DE3750503T2

DE3750503T2 - Chemilumineszierende Acridinium- und Phenantridiniumsalze.

Info

Publication number: DE3750503T2
Application number: DE3750503T
Authority: DE
Inventors: Larry Gene Bennett; Phillip Gregory Mattingly
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1986-10-22
Filing date: 1987-10-05
Publication date: 1995-02-09
Anticipated expiration: 2007-10-06
Also published as: US5783699A; AU7979487A; JPH0816103B2; EP0273115A2; US5468646A; KR880005238A; EP0273115A3; ATE111083T1; US5543524A; US5545739A; EP0273115B1; US5669819A; AU613586B2; ES2063735T3; CA1341637C; JPS63112564A; DE3750503D1; US5565570A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Chemilumineszenzverfahren und -materialien und insbesondere Verfahren und Materialien, die chemilumineszierende Acridinium- und Phenanthridiniumsalze miteinbeziehen. Chemilumineszenz läßt sich definieren als die Erzeugung von Licht durch eine chemische Reaktion. Der Mechanismus der meisten Chemilumineszenzreaktionen ist nicht im Detail bekannt, aber ein verallgemeinerter Mechanismus [Schuster et al., Advances in Physical Organic Chemistry, 187-238 (1984)] kann geschrieben werden als:
A → B* → B + hν
Verbindung A geht eine chemische Reaktion ein (für gewöhnlich eine Oxidation) und liefert ein Produkt in einem elektronisch angeregten Zustand ("B*"). Bei seiner Rückkehr in den Grundzustand ("B") gibt dieses Produkt Energie in Form von Licht ab ("hν").
Obwohl konkurrierende Dunkelreaktionen die Ausbeute der Gesamtreaktion auf weniger als 1% reduzieren können, erreichen manche Biolumineszenzsysteme 60-70% Ausbeute, und in vielen Fällen wurden Nachweisgrenzen im Bereich von Femtomol (10&supmin;¹&sup5; Mol) bis Attomol (10&supmin;¹&sup8; Mol) festgestellt. Die Chemilumineszenz wird in der analytischen Chemie für verschiedene Aufgaben eingesetzt, wo andere Verfahren mangels geeigneter Empfindlichkeit scheitern. Bei der Immunodiagnose können Chemilumineszenzimmunoassays ("CLIA") dabei die Empfindlichkeit von Radioimmunoassays ("RIA") oder Enzymimmunoassays ("EIA") erreichen oder sogar übertreffen [Kircka et al., Diagnostic Medicine, 1, 45-52 (1984)].
Luminol- und Isoluminolderivate sind die am weitesten verbreiteten Chemilumineszenzreagenzien für Immunoassays. Die lichterzeugende Reaktion wird durch Oxidation mit basischem Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines Katalysators wie Mikroperoxidase oder Übergangsmetallionen gestartet. Es tritt Lichtemission bei etwa 465 nm auf, was der Fluoreszenzemission des Produkts, Aminophthalsäure, entspricht. Aminobutylethylisoluminol ("ABEI") kann als Markierung bei Immunoassays verwendet werden und ist kommerziell erhältlich.
Eine zweite Gruppe von Chemilumineszenzreagenzien, die Aryloxalate [Gill, Aldrichimica Acta, 16, 59-61 (1983) und Catherall et al., J. Chem. Soc. Faraday Trans. 2, 80, 823- 834 (1984), wurden als handelsübliche kalte Lichtquellen [siehe z. B. Tseng et al., U.S. Patent No. 4 338 213] und in Hochleistungs-Flüssigchromatographie ("HPLC")-Detektoren verwendet [Kobayashi et al., Anal. Chem., 52, 424-427 (1980) und Miyaguchi et al., J. Chromatogr., 303, 173-176 (1984)]. Es wird angenommen, daß diese Derivate mit Wasserstoffperoxid in gepufferter oder ungepufferter Lösung reagieren und ein Dioxetandion bilden, das sich schnell zersetzt und CO&sub2; in einem angeregten Zustand liefert. Die Energie wird anschließend durch Elektronentransfer auf ein fluoreszierendes Molekül übertragen, das Licht emittiert.
