat, wobei man 1,08 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,78
Rf¹¹: 0,82

Elementaranalyse für C^H._fiN,O._fl
20

Berechnet (%) : C 58,43 H 6,54 N 9,09 Gefunden (%): 58,14 6,58 9,16

(1 7d)

1,00 g Z-Tyr~Ser~Leu-Ser-OCH₃ wurden in Methanol gelöst und unter Eiskühlung wurden 0,82 ml 100 %-iges NH₂NH₂-H₂O dazugegeben und die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Methanol wurde

·- 104 -

1-W -

unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt .'. und dann mit Wasser gewaschen um den* überschuss an NH₂NH₂-H₂O zu entfernen und aus Methanol-Ether umkristallisiert und mit heissem Methanol gewaschen, wobei man 0,81 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf¹ : 0,45
Rf¹¹: 0,76
10

Elementaranalyse für CpgH.^N^Oq

Berechnet (%): C 56,48 H 6,54 N 13,63 Gefunden (%): 56,12 6,57 13,58 15

(18a)

42,3 mg Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH« wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu wurden 0,34 ml einer 10-fach verdünnten Dimethylformamidlösung von 6N HCl/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und unter Rühren wurden dazu 0,09 ml einer auf das 10-fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest zeigte, wurden 0,29 ml einer auf das 10-fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin tropfenweise in kleinen Mengen zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches zugegeben. Die das Azidprodukt

- 105 -

enthaltende Reaktionsmischung wurde zu 4 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend 50,0 mg H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH sowie 0,10 ml einer um das 10-fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15°C und anschliessend 18 Stunden bei 4°C gerührt. Dazu wurden 42,3 mg Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH₂ in Form des Azides gegeben und die Umsetzung wurde 24 h durchgeführt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 30 ml n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, extrahiert und das Extrakt wurde zehnmal mit Wasser, das mit n-Butanol gesättigt war, gewaschen und anschlies· send fünfmal mit 2 %-iger Essigsäure die mit n~Butanol gesättigt war. Die organischen Schichten wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Entfernung von n-Butanol destilliert und der Rückstand wurde lyophilisiert und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(18b)

Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-LYS-Glu-OH

Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-GIu-OH wurde in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu wurden kleine Natriummetallstücke unter Rühren gegeben, bis die Farbe der Reaktionsmischung sich nach blau veränderte und 3 0 Sekunden bis 1 Minute

- 106 -

-IM-

diese Farbe beibehielt. Dann wurden Kristalle von NH₄Cl zum Reaktionsgemisch gegeben und das überschüssige metallische Natrium neutralisiert und nachdem der Ammoniak vollständig bei Raumtemperatur abdestilliert worden war, wurde das erhaltene Reaktionsprodukt einer Gelfiltration mit Sephadex G-25~Gel unter Verwendung von 50 %-iger Essigsäure als Eluiermittel unterworfen, wobei man 33 mg des gewünschten Produktes erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid H bezeichnet.

Rf¹ : 0,02
Rf¹¹: 0,35

Elementaranalyse für C-, ,H₁ ^N₀₁O₀₀'C₀H-O₀ ·4Η_ο0

/4 ι Zi Zi Zo ZQZ Z

Berechnet (%): C 47,71 H 7,30 N 15,79 Gefunden (%): 47,32 7,24 15,82

Herstellungsbeispiel C
Referenzbeispiel 1

5,06 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 50 ml Dimethylformamid zusammen mit 6,66 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und

die Lösung wurde auf -15°C gekühlt. Dazu wurden 2,68 ml

- 107 -

Isoamylnitrit gegeben und die Mischung wurde 5 Minuten gerührt. Anschliessend wurden zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches 5,60 ml Triethylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zu 30 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 3,11 g H-Ser-OMe-HCl und 2,80 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Ethylacetats wurde der Rückstand durch Zugabe von Ether kristallisiert und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert_r wobei man 3,75 g Z-Ser-Ser-OMe erhielt.

Rf¹ : 0,64
Rf¹¹: 0,77

Elementaranalyse für C₁₁-H_7nNpO₇
20

Berechnet	(	%) :	C	52,	94	H	5,	92	N	8,	23
Gefunden	(	%) :		52,	67		5,	89		8,	35

Referenzbeispiel 2

2,5 g Z~Ser-Ser~OMe wurden in 50 ml Methanol zusammen mit 7,34 ml 1N Salzsäure gelöst und dann wurde in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz unter 1 Atm Wasserstoffdruck bei 20⁰C eine katalytisch^ Reduktion durchgeführt,

- 108 -

unter Erhalt von H-Ser-Ser-OMe-HCl.

Rf¹: 0,08

3,39 g Z-Arg(Tos)-OH wurden in 40 ml Tetrahydrofuran und 0,75 ml N-Methylmorpholin gelöst und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu wurden unter kräftigem Rühren während 30 Sekunden 0,97 ml Isobutylchloroformiat gegeben.

Das wie oben erhaltene H-Ser-Ser-OMe-HCl, 20 ml Dimethylformamid und 1,03 ml Triethylamin wurden zugegeben und gerührt, dann wurde 5 Minuten bei 0⁰C und weitere 2 Minuten bei 40⁰C und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde dreimal mit 1N Zitronensäure und anschliessend fünfmal mit Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.

Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 3,65 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe erhielt.

Rf¹ : 0,51
Rf¹¹: 0,73

Elementaranalyse für ^C28^H38^N6°10^S

Berechnet (%) : C 51,68 H 5,88 N 12,91 Gefunden (%): 51,62 5,82 12,73

- 109 -

Referenzbeispiel 3

3,5 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe wurden in 50 ml Methanol gelöst und dazu wurden 10 ml Wasser und 8,06 ml 1N NAtriumhydroxid gegeben und die Mischung wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 7,24 ml 1N HCl zugegeben und dann wurde Methanol abdestilliert und der Rückstand mit n-Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und nach dem Abdestillieren von n-Butanol und Wasser wurde der Rückstand durch Zugabe von Ether kristallisiert und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,60 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf¹ : 0,28
Rf¹¹: 0,57

Elementaranalyse für C₃₇H₃₆N₅O_1QS·1

Berechnet (%): C 50,22 H 5_r77 N 13,02 Gefunden (%): 50,24 5,62 13,20

Referenzbeispiel 4

1,35 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser~OH wurden in 50 ml Methanol und 10 ml 10 %-iger Essigsäure gelöst und die Lösung

- 110 -

wurde katalytisch in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz unter 1 Atm Wasserstoffdruck reduziert, wobei man H-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf¹V 0,034

Referenzbeispiel 5
10

H§E§tellun2_von_Z-Asn-Leu_OEt

5,32 g Z-Asn-OH wurden in 60 ml Tetrahydrofuran, 10 ml Dimethylformamid und 2_r04 ml N-Methylmorpholin gelöst und dazu wurden 40 ml einer Dxmethylformamidlösung, enthaltend 2,64 ml Isobutylchloroformiat, 3,91 g H-Leu-OEt-HCl und 2,80 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde in ähnlicher Weise, wie dies in Referenzbeispiel 2 beschrieben wurde, umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde zu dem Rückstand 1M Zitronensäure gegeben und der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet und aus Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 6,1 g Z-Asn-Leu-OEt erhielt.

Rf¹ : 0,71
Rf¹¹: 0,80

Elementaranalyse für ^C20^H29^N3°6
30

Berechnet (%): C 58,95 H 7,17 N 10,31 Gefunden (%) : 58,99 7,23 10,26

- 111 -

- νπ -

Referenzbeispiel 6
Herstellun2_von_Z_:;TYr_::Asn-Leu_:;0Et

3,01 g Z-Asn-Leu-OEt wurden in 50 ml Methanol und 7,4 ml 1N HCl gelöst und die Lösung wurde in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck reduziert, wobei man H-Asn-Leu-OEt*HC1 erhielt.
10

Rf¹: 0,26

Das so erhaltene H-Asn-Leu-OEt-HCl wurde in 5 0 ml Dimethylformamid und 1,03 ml Triethylamin gelöst und dazu wurden 3,35 g Z-Tyr-ONHS gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde zu dein Rückstand eine wässrige 1M Zitronensäurelösung gegeben und der Niederschlag wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 3,58 g Z-Tyr-Asn-i Jeu-OEt erhielt.

Rf¹ : 0,73
Rf¹¹: 0,82
25

Elementaranalyse für C_?qH_oN.O„

Berechnet {%)	61,	04	H	6	,71	N	9,	82
Gefunden (%)	60,	84		6	,70		9,	39
- : C

- 112 -

Ή-2 -

Referenzbeispiel 7

2,78 g Z-Tyr-Asn-Leu-OEt wurden in 30 ml Methanol gelöst und dazu wurden 1,21 ml Hydrazinhydrat gegeben und die Mischung wurde über Nacht stehen gelassen und die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert und mit einerkleinen Menge Methanol gewaschen, wobei man 3,10 g Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH₂ erhielt.

Rf¹ : 0,56
Rf¹¹: 0,75

Elementaranalyse für C₂^H₃₆NgO.,

•Berechnet (%): C 58,26 H 6,52 N 15,10 Gefunden (%) : 57,91 6,65 15,.12

Beispiel 1
(a)

Ser-OH

0,84 g Boc-Leu-Gln-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran und 0,24 ml N-Methylmorpholin gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,31 ml Isobutylchloroformiat und H-Arg(Tos) Ser-Ser-OH, erhalten gemäss Referenzbeispiel 4, gegeben

- 113 -

-W-S-

und die Mischung wurde dann in ähnlicher Weise wie dies beim Referenzbeispiel 2 beschrieben wurde, umgesetzt. Nach dem Abdestiilieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wurde mit 20 %-iger Essigsäure gewaschen und dann wurde Butanol abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Ethylacetat erhielt man 1,54 g Boc-Leu-Glb-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.

Rf¹ : 0,18
Rf¹¹: 0,57

Elementaranalyse für C₃₅H₅₇NgO₁₃S^H₂O

Berechnet (%): C 48,77 H 6,90 N 14,62 Gefunden (%): 48,76 6,61 14,78

(b)

1,50 g Boe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden mit 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur zur Entfernung der t-Butoxycarbonylgruppe behandelt und trockener Ether wurde zum Reaktionsgemisch zum Kristallisieren des Produktes zugegeben, wobei man H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf¹: 0,04
30

H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten wie oben, wurde in 25 ml flüssigem Ammoniak gelöst und dazu wurden

- 114 -

kleine metallische Natriumstücke gegeben. Dabei veränderte sich die Farbe der Mischung nach blau. Zu dieser Mischung wurde 1 g trockenes Ammoniumchlorid gegeben und dann wurde der Ammoniak abdestilliert. Der Rückstand wurde in 50 %-iger Essigsäure gelöst und diese Lösung wurde einer Gelfiltration mit Sephadex G-IO (2,2 χ 85 cm, Eluiermittel: 50 %-ige Essigsäure) und weiter mit LH-20 (2,2 χ 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man ein reines H-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid I bezeichnet.

Rf¹ : 0,01
Rf¹¹: 0,34

— —9Π
^/

Z_ß^: -42,5° (C = 0,230, 0,001N HCl) Elementaranalyse für C₃₃H₄₃N₉O₉·4H₂O-CH₃CQOH

Berechnet (%): C 41,60 H 7,68 N 17,46 Gefunden (%) : 41,20 7,93 17,91

Beispiel 2

(a) S§Egtellung_von_Z-Phe-Le--Gln~Ar2iTos)_-Ser-Ser-OH

H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten gemäss Beispiel 1, wurde in 30 ml Dimethylformamid und 0,24 ml Triethylamin gelöst und dazu wurden 0,77 g Z-Phe-ONHS gegeben

- 115 -

- 1*5 -

und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert und das Extrakt wurde mit 2 %-iger Essigsäure extrahiert. Die Butanolschicht wurde konzentriert und das

Konzentrat wurde durch Zugabe von Ether kristallisiert und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit heissem Ethanol gewaschen, wobei man 1,40 g Z-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt. 10

Rf¹ : 0,22
Rf¹¹: 0,59

Elementaranalyse für C- -1 15

Berechnet (%) : C 54,12 ■Gefunden (%) : 54,42

(b)

N.	iO	°14	S-	H₂O	1	3,	43
H	6	,28		N	1	3,	84
	6	,38

20 mg Z-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak zur Entfernung einer Gruppe der Formel Z und einer Gruppe der Formel (Tos) in ähnlicher Weise, wie dies in Beispiel 1 (b) beschrieben wurde, behandelt und die Reaktionsmischung wurde dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 χ 85 cm, Eluiermittel: 10 %-ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (2,2 χ 80 cm, Eluiermittel: 0_r001N HCl) unterworfen, wobei man

- 116 -

12 mg eines gereinigten Produktes von H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid J bezeichnet.

Rf¹ : 0,01
Rf¹¹: 0,35

/afc/* : -37,3° (C = 0,249_r 0,001N HCl) Elementaranalyse für C₃₂H₅₃N O₁₀-TH₂O

Berechnet (%): C 44,24 H 7,64 N 15,17 Gefunden (%): 44,27 7,10 15,60

* Beispiel 3

(a)

0,39 g Z-LeU-GIy-NHNH₂ wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,58 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde in ähnlicher Weise wie in Referenzbeispiel 1 eine Umsetzung durchgeführt, unter Verwendung von 10 ml einer Dimethylformamidlösung_r enthaltend 0,15 ml Isoamylnitrit, 0,49 ml Triethylamin und 1,00 g H-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH. Dann wurde zu dem Reaktionsgemisch eine äquivalente Menge von Z-Leu~GlyN_ gegeben und die Umsetzung wurde 20 Stunden bei 4°C durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mit Methanol extrahiert und das Extrakt wurde mit

- 117 -

- VT7 -

2 %-iger Essigsäure und dann mit Butanol gewaschen und die Essigsäure wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Ether kristallisiert. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit heissem Methanol gewaschen,-wobei man 0,65 g Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg (Tos) Ser-Ser-OH erhielt.

Rf¹ : 0,19
Rf¹¹: 0,60
10

Elementaranalyse für C₅₅H₇₈N₁₂O₁₆S-H₂O

Berechnet (%): C 54,44 H 6,64 N 13,85 Gefunden (%): 54,74 6,66 1-3,98 15

(b)

Ser-Ser-OH

20 mg Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (b) beschrieben zur Entfernung eine Gruppe der Formel Z und einer Gruppe der Formel Tos behandelt und dann wurde das Reaktionsgemisch einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 χ 85 cm, Eluiermittel: 10 %-ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (2,2 χ 80 cm, Eluiermittel: O₁-OOIN HCl) unterworfen,, wobei man 11 mg H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid K bezeichnet.

- 118 -

Rf¹ : 0,01
Rf¹¹: 0,40

— —9Π

/rlj /r; : -27,6° (C = 0,228, 0,001N HCl)

"^ — L)

Elementaranalyse für C₄₀H ,N₁₃O₁₂'6H₃O'CH^COOH

Berechnet (%) : C 46,92 H 7,63 N 15,63 Gefunden (%): 46,89 7,25 15_f51 10

Beispiel 4
(a)

600 mg Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden in 50 mg Methanol und 10 mg 10 %-iger Essigsäure gelöst und die Mischung wurde in Gegenwart von 500 mg Palladium bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck reduziert, wobei man H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf¹: 0,18

420 mg Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH₂ wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,37 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde unter Verwendung von 0,10 ml Isoamylnitrit und 0,31 ml Triethylamin ein Azidprodukt in ähnlicher Weise hergestellt wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben. Das

- 119 -

- vw -

Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung von 10 ml Hexamethylphosphortriaraid und H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH in 10 ml Dimethylformamid gegeben und die gesamte Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert und das Extrakt wurde mit 2 %-iger Essigsäure gewaschen und Butanol abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ether kristallisiert. Das so erhaltene Z-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe~Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurde in 30 ml Methanol und 10 ml 10 %-iger Essigsäure gelöst und die Lösung wurde in Gegenwart von Palladium bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck einer katalytischen Reduktion unterworfen und das Reaktionsgemisch dann unter Verwendung von Sephadex G-25 (3 χ 120 cm, Eluiermittel

50 %-ige Essigsäure) einer Gelfiltration unterworfen, "wobei man 650 mg H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf¹ : 0,05
Rf¹¹: 0,53

Elementaranalyse für ^cggHgo^N-i g°-i q^s* 2H2O

Berechnet (%): C 53,28 ■ H 6,91 N 15,06 Gefunden (%): 53,10 6_f43 14,84

- 120 -

(b)

H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten gemäss Beispiel 4 (a), wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (b) beschrieben behandelt, um eine Gruppe der Formel Tos zu entfernen und dann wurde das Reaktionsgemisch einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 χ 85 cm, Eluiermittel: 10 %-ige Essigsäure) und unter Verwendung von LH-20 (2,2 χ 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man 9 mg des gereinigten Produktes von H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid L bezeichnet.

Rf¹ : 0,41
"Rf¹¹: 0,42

— —90

<Wp : -24,3° (C = 0,078, 0,001N HCl)

Elementaranalyse für

Berechnet (%): C 45,01 H 7,80 N 13,77 Gefunden (%): 45,21 7,31 14,22 25

- vzr\ -

Beispiel 5

(a) S®Estellun2_von__Z-Met-Ser-TYr-Asn-Leu-Leu2

159 mg Z-Met-Ser-NHNH- wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,21 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde unter Verwendung von 0,055 ml Isoamylnitrit und 0,17 ml Triethylamin in ähnlicher Weise wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, das Azidprodukt hergestellt. Die Reaktionsmischung wurde zu einer Mischung aus 300 mg H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, 5 ml Dimethylformamid und 5 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C gerührt. Dazu wurden 318 mg Z-Met-Ser-NHNEL· gegeben und 'dann wurde 72 Stunden bei 4°C gerührt. In ähnlicher Weise wie in Beispiel 4(a) beschrieben, erfolgte- dann die Reinigung, wobei man Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly~Phe~Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

(b)

Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (b) beschrieben behandelt, um eine Gruppe der Formel Z und eine Gruppe der Formel Tos zu entfernen und dann wurde das Reaktionsgemisch unter Verwendung von Sephadex G-25

- 122 -

(3 χ 120 cm, Eluiermittel: 50 %-ige Essigsäure) und weiterhin unter Verwendung von LH-20 (2 χ 85 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) gereinigt, wobei man 119 mg H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid M bezeichnet.

Rf¹ : 0,01
Rf¹¹: 0,45

—*?n
j

-15,7° (C = 0,254, O,OO1K HCl)

Elementaranalyse für C^-,Η., „ ,ISL _o0„~S · 5H₀O-CH₀COOH

b/ IUo Io iU ^ ο

Berechnet (%): C 49,75 H 7,26 N 15,13 Gefunden (%): 49,80 6,92 14,91

Aminosäurenanalyse: Asp: 0,95, Ser: 3,15, .GIn: 1,03 Met: 0,92, GIy: 1,05, Leu: 3,08 Tyr: 1,00, Phe: 0,98, Arg: 0,96

Herstellung eines markierten Peptids 25

Herstellungsbeispiel von markiertem Peptid 1

H-Tyr-Scr-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, d.h. Peptid D, vrarde unter Verwendung von Chloramin T wie folgt markiert:

- 123 -

- «rs -

Zu 20 Mikrolitern 0,5M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 5 Mikrogramm des vorerwähnten Peptids D, wurden 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 1 Mikro-

125
curie Na ( J) (trägerfreies New England Nuclear ,N.E.N.)und 20 Mikroliter einer 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 70 mg/ml Chloramin T gegeben. Die Mischung wurde 30 Sekunden bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 Mikrolitern einer 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 60 mg/ml Natriummetabisulfit (Na₂S₃O₅) beendet. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 100 Mikroliter kalte wässrige, 1 %-ige Natriumjodidlösung gegeben und die Mischung wurde mit einer Sephadex G-25-Säule (1,0 χ 30 cm, Eluiermittel: 0,05M Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,25 % BSA, 10 mM EDTA und 0,02 % NaN₃) behandelt. Man erhielt ein markiertes Peptid D, in welchem die 13. und die

1 25
Fraktion mit J markiert war. Dies Produkt wird

1 25

nachfolgend als J-markiertes Peptid D bezeichnet.

Herstellungsbeispiel von markiertem Peptid 2-1

H-Tyr-Ser-LGU-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH, d.h. Peptid H, wurde mittels der Chloramin T-Methode wie folgt markiert.

Zu 20 Mikrolitern einer 0,5M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 5 Mikrogramm des vorerwähnten Peptids (Peptid II), wurden 0,5M Phosphatpufferlösung, cnthal-

125
tend 1 Mikrocurie Na( ' J) (trägerfreies N.E.N.) und

- 124 -

dann 20 Mikroliter 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 70 mg/ml Chloramin T gegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und die Umsetzung dann durch Zugabe von 50 Mikrolitern einer 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 60 mg/ml Natriummetabisulfit (NapSpOj-) beendet. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 100 Mikroliter einerkalten wässrigen, 1 %-igen Natriumjodidlösung gegeben und die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule (1,0 χ 30 cm, Eluiermittel: 0,05M Phosphatpufferlösung, pH 7,4, enthaltend 0,25 % NSA, 10 mM EDTA und 0,02 % NaN.,)

1 25 behandelt. Man erhielt ein Peptid H, das mit J mar-

125 kiert war. Dieses Produkt wird nachfolgend als J-

markiertes Peptid H bezeichnet.
15

Herstellungsbeispiel von markiertem Peptid. 2-2

Zu 20 Mikrolitern 0,5M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 5 Mikrogramm-Peptid H, wurden 0,5M Phos-

1 25 phatpufferlösung, enthaltend 1 Millicurie Na( J) (trägerfreies N.E.N.) und dann 20 Mikroliter 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 70 mg/ml Chloramin T, gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Sekunden gerührt und dann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 Mikrolitern 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 60 mg/ml Natriummetabisulfit (Na-S-Oj.) beendet. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 100 Mikroliter einer kalten wässrigen 1 %-igen Natriumjodidlösung gegeben und dann erfolgte eine Behandlung mit einer Sephadex

- 125 -

-YiS-

G-25-Säule (1,0 χ 30 cm, Eluiermittel: 0,05Μ Phosphatpufferlösung, pH 7,4, enthaltend 0,25 % BSA, 1OmM EDTA und 0,02 % NaN₃). Man erhielt ein J-markiertes Peptid H.

Herstellungsbeispiel von markiertem Peptid 3·

(1) H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH,-d.h. Peptid M_r wurde nach der Chloramin T-Methode wie folgt markiert.

Zu 20 Mikrolitern einer 0,2M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 5 Mikrogramm des vorerwähnten Peptids (Peptid M) wurde eine 0,2M Phosphatpufferlösung, 'enthaltend 1 Mikrocurie Na(¹²⁵J) (NEN) und darm 20 Mikroliter einer 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 3,5 mg/ml Chloramin T, gegeben. Die Mischung wurde 20 Sekunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 Mikrolitern einer 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 2,4 mg Natriumrnetabisulfit, beendet. Die Reaktionsmischung wurde mit einer DEAE-Sephadex A-25-Säule (1,0 χ 30 cm, Eluiermittel: 0,1M Tris-Salzsäurepufferlösung, pH 8,6, enthaltend 0,1 % BSA und 0,01 % NaN₃) behandelt. Die erste Peptidfraktion wurde durch Ionenaustauschchroma-

1 25 tografie behandelt, wobei man J-markiertes Peptid

1 25

erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend asl J-markiertes Peptid M bezeichnet.

- 126 -

- νίβ

(2) H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH, d.h. Peptid M, wurde mit Chloramin T wie folgt markiert.

Zu 20 Mikrolitern einer 0,2M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 5 Mikrogramm des vorerwähnten Peptids (Peptid M), wurde eine 0_r2M Phosphatpufferlösung, ent-

1 25
haltend 1 Mikrocurie Na( J) (NEN) gegeben und anschliessend 20 Mikroliter einer 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 3,5 mg/ml Chloramin T. Die Mischung wurde 20 Sekunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 Mikrolitern einer 0,2M Phosphatpufferlösung,- enthaltend 2,4 mg/ml Natriummetabisulfit beendet. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer SP-Sephadex C-25-Säule (1,0 χ

30 cm, Eluiermittel: 50 mM Phosphatpufferlösung) behandelt. Man erhält das vorerwähnte Peptid M, dessen 4.

1 25
Fraktion mit J markiert war. Dieses Produkt wird

1 25
nachfolgend als J-markiertes Peptid M bezeichnet.

Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid 4

(1) 1 mg Peptid C und 1 mg Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) wurden in einer 0,2M Natriumboratpufferlösung (pH 9,5) gelöst. Eine Stunde nach der Umsetzung bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung durch Dünnschichtchromatografie über Kieselgel behandelt (Eluiermittel: Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5). Isolierte Spots, erhalten bei der Dünnschichtchromatografie

- 127 -

-ViTl-

(TIC) wurden gesammelt und mit Methanol und dann mit Ethanol gewaschen und mit der vorerwähnten Pufferlösung (pH 7,8) eluiert, wobei man 0,3 mg FITC-markiertes Peptid erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als FITC-markiertes Peptid C bezeichnet.

Rf¹ : 0,11
Rf¹¹: 0,50

Elementaranalyse für

Berechnet (%): C 50,77 H 6,96 N 15,79 Gefunden (%): 49,99 6,85 15,50

(2) 1 mg Peptid C wurde in 1 ml 0,2M Natriumbi-'karbonatpufferlösung (pH 9,5) gelöst. Dann wurden 1 mg Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) in der vorerwähnten Pufferlösung gelöst und mit der vorerwähnten Peptidlösung bei 0⁰C vereint. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten und die Reaktionsmischung wurde dann durch Kieselgel-TLC (Eluiermittel Butanol!Essigsäure:Wasser 4:1:5) behandelt. Isolierte Spots, erhalten bei der TLC, wurden gesammelt und mit der vorerwähnten Pufferlösung behandelt, wobei man 0,2 mg TRITC-markiertes Pep tid erhielt, das nachfolgend als TRITC-markiertes Peptid C bezeichnet wird.

Rf¹: 0,08

- 128 -

Elementaranalyse für ^c-]20^Hi84^N34^O33^S'^2CH3^COOH'^7H2°

Berechnet (%): C 51,19 H 7,14 N 16,37

Gefunden (%): 50,08 7,02 16_r19

Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid 5

(1) 1 mg Peptid G wurde in 1 ml einer 0,2M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 9,5) gelöst. Dazu wurde 1 mg PITC gegeben und die Umsetzung erfolgte 1 Stunde bei 25⁰C. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch durch Kieselgel-TLC (Eluiermittel Butanol:

Essigsäure:Wasser = 4:1:5) zur Reinigung behandelt, wobei man 0,1 mg FITC-markiertes Peptid erhielt, das "nachfolgend als FITC-markiertes Peptid G bezeichnet wird.

Rf¹ : 0,13
Rf¹¹: 0,49

(2) 1 mg Peptid G wurde in 1 ml einer 0,2M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 9,5) gelöst. Dazu wurde 1 mg Dxchlorotriazinfluoreszein gegeben und die Umsetzung erfolgte 1 Stunde bei 25°C. Dann wurde das Reaktionsgemisch durch Kieselgel-TLC (Eluiermittel Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:5) behandelt. Man erhielt 0,1 mg eines gereinigten Produktes von DTAF-markiertem Peptid, das nachfolgend als DTAF-markiertes Peptid G bezeichnet wird.

Rf¹: 0,12

- 129 -

- «rs -

Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid 6

(1) 1 mg Peptid M und 1 mg FITC wurden in 0,2M Natriumbikarbonatpuffer 50 % v/v methanolischer Lösung (pH 9,5) gelöst. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden durchgeführt und dann wurde das Reaktionsgemisch durch Kieselgel-TLC (Eluiermittel Butanol: Essigsäure:Wasser = 4:1:5) gereinigt. Isolierte Spots, die bei der TLC erhalten wurden, wurden gesammelt und mit Methanol eluiert,- wobei man 0,3 mg FITC-markiertes Peptid erhielt, das nachfolgend als FITC-markiertes Peptid M bezeichnet wird.

Rf¹ : 0,16
Rf¹¹: 0,52

"Elementaranalyse für Cg₈H₁₁₇N₁₉O₂₅S₂-SH₂O-CH

Berechnet (%): C 52,60 H 6,42 N 12,95 Gefunden (%): 52,65 6,22 12,74

(2) 1 mg Peptid M wurde in 0,05 ml einer O,OO1N HCl-Lösung gelöst und diese Lösung wurde mit 0,2M Natriumbikarbonatpuffer 50 % v/v methanolischen Lösung (pH 9,5) vermischt. Weiterhin wurde 1 mg TRITC in 0,2M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 9,5) gelöst und die Lösung wurde mit der Peptidlösung vermischt. Die Umsetzung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt und dann wurde die Reaktionsmischung einer Kieselgel-TLC (Eluiermittel Butanol!Essigsäure:Wasser =

- 130 -

4:1:5) unterworfen. Isolierte Spots wurden gesammelt und mit Methanol eluiert, wobei man 0,1 mg TRITC-markiertes Peptid erhielt,- das nachfolgend als TRITC-markiertes Peptid M bezeichnet wird. 5

Rf¹ : 0,12
Rf¹¹: 0,42

Elementaranalyse für C_g2H Ή .0₂ S₂-5H₃O-CH₃COOH 10

Berechnet (%): C 53,12 H 6,69 N 18,84

Gefunden (%): 53,20 6,51 18,80

'Herstellung von Antigen

Herstellungsbeispiel 1

1 mg Peptid A, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel A-1 für die Synthese von Peptiden, und 15 mg Rinderserumalbumin (nachfolgend als BSA bezeichnet) wurden in 2 ml 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu der Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 1 Wasser bei 4°C 48 Stunden dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die die Peptid-Protein-Zusammensetzung enthaltende dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, wobei man 18 mg Humaninterferon- 00 -Antigen (nachfolgend als Antigen~o(,-N-I

- 131 -

bezeichnet) erhielt.

Bei diesem Antigen-20-N-I handelt es sich um ein Antigen, bei dem durchschnittlich 12 Mole des Peptids A mit einem Mol BSA kombiniert sind.

Herstellungsbeispiel 2

5 mg Peptid B, das gemäss Herstellungsbeispiel A-2 bei der Synthese von Peptiden hergestellt worden war und 20 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur ge-■ rührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 1 1 Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 23 mg Humaninterferon- r/j -Antigen (nachfolgend als Antigen- ^-N-II bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen-^-N-II sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids B mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 3

4,5 mg Peptid C, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel

- 132 -

A-3 bei der Synthese der Peptide, und 25 mg BSA wurden in 2 ml einer O,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1,0 ml 0,1 M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 1 Wasser während 48 Stunden bei 4°C dialysiert und dabei das Wassser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 27 mg Human- Interferon-^O -Antigen (nachfolgend als Antigen-^-N-III bezeichnet) erhielt.

Bei diesem Antigen-el· -N-III sind durchschnittlich 10 Mole des Peptids C mit 1 Mol BSA vereint. 15

Herstellungsbeispiel 4

5 mg Peptid D, das gemäss Herstellungsbeispiel A-4 bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 25 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 1 Wasser während 48 Stunden bei 4°C dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 28 mg Human-Interferon-Ck-Antigen (nachfolgend als Antigen-cL>-N-IV bezeichnet) erhielt.