Eine dritte Gruppe von Reagenzien, die 10-Methylacridinium-9-carbonsäurearylester, sind in Gegenwart von basischem Wasserstoffperoxid und bei Abwesenheit eines Katalysators chemilumineszent. Für den Mechanismus wird angenommen, daß zunächst ein anfänglicher Angriff durch ein Wasserstoffperoxidanion stattfindet, gefolgt von einer intramolekularen Verlagerung des Phenolats (der "Austrittsgruppe") unter Bildung eines gespannten Dioxetanons. Das gespannte Dioxetanon zerfällt zu CO&sub2; und angeregtem N-Methylacridon, welches Licht bei 430 nm emittiert. Carboxysubstituierte Acridiniumsaize wurden als Markierung in Immunoassays verwendet [Weeks et al., Clin. Chem., 29, 1474-79 (1983) Campell et al., European Patent Application No. 82 636 und McCapra et al., UK Patent No. GB 1 461 877]. Desweiteren wurden 5-Methyl-phenanthridinium- 6-carbonsäurearylester, die zu den Acridiniumarylestern isomer sind, als Markierung in Immunoassays verwendet [Lin et al., European Patent Application No. 170 415].
Trotz ihrer Nützlichkeit in Immunoassays sind Antikörper-konjugierte Phenyl-10-methyl-9-acridiniumcarboxalate unserer Erfahrung nach wegen der Hydrolyse überhalb pH 4.0 (-20ºC bis 40ºC) instabil und verlieren dabei mehr als 10% ihrer Aktivität innerhalb von drei Tagen. Obwohl Acridiniumester unterhalb pH 4.0 stabil sind, sind es die konjugierten Antikörper in diesem pH-Bereich oftmals nicht.
In Tseng et al., supra, ist angegeben, daß bis-N- Alkyl-N-trifluormethylsulfonyloxalamide stabiler als die korrespondierenden Arylester sind, und sie werden außerdem als genauso wirkungsvoll bezeichnet. Die Nucleofugazität des Phenols und des Trifluormethylsulfonamids werden als vergleichbar angegeben, d. h. es ist angegeben, daß beide einen pKa-Wert von etwa 7 haben. Gill, supra, erwartet die Entwicklung eines speziellen Sulfonyloxalamids als Beispiel für ein Oxalat mit höherer Quantenausbeute.
Die Abbildung stellt die Synthese eines 10-Alkyl-N- sulfonyl-9-acridiniumcarboxamides gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
Die vorliegende Erfindung liefert chemilumineszierende Verbindungen, die durch folgende Formeln beschrieben werden:
und
wobei R, R' und R'' unabhängig voneinander ein Glied aus der Gruppe, bestehend aus Alkylen-, Arylen-, substituierten Alkylen- und substituierten Arylengruppen enthalten, derart daß: ein oder mehrere Wasserstoffe des Glieds durch eine Alkyl-, Aryl-, substituierte Alkyl-, substituierte Aryl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-, geschützte Amino-, substituierte Amino-, Hydroxy-, geschützte Hydroxy-, Oxo-, Thio-, Imino-, Mercapto- oder substituierte Mercaptogruppe ersetzt sind; oder derart, daß ein oder mehrere Kohlenstoffatome des Glieds durch ein Heteroatom ersetzt sind;
wobei X¹, X² und X³ unabhängig voneinander Glieder der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Carboxy-, Carboalkoxyl-, Carboxamido-, Carboaryloxy-, Cyano-, Carboximido-, Isocyanat-, Isothiocyanat-, Sulfo-, Sulfonylhalogenid-, Carbonylhalogenid-, N-Succinimidyloxycarboxy- und der N- Maleinimidgruppe sind;
oder wobei einer der Reste R'-X² oder R-X³ entweder ein Nitrobenzol ist, vorausgesetzt, daß der andere aus Phenyl, Iso-Propyl, n-Butyl oder Benzyl-5-carboxypentyl gewählt ist, oder aber einer ist ein Dinitrobenzol, vorausgesetzt, daß der andere Rest aus n-Butyl oder Phenyl gewählt ist;
und wobei Y- ein geeignetes Gegenion ist, vorausgesetzt, daß R-X³, R'-X² und R''-X¹ unabhängig voneinander Wasserstoff sein können;
und unter dem weiteren Vorbehalt, daß, wenn in den Verbindungen nach Formel I entweder in R'-X² oder R-X³, X² oder X³ aus einer Carbopentachlorphenoxy-, Carbo-p- nitrophenoxy-, Carboximido, Isothiocyanat-, N-Maleinimid- und einer N-Succinimidylcarboxygruppe gewählt ist, und wenn der andere Rest aus R'-X² und R-X³ aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Benzyl, oder aus solchem Aryl oder Benzyl, das durch Alkoxy, Aryloxy, Amino oder Hydroxy substituiert ist, gewählt ist;
dann X¹ kein Wasserstoff und R''-X¹ kein Wasserstoff ist;
und die Verbindung außerdem 10-Methyl-N-allyl-N-p- toluolsulfonyl-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat sein kann.