- 1-3T3

In diesem Antigen sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids D mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 5

4,5 mg Peptid C, das gemäss Herstellungsbeispiel A-3 bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 2 1 Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und dabei das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, 'wurde lyophilisiert, wobei man 27,5 mg Human-Interferonci/ -Antigen (nachfolgend als Antigen-OO -N-V- bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen sind durchschnittlich 12 Mole des Peptids C mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 6

4,5 mg Peptid D, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel A-4 bei der Synthese der Peptide, und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und die

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Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 2 1 Wasser 48 Stunden bei 4°C dialysiert. Dabei wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die die Peptid-Protein-Zusammensetzung enthaltende dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, wobei man 29 mg Human-Interferon-X-Antigen (nachfolgend als Antigen-r//-N-VI bezeichnet) erhielt.

In dem Antigen-oO -N-VI sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids D mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 7

5 mg Peptid E, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel 'B-7c bei der Synthese der Peptide und 15 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 1 Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und dabei das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 15 mg Human-Interferon-o0-Antigen (nachfolgend als Antigen-d* -C-I bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen-cv-C-1 sind durchschnittlich 10 Mole des Peptids E mit 1 Mol BSA vereint.

Das Kombinationsverhältnis von Peptid E zu BSA im Antigen-pC-C-I wurde wie folgt berechnet. Nachdem man festgestellt hatte, dass weder nicht-umgesetztes BSA noch nicht-umgesetztes Peptid E in dem Antigen-oO-C-I vorhanden war, indem man eine weitere Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 vornahm (Eluiermittel: physiologische Kochsalzlösung; Bestimmung: OD 280 nm; Eluiergeschwindigkeit: 3 ml/h; abgetrennte Menge: jeweils 1 ml) wurden die Mengen eines Bruchteils von Peptid E, das sich mit BSA (einer Peptid-Protein-Zusammensetzung) vereint hat, bestimmt und eine Fraktion eines anderen Produktes (eines Dimeren von Peptid E) wurde gleichfalls bestimmt und auf diese Weise wurde eine Kalibrierungskurve der Standardkonzentration für das Dimcre und für das Peptid E erstellt, um die Menge des Dimeren festzustellen. Dann wurde die Menge ' des Dimeren von der Menge des Peptids E, das als Ausgangsmaterial verwendet worden war, abgezogen und der abgezogene Wert der Menge des Peptids E ist dann die Menge an Peptid E, die mit BSA kombiniert ist.

Das Kombinationsverhältnis eines synthetischen Peptids zu BSA bei jedem der in den jeweiligen Beispielen verwendeten Antigene wurde in gleicher Weise berechnet. 25

Herstellungsbeispiel 8

5 mg Peptid F, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel B-12 bei der Synthese der Peptide, und 5 mg BSA wurden

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in 2 ml einer 0,1M Ämmoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 1 Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 9 mg Human-Interferon-zL>-Antigen, nachfolgend als Antigen-c^-C-II bezeichnet, erhielt.

Dieses Antigen-c^-C-II enthält durchschnittlich 9 Mole des Peptids F kombiniert mit 1 Mol BSA.

' Herstellungsbeispiel 9

5 mg Peptid G, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel B-16b bei der Synthese der Peptide und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 2 1 Wasser von 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 28 mg Human-Interferon-c>6-Antigen, nachfolgend als Antigen-Ct-c-III bezeichnet, erhielt.

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Bei diesem Antigen waren im Durchschnitt 12 Mole des Peptids G mit 1 Mol BSA kombiniert.

Herstellungsbeispiel 10

4 mg Peptid H, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel B-18b bei der.Synthese der Peptide, und 20 mg BSA wurden in 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 1 Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-'Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 22 mg Human-Interferon-c^ -Antigen, nachfolgend als Antigen-^- C-IV bezeichnet, erhielt.

Das Antigen-C^-C-IV enthielt im Durchschnitt 9 Mole des Peptids H kombiniert mit 1 Mol BSA.

Herstellungsbeispiel 11

4 mg Peptid G, das gemäss Herstellungsbeispiel B-16b bei der Synthese der Peptide erhalten wordenwar, und 20 mg BSA wurden in 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M

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Glutaraldehydlösung gegeben und dann wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 1 1 Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 21 mg Human-Interferon-.;^-Antigen, nachfolgend als Antigen-·^/-C-V bezeichnet, erhielt.

0 Das Antigen-d-- -C-V enthielt im Durchschnitt 8 Mole Peptid G in Kombination mit 1 Mol BSA.

Herstellungsbeispiel 12

'10 mg Peptid I, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel C-1b bei der Synthese der Peptide, und 50 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Lösung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 48 Stunden mit 1 1 Wasser von 4°C dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt.

Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 45 mg Human-Interferon-ß-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-I bezeichnet, erhielt.

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Herstellungsbeispiel· 13

5 mg Peptid J, welches gemäss Herstellungsbeäspiel C-2b bei der Synthese der Peptide hergestellt worden war, und 20 mg BSA wurden in 2 ml 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 48 Stunden mit 1 1 Wasser von 4°C dialy- siert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt« Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 23 mg Human-Interferon-ß-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-II bezeichnet, erhielt.

Herstollungsbeispiel 1 4

4 mg Peptid K, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel C--3b bei der Synthese der Peptide, und 15 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt= Dann wurde die Reaktionsinischung mit 1 1 Wasser von 4⁰C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechsel.t Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 17 mg Human-Inter-Feron-ß-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-III bezeichnet_f erhielt.

- 140 -

- j-ro -

Herstellungsbeispiel 15

4 mg Peptid L, das gemäss Herstellungsbeispiel C-4b bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 12 ing BSA wurden in 2 ml einer 0,1 M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0_r11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung 48 Stunden bei 4°C dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert wobei man 14 mg Human-Interferon-ß-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-IV bezeichnet, erhielt.

Herstellungsbeispiel 16

8 mg Peptid M, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel C-5b bei der Peptidsynthese, und 25 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktion gegen 1 1 Wasser von 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die diaiysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 31 mg Hviman-Interferon-ß-Antigen, nachfolgend als Antigen-ß-V bezeichnet, erhielt.

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Herstellungsbeispiel 17

8 mg Peptid M, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel C-5b bei der Peptidsynthese, und 25 rag BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurde Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 2 1 Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, welche die Peptid-Protein-Zusammensetzung. enthielt, wurde lyophilisiert, wobei man 29 mg Human-Interferon-ß-Antigen,· nachfolgend als Antigen-ß-VI bezeichnet, erhielt.

Herstellung von Antikörpern
Herstellungsbeispiel 1

100 Mikrogramm Antigen-,^/-N-I, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel 1 bei der Herstellung der Antigene, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines"Complete Freund's Adjuvant" unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge wurde dem gleichen 0 Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde, die gleiche Menge der Suspension den gleichen

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Kaninchen dreimal monatlich verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen. Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen _f wobei man das Serum, enthaltend Human-Interferon-cv-Antikörper, erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper- (js/ -N-I bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 2

20 Mikrogramm Antigen-,^ -N-II, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 2 bei der Herstellung der Antigene, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml einers "Complete Freund¹ s Adjuvant" unter Ausbildung einer Suspensiongegeben. Diese Suspension wurde subkutan sieben Kaninchen (jedes mit einem Gewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen. Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Interferon-öl·-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend ans Antikörper-oO-N-II bezeichnet.

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Herstellungsbeispiel 3

20 Mikrogramm Antigen-rb-N-III, erhalten gemäss Her-Stellungsbeispiel 3 bei der Herstellung der Antigene, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und dazu wurden 1,5 ml eines Complete Freund¹s Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan sieben Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen dreimal monatlich verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung wurde den Versuchstieren Blut entnommen und das Blut wurde auf einer Zentrifuge getrennt, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interferon-φ-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-- fa-N-III bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 4

100 Mikrogramm Antigen-oO-N-III, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 3 bei der Herstellung von Antigenen wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und dazu wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben.

Diese Suspension wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem Gewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und

- T 44 _

die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Versuchstieren Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interferon-φ-Antikörper enthielt, nachfolgend wird dieses Produkt als Antikörper-oO -N-IV bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 5

20 Mikrogramm Antigen-o</-N-IV, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel 4 bei der Herstellung von Antigenen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und dazu wurden 1,5 ml an Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben.

Diese Suspension wurde subkutan sieben Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und zwar wurde die gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen und einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum, enthaltend Human-Interferonoi> -Antikörper, erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-o0-N-V bezeichnet.

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Herstellungsbeispxel 6

100 Mikrogramm Antigen-.5O-N-IV, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 4 bei der Herstellung von Antigenen, wurde in 1 _r 5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und zwar wurde die gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen und einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-Interferon-ok-Antikörper erhielt. Nachfolgend wird dieses Produkt als Antikörper-Φ-N-VI bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 7

Unter Verwendung von 20 mg Antigen-C^-N-V, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 5 bei der Herstellung von Antigenen, und nach dem gleichen Verfahren wie im vorhergehenden Herstellungsbeispiel 5 erhält man ein Serum, welches Human-Interferon-oC—Antikörper enthält. Nachfolgend wird dieses Produkt als Antikörper-O^-N-VII bezeichnet.

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Herstellungsbeispiel 8

Unter Verwendung von 100 Mikrogramm Antigen-.^O-N-V, das gemäss Herstellungsbeispiel 5 bei der Herstellung von Antigenen erhalten worden war, und einen ähnlichen Verfahren wie es vorher beim Herstellungsverfahren 4 beschrieben wurde, erhält man ein Se'rum, welches Humaninterferon- φ-Antikörper enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ö(/-N-VI11 bezeichnet. 10

Herstellungsbeispiel 9

Unter Verwendung von 20 Mikrogramm Antigen-<X—N-VI, das gemäss Herstellungsbeispiel 6 bei der Herstellung von Antigenen erhalten worden war, und einem ähnlichen Verfahren, wie es vorher für Herstellungsbeispiel 3 beschrieben wurde, erhält man ein Serum, das Human-Interferon-Φ-Antikörper enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-.^-N-IX bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 10

Unter Verwendung von 100 Mikrogramm Antigen-cC-N-VI, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 6 bei der Herstellung von Antigen, und nach einem ähnlichen Verfahren wie zuvor im Herstellungsbeispiel 4 beschrieben, wurden drei Kaninchen immunisiert und von diesen Kaninchen

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wurde das Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen und dabei erhielt man ein Serum, das Human-Interferon-c^-Antikörper enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-oO-N-X bezeichnet .

Herstellungsbeispiel 11

100 Mikrogramm Antigen-oO-c-III, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 9 bei der Herstellung von Antigenen, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Die Suspension wurde subkutan 7 Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde Blut von den Kaninchen entnommen und einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum' erhielt, welches Human-Interferon-d/-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper- ck/-C-III bezeichnet.

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Herstellungsbeispiele 12 bis 14

Unter Verwendung von Antigen- #6-C-1, Antigen-^-C-II und Antigen-oL- -C-IV, die nach den Herstellungsbeispielen 7, 8 bzw. 10 bei der Herstellung der Antigene erhalten worden waren, und nach einem Verfahren, wie es zuvor im Herstellungsbeispiel 11 für die Herstellung von Antikörpern beschrieben wurde, erhielt man Seren, die jeweils die entsprechenden Human-Interferon-ι/-'-Antikörper enthielten. Diese Produkte werden nachfolgend als Antikörper-ds-C-1, Antikörper-^y-C-II bzw.
Antikörper-(^.y-C-IV bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 15

30 Mikrogramm Antigen- c//-C-III, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 9 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension
gegeben. Diese Suspension wurde subkutan einem Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2,7 kg verabreicht

und die gleiche Menge der Suspension wurde dem Kaninchen jede zweite Woche fünfmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich dem Kaninchen in einem Intervall von 3 Wochen fünfmal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde Blut von dem Kaninchen entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen,

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- vw -

wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interferon-oO-Antikörper enthielte Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-O¹^-C-V bezeichnet»

Herstellungsbeispiel 16 · ■

Unter Verwendung von 60 Mikrograirun Antigen-C^-C-III, welches gemäss Herstellungsbeispiel 9 bei der Herstellung von Antigenen erhalten worden war, und nach einem gleichen Verfahren, wie es zuvor beim Herstellungsverfahren 15 bei der Herstellung von Antikörpern beschrieben wurde, erhält man ein Human-Interferon-i^ Antikörper enthaltendes Serum. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-οι/-C-VI bezeichnet.

0 Herstellungsbeispiel 17

Unter Verwendung von 30 Mikrograrnm Antigen-ck -C-V, die gemäss Herstellungsbeispiel 11 bei der Herstellung von Antigenen erhalten worden waren und nach einem Verfahrenentsprechend dem vorstehend erwähnten Herstellungsbeispiel 15 für die Herstellung von Antikörpern, wurde unter Verwendung von zwei Kaninchen (mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) Serum erhalten, das Humaninterferon- df -Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ob-C-VIII bezeichnet.

- 150 -

-UeA-

Herstellungsbeispiel 18

Unter Verwendung von 60 Mikrogramm Antigen-Cv-C-V, das gemäss Herstellungsbeispiel 11 bei der Herstellung von Antigen erhalten worden war, und nach einem Verfahren
entsprechend dem Herstellungsbeispiel 15 für die Zubereitung von Antikörpern, wurden fünf Kaninchen (jedes
mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) immunisiert und den Kaninchen wurde Blut entnommen und dieses Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man Seren erhielt, die jeweils Human-Interferon-Antikörper enthielten. Diese Produkte werden nachfolgend als Antikörper- C^-C-IX, Antikörper-oC-C-X, Antikörper-^ -C-XI, Antikörper-:*/-C-XII bzw. Antikörper-oG-C-XIII bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 19

250 Mikrogramm Antigen-ß-I, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 12 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben.

Diese Suspension wurde vier Kaninchen (jeweils mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) subkutan verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätz-

lieh den gleichen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der

- 151 -

-WI-

Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt xvird nachfolgend als Antikörper-ß-I bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 20

25 Mikrogramm Antigen-ß-II, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 13 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5.ml eines Complete Freund 's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde vier Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) subkutan verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ß-II bezeichnet.

- 152 -

Herstellungsbeispiel 21

25 Mikrogramm Antigen-ß-III, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 14 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan vier Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ß-III bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 22

25 Mikrogramm Antigen-ß-IV, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 15 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Die Suspension wurde subkutan vier Kaninchen (jeweils mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg)

- 153 -

verabreicht, wobei die gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht wurde. Ausserdem v/urde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-Interferon-ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ß-IV bezeichnet.

Herstellungf.beispiel 2 3

25 Mikrogramm Antigen-ß-V, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 16 bei der Herstellung von Antigenen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan vier Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Ausserdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen. Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-Unterferon~ß-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ß~V bezeichnet.

- 154 -

Herstellungsbeispiel 24

Unter Verwendung von Antigen-ß-VI, das gemäss Herstellungsbeispiel 17 bei der Herstellung von Antigen erhalten worden war und nach einem Verfahren, das dem vorher erwähnten Herstellungsbeispiel 15 bei der Herstellung von Antikörpern entspricht, erhält man ein Serum, das einen Antikörper mit hoher Wirksamkeit und hoher
Spezifität gegenüber Human-Interferon-ß enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-ß-VI bezeichnet,

Bestimmung der Titer des Antikörpers - (1)

Der Titer des ■ Antikörper-G^-N-I bis co -N-X wurde wie folgt bestimmt.

0 Jeder der Antikörper wurde mit einer physiologischen
Kochsalzlösung verdünnt unter Ausbildung von Serienverdünnungsproben mit einer 10, 10 , 10, 10 , 10 -fach verdünnten Konzentration (Anfangskonzentration). Zu

jeweils 100 Mikrolitern dieser verdünnten Proben wur-

1 25
den 0,1 ml einer verdünnten Lösung von J-markiertem Peptid D (das erhalten wurde gemäss dem Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid 1 und das auf eine Verdünnung gebracht worden war, dass es eine Radioaktivität von etwa 9500 cpm aufwies) gegeben, sowie 0,2 ml einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,25 % BSA und 10 mM EDTA und 0,02 % NaN₃) und diese Mischung

- 155 -

wurde 2 4 Stunden bei 4⁰C inkubiert. Man erhielt ein Produkt aus dem Antikörper, kombiniert mit dem J-markierten Peptid D in der inkubierten Mischung und dieses Produkt wurde von nicht-umgesetzten (nicht-

1 25

kombinierten) J-markiertem Peptid D mittels einer dextranaktivierten Kohlenstoffmethode und durch Zentrifugentrennung (bei 4⁰C während 30 Minuten bei 3000 üpm) isoliert.

Das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem

1 25

J-markierten Peptid D in dem gebildeten Produkt wurde durch Messung der Radioaktivität einer jeden Probe in der Serienverdünnung festgestellt. Die Daten für das Kombinationsverhältnis (%) aus den jeweiligen Proben bei den Serienverdünnungen wurden auf ein Schaubild aufgetragen, wobei die Ordinate das Kombinationsver-

1 25

-hältnis (%) des Antikörpers zu dem J-markierten Peptid D zeigt und die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers angibt. Aus der aufgetragenen Kurve ergibt sich bei einer Verdünnungskonzentration des Antikörpers von 50 % ein Kombinationsverhältnis entsprechend dem Titer des Antikörpers. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

- 156 -

λΆλ

Tabelle 1

Antikörper	Titer	Antikörper	Titer
ci/-N-I	10.000	cU-N-V	150.000
cMsr-ii	12.000	C^-N-VII	180.000
C^-N-III	120.000	C^-N-VIII	42.000
C^-N-IV	200.000	C^-N-X	28.000

Test für die Spezifität des Antikörpers über Human-Lymphoblastoid-Interfcron.

gegen-

Bei der Durchführung dieses Tests für die Spezifität wurden folgende Materialien als zu untersuchende Proben verwendet:

(1) Human-Interferon-ß (hergesteylt von Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science,

spezifische Aktivität: 3x10 schiedlichen Konzentrationen.

U/mg Protein) in unter-

(2) Peptid C, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel A-3 von der Synthese von Peptiden mit einer Peptidkette von Human-Lymphoblastoid-Interferon.

(3) Human-Interferon-c/v/ (hergestellt von Hayashibare Biochemical Research Laboratory, lymphoblastoides Interferon Lot. Nr. 800 92 8).

- 157 -

(4) Human-Interf eron-ίΛ/ (erhalten von Dr. Cantell, Central Public Health Lab., Finnland).

Weiterhin wurden Standardverdünnungsmittel, wie eine 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4)/ enthaltend 0,25 % BSA, 5 mM EDTA und 0,02 % NaN₃, verwendet.

In Reagenzgläser werden jweils 0,2 ml des Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml Antikörper-oO-N-IV, erhalten gemäss .Herstellungsbeispiel 4 bei der Herstellung der Antikörper (Titer =

1 25

200.000) und 0,1 ml J-markiertes Peptid D (das gemäss Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid - 1 erhalten worden war, und das zu einer verdünnten Lö-. sung mit etwa 2.800 cpm Radioaktivität verdünnt worden war) gegeben. Jeder der die obige Mischung enthaltenden Reagenzgläser wird während 72 Stunden bei 4⁰C inkubiert und dann werden 0,1 ml normales Schweineserum dem Gemisch zugegeben und anschliessend daran 0,5 ml einer Suspension aus Aktivkohle, welche mit Dextran beschichtet ist und die gesamte Mischung lässt man 30 Minuten bei 4°C stehen. Anschliessend wird die gesamte Mischung 30 Minuten bei 3.000 üpm bei 4⁰C auf der Zentrifuge getrennt, um das gebildete Produkt aus dem Antikörper in

1 25

Kombination mit dem J-markierten Peptid von dem nicht-

125

umgesetzten (nicht-kombinierten) J-markierten Peptid zu trennen. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide

1 25 wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B ) entsprechend dem

- 158 -

Titer des verwendeten Antikörpers mit 1OO % einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativ gebundenen Menge ( % = Β/Β χ 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentration der zu prüfenden Proben zeigt (Peptid C, das gemäss Herstellungsbeispiel A-3 bei der Synthese der Peptide hergestellt wurde und eine Peptidkette aus Human-Lymphoblastoid-Interferon, Human-Interferon-ß und Human-Interferon-c^.- hat) . In dieser Fig. 1 bedeutet die Kurve (a) Peptid C, d.h. eine Peptidkette mit Human-Lymphoblastoid-Interferon, Kurve (b) ein Human-Interferon-^ (Cantell), Kurve (c) ein Human-Interferon-oO (hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory) und Kurve (d) ein Human-Interferon-ß. Aus den in Fig. 1 gezeigten Kurven wird ersichtlich, dass die Reaktivität von Antikörper- d/-N-IV gegenüber Humaninterferon- cC- deutlich unterschiedlich ist von der Reaktivität von Antikörper-Cw-N-IV gegenüber Human-Interferon-ß und dies bedeutet, dass der Antikörper- o(/-N-IV ein Antikörper hoher Spezifität ist und dass er bis zu einer Kombzentration von 3,0 χ 10 U/ml mit Human-Interferon-ß reagiert (cross match).

Bewertung der Titer von Antikörpern - (2)

Der Titer der Antikörper-c\/-C-I bis Antikörper-oO-C-XIII wurde wie folgt bewertet:

Jeder der Antikörper wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wobei man Serienverdünnungsproben mit

- 159 -

einer 10, 1O², 10³, 10⁴, 10⁵, ... -fachen Verdünnungskonzentration (bezogen auf die Anfangskonzentration) erhielt. Zu 100 Mikrclitern jeder dieser Verdünnungs-

1 25 proben wurden 0,1 ml einer verdünnten Lösung von J-markiertem Peptid H zugegeben (diese verdünnte Probe wurde gemäss Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid 2-1 hergestellt und wurde dann auf eine verdünnte Lösung mit einer Radioaktivität von etwa 9.50 0 cpm verdünnt), sowie 0,2 ml 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,25 % BSA, 10 nM EDTA und 0,02 % NaN-,) und diese Mischung wurde 2 4 Stunden bei 4 ⁰C inkubiert. Das gebildete Produkt aus dem Antikörper, kom-

1 25
biniert mit J-markiertem Peptid H, wurde aus der Mischung von dem nicht-umgesetzten (nicht-kombinierten)

125

J-markierten Peptid H durch die dextrakaktivierte Kohlenstoffmethode und Zentrifugenabtrennung (bei 4⁰C während 30 Minuten, 3.000 Upm) abgetrennt.

Das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem

125

J-markierten Peptid H in dem gebildeten Produkt wurde bestimmt, indem man die Radioaktivität einer jeden Probe bei der Serienverdünnungskonzentration mass. Die Daten für das Kombinationsverhältnis (%), die man bei den jeweiligen Proben in den Serienverdünnungskonzentrationen erhielt, wurden zu einer Kurve aufgetragen, in welcher die Ordinate, das Kombinationsverhältnis (%)

1 25

des Antikörpers zu dem J-markierten Peptid H anzeigt und die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers (Anfangskonzentration). Aus der Kurve kann man dann eine Verdünnungskonzentration des Antikörpers, die 50 % des Kombinationsverhältnisses zeigt und welche

- 160 -

dem Titer des Antikörpers entspricht, erhalten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Antikörper	Titer	Antikörper	Titer
d/-C-I	2.500	^-C-VIII	1 .200
4/-C-II	4.200	ds-C-IX	6.000
ob-C-III	50.000	ds -C-X	1 .100
oUc-IV	1 .200	et-C-XI	2.200
&-C-V	10.400	ώ -C-XIi	3.600
d-c-vi	2.600	SÜ-C-XIII	1 .000
'.1-C-VII	40.000

Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 geht hervor, dass C-terminierte Peptide von Human-Interferon- der allgemeinen Formel (II) und deren Derivate eine starke Antigenität im Vergleich zu anderen Peptiden aufweisen, wie dies ersichtlich wird aus dem Titer von Antikörper-cL-C-IX bis cXy-C-XIII und dass die brauchbaren Antikörper in den meisten Tieren, denen das Antigen verabreicht wurde, gebildet werden.

- 161 -

Test für die Spezifität von Antikörper-cO-C-III gegenüber Human-Interferon-dv

(a) Bei der Durchführung dieses Tests hinsichtlich der Spezifität wurden folgende als Proben verwendete Materialien untersucht:

(1) Huraan-Interferon-ß (hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, spezifische Aktivität: 3x1'
Konzentrationen„

Aktivität: 3 χ 10 U/mg Protein) in unterschiedlichen

(2) Peptid G, earhalten gemäss Herstellungsbeispiel 16b bei der Synthese des Peptide, mit einer Peptidkette von Human-Interf eron- φ.

(3) Human-Interferon-,^ (lymphoblastoides Interferon, hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory).

Als Standardverdünnungsmittel wurde eine 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,25 % BSA, 5 mM EDTA und 0,02 5 NaN-,, verwendet.

In eine Reihe von Reagenzgläsern wurden jeweils 0,2 ml des Standardverdünnungsmittels,, 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml Antikörper- (Xy-C-III, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 11 der Zubereitungen für

1 25
Antikörper, und 0,1 ml J-markiertes Peptid H vorgelegt (wobei das Peptid H gemäss Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid 2-1 hergestellt worden war und

- 162 -

32112B3

zu einer Lösung verdünnt wurde, die etwa 2.800 cpm Radioaktivität aufwies. Jedes der die obige Mischung enthaltenden Reagenzgläser wurde 72 Stunden bei 4⁰C inkubiert und dann wurden 0,1 ml eines normalen Schweineserums zu der inkubierten Mischung gegeben und daran anschliessend 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, die mit Dextran beschichtet war. Man liess die Mischung 30 Minuten bei 4⁰C stehen und führte dann eine Zentrifugentrennung bei 4⁰C während 30 Minuten mit 3.000 üpm durch, wodurch das gebildete Produkt aus dem Antikörper,

125
kombiniert mit dem J-markierten Peptid, von dem nicht-

1 25 umgesetzten (nicht-kombinierten) J-markierten Peptid abgetrennt wurde. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%>) von

1 25

J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B ) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100 % einsetzt. Aus den bei diesem Versuch ermittelten Ergebnissen geht hervor, dass die Reaktivität von Antikörper-;-^ -C-III gegenüber Human-Interferon-^ eindeutig verschieden ist von der Reaktivität des Antikörpers-.ίΤθ-C-III gegenüber Human-Interferon-ß und das bedeutet, dass Antikörper- OJ -C-III ein Antikörper hoher Spezifität ist, der nur eine niedrige Kreuzprobe (cross matching) zu Human-Interferon-ß aufweist.

Weiterhin wurden ähnliche Versuche hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-öO-C-I, Antikörper-cO-C-II und Antikörper-öl-C-IV bis Antikörper-rl-C-VII und AntikörperoL/-C-IX bis Antikörper-d, -C-XIII gegenüber Human-Interferon-c-o durchgeführt und es wurde dabei bestätigt, dass

- 163 -

diese Antikörper hochspezifisch gegenüber Human-Interferon-cl sind.

(b) Ähnliche Versuche wurden mit Äntikörper-oO-C-VIII im obigen Versuch (a) durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt, wo die Ordinate den relativ gebundenen Prozentsatz {% = Β/Β χ 100) anzeigt, während die Abszisse die Konzentrationen der zu prüfenden Proben zeigt. Peptid G wurde gemäss Herstellungsbeispiel B-16b für die Synthese von Peptiden hergestellt, d.h. mit einer Peptidkette von Human-Interferon-oO. Weiterhin wurde für die Untersuchungen verwendet Human-Interf eron-oü (lymphoblastoides Interferon, hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory, und Leukocyten-Interferon, erhalten vom National Institute of Health),sowie Human-Interferon-ß (spezifische Aktivität: 3x10 ü/mg Protein, hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science). In Fig. 2 zeigt Kurve (a) Peptid G an, Kurve (b) Human-Interferon-(hergestellt von Hashibara Biochemical Research Laboratory) , Kurve (c) Human-Interf eron- ck/ (erhältlich von National Institute of Health) und Kurve (d) llumaninterferon-ß (hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science). Aus den Kurven in Fig. 2 wird ersichtlich, dass die Reaktivität von Antikörper-φ-C-VIII zu Human-Interferon eindeutig unterschiedlich ist gegenüber der Reaktivität von Antikörper-ch-C-VIII zu Human-Interferon-ß und dies bedeutet, dass Antikörper-oO-c-VIII ein Antikörper mit hoher Spezifität ist und dass es keine Kreuzprobe mit Human-Interferon-ß bis zu einer

- VerA -

Konzentration von 1,0 χ 10 U/ml zeigt.

Untersuchung des Titers von Antikörper - (3)

Der Titer von Antikörper-ß-I bis Antikörper-ß-VI wurde wie folgt bewertet.

Jeder der Antikörper wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt, unter.Erhalt von Verdünnungsproben mit einer 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, ... -fachen Verdünnungskonzentration. Zu 100 Mikrolitern einer jeden dieser verdünnten Proben wurden 0,1 ml einer verdünnten

1 25
Lösung von J-markiertem Peptid M gegeben (Peptid M wurde gemäss Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid - 3 erhalten und dieses wurde verdünnt auf eine Radioaktivität von etwa 10.000 cpm) , sowie 0,2 ml 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,1 % BSA, 0 0,15M Natriumchlorid und 0,01 % NaN₃) und dann wurde

die Mischung 24 Stunden bei 4⁰C inkubiert. Das erhalte-

125

ne Produkt aus Antikörper, kombiniert mit J-markiertem Peptid M, das sich in der inkubierten Mischung gebildet hatte, wurde von nicht-umgesetztem (nicht-kombi-

125
niertem) J-markiertem Peptid M durch die Dextran-Aktivkohle-Methode und Zentrifugentrennung (bei 4⁰C während 15 Minuten, 3.000 Upm) isoliert.

1 25 Das Kombinationsverhältnis (%) von Antikörper zu J-markiertem Peptid M in dem gebildeten Produkt wurde bestimmt, indem man die Radioaktivität der Proben in den

- 165 -

- 1-6-5 -

Serienverdünnungskonzentrationen untersuchte. Die Daten des Kombinationsverhältnisses (%), erhalten mit den jeweiligen Proben bei den Serienverdünnungskonzentrationen (Anfangskonzentration) wurden in eine Kurve eingetragen, in welcher die Ordinate das Kombinationsverhält-

1

nis (%) des Antikörpers zu J-markiertem Peptid M zeigt, während die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers zeigt. Von den aufgezeichneten Linien wird eine Verdünnungskonzentration des Antikörpers, die 50 % des kombinierten Verhältnisses, entsprechend dem Titer des Antikörpers zeigt, erhalten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle	3	.000 .000

Antikörper
ß-V ß-VI
Titer
52 100

5 Test für die Spezifität von Antikörper-ß-V gegenüber Human-Interferon-ß.

Bei der Durchführung dieses Versuches wurden folgende Materialien als zu untersuchende Proben verwendet: 30

- 166 -

- -we -

(1) Human-Interferon-ß (spezifische Aktivität: 3x10 U/mg Protein, hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science).

(2) Die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M wurde hergestellt gemäss Beispiel 5 von Herstellungsbeispiel C für die Peptidsynthese).

(3) Human-Interferon-oO (lymphoblastoides Interferon, Lot. Nr. 800 92 8, hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory).