Das Gegenion Y&supmin; kann gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Sulfat, Alkylsulfat, Halogensulfat, Halogenborat, Halogenacetat, Halogenphosphat, Phosphat und Halogenid, gewählt werden.
Das Heteroatom kann aus der Gruppe, bestehend aus Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Sauerstoff, gewählt werden.
R, R' und R'' können unabhängig voneinander Spacerarme mit der Formel
-(CH&sub2;)nsein, wobei n = 0-50 ist. Spezifischerweise kann R'' gleich -CH&sub2;- sein, und X¹ kann gleich -H sein.
Beispielhaft für Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind jene, in denen R'' gleich -CH&sub2;- ist, X¹ gleich -H ist, und in denen R'-X² wird durch die Formel
beschrieben wird.
Ein Beispiel für solche Verbindungen ist 10-Methyl-N- (4-carboxybutyl)-N-tosyl-9-acridiniumcarboxamid.
Ein anderes Beispiel für solche Verbindungen ist 10- Methyl-N-(5-carboxypentyl)-N-tosyl-9-acridiniumcarboxamid.
Weitere Beispiele für Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind jene, in denen R'' gleich -(CH&sub2;)&sub3;- ist, X¹ gleich -SO&sub3;- ist, und in denen R'-X² durch die Formel
beschrieben wird.
Noch weitere Beispiele für Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind solche, in denen R'-X² durch die Formel
beschrieben wird, und in denen R-X³ durch die Formel
beschrieben wird.
Die derzeit am meisten bevorzugten Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in Chemilumineszenz-Immunoassays sind 10-Methyl-N-(2- carboxyethyl)-N-tosyl-9-acridiniumcarboxamid, 10-(3- Sulfopropyl)-N-(2-carboxyethyl)-N-tosyl-9- acridiniumcarboxamid und 10-(3-Sulfopropyl)-N-(3- sulfopropyl)-N-tosyl-9-acridiniumcarboxamid.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Darstellung einer chemilumineszierenden Verbindung umfaßt die Schritte, ein Amin, beschrieben durch die Formel
X³-R-NH&sub2;
mit einem Sulfonylhalogenid mit der Formel
W-SO&sub2;-R'-X²
in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart einer Base unter Bildung eines Sulfonamids mit der Formel
X³RNHSO&sub2;R'X²,
zusammenzubringen, und das Sulfonamid in ein inertes Lösungsmittel in Gegenwart einer Base unter Bildung eines Sulfonamid-Anions mit der Formel
X³-R-N&supmin;-SO&sub2;R'-X² M&spplus;,
einzubringen, und
a) die Acylierung mit einer aktivierten 9- Acridincarboxylatverbindung der Formel
zur Darstellung der chemilumineszierenden Verbindung mit der Formel
oder
b) die Acylierung mit einer aktivierten Phenanthridin-6- carboxylatverbindung mit der Formel
zur Darstellung der chemilumineszierenden Verbindung mit der Formel
wobei W aus der Gruppe bestehend aus Chlor- und Fluorgruppen gewählt ist, wobei M aus der Gruppe bestehend aus Li, Na und K gewählt ist, wobei die Aktivierungsgruppe Z aus der Gruppe bestehend aus Halogen-, Imidazol-, N-Hydroxysuccinimidyl- und aus Azidogruppen gewählt ist, und wobei alle anderen Symbole wie oben definiert sind.
Desweiteren kann ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung Schritte enthalten, in denen die Acylierung in Teil a) mit
und in Teil b) mit
ausgeführt wird, und in denen R''-X¹ nachfolgend durch Alkylierung mit Y-R''-X¹ eingeführt wird, wobei Y während der Reaktion zum Gegenion wird.
Ein Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch kovalente Kupplung eines Antikörpers, eines Haptens, eines Antigens oder eines Polynucleotids (z. B. DNA oder RNA) an eine chemilumineszierende Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet werden, und ein Verfahren zur Durchführung eines Chemilumineszenzassays umfaßt den Schritt des Aussetzens einer zu testenden Probe gegenüber dem Konjugat, um die Anwesenheit einer Substanz nachzuweisen, die gegenüber dem Konjugat spezifisch reaktiv ist, wie z. B. ein spezifisches Antigen, ein spezifischer Antikörper oder ein komplementäres Polynucleotid (d. h. ein Polynucleotid, das sequenzspezifische Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Polynucleotidkonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung bildet).