Ausserdem wurde als Standardverdünnungsmittel 0,1M Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,1 % BSA, 0,15M NaCl und 0,01 % NaN₃, verwendet.

In Reagenzgläser wurden jeweils 0,2 ml des Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml Antikörper-ß-V, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 23 für die Herstellung von Antikörper (Radioaktivität 52.000) und 0,1 ml von J-markiertem Peptid M vorgelegt (dieses markierte Peptid M wurde gemäss Herstellungsbeispiel für markierte Peptide - 3 erhalten und auf eine Verdünnungskonzentration gebracht, bei der es eine Radioaktivität von etwa 10.000 cpm zeigte). Die Mischung wurde dann 48 Stunden bei 4⁰C inkubiert. Zu der inkubierten Mischung wurden 0,1 ml normales Schafsserum gegeben und dann wurden zu der Mischung 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, beschichtet mit Dextran, gegeben und die ganze Mischung wurde 30 Minuten bei 4⁰C stehen gelassen und dann einer Zentrifugentrennung bei

- 167 -

4°C während 30 Minuten mit 3.000 üpm unterworfen, wobei

man aus dem Produkt den Antikörper, kombiniert mit J-markiertem Peptid von dem nicht-umgesetzten (nicht-kom-

1 25
binierten) J-markierten Peptid abtrennte. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bin-

1 25

dungsverhältnis (%) von J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B ) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100 % einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 3 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativen gebundenen Menge (% = Β/Β χ 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentration der zu prüfenden Proben zeigt (die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M) , Human-Interferon-ß und Human-Interferon-C^ ). In Fig. 3 bedeutet Kurve (a) die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M), Kurve (b) Human-Interferon-ß und Kurve (c) Human-Interferon-f^-- Aus den Kurven in Fig. 3 wird ersichtlich, dass die Reaktivität von Antikörper-ß-V gegenüber Human-Interferoneindeutig unterschiedlich ist von der Reaktivität von Antikörper-ß~V gegenüber Human-Interferon-ß und daraus lässt sich entnehmen, dass Antikörper-ß-V ein Antikörper mit hoher Spezifität ist und dass er keine Kreuzprobe

mit Interferon-oo bis zu einer Konzentration von 3,7 χ 10⁶ U/ml zeigt.

Weitere, ähnliche Versuche hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-ß-VI gegenüber Interferon-ß wurden durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Fig„ 4 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativen

- 168 -

gebundenen Menge (% = Β/Β χ 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentration der zu prüfenden Proben zeigt (die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M), Human-Interferon-ß und Human-Interferon-^O ). 5

In Fig. 4 bedeutet Kurve (d) die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M), Kurve (e) ist Human-Interferon-ß und Kurve (f) Human-Interferon-c^/.

Ähnliche Versuche wurden hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-ß-II, Antikörper-ß-III und Antikörper-ß-IV durchgeführt. Hierfür wurden jeweils 0,2 ml des vorerwähnten Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der vorerwähnten zu prüfenden Proben, 0,1 ml Antikörper-ß-II, Antikörper-ß-III oder Antikörper-ß-IV, sowie 0,1 ml

1 ?5

J-markiertes Peptid M eingefüllt und die Umsetzung

wurde dann in gleicher Weise wie vorher angegeben durchgeführt. Nimmt man die Bindungsreaktivität zwischen AntikÖrper-ß-V oder Antikörper-ß-VI, erhalten von der

1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M) und das 1. bis 13. Peptid von Human-Interferon-ß (Peptid) mit 100 % an, so werden die relativ gebundenen Prozentsätze (%) für die jeweiligen Antikörper in Tabelle 4 gezeigt.

- 169 -

Tabelle 4

Antikörper	relativ ge- - bundener Pro zentsatz	Antikörper	relativ ge bundener Pro sentsatz
ß-V	100	ß-VI	100
ß-II	25	ß-II	25
ß-II I	30	ß-III	27
ß-IV	50	ß-IV	70

Bestimmung der Empfindlichkeitsgrenze

In Reagenzgläser v/erden jeweils 0,2 ml eines Standard-Verdünnungsmittels, 0,1 ml der 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptid M), 0,1 ml Antikörper-ß-V erhalten gemäss Beispiel 23 für die Herstellung von Antikörpern oder Antikörper-ß-VI, erhalten gemäss Beispiel 24 für die Herstellung von Antikörper, und 0,1 ml von

125 125

J-markiertem Peptid M vorgelegt (wobei das J-mar-

kierte Peptid M gemäss Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid - 3 hergestellt wurde und so verdünnt wurde, dass es eine Radioaktivität von 10.0 00 cpm aufwies) und die Mischung wird 48 Stunden bei 4⁰C inkubiert. Zu der inkubierten Mischung gibt man 0,1 ml normales Schafsserum und anschliessend daran gibt man 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, die mit Dextran beschichtet ist, hinzu und lässt die Mischung dann 30 Minuten bei 4⁰C stehen, worauf man dann eine Zentrifugentrennung während

- 170 -

- MK) -

30 Minuten bei 40⁰C und mit 3.000 Upm durchführt und das gebildete Produkt aus dem Antikörper, der mit dem

1 25

J-markierten Peptid kombiniert ist vom nicht-umge-

1 25
setzten (nicht-kombinierten) J-markierten Peptid abtrennt. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde

1 25 gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B ) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100 % einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt, in welcher die Ordinate den relativ gebundenen Prozentsatz (% = Β/Β χ 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentrationen der 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-ß (Peptin M), Kurve (g) die Daten, die man unter Verwendung von Antikörper-ß-V und Kurve (h) die Daten, die man unter Verwendung von Antikörper-ß-VI erhält, zeigt. Aus diesen Kurven in Fig. 5 geht hervor, dass die Minimumsensitivitätsgrenze zur Bestimmung von Human-Interferon 13 Pico-0 gramra/ml bei Verwendung von Antikörper-ß-V und 5 pg/ml bei Verwendung von Antikörper-ß-VI beträgt.

Bestinuimng von Human-Interferon- ¹X/ durch Fluor es zenz polarisations-Immunoassay - 1

i?§£§tellun2_einer_Fluorochrom-markierten

FITC-markiertes Peptid C (hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid - 4(1)) wurde in

- 171 -

0,1M Natriumphosphatpufferlösung (pH 7), enthaltend 0,9 w/v % NaCl und 0,05 w/v % BSA, gelöst, bis zu einer

-9 Lösung mit einer Konzentration von 3x10 M FITC-markiertem Peptid C. Nachfolgend wird diese Lösung als Lösung A bezeichnet.

(b)

Eine Lösung der gleichen Zusammensetzung wie die Lösung A/ mit der Ausnahme, dass sie ohne FITC-markiertes Peptid C hergestellt wurde. Nachfolgend wird diese Lösung als Lösung B bezeichnet.
15

(c) @§£§tellung_einer_Antikörger-Lösung

Antikörper-Cv-N-VII (erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 7 für die Herstellung von Antikörpern und mit einem Titer von 180.000 wurde um das 150-fache mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Diese Lösung wird nachfolgend als Lösung C bezeichnet.

(d)

Eine Verdünnungslösung (pH 7,8), enthaltend 9,89 g/l H₃BO₃, 4,32 g/l Na₂B₄O₇-IOH₃O, 9 g/l NaCl, 0,005 w/v % NaN₃ und 0,01 w/v % BSA, wurde hergestellt. Diese Lösung wird nachfolgend als Lösung D bezeichnet.

- 172 -

(e) Herstellun2_einer_Verdünnun2glösun2sreihe

(1) Peptid C (hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel Ä-3-5 für die Herstellung von Peptiden) wurde in O,1M Natriumphosphatpufferlösung (pH 6,5), enthaltend 0,9 w/v % NaCl, 0,05 w/v % BSA, gelöst unter Erhalt einer Lösung, die das Peptid C in einer Konzentration von 5 Mikrogramm/1 enthielt. Diese Lösung wurde mit der Lösung D verdünnt unter Herstellung einer Verdünnungsserie mit den Konzentrationen 500, 250, 125, 62,5 31,25, 15,6, 7,8, 3,9, 1,95, 0,925, 0,46 3 und 0 ng/ml an Peptid C.

(2) Unter Verwendung von Human-Interferon-Φ (Canteil) und in ähnlicher Weise wie unter (1) beschrieben,

wurdo eine Verdünnungslösungsrexhe von Human-Interferon-o6 hergestellt. Die Konzentrationen dieser Verdünnungslösungsreihe betrugen 1 χ 10⁶, 0,5 χ 10⁶, 0,25 χ 10⁶, 0,125 χ 10⁶, 0,063 χ 10⁶, 0,031 χ 10⁶, 0,016 χ 10⁶, 0,008 χ 10⁶ und 0 U/ml an Human-Interferon-C^.

(f)

Zu jeweils 0,2 ml jeder der gemäss (e-1) hergestellten Verdünnungslösungen wurden 0,05 ml Lösung A, 0,1 ml Lösung C und 0,65 ml Lösung D zugegeben, wobei man Probelösungen des Peptids C erhielt. In ähnlicher Weise wurde eine Vergleichsprobe einer Lösung des Peptids C unter Verwendung von 0,05 ml Lösung B anstelle von Lösung A hergestellt.

- 173 -

In gleicher Weise wie vorher angegeben, wurde eine Reihe von verdünnten Probelösungen von Human-Interferon-cO und eine Reihe von verdünnten Probelösungen daraus aus den Serienverdünnungslösungen, wie in (e-2) beschrieben wird, hergestellt. Weiterhin wurde eine Probelösung eines Antikörpers für eine Blindprobe hergestellt, indem man 0,05 ml der Lösung A mit 0,95 ml der Lösung D vermischte und eine Vergleichsprobelösung des Antikörpers für die Blindprobe wurde hergestellt, indem man 0,05 ml der Lösung B mit 0,95 ml der Lösung D vermischte*

Jede dieser Probelösungen und Vergleichslösungen wurde 12 Stunden bei 4⁰C inkubiert und dann wurde mit einer Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzpolarisationsintensität im polarisierten Licht die Fluoreszenz gemessen. Der Polarisationsgrad (P-Wert) der Serien von Verdünnungsprobelösungen wurde nach folgender Formel berechnet;

P - {^^4-liHrt4 x ₁₀₀

^{IVS ¹VrJ ^{+ (I}HS ¹IIR'

darin bedeuten:

I _: die Stärke der vertikalen polarisierten Fluores-

zenz der Probe,

I„_s: die Stärke der horizontalen polarisierten Fluoreszenz der Probe,
30

- 174 -

Ι_τττ-: die Stärke der vertikal polarisierten Fluo-

VK

reszenz der Vergleichsprobe, I„„: die Stärke der horizontalen polarisierten

XlK

Fluoreszenz der Vergleichsprobe.

Die Ergebnisse werden in Fig. 6 und 7 gezeigt. Aus diesen Fig. 6 und 7 wurden die Konzentrationen entsprechend der Hälfte der Veränderung des P-Wertes beim Peptid C als 0,70 ng/Reagenzglas und für Human-Interferon-oU mit 7,2 χ 10 U/Reagenzglas festgestellt und das Verhältnis aus diesen Werten, also 91 ü/pg, wurde als das "Cross-Matching- Verhältnis" bezeichnet.

In ähnlicher Weise wurden die P-Werte in Probelösungen aus Human-lnterferon-ίλ.' unbekannter Konzentration bestimmt und die Wirksamkeit wurde dann in Fig. 6 und 7 untersucht.

Bestimmung von Human-Interferon-cO-Fluoreszenzpolarisation Immunoassay - 2

(a)

lösung

DTAF-inarkiertes Peptid G (hergestellt gemäss Herstellungs beispiel für ein markiertes Peptid - 5(2)) wurde in 0,1M Natriumphosphatpufferlösung (pH 7), enthaltend 0,9 w/v % NaCl und 0,05 w/v % BSA, unter Ausbildung einer Lösung

- 175 -

— 9 mit einer Konzentration von 1,5 χ 10 M DTAF-markiertem Peptid G gelöst. Diese Lösung wird nachfolgend als Lösung A' bezeichnet.

(b) LS£St§üi}2S_EiH2E2225Z5£!iS Blindlösung__für_den_Blindversuch

Eine Lösung der gleichen Zusammensetzung wie Lösung A', mit der Ausnahme, dass sie kein DTAF-markiertes Peptid G enthielt, wurde hergestellt. Diese Lösung wird nachfolgend als Lösung B¹ bezeichnet.

(c)

Antikörper- ώ-C-VIII (Titer 1.200), erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 17 der Herstellung für Antikörper, wurde um das 40-fache mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt. Diese Lösung wird nachfolgend als Lösung C bezeichnet.

(d) Herstellung einer Verdünnung_s lösung

Eine Verdünnungslösung (pH 7,0), enthaltend 9,89 g/l H₃BO₃, 4,32 g/l Na₂B₄O₇-IOH₂O, 9 g/1 NaCl, 0,005 w/v % NaN₃ und 0,01 w/v % BSA, wurde hergestellt. Diese Lösung wird nachfolgend als Lösung D' bezeichnet.

- 176 -

(d) Η§2Γί3 tellung_einer_Serie_von_Verdünnun2S lösungen

(1) Peptid G, erhalten in Herstellungsbeispiel B-16b für die Peptidherstellung, wurde in 0,1M Natriumphosphatpufferlosung (pH 6,5), enthaltend 0,9 w/v % NaCl und 0,05 w/v % BSA, zu einer Lösung mit einer Konzentration von 5 Mikrogramm/1 an Peptid G gelöst. Die Lösung wurde mit der Lösung D¹ verdünnt, wobei man verdünnte Lösungen einer Konzentration von 200, 66,7, 22,2, 7,4, 2,5, 0,8 und 0 nM an Peptid G erhielt.

(2) Unter Verwendung von Human-Interferon-O^ (Cantell) und in gleicher Weise wie in (1) beschrieben, wurde eine Reihe von Verdünnungslösungen von Human-Interferon-jo hergestellt. Die Konzentration der Serien der Verdünnungslösungen war 6,4 χ 10 , 3,2 χ 10 , 1,6 χ 10 , 0,8 χ 10⁶, 0,4 χ 10⁶, 0,2 χ 10⁶, 0,1 χ 10⁶, 0,05 χ 10⁶ und 0 U/ml an Human-Interferon-ciG .

(f)

Zu jeweils 0,1 ml von verdünnten Lösungen, hergestellt gemäss (e-1) , wurden 0,2 ml einer Lösung A¹ und 0,2 ml einer Lösung C unter Ausbildung von Probelösungen des Peptids G gegeben. In gleicher Weise wurden Vergleichsprobelösungen von Peptid G hergestellt, unter Verwendung von 0,1 ml Lösung B' anstelle von Lösung A¹. 30

In gleicher Weise wurde eine Reihe von verdünnten Probelösungen von Human-Interferon-oL· und einer Reihe von

- 177 -

verdünnten Probelösungen daraus zur Herstellung einer Reihe von verdünnten Lösungen, wie sie in (e-2) beschrieben werden, hergestellt.

Weiterhin wurde eine Probelösung eines Antikörpers für den Blindversuch hergestellt, indem man 0,2 ml einer Lösung A¹ mit 0,3 ml einer Lösung D¹ vermischte und eine Vergleichsprobelösung von Antikörper für den Blindversuch wurde hergestellt durch Vermischen von 0 ,2 ml einer Lösung B^g mit 0,3 ml einer Lösung D".

Jede dieser Probelösungen und Vergleichsprobelösungen wurde 12 Stunden bei 4 ⁰C inkubiert und dann wurde die Fluoreszenz in polarisiertem Licht bestimmt in einer Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzpolarisationsintensität. Der Polarisationsgrad (P-Wert) der jeweiligen Reihen aus verdünnten Probelösungen wurde nach folgender Formel berechnet:

ί T — τ \ — Π T^

ρ - „vs ^xvr' ^uhs ¹Hs'

P ~ Tt" Zt \—+ (J Tt Γ

^lxVS VR^{; v} HS HR^;

darin bedeuten;
25

I»₇q ! die Stärke der vertikalen Polarisationsfluoreszenz in der Probe,

I_HS: die Stärke der horizontalen Polarisationsfluoreszenz in der Probe,

- 178 -

I _R: die Stärke der vertikalen Polarisationsfluoreszenz der Vergleichsprobe,

die Stärke der horizontalen Polarisations fluoreszenz der Vergleichsprobe.

Die Ergebnisse werden in Fig. 7 gezeigt, wobei man den relativen gebundenen ]
der Formel berechnet:

relativen gebundenen Prozentsatz (B/B (%)) nach folgen-

P-P

B/B_o = χ 100

darin bedeuten:

P : den Polarisationsgrad der Probe

P₀: den Polarisationsgrad der Probe mit einer Null-Konzentration,

P_f: den Polarisationsgrad einer aus der Probe erhaltenen Lösung für den Antikörper-Blindtest.

In Fig. 8 ist die dem 50 %-Wert von B/B entsprechende Konzentration in Peptid G 3 6 nM. Ähnlich wie bei dem vorerwähnten Verfahren wurde die dem 50 %-Wert von B/B entsprechende Konzentration mit 1,0 χ 10 U/ml erhalten. Dann wurde das Verhältnis aus diesen Werten, das 2,78 χ 10 U/nM beträgt, als Kreuzverhältnis angenommen.

In gleicher Weise wurde der P-Wert und der B/B -Wert bei einer Probelösung für Human-Interferon-oO einer unbekannten Konsentration bestimmt und dann wurde die Wirksamkeit wie in Fig. 8 untersucht.

Untersuchung von Human-Interferon-ß durch Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay - 3
10

(a) @§£Etellung_einer_Fluorochrom-markierten_Pegtidlösung

FITC-rnarkiertes Peptid M, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel für ein markiertes Peptid 6(1), wurde in 0,1M Natriumphosphatpufferlösung (pH 7), enthaltend 0,9 w/v % NaGl und 0,05 w/v % BSA, unter Ausbildung einer

-9

Lösung mit einer Konzentration von 3x10 M FITC-markiertem Peptid M gelöst. Diese Lösung wird nachfolgend als Lösung A" bezeichnet.

(b)

tidlösurig_f ür_den_Blindversuch

Eine Lösung der gleichen Zusammensetzung wie die Lösung A", mit der Ausnahme, dass sie kein FITC-markiertes Peptid M enthielt. Nachfolgend wird diese Lösung als Lösung B" bezeichnet.

- 180

(c) Herstellung_einer_Antxkörger-Lösung

Antikörper-ß-V (Wirksamkeit 52.000), erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 23 der Herstellung für Antikörper, wurde um das 800-fache mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Diese Lösung wird nachfolgend als Lösung C" bezeichnet.

(d) Herstellung_eJ.ner_Verdünnung_slösun2

Eine Verdünnungslösung (pH 7,8), enthaltend 9,89 g/l H₃BO₃, 4,32 g/l Na₂B₄O₇-IOH₃O, 9 g/l NaCl, 0,005 w/v NaN₃ und 0,01 w/v % BSA wurde hergestellt und diese Lösung wird nachfolgend als Lösung D" bezeichnet.

(e)

sungen

(1) Peptid M, hergestellt gemäss Herstellungsbeispiel C-5 für die Herstellung von Peptiden, wurde in einer 0,1M Natriumphosphatpufferlösung (pH 6,5), enthaltend 0,9 w/v % NaCl und 0,05 w/v % BSA, unter Erhalt einer Lösung mit einer Konzentration von 5 Mikrogramm/1 an Peptid M, hergestellt. Dann wurde diese Lösung mit Lösung D", wie sie zuvor erwähnt wird, verdünnt, unter Ausbildung einer Reihe von verdünnten Lösungen mit Konzentrationen von 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,6, 7.8. 3.9, 1,95, 0,925, 0,465 und 0 ng/ml an Peptid M.

- 181 -

(2) Unter Verwendung von Human-Interferon-ß (hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science) und nach dem gleichen Verfahren, wie es in (1) vorstehend beschrieben wird, wurde eine Reihe von verdünnten Lösungen von Human-Interferon-ß hergestellt. Die Konzentrationen der Serien der verdünnten Lösungen betrug 2 χ 10⁶, 1 χ "ΙΟ⁶, 0,5 χ 10⁶, 0,25 χ 10⁶, 0,125 χ 10^β, 0,053 χ 10⁶, 0,031 χ 10⁶, 0,016 χ 10^β und 0 U/ml an Human-Interferon-ßo
10

(f) Bggtiinmung_des_Polarisationsgrades__(P3Wert)

Zu 0,2 ml der jeweils hergestellten verdünnten Lösungen gemäss (e-1) wurden 0,05 ml Lösung A", 0,1 ml Lösung C" und 0,65 ml Lösung D" zur Herstellung von Probelösungen des Pepbids M hergestellt.

Ebenso wurden Vergleichsprobelösungen des Peptids M hergestellt, unter Verwendung von 0,05 ml Lösung B" anstelle von Lösung A".

Wie oben beschrieben wurde eine Reihe von verdünnten Probelösungen von Human-Interferon-ß und eine Reihe von verdünnten Vergleichsprobelösungen aus den Reihen, wie sie für die verdünnten Lösungen in (e-2) beschrieben werden, hergeste11t.

Dann wurde eine Probelösung eines Antikörpers für einen Blindversuch hergestellt, indem man 0,05 ml der Lösung A" mit 0,95 ml der Lösung D" vermischte und eine

- 182 -

Vergleichsprobelösung des Antikörpers für den Blindtest wurde hergestellt durch Vermischen von 0,05 ml der Lösung B" mit 0,95 ml der Lösung D".

Jede dieser Probelösungen und Vergleichsprobelösungen wurde 12 Stunden bei 4⁰C inkubiert und dann wurde die Fluoreszenz von polarisiertem Licht in einer Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzpolarisationsintensität gemessen. Der Polarisationsgrad (P-Wert) der jeweiligen Serien der verdünnten Probelösungen wurde nach folgender Gleichen bestimmt:

ρ ₌ ^(IVS"^IVR⁾ " ^(IHS"^IHR⁾

(I -I ) + (I -I ) * VS VR^{; lX}HS ^HR'

darin bedeuten:

I,_re: die Stärke der vertikal polarisierten Fluo-

Vb

reszenz der Probe,

I„_o: die Stärke der horizontal polarisierten Fluo-

XlO

reszenz der Probe,

•ⁱ-vR^: ^^e stärke ^^er vertikal polarisierten Fluoreszenz der Vergleichsprobe,

I„_R: die Stärke der horizontal polarisierten Fluoreszenz der Vergleichsprobe. 30

Die Ergebnisse werden in den Fig. 9 und 10 gezeigt. Aus den Fig. 9 und 10 sind die Konzentrationen entsprechend

der halben Veränderung des P-Wertes ersichtlich. Sie betragen 1 ng/Reagenzglas in Peptid M und 2,1 χ 10 U/ Reagenzglas bei Human-Interferon-ß und aus dem Verhältnis dieser Werte errechnet sich ein Wert von 210 U/pg, als Kreuzverhältnis.

In gleicher Weise wurden die P-Werte bei den Probelösungen von Human-Interferon-ß unbekannter Konzentration bestimmt. Die Wirksamkeiten der Interferone kann aus Fig. 9 und 10 entnommen werden. ν 1 0

Herstellung von immobilisierten Antikörpern

Herstellungsbeispiel 1

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-V, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 23 für die Herstellung von Antikörpern, wurde in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst, und dazu wurden 3 ml einer gesättigten, wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Zu dem Gemisch wurden 3 ml destilliertes Wasser gegeben und dann liess man 3 Stunden bei 4⁰C stehen. Anschliessend wurde die Mischung mit 3.500 Upm 15 Minuten bei 4⁰C zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (OD₂₈₀ = 1,157) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde mit destilliertem Wasser dreimal dialysiert und anschliessend nochmals mit einer wässrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend

- 184 -

-A⁰I⁰V

0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml einer wässrigen Antikörper-Lösung (OD„_ßQ ⁼ 0,923) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 BiI einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung und dann mit 30 ml einer 0,1M wässrigen Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und 7 ml der zuvor dialysierten Antikörper-Lösung wurden zu der gewaschenen Sepharose 4B gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde durch ein Glasfilter filtriert und das Gel in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid gewaschen und anschliessend viermal mit 0,1M Boratpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Beim Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein immobilisiertes Produkt von Human-Interferon-ß-Antikörper-Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des Äbfiltrierten aus der Filtration auf dem Glasfilter eine OD„_Rn = 0,004 zeigten, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B iramobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 2
30

(a) 0,74 ml von Antikörper-ß-I, erhalten im Herstellungsbeispiel 19 für die Herstellung von Antikörpern,

- 185 -

in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine wässrige Lösung von 3 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Zu der Mischung wurden 3 ml destilliertes Wasser gegeben und dann liess man die Mischung 3 Stunden bei 4⁰C stehen. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4⁰C mit 3„500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (OD„₈q = 1,154) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde mit destilliertem Wasser dreimal dialysiert und anschliessend einmal mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml einer wässrigen Antikörper-Lösung (OD_00n =

0,921) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen und dann wurde diese gewaschene Sepharose 4B zu 30 ml einer 0,1M wässrigen Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid und 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung gegeben und die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 50 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung wurde im Kreislauf mit 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, und dann mit 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, viermal gewaschen. Beim Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung

- 186 -

erhält man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferonß-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des beim Filtrieren auf dem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine OD„_g0 = 0,004 zeigten, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert wurde.

Herstellungsbeispiel 3

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-II, erhalten in Herstellungsbeispiel 20 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine wässrige, gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben und die erhaltene Mischung wurde 3 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Dann gab man 3 ml Wasser zu dieser Mischung und liess diese 3 Stunden bei 4⁰C stehen. Die Mischung wurde dann mit 3.500 Upm 15 Minuten bei 4⁰C zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (0D„o_n = 1,155) erhielt. Diese Lösung des Antikörpers wurde dann dreimal mit destilliertem Wasser und einmal mit 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, dialysiert, wobei man 7 ml einer wässrigen Antikörper-Losung (OD₂₈₀ = 0,921) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäure

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gewaschen und zu der gewaschenen Sepharose 4B wurden 30 ml einer wässrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthalten 0,5M Natriumchlorid, sowie 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung gegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert * Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 50 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,3 6) gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Diese Lösung wurde mit einer umlaufenden Lösung von 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und anschliessend viermal mit 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des Filtrates, das man erhält, wenn man das adsorbierte Produkt über ein Glasfilter filtriert, eine OD„_OA = 0,004

Δ O U

zeigte, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 4

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-III, erhalten in Herstellungsbeispiel 21 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde dann 3 Stunden bei 4⁰C stellen gelassen. Zu der Mischung wurden 3 ml destilliertes Wasser gegeben und dann liess man die Mischung

- 188 -

3 Stunden bei 4⁰C stehen. Die Mischung wurde mit 3.500 üpm bei 4⁰C 15 Minuten zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde destilliert und in Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (0D_?„_n = 1,156) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde dreimal gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschliessend gegen eine 0,1M wässrige Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml der wässrigen Antikörper-Lösung (OD~_Rn = 0,922) erhielt.

(b) 1g trockene Cyanogenbromid-akt!vierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäure gewaschen und diese gewaschene Sepharose 4B wurde zu 30 ml einer wässrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben und dazu wurden 7 ml der vorerwähnten dialyiserten Antikörper-Lösung gegeben und die Mischung wurde dann 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Diese Lösung wurde mit einer umlaufenden Lösung von 0,1M Acetatpuffer (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und dann noch viermal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhält man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß-Antikörper, der auf Sepharose 4B immobilisiert ist. Aus der Tatsache, dass 35 ml des beim Filtrieren des absorbierten Produktes auf einem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine O

- 189 -

- 1*8-9 -

0,004 zeigen, wird bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel 5

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-IV, erhalten in Herstellungsbeispiel 22 für die Herstellung von Antikörper, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Dann wurden 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Die Mischung wurde dann mit 3.500 Upm bei 4⁰C während 15 Minuten zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser aufgelöst, wobei man 8 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (OD-_ß„ = 1,153) erhielt. Diese Lösung des 0 Antikörpers wurde dreimal mit destilliertem Wasser dialysiert und weiter mit einer 0,1M wässrigen Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml der wässrigen Antikörper-Lösung (OD„orv ⁼ 0,920) erhielt.

(b) 1g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen und zu dieser gewaschenen Sepharose 4B wurden 30 ml einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben, sowie 7 ml der vorerwähnten, dialysierten Antikörper-Lösung. Die Mischung

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wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,3 6) gelöst und bei Raumtemperatür 2 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und anschliessend noch viermal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des FiI-trats, das man beim Filtrieren des adsorbierten Produktes auf einem Glasfilter erhielt, eine OD „_ = 0,004 zeigte, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert wurde.

Herstellungsbeispiel 6

(a) 0,74 ml Antikörper-ß-VI, erhalten in Herstellungsbeispiel 24 für die Herstellung von Antikörper, wurden in 2n26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer wässrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Dann wurden 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gegeben und diese 3 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Die Mischung wurde dann mit 3.500 Upm 15 Minuten bei 4⁰C zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml

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einer wässri-en Lösung des Antikörpers (OD₀₀-. = 1,158) erhielt» Die Lösung des Antikörpers wurde dreimal gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschliessend mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml der wässrigen Antikörperlösung (Ο°280 ⁼ 0/924) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen und dann wurden zu dieser gewaschenen Sepharose 4B 30 ml einer 0,1M Natriumbikarbinatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben, sowie 7 ml der vorerwähnten dialyiserten Antikörper-Lösung. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml einer 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde diese Lösung mit einer umlaufenden 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und dann noch viermal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man das adsorbierte Produkt von Human-Interferon-ß-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des beim Filtrieren des adsorbierten Produktes auf einem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine OD„_OA = 0,004 zeigten, wur-

ZöU

de bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert war.
30

- 192

Herstellungsbeispiel 7

Ein Filterpapier (Toyo Filterpapier Nr. 2, hergestellt von Toyo Filter Paper Co. Ltd.) wurde in kleine Stücke von 0,5 χ 0,5 cm mit einem Gewicht von jeweils etwa 1 g geschnitten. Diese kleinen Filterpapierstückchen (aus Zellulose) wurden in 100 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 1 g Cyanogenbromid, gegeben und der pH-Wert der Mischung wurde auf etwa 11,0 bis 11,5 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt, um die Zellulose bei Raumtemperatur während 6 bis 8 Minuten zu aktivieren. Nach Beendigung der Aktivierung wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert und der erhaltene Feststoff wurde mehrere Male mit einer eiskalten 0,5M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und dann wurde der gewaschene Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde die wässrige Antikörperlösung (0D„,._fi = 0,918), die in 0 gleicher Weise erhalten wurde wie beim zuvor beschriebenen Herstellungsbeispiel 1(a), gegeben und die Mischung wurde dann in gleicher Weise wie vorher im Herstellungsbeispiel 1(b) beschrieben wurde, behandelt, wobei man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ß, immo-5 bilisiert auf Zellulose, erhielt. Aus der Tatsache, dass das beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhaltene FiI-

trat eine OD = 0,00 4 zeigte, wurde bestätigt, dass 2 oU

der grösstc Teil des Antikörpers auf Zellulose gebunden ist.
30

- 193 -

Herstellungsbeispiel 8

1 g vernetztes Dextran (Sephaded G-25) wurde in 10 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml einer wässrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und dabei schwach gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht und 500 Mikroliter einer Acetonitrillösung von Cyanogenbromid (2 g/ml) wurde auf einmal zugegeben und dabei wurde kräftig während 1 bis 2 Minuten gerührt und dann wurde das Reaktionsgemisch durch ein Glasfilter filtriert und der Feststoff mehrere Male mit einer 0,1M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert und die wässrige Antikörper-Lösung (°^D280 ⁼ ^'^21), erhalten im oben erwähnten Herstellungsbeispiel 1(a) wurde zugegeben und dann erfolgte die weitere Behandlung wie bei dem zuvor erwähnten Herstellungsbeispiel 1(b), wobei man ein adsorbiertes Produkt von Human--Inter feron-ß , immobilisiert auf vernetzten¹. Dextran, erhielt. Das FiI-trat, das man beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhielt zeigte eine OD„_ftn = 0,00 4. Dadurch wird bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf dem vernetzten Dextran immobilisiert ist.