Vertreter für Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung sind Antikörper oder Antigene, die an eine chemilumineszierende Verbindung der vorliegenden Erfindung gekuppelt sind.
Vertreter für Immunoassays gemäß der Erfindung sind solche, die auf die Anwesenheit von Antigenen prüfen und den Schritt des Aussetzens einer Probe gegenüber dem entsprechenden Antikörper-chemilumineszierende-Verbindung- Konjugat umfassen, und solche, die auf die Anwesenheit von Antikörpern prüfen und den Schritt des Aussetzens einer Probe gegenüber dem Antigen-chemilumineszierende-Verbindung- Konjugat umfassen.
Das Problem der Instabilität von Acridiniumarylestern wird bei der vorliegenden Erfindung durch den Wechsel der Austrittsgruppe von einem Phenolat zu einem Sulfonamid-Anion angegangen. Obwohl beide Austrittsgruppen einen pKa-Wert von etwa 10 haben, besitzt das Acridiniumsulfonylamid die zusätzliche Stabilisierung, die mit Amidbindungen einhergeht. Dies spiegelt sich in einem Vergleich der Carbonylstreckschwingung des Arylesters (1730 cm&supmin;¹) im Infraroten mit der des Sulfonylamids (1680 cm&supmin;¹) wieder.
Eine Klasse von Acridiniumsalzen, die 10-Alkyl-N- alkyl(aryl)-sulfonyl-N-alkyl(aryl)-9-acridiniumcarboxamidsalze, wurde entsprechend der allgemeinen Darstellung in der Abbildung dargestellt. In der Abbildung sind R, R' und R'' Substituenten, die als Spacerarme, Löslichkeitsmodifizierer und/oder Reaktivitätsmodifizierer wirken können, die jedoch nicht mit der Chemilumineszenz-Reaktion interferieren. ("Interferieren" bedeutet hier "Verhindern der Bildung effektiver Chemilumineszenz", d. h., Verhindern der Bildung von Chemilumineszenz in dem Ausmaß, daß die Verbindung für die beabsichtigte Anwendung nicht nützlich ist.) Desweiteren sind in der Abbildung X¹, X², X³ Substituenten, die als Löslichkeitssteigerer und/oder als reaktive Gruppen für die Bindung an ein Analyt wirken können, oder die als Gruppen wirken können, die unmittelbar zu solchen reaktiven oder zu Verbindungsgruppen konvertiert werden können, die dem Fachmann gut bekannt sind. Y&supmin; ist ein Gegenion in der Abbildung.
Salze, die gemäß dem Schema in der Abbildung dargestellt wurden, erzeugen bei Oxidation mit basischem Wasserstoffperoxid Licht. Die Verbindungen wurden aus unmittelbar verfügbaren Aminen (X³-RNH&sub2;) und Sulfonylchloriden (X²-R'SO&sub2;Cl) dargestellt. Bei Acylierung mit 9-Chlorcarbonylacridin bildet das intermediäre Sulfonamid (X³-RNH-SO&sub2;R'-X&sub2;) eine neue Klasse von Acridinverbindungen, die nach Alkylierung die Acridiniumsalze ergaben. Ähnlich führt die Substitution von Acridin durch ein 6-Chlorcarbonylphenanthridin in diesem Schema zu einer neuen Klasse von Phenanthridiniumsalzen. Diese Acridinium- und Phenanthridiniumsalze sind nützlich für die Chemilumineszenzmarkierung von Proteinen, Nucleinsäuren und kleinen Molekülen, die in Diagnosetests verwendet werden.
Verschiedene Acridiniumsulfonylamide wurden hergestellt, die spezifische Aktivität und Stabilität aufzeigen, und die für die Verwendung in Diagnosetests, insbesondere in CLIA, geeignet sind. Die Synthese dieser Verbindungen ermöglicht die Einführung mehrerer funktioneller Gruppen (X¹, X², X³), die für die Antikörpermarkierung verwendet werden können. Desweiteren kann die Kinetik der Chemilumineszenzreaktion durch die Wahl der Substituenten (R, R') in der Sulfonamid-Austrittsgruppe gesteuert werden.