Herstellungsbeispicl 9

1 ml Antikörper- cL--N-IV, erhalten in Herstellungsbeispiel 4 für die Herstellung des Antikörpers, wurde in 2,0 ml

- 194 -

destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und das Gemisch liess man 3 Stunden bei 4⁰C stehen. Dann wurden zu der Mischung 3 ml destilliertes Wasser gegeben und die Mischung 3 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Die Mischung wurde dann 15 Minuten bei 4⁰C mit 3.500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 10 ml einer wässrigen Lösung des Antikörpers (Ο°₂80 ⁼ ^ /^53S) erhielt.

Änschliessend wurde die Lösung des Antikörpers dreimal mit destilliertem Wasser dialysiert und änschliessend noch mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 10 ml der wässrigen Antikörperlösuiig (OD~_ß0 = 1,501) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wässrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen« Die gewaschene Sepharose 4B wurde zu 30 ml einer wässrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid/ gegeben und 7 ml der zuvor erwähnten dialysierten Antikörper-Lösung wurden dazu gegeben und die erhaltene Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und dann 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,O)₇ enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und änschliessend noch viermal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen

-

Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-Ο*·*-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des beim Filtrieren auf dem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine OD„oa ⁼ 0,004 zeigten, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 10

Unter Verwendung von Antikörper- .^-N-I bis -^-N-von Antikörper-."^ -N-V bis Antikörper--v-N-X, erhalten in den Ilerstnllumisbeispiclcn 1 bis 3 bis 5 bis 10 für die Herstellung der Antikörper, einstelle von Antikörper- ^vZ-N-IV,. verwendet man dem oben erwähnten Herstellungsbeispiel 9, wobei, man sonst die gleiche Verfahrensweise wie im Herstollunysbeispiel 9 anwendete, wurden die nachfolgenden wässrigen Antikörper-Lösungen erhalten.

- 196 -

- ι&β -

wässrige Anti körper-Lösung	verwendeter Antikörper	^OD280
A	ck-N-I	1 ,501
B	G^-N-II	1 ,522
C	et-N-III	1 ,512
D	öl-N-V	1 ,532
E	oL-N-VI	1 ,515
F	ol -N-VII	1 ,526
G	oL-N-VIII	1 ,513
H	C^-N-IX	1 ,527
I	Oj-N-X	1,521

(b) Unter Verwendung der wässrigen in Stufe (a) erhaltenen Antikörper-Lösungen und unter Anwendung eines grundsätzlich gleichen Verfahrens ., wie es im oben erwähnten Herstellungsbeispiel 9(b) beschrieben wird, wurden entsprechende adsorbierte Produkte von Human-Interferon-χ r immobilisiert auf Sepharose 4B, erhalten. Alle die Filtrate, die man beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhielt, zeigten eine OD„_on = 0,00 4 und das be-

Z O¹J

stätigt, dass der grösste Teil der Antikörper auf Sepharose 4B immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel

Ein Filterpapier (Toyo Filter Papier Nr. 2, hergestellt von Toyo Filter Paper Co. Ltd.) wurde in kleine Stücke

- 197 -

einer Grosse von 0,5 χ 0,5 cm mit einem Gewicht von etwa 1 g geschnitten. Diese Filterpapierstücke aus Zelluluse wurden zu 100 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 1 g Cyanogenbromid, gegeben und bei einem pH-Wert von 11 bis 11,5 durch Zugabe von Natriumhydroxid gehalten, dann wurde die Zellulose bei Raumtemperatur während 6 bis 8 Minuten aktiviert. Nach Beendigung der Aktivierung wurde die Raktionsmischung zur Entfernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert und der gebildete Feststoff wurde mehrere Male mit eiskalter 0,5M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und der gewaschene Feststoff wurde dann in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde eine wässrige Antikörper-Lösung (OD ^_n = 1,502), erhalten in gleicher Weise wie zuvor in Herstellungsbeispiel 9(a) beschrieben, gegeben und die Mischung wurde dann in gleicher Weise wie zuvor in Herstellungsbeispiel 9(b) beschrieben behandelt, wobei man ein adsorbiertes Produkt aus Human-Interferonoi■ -Antikörper, immobilisiert auf Zellulose, erhielt.

Aus der Tatsache, dass das Filtrat, das man beim Filtrieren des absorbierten Produktes durch ein Glasfilter erhielt, eine OD_?„„ = 0,004 zeigte, wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Zellulose immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 12
30

1 g vernetztes Dextran (Sephaded G-25) wurde in 10 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml

- 198 -

einer wässrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und gründlich gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht und 500 Mikroliter einer Acetonitrillösung von Cyanogenbromid (2 g/ml) wurden auf einmal zugegeben und dabei wurde während 1 bis 2 Minuten kräftig gerührt und das Reaktionsgemisch wurde dann auf einem"Glasfilter unter Entfernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert. Der erhaltene Feststoff wurde mehrere Male mit einer 0,1M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert und dazu wurde eine wässrige Anitkörperlösung (OD o» = 1,511), erhalten gemäss obigem Herstellungsbeispiel 9(a), gegeben und dann erfolgte die weitere Behandlung wie sie zuvor für das Herstellungsbeispiel 9(b) beschrieben wurde und auf diese Weise erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-Cvj-Antikörper, immobilisiert auf dem vernetzten Dextran. Aus der Tatsache, dass das beim Filtrieren des Produktes erhaltene Filtrat eine 0D„„_n = 0,004 zeigte, geht hervor, dass der· grösste Teil des Antikörpers auf dem vernetzten Dextran immobilisiert wurde.

Herstellungsbeispiel 13

(q? ) 1,0 ml Antikörper-rxz-C-VIII, erhalten in Herstellungsbeispiel 17 für die Herstellung von Antikörper, 0 wurde in 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine gesättigte, wässrige Ammoniumsulfatlösung

- 199 -

gegeben und die Mischung liess man dann bei 4°C 3 Stunden stehen= Dann wurden 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Anschliessend wurde die Mischung 15 Minuten bei 4°C mit 3„500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 10 ml einer wässrigen Antikörper-Lösung (OD„oq ⁼ 1*526) erhielt,, Die Lösung des Antikörpers wurde dreimal mit destilliertem Wasser dialysiert und dann nochmals mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4) , enthaltend 0,5M Natriumchlorid,, wobei man 10 ml einer wässrigen Antikörper-Lösung = 1,511) erhielt»

(b¹ ) 1g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer 1 mM Salzsäure gewaschen und zu der so gewaschenen Sepharose 4B wurden 30 ml einer wässrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben,· sowie 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 4 0 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde mit einer umlaufenden 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und anschliessend mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-ςθ -Antikörper, immobilisiert auf

- 200 -

- 2170 -

Sepharose 4B. Aus der Tatsache, dass 35 ml des Filtrats, das man beim Filtrieren des adsorbierten Produktes auf

einem Glasfilter erhielt, eine OD

= 0,004 zeigten,

wurde bestätigt, dass der grösste Teil des Antikörpers auf Sepharose 4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 14

(a) Wendet man im vorhergehenden Herstellungsbeispiel 13 anstelle des Antikörpers-oC-C-VIII Antikörper- ch -C-I bis Antikörper-ci/ -C-VII und Antikörper-cL>-C-IX bis Antikörper- ilz-C-XIII, erhalten gemäss Herstellungsbeispielen 11 bis 18 für die Herstellung der Antikörper, an, so erhält man die nachfolgenden wässrigen Antikörper-Lösungen:

wässrige Anti körper-Lösung	verwendeter Antikörper	^OD280
J	'O-C-III	1,511
K	ei/-C-I	1,502
L	öl,-C-II	1,512
M	oO-C-IV	1,506
N	oL-C-V	1,513
0	dt,-C-VI	1,507
P	öl -C-VII	1,513
Q	dl-C-IX	1,502

- 201 -

wässrige Antikörper-Lösung

verwendeter
Antikörper

OD

280

R S T U

-c-X
-C-XI
-C-XII
-C-XIII

1,501 1,509 1,507 1,506

(b) Unter Verwendung der jeweils in Stufe (a) erhaltenen wässrigen Antikörper-Lösungen und des gleichen Verfahrens, wie es zuvor in Herstellungsbeispiel 13(b) beschrieben wird, wurden die entsprechenden adsorbierten Produkte von Human-Interferon-ot, immobilisiert auf Sepharose 433, erhalten« Aus der Tatsache, dass die Filtrate, die man beim Filtrieren durch ein¹Glasfilter erhielt, eine OD„„.. = 0,004 zeigten, geht hervor, dass der grösste Teil der Antikörper in den jeweiligen Produkten auf Sepharose 4B immobilisiert ist«,

Ilerstcllungsbeispiel 15

Ein Filterpapier (Toyo Filter Papier Nr. 2) wurde in kleine Stücke einer Grosse von 0,5 χ 0,5 cm mit einem Gewicht von etwa 1 g geschnitten. Diese Filterpapierstückchen aus Zellulose wurden in 100 ml einer 1 g Cyanogenbromid enthaltenden wässrigen Lösung gegeben

- 202 -

- 2-6*2 -

und der pH der Mischung wurde dtarch Zugabe von Natriumhydroxid auf 11,0 bis 11,5 gehalten, wodurch die Zellulose innerhalb von 6 bis 8 Minuten bei Raumtemperatur aktiviert wurde. Nach Beendigung der Aktivierung wurde das Reaktionsgemisch filtriert und die Reaktionsflüssigkeit entfernt und der Feststoff wurde mehrere Male mit einer eiskalten 0,5M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und der gewaschene Feststoff wurde in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde die wässrige Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 1,502), erhalten in gleicher Weise wie im zuvor beschriebenen Herstellungsbeispiel 13(a), gegeben und die Mischung wurde dann in gleicher Weise wie im vorhergehenden .Herstellungsbeispiel 13(b) beschrieben, behandelt, wobei man ein adsorbiertes Produkt von Human-Int er feron-o£/ -Antikörper, immobilisiert auf Zellulose, erhielt. Aus der Tatsache, dass das Filtrat, das man beim Filtrieren des adsorbierten Produktes unter Verwendung eines Glasfilters, eine OD„_RQ = 0,004 zeigte, geht hervor, dass der grösste Teil des Antikörpers auf der Zellulose immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel 16

1 g vernetztes Dextran (Sephadex G-25) wurde in 10 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml einer wässrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und dabei schwach gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit

- 203 -

- 2*3 -

erhöht und 500 Mikroliter einer Lösung von Cyanogenb.romid in Acetonitril (2 g/ml) wurde auf einmal zugegeben und dabei wurde kräftig während 1 bis 2 Minuten gerührt und dann wurde die Reaktionsmischung auf einem Glasfilter filtriert. Der erhaltene Feststoff wurde mehrere Male mit 0,1M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert und eine wässrige Antikörper-lösung (OD„pQ ⁼ 1,505), erhalten in gleicher Weise wie beim vorhergehenden Herstellungsbeispiel 13(a), wurde dazugegeben und dann wurde die in Herstellungsbeispiel 13(b) beschriebene Verfahrensweise durchgeführt und man erhielt ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-CO-Antikörper, immobilisiert auf dem vernetzten Dextran. Aus der Tatsache, dass beim Filtrieren des adsorbierten Produktes durch ein Glasfilter das Filtrat eine 0D„_on =

ZtSU

0,004 zeigte, geht hervor, dass der grösste Teil des Antikörpers auf dem vernetzten Dextran immobilisiert ist.

Reinigung von Human-Interferonen

(1) 0,5 ml Human-Interferon-ß, enthaltend 5,9 g Proteine, (OD₂₈₀ = 11,8, hergestellt von Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science), wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und diese Lösung wurde einer Affinitätschromatografie unterworfen, unter Verwendung eines adsorbierten Produktes von Iluman-

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Interferon-ß-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 1(b) für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern, und wurde mit 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,15M Natriumchlorid, eluiert. Wenn das Eluat eine OD„oq = 0,0002 zeigte, wurde das adsorbierte Produkt mit 0,5M Acetatpufferlösung (pH 2,5), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, eluiert, wobei man ein gereinigtes Human-Interferon-ß von dem adsorbierten Produkt isolierte.

Vor der Behandlung durch Affinitätschromatografie zeigte das Human-Interferon-ß den veränderten OD-Wert von 5,9 (ein Wert, den man mit 1 mg Proteine bei einer OD„„„ =1 erhält) und eine Aktivität von 1,5 χ 10 U/ml ZoO

und eine Konzentration von 13.240 pg/ml bei der Immunitätsreaktion des Human-Interferons-ß, während nach der Behandlung durch Affinitätschromatografie der veränderte OD-Wcrt des Human-Interferon-ß 0,059 betrug und die gezeigte Aktivität 1,37 χ 10 ü/ml und die Konzentration 12.050 pg/ml bei der Immunitätsreaktion von Human-Interferon-ß betrugen. Daher betrug die spezifische Aktivität vor der Behandlung durch Affinitätschromatografie 2,54 χ 10 U/mg, während die spezifische Aktivitat nach der Behandlung durch Affinitätschromatografie

η
2,32 χ 10 U/mg betrug, was einen beachtlichen, 91,3 Mal so grossen Wert hinsichtlich der spezifischen Aktivität bedeutet. Wie aus den Ergebnissen, die man bei Verwendung des adsorbierten Produktes (immobilisierte Antikörper auf dem Träger) erhält, hervorgeht, kann Human-Interferon-ß um das 91-fache der Reinheit gereinigt

- 205 -

werden und auch die Ausbeute davon wird erheblich verbessert.

Unter Verwendung der jeweiligen immobilisierten Antikörper, erhalten in den Herstellungsbeispielen 2 bis 8 zur Herstellung von immobilisierten Antikörpern, kann man gemäss der Erfindung hervorragende Ergebnisse beim Isolieren und Reinigen von Iluman-Interf eronen erzielen, wie durch die Behandlung durch Affinitätschromatografie gezeigt wird.

(2) 0,5 ml (10,1 mg Proteine) von Human-Interferon-oO (OD _ßQ = 20,2, hergestellt von Hayashibara Biochemical Research Laboratory) wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und diese Lösung wurde für eine Affinitätschromatografie verwendet unter Verwendung des adsorbierten Produktes von Human-Interferon-CL·-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B, erhalten gemäss Herr;tellungsbeispiel 9 (b) für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern, und wurde dann mit 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,15M Natriumchlorid, eluiert. Wenn im Eluat die 0Γ3__ο_ = 0,002 oder weniger ist, wird das adsorbierte

ZoO

Produkt mit 0,5Μ Acetatpufferlösung (pH 2,5), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, eluiert und dadurch ein gereinigtes Human-Interferon-χ von dem adsorbierten Produkt isoliert.