Die Verbindungen wurden durch Verdünnung von 20 ul einer 10-9 M-Lösung der Verbindung mit 300 ul 0,1 N HCl, dann Zugabe von 150 ul 0,03% H&sub2;O&sub2; in 0,2 N NaOH zum Auslösen der Chemilumineszenz, auf ihre Wirksamkeit geprüft. Die Chemilumineszenz wurde mit einem photonenzählenden Luminometer gemessen. Die Lichtabgabe wurde als Summe der Photonenzählimpulse aufgezeichnet, woraus die Ausbeute für jede Verbindung als Zählimpulse/Mol berechnet wurde. Dies sind relative Werte, da die Effizienz der Photonenzählung meßgeräteabhängig war. Direkte Vergleiche der Verbindungen wurden mit dem selben Meßgerät durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt, in der die Strukturen durch die Formel
beschrieben werden können, wobei R''-X¹ gleich CH&sub3; ist, und R'-X² und R-X³ wie in Tabelle 1 angezeigt, sind. Die Chemilumineszenzabgabe ist als "ZI/MOL" abgekürzt, die benötigte Zeit für die gesamte Lichtabgabe ist als "GES.ZEIT" und die benötigte Zeit bis zum Höchstwert der Lichtabgabe ist abgekürzt mit "ZI MAX". TABELLE 1 MOL GES.ZEIT
Alle untersuchten Verbindungen waren wirksam (5-20· 10¹&sup8; Zählimpulse/Mol). Die spezifische Aktivität war gegenüber der Natur der R- und R'-Gruppen an den oben aufgeführten Stellen unempfindlich, jedoch variierte die benötigte Zeit bis zum Höchstwert der Lichtabgabe und die benötigte Zeit für die gesamte Lichtabgabe um den Faktor 50 zwischen den langsamsten und den schnellsten Verbindungen.
Elektronenziehende Gruppen in R und R' vergrößerten die Reaktionsgeschwindigkeit, während sperrige, elektronenabgebende Gruppen die Reaktionsgeschwindigkeit verringerten. Obwohl chemilumineszente Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Chemilumineszenz- Lebensdauer von 2-10 s für Immunoassays bevorzugt sind, können Verbindungen mit einer kürzeren Lebensdauer als Quelle für intensives, gepulstes Licht nützlich sein, und Verbindungen mit einer längeren Lebensdauer können als "Kaltlicht"-Quellen nützlich sein.
Die Stabilität der gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellten Verbindungen wurde auf verschiedene Weise festgestellt. Zunächst wurden die Verbindungen auf subnanomolare Lösungen in wäßrigem Puffer bei pH 5-7 verdünnt. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur und bei 45ºC inkubiert, währenddessen wurde die Abnahme der Chemilumineszenz mit der Zeit überwacht. Dies ergab qualitative Ergebnisse, aus denen die relative Stabilität der Verbindungen bestimmt wurde. Anormale Ergebnisse infolge nicht-spezifischer Adsorption der Verbindungen im Inkubationsbehälter wurden durch Zugabe von Detergenzien, Protein und ähnlichem minimiert. Unzweideutige, quantitative Ergebnisse wurden durch Überwachung millimolarer Lösungen der Verbindungen mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie ("HPLC") erhalten. Die Stabilität dieser Verbindungen wurde durch R und R' auf die gleiche Weise beeinflußt wie die Kinetik der Chemilumineszenz- Reaktion, d. h. elektronenziehende Gruppen destabilisierten und sperrige, elektronenabgebende Gruppen stabilisierten die Verbindungen.
Obwohl andere Verfahren zum Markieren von Antikörpern eingesetzt werden können, wird das NHS-Aktivierungsverfahren derzeit bevorzugt. Zu weiteren Stoffen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gut wirken, gehören polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Fab-Antikörperfragmente, die alle hierin folgend mit dem allgemeinen Ausdruck "Antikörper" bezeichnet sind, Haptene, Antigene, Nucleinsäuresonden und Nicht-Antikörper bindende Proteine, die in der Lage sind, komplementäre Analyte mit kleinem Molekulargewicht zu binden (z. B. folatbindendes Protein, das Folsäure bindet, und intrinsicher Faktor, der Vitamin B&sub1;&sub2; bindet). Die Antikörperkonjugate behalten mehr als 80% der Chemilumineszenz bei, nachdem sie vier Wochen lang bei 45 ºC erhitzt worden waren.
Ein Festphasen-Sandwich-Immunoassaysystem zur Bestimmung von Hepatitis-B-Oberflächenantigen ("HBsAg") (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) wurde verwendet, um das CLIA gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem RIA zu vergleichen. Der Typ der antikörperbeschichteten Perlen, der Verdünner, die Inkubationsbedingungen, die Waschbedingungen und die Antikörperpräparation waren gleich, außer daß der Antikörper für das RIA nach dem Chloramin-T- Verfahren mit 1251 markiert wurde, und daß er für das CLIA mit NHS-aktiviertem N-Sulfonyl-9-acridiniumcarboxamid markiert wurde.
Ein Festphasen-Sandwich-Immunoassay für humanthyroidstimulierendes Hormon (hTSH) wurde verwendet, um das CLIA mit dem EIA zu vergleichen (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). Beim EIA wurde ein Meerrettichperoxidase ("HRPO")-markierter Antikörper eingesetzt, während beim CLIA ein NHS-aktiviertes N- Sulfonyl-9-acridiniumcarboxamid verwendet wurde.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben. In Beispiel 1 wird die Darstellung von Sulfonamiden beschrieben, die beim Aufbau von Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Beispiel 2 umfaßt eine Beschreibung der Darstellung von N-Sulfonyl-9-acridincarboxamiden gemäß der vorliegenden Erfindung. In Beispiel 3 wird die Herstellung von 10-Methyl- N-sulfonyl-acridiniumcarboxamiden beschrieben. Die Beispiele 4-6 enthalten Beschreibungen von Synthesen von p- Toluolsulfonyl (Tosyl)-Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung. In Beispiel 7 wird die Darstellung von Acridincarboxamiden beschrieben.
Die Beispiele 8-10 enthalten Verfahren für die Synthese von einigen Acridiniumcarboxamiden und deren Produkten gemäß der vorliegenden Erfindung. In Beispiel 11 wird eine Beurteilung der Chemilumineszenz von N- Sulfonylacridiniumcarboxamid-Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung gegeben. Beispiel 12 umfaßt eine Aufzeichnung eines Stabilitätstests eines Acridiniumcarboxamids gemäß der vorliegenden Erfindung. In Beispiel 13 wird die Temperatur- und pH-Stabilität von zwei Acridiniumcarboxamiden gemäß der vorliegenden Erfindung mit der Temperatur- und pH-Stabilität eines Acridiumcarboxylates verglichen. Beispiel 14 ist die Beschreibung eines Verfahrens zur Konjugation eines Antikörpers, genauer eines Immunoglobulin G("IgG")-Antikörpers, mit einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Ergebnisse einer Hitzestabilitätsuntersuchung eines Konjugats gemäß Beispiel 14 sind in Beispiel 15 beschrieben. Beispiel 16 enthält eine Beschreibung für die Darstellung eines Anti-HBsAg- Acridinium-markierten Konjugats sowie einen Vergleich der Empfindlichkeit, die bei CLIA- und RIA-Assays mit diesen Konjugaten beobachtet wurde. In Beispiel 18 wird die Synthese einer Phenanthridiniumverbindung gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben. Beispiel 17 beschreibt ein Anti-hTSH-Acridinium-markiertes Konjugat zusammen mit einem Vergleich zu einem EIA-System.

Beispiel 1

Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Sulfonamiden

Die Aminausgangsstoffe für die Verbindungen 1-13 und 17-21 sind bei Aldrich Chemical Co. Milwaukee, Wisconsin, erhältlich. Für die Verbindungen 14-16 und 22-25 wurde die geeignete Aminocarbonsäure (wie von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Winconsin, erhalten) gemäß veröffentlichter Standardverfahren verestert, um das Ausgangsmaterial zu liefern.
Um ein Sulfonamid gemäß der vorliegenden Erfindung darzustellen, wurde das entsprechende Amin (200 Mol-%) in wasserfreiem Methylenchlorid gelöst, und tropfenweise bei 0ºC mit einer Lösung (100 Mol-%) des Sulfonylchlorids oder -anhydrids behandelt. Die Lösung wurde in wasserfreien Ether (5 Volumina) gegossen, mit 1,4 M H&sub3;PO&sub4; (25 ml) und anschließend mit Salzlösung (25 ml) gewaschen, und über MgSO&sub4; getrocknet. Nach Filtration und Eindampfen wurden die Rohsulfonamide aus einem geeigneten Lösungsmittel kristallisiert.
Die folgenden Sulfonamide wurden auf diese Weise hergestellt. In der Beschreibung, die den Namen jeder Verbindung begleitet, bezeichnet die Abkürzung "MS" Peaks wie den Basispeak ("M&spplus;") im Massenspektrum an einer Stelle (d. h. bei einem m/e), die durch das Symbol "@" spezifiziert ist. Ein Schmelzpunkt ("Mp") oder eine Angabe, daß der Stoff bei Raumtemperatur flüssig ist (z. B. "Öl") oder vor dem Schmelzen zerfällt ("decomp."), kann angegeben sein. Jede Verbindung ist durch eine "Verbindungsnummer" (1-25 in diesem Beispiel) und nachfolgende "Identifikationsnummer" (z. B. 13513-227) und durch einen chemischen Namen identifiziert.