Vor der Behandlung durch die Affinitätschromatografie zeigte das IJuman-Interferon-QO einen unveränderten

- 206 -

OD-Wert von 10,1 (ein Wert, den man mit 1 mg Proteine bei OD₂RO ^{= 1} erhält), eine Aktivität von 1 χ 10 U/ml und eine Konzentration vpn 6.900 pg/ml bei einer Immunitätsreaktion von Human-Interf eron-ol/. Dagegen erzielt man nach der äffinitätschromatografischen Behandlung einen PD-Wert des Human-Interferon-CV von 0_f080, die Aktivität ist 8x10 U/ml und die Konzentration beträgt 55.000 pg/ml bei einer Immunitätsreaktion von Human-Interferon-φ . Die spezifische Aktivität vor der äffinitätschromatografischen Behandlung betrug 5,9 χ 10⁴ U/mg, während die spezifische Aktivität nach der äffinitätschromatografischen Behandlung 1, χ 1 0 U/mg betrug, was eine Verbesserung der spezifischen Aktivität um das 16 9-fache bedeutet. Aus diesem Ergebnis wird ersichtlich, dass man bei Verwendung des adsorbierten Produktes (immobilisierter Antikörper auf dem Träger) Human-Interferon-c^ um das 169-fache reinigen kann, wobei die Ausbeute quantitativ ist.

Verwendet man jeweils die immobilisierten Antikörper die in den Herstelliangsbeispielen 10 bis 12 für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern erhalten wurden, bei der vorliegenden Erfindung, dann kann man hervorragende Ergebnisse erzielen, beim Isolieren und Reinigen von Human-Interferonen, wie druch die affinitätschromatograf ische Behandlung gezeigt wird.

(3) 0,5 ml (10,1 mg Proteine) Human-Interferon-oi/ (°^D280 ⁼ 20,2, hergestellt von National Institute of Health) wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung

- 207 -

- 2-Θ7 -

gelöst und dann wurde diese Lösung einer Affinitätschromatografie unterworfen unter Verwendung eines adsorbierten Produktes von Human-Interferon-CO-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose 4B, erhalten gemäss Herstellungsbeispiel 13(b) für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern, und mit 0,,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,15M Natriumchlorid, eluiert. Wenn im Eluat die ODogn ⁼ ®' ⁰^^{2 oder} weniger ist„ dann wird das adsorbierte Produkt mit 0,5M Essigsäurepufferlösung (pH 2,5), enthaltend 0, 5M Natriumchlorid,, eluiert und dadurch wird gereinigtes Human-Interferon-oO von dem adsorbierten Produkt isoliert.

Vor der Behandlung durch die Affinitätschromatografie zeigte das Human-Interferon-oO den umgewandelten OD-Wert von 10,1 (ein Wert, eirhalten mit 1 mg Proteine bei ^0Dooλ - 1) f eine Aktivität von 1x10 U/ml und eine Konzentration von 23.000 pg/ml bei einer Iminunitätsreaktion von Human-Interferon-;i0 . Nach der Behandlung durch die Affinitätschromatografie betrug der umgewandelte OD-Wert des Ilunian-Interferon-oo 0,0GO, und zeigte eine Aktivität von 8,2 χ 10 U/ml und eine Konzentration von 19.792 pg/mg bei einer Immunitätsreaktion von Human-Infcerferon~oO . Die spezifische Aktivität vor der Behand-

4 lung durch Affinitätschromatografie betrug 9,9 χ 10 U/rag und die spezifische Aktivität nach der Behandlung durch AfriniLätsc-hromatografic betrug 1,37 χ 10 U/mg und das bedeutet eine 138-fache Steigerung der spezifischen Aktivität. Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich,. dass unter Verwendung des adsorbierten Produktes (immobilisierter Antikörper auf dem Träger) Human-Interferon-CV

- 208 -

um das 138-fache gereinigt werden kann, wobei auch die Ausbeute quantitativ ist.

Verwendet man immobilisierte Antikörper, wie sie gemäss den Beispielen 14 bis 16 für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern erhalten wurden, bei der vorliegenden Erfindung, so kann man hervorragende Ergebnisse beim Isolieren und Reinigen von Human-Interferonen erzielen, wie durch die Behandlung unter Anwendung von Äffinitätschromatografie gezeigt wird.

L eersei te

Claims

'"* '"·■ 32t 1263

36 607 o/wa

OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO/JAPAN

Human-Interferon verwandte Peptide, Antigene und Antikörper sowie Verfahren zu deren Herstellung

PATENTANSPRÜCHE

Human-Interferon verwandte Peptide der allgemeinen Formel (I)

R¹-Leu~Ile-Leu-Leu-Ala~G.ln-OH (I)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der
Formel H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala--,
eine Gruppe der Formel H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ara- oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser·- Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala- bedeutet),

oder der allgemeinen Formel (II)

R²-Glu-Ser-Leu-Arg~Ser-Lys-Glu-OH (II)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Thr-Asn-iLeu-Gln-, eine Gruppe der Formel H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-L'eu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet, oder
10

der allgemeinen Formel (III)

R³-Leu-Gln-Arg-Ser~Ser-OH (III)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der

Formel H-Phe-, eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe-, eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-Gly-Phe- oder eine Gruppe der Formel H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phebedeutet).
20

2. Human-Interferon verwandtes Peptid gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Peptid die allgemeine Formel (I) hat

R¹-Leu-Ile~Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Thr-IIis-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Alar/ eine Gruppe der Formel H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-GIy-Asn-Arg-Arg-Ara-, oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Alabedeutet).

3. Human-Interferon verwandtes Peptid gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die allgemeine Formel (II) hat

R²-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Thr-Asn-Leu-Gln-, eine Gruppe der Formel H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet) .

4. Human-Interferon verwandtes Peptid gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid doe allgemeine Formel (III) hat

R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III)

(worin R ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Phe-, eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe-, eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- oder eine Gruppe der Formel H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phebedeutet).

5. H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH.

6. H-Ser-Leu-Ser-Thr-Äsri-Leu-Gln-Giu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH.

7. H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH.

·^:·^:-32Π263

8. Human-Interferon-Antikörper, dadurch gekennzeichnet , dass man ihn durch Sammeln eines Antikörpers erhalten hat, der im Körper eines Säugers gebildet wurde, indem man dem Sauger ein Human-Interferon-Antigen verabreichte, das gebildet wurde durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids aus der Gruppe der allgemeinen Formel (I)

R Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I)

(worin R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat), einem Peptid der allgemeinen Formel (II)

R²-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)

(worin R die in Anspruch 1, angegebene Bedeutung hat) und einem Peptid der allgemeinen Formel (III)

R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III)

3
(worin R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung

hat) als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Träge.r-Bindungsmittels. 25

9. Human-Interferon-Antikörper gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Human-Interferon-Antigen erhalten wurde durch Umsetzen eines von Human-Interferon abgeleiteten Peptids der allgemeinen Formel (I)

R -Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I)

(worin R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat) als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Träger-Bindungsmittels.

10. Human-Interferon-Antikörper gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass der Human-Interferon-Antikörper gebildet wurde durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids der allgemeinen Formel (II)

R -Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)

(worin R" die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat) als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Träger-Bindungsmittels.

11. Human-Interferon-Antikörper gemä-s Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde durch Umsetzen eines Human-Intorferon verwandten Peptids der allgemeinen Formel (III)

' R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III)

(worin R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat) als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Träger-Bindungsmittels. 30

12. Human-Interferon-Antikörper gemäss Ansprüchen 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet dass das Human-Interferon-Antigen hergestellt wurde unter Verwendung eines Trägers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus tierischem Serumalbumin, tierischem Serumglobulin, tierischem Thyroglobulin, tierischem Hämoglobulin, tierischem Hämocyanin, einem Ascarisextrakt, einem Polylysin, einer PoIyglutamsäure, einem Lysin-Glutamsäure-Copolymer, einem Lysin- enthaltenden Copolymer und einem Ornitin enthaltenden Copolymer und wobei das Hapten-Träger-Bindungsmittel ein Träger aus der Gruppe aliphatische Dialdehyde, einer Dimaleimidverbxndung, einer Maleimidcarboxyl-N-hydroxysuccinimid-Verbin-· dung und einem Carbodiimid ist.

13. Human-Interferon-Antikörper gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass das Tier ein Säugetier aus der Gruppe Kaninchen und Meerschweinchen ist.

14. Human-Interferon-Antikörper gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass der in einem Säugetier gebildete Human-Interferon-Antikörper gebildet wurde, indem man dem Säugetier ein Human-Interferon-Antigen durch Mischen mit einem Freund's Adjuvant verabreichte.

15. Human-Interferon-Antikörper gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass der in einem Säugetier gebildete Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde, indem man einem Kaninchen

~ 7 "—

ein Human-Interferon-Antigen verabreichte, das unter Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel

H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-

GIy-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-AIa-GIn-OH

als ein Hapten, Glutaraldehyd oder DCC als Hapten-Träger-Bindungsmittel und BSA als Träger hergestellt worden ist.

16. Human-Interferon-Antikörper gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass der in einem Säugetierkörper gebildete Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde durch Verabreichen eines Human-Interferon-Antigens an ein Kaninchen, wobei das Human-Interferon-Antigen hergestellt wurde unter Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel

H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH
25

als ein Hapten> Glutaraldehyd als Hapten-Träger-Bindungsmittel und BAS als Träger.

17. Human-Interferon-Antikörper gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass der

— 8 —

in dem Säugetierkörper gebildete Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde durch Verabreichen von Human-Interferon-Antigen an ein Kaninchen und wobei das Human-Interferon-Antigen hergestellt wurde unter Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel

H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-

Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH
10

als Hapten, DCC als Hapten-Träger-Bindungsmittel und BSA als Träger.

18. Human-Interferon-Antikörper gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass der in dem Säugetier gebildete Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde durch Verabreichen von Human-Interferon-Antigen an ein Kaninchen und wobei das Human-Interferon-Antigen hergestellt wurde unter Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel

H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

als Hapten, Glutaraldehyd oder DCC als Hapten-Träger-Bindungsmittel und BSA als Träger.

„ 9 _

19. Verfahren zur Herstellung eines Human-Interferon-Antikörpers durch Sammeln eines in einem Säugetierkörper gebildeten Antikörpers, wobei der Antikörper in dem Säugetier gebildet wurde, indem man dem Sauger ein Human-Interferon-Antigen verabreichte und wobei das Human-Interferon-Antigen gebildet wurde durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids aus der Gruppe der Peptide der allgemeinen Formel (I)
10

R¹ -Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-^Gln-OH (I)

(worin R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat), einem Peptid der allgemeinen Formel (II)

R -Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)

ο
(worin R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung

hat) und einem Peptid der allgemeinen Formel (III) 20

R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III)

(worin R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung .hat) als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Träger-Bindungsmittels.

20. Adsorptionsmittel zur Affinitätschromatografie, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Immobilisieren auf einem unlöslichen Träger eines Human-Interferon-Antikörpers erhalten wurde, wobei

4211263

- ίο -

der Human-Interferon-Antikörper durch Sammeln eines in einem Säuger gebildeten Antikörpers erhalten wurde und wobei man dem Sauger ein Human-Interferon-Antigen verabreichte, das erhalten wurde durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids der allgemeinen Formel (I)

ι
R -Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I)

-I

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat), einem Peptid der allgemeinen Formel (II)

R -Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat) oder einem Peptid der allgemeinen Formel (III)

R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III)

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat) als Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Trager-Bindungsmittels.

21. Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatografie gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Human-Interferon-Antigen erhalten wurde durch Umsetzen eines Peptids der Formel

H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-GIn-OH

- 11 -

als Hapten mit BSA als Träger, in Gegenwart von Glutaraldehyd als Hapten-Träger-Bindungsmittel, wobei das Human-Interferon-Antigen einem Kaninchen verabreicht wird und der in dem Kaninchenkörper gebildete Interferon-Antikörper gesammelt wird und dieser Interferon-Antikörper dann auf Sepharose 4B₁. die mit BrCN aktiviert worden ist, immobilisiert wurde.

22. Adsorptionsmittel für die .Affinitätschromatografie

gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Human-Interferon-Antigen erhalten wird durch Umsetzen eines Peptids der Formel 15

H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu~Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

als Hapten mit BSA als Träger, in Gegenwart von Glutaraldehyd als Hapten-Träger-Bindungsmittel, wobei das Human-Interferon-Antigen einem Kaninchen verabreicht wird und der in den Kaninchenkörper gebildete Interferon-Antikörper gesammelt wird und dieser Interferon-Antikörper dann auf Sepharose 4B, die mit BrCN aktiviert worden ist, immobilisiert wurde.

23. Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatografie gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Human-Interferon-Antigen erhalten wurde durch Umsetzen eines Peptids der Formel

- 12 -

H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

als Hapten mit BSA als Träger, in Gegenwart von Glutaraldehyd als Hapten-Träger-Bindungsmittel^ wobei das Human-Interferon-Antigen einem Kaninchen verabreicht wird, und der in dem Kaninchenkörper gebildete Interferon-Antikörper gesammelt wird und dieser Interferon-Antikörper dann auf Sepharose 4B, die mit ErCN aktiviert worden ist, immobilisiert wurde.

„ Verfahren zur Herstellung eines Adsorptionsmittels für die Affinitätschromatografie, dadurch gekennzeichnet , dass man auf einem unlöslichen Träger einen Human-Interferon-Antikörper immobilisiert, der durch Sammeln eines Antikörpers erhalten wurde, der in einem Säugetierkörper gebildet wurde, indem man dem Säugetier ein Human-Interferon-Antigen verabreichte, das hergestellt wurde durch Umsetzen eines von Human-Interferon abgeleiteten Peptids der allgemeinen Formel (I)

R¹Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I)

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat), eines Peptids der allgemeinen Formel (II)

R²-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-GIu-OH (II)

- 13 -

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat) oder eines Peptids der allgemeinen Formel (III)

R -Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III)

(worin R die vorher angegeben Bedeutung hat) als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Träger-Bindungsmittels.

25. Markiertes Peptid, erhaltexi durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids der allgemeinen Formel (I)

R¹-Leu-Ile-Leu-Leu-Äla-Gln-OH (I)

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat) eines Peptids der allgemeinen Formel (II)

R²~Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)

2
(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat) oder

eines Peptids der allgemeinen Formel (III) R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser~OH (III)

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat) mit einem Markierungsmittel.

26. Markiertes Peptid gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Tyrosyl in dem

- 14 -

ο υ ο ö

■..•.:θ2·Τ1263

- 14 -

Human-Interferon verwandten Peptid aus der Gruppe der Formel

H-Tyr-Ser~Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Äsn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-

Ala-Gln-OH

oder einem Peptid der Formel

H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

oder einem Peptid der Formel

H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-OH

1 25
mit J markiert ist«

27. Markiertes Peptid gemäss Anspruch 25 _r dadurch gekennzeichnet , dass die Aminogruppe in dem Human-Interferon verwandten Peptid der Formel

' H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Ärg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala~ GIn-OH

oder dem Peptid der Formel
30

H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

- 15 -

oder dem Peptid der Formel

H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-

Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH
5

mit einer fluoreszierenden Substanz, ausgewählt aus FITC, TRITC und DTAF, markiert ist.

28. Verfahren zum Herstellen eines markierten Peptids, dadurch gekennzeichnet , dass man ein Human-Interferon verwandtes Peptid der allgemeinen Formel (I)

R¹-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (I)

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat) oder einem Peptid der allgemeinen Formel (II)

R²-Glu~Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (II)

(worin R die vorher angegebene Bedeutung hat) oder

einem Peptid der allgemeinen Formel (III) R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (III)

(worin R^ die vorher angegebene Bedeutung hat) mit einem Markierungsmittel umsetzt.