1. 13513-227 N-Phenyl-p-toluolsulfonamid MS M&spplus; @ 247 Mp 100-102ºC
2. 13513-228 N-Phenyl-p- brombenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 311 Mp 115-117ºC
3. 13513-229 N-Phenyl-onitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 278 Mp 112-113ºC
4. 13513-231 N-Phenyl-p- nitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 278 Mp 168-170ºC
5. 13513-232 N-Phenyl-2,4- dinitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 323 Mp 110-113ºC
6. 13513-233 N-Phenyltrifluormethansulfonamid MS M&spplus; @ 225 Mp 55-67ºC
7. 13514-001 N-Isopropyl-p-toluolsulfonamid MS M&spplus; @ 213 Mp 50-51ºC
8. 13514-002 N-Isopropyl-p- brombenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 277 Mp 95-96ºC
9. 13514-003 N-Isopropyl-onitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 244 Mp 119-120ºC
10. 13514-004 N-Isopropyltrifluormethansulfonamid MS (M - 1) @ 190 Öl
11. 13514-006 N-Isopropyl-p- nitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 244 Mp 113-114ºC
12. 13514-025 N-Butyl-2,4,6- trimethylbenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 255 Mp 45ºC
13. 13514-026 N-Butyl-2,4,6- triisopropylbenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 339 Mp 104ºC
14. 13514-032 Benzyl-6-(N-tosylamino)hexanoat MS M&spplus; @ 375 Öl
15. 13514-057 t-Butyl-N-tosyl-b-alanin MS M&spplus; @ 242 (M-57) Öl
16. 13514-058 Benzyl-5-(N-tosylamino)pentanoat MS M&spplus; @ 361 Öl
17. 13513-170 N-Butyl-p-toluolsulfonamid MS M&spplus; @ 227 Mp 42-44ºC
18. 13513-173 N-Butyl-p-brombenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 241 Mp 53-54ºC
19. 13513-172 N-Butyl-onitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 258 Mp 58-60ºC
20. 13513-174 N-Butyl-p- nitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 258 Mp 80-81ºC
21. 13513-213 N-Butyl-2,4- dinitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 304 Mp 60-62ºC
22. 13513-085 Benzyl-6-(N-trifluormethylsulfonylamino)-hexanoat Öl
23. 13513-083 Benzyl-N- (trifluormethylsulfonyl)-4- (carboxymethyl)anilin
24. 14973-1A Benzyl-N-(5-carboxypentyl)-p- brombenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 439 Mp 52-56ºC
25. 14973-37A Benzyl-N-(5-carboxypentyl)-p- nitrobenzolsulfonamid MS M&spplus; @ 406 Mp 86-88ºC

Beispiel 2

Herstellung von N-Sulfonyl-9-acridincarboxamiden

Frisch sublimiertes Kalium-tert-butoxid (200 Mol-%) und tri-n-Butylbenzylammoniumbromid (1 Mol-%) wurden in Toluol unter Stickstoff suspendiert. Ein ausgewähltes Sulfonamid (200 Mol-%) wurde zugefügt, das Gemisch wurde 10- 30 Minuten lang gerührt, bevor es bis zur Trockne eingedampft wurde. Das getrocknete Material wurde in Lösungsmittel resuspendiert. (Alternativ kann der Phasentransferkatalysator weggelassen werden und es kann ein geeignetes Anion in Tetrahydrofuran erzeugt werden.) Nach der Zugabe von 9-Chlorcarbonylacridinhydrochlorid (100 Mol-%) wurde das Reaktionsgemisch 3 bis 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bis keine weitere Änderung durch Dünnschichtchromatografie ("TLC") festgestellt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit Ethylether (10 Volumina) verdünnt und mit Salzlösung (25 ml) gewaschen. Nach Trocknen über MgSO&sub4;, Filtrieren und Eindampfen wurde das Rohprodukt chromatographiert (auf einem ChromatotronTM-Chromatograph [erhältlich bei Harrison Research, Palo Alto, California] unter Verwendung eines 2 mm Silicarotors und unter Verwendung eines Ethylacetat/Hexan-Gradienten). Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden gesammelt, eingedampft und aus Ether/Heptan kristallisiert (d. h. die Fraktionen wurden in Ether gelöst und anschließend wurde Heptan zugegeben, bis das Gemisch trüb wurde).
Die folgenden Verbindungen wurden aus der in Klammern angegebenen Ausgangssubstanz dargestellt, wobei das hier dargestellte Ausgangsmaterial durch die Nummer nach Beispiel 1 oder nach diesem Beispiel identifiziert ist, und wobei für jedes identifizierte Ausgangsmaterial, das nicht hier synthetisiert wurde, eine kommerzielle Bezugsquelle in Klammern angegeben ist. Alle anderen Bezeichnungen sind in Beispiel 1 erklärt.
26. 13513-234 N-Phenyl-N-p-toluolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 1) MS M&spplus; @ 452 Mp 200ºC
27. 13513-236 N-Phenyl-N-p- brombenzolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 2) MS M&spplus; @ 516 Mp 218-219ºC
28. 13513-240 N-Phenyl-N-onitrobenzolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 3) MS M&spplus; @ 483 Mp 197-200ºC
29. 13513-242 N-Phenyl-N-p- nitrobenzolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 4) MS M&spplus; @ 483
30. 13513-243 N-Phenyl-N- trifluormethansulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 6) MS M&spplus; @ 430 Mp 162ºC
31. 13514-007 N-Isopropyl-N-p- toluolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 7) MS M&spplus; @ 418 Mp 163-164ºC
32. 13514-009 N-Isopropyl-N-p- brombenzolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 8) MS M&spplus; @ 482 Mp 205ºC
33. 13514-012 N-Isopropyl-N-onitrobenzolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 9) MS M&spplus; @ 449 Mp 215ºC
34. 13514-001 N-Isopropyl-N- trifluormethansulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 10) MS M&spplus; @ 396
35. 13514-028 N-Butyl-N-2,4,6- trimethylbenzolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 12) MS M&spplus; @ 460 Mp 88-90ºC
36. 13514-031 N-Butyl-2,4,6- triisopropylbenzo1sulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 13) MS M&spplus; @ 544
37. 13514-042 N-Tosyl-N-(5-carboxypentyl)-9- acridincarboxamidbenzylester (Verbindung 14) MS M&spplus; @ 550 Öl
38. 13514-062 N-Tosyl-N-(4-carboxybutyl)-9- acridlncarboxamidbenzylester (Verbindung 16) MS M&spplus; @ 566
39. 13514-069 N-Tosyl-N-(2-carboxyethyl)-9- acridincarboxamid-t-butylester (Verbindung 15) MS M&spplus; 504 Mp 157-158ºC
40. 13513-186 N-Butyl-N-p-toluolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 17) MS M&spplus; @ 432 Mp 122-123ºC
41. 13513-191 N-Butyl-N-onitrophenylsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 19) MS M&spplus; @ 463 Mp 170ºC
42. 13513-195 N-Butyl-N-p- nitrophenylsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 20) MS M&spplus; 463 Mp 210ºC
43. 13513-218 N-Butyl-N-(2,4- dinitrophenylsulfonyl)-9- acridincarboxamid (Verbindung 21) MS M&spplus; @ 508 Mp 95ºC
44. 14973-9C N-(5-Carboxypentyl)-N-p- brombenzolsulfonyl-9- acridincarboxamidbenzylester (Verbindung 24) MS (M + H) @ 645
45. 14973-40C N-(5-Carboxypentyl)-N-p- nitrobenzolsulfonyl-9- acridincarboxamidbenzylester (Verbindung 25) MS (M + H) @ 645
46. 14973-88A N-p-Toluolsulfonyl-9- acridincarboxamid [p-Toluolsulfonamid (Aldrich)] Mp 276ºC
47. 14973-21C N-Allyl-N-p-toluolsulfonyl-9- acridincarboxamid (Verbindung 46) Mp 136-138ºC
48. 13513-202 N-Butyl-N-p- brombenzolsulfonyl-9- acridincarboxamid MS M&spplus; @ 496/498 Mp 148-149ºC

Beispiel 3

Darstellung von 10-Methyl-N-sulfonylacridiniumcarboxamiden

Die Methylierung von N-Sulfonylacridincarboxamiden wurde nach dem folgenden Verfahren durchgeführt. Jedes Acridinsulfonamid wurde in wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Wasserfreies Na&sub2;CO&sub3; (5·Gewicht des Sulfonamids) wurde zugefügt, gefolgt von Methyltriflat (20·Gewicht des Sulfonamids). Die Suspension wurde unter Stickstoff 14-48 Stunden bei Raumtemperatur bis 40ºC gerührt. Die Reaktion wurde mittels TLC (Umkehrphasenchromatographie) überwacht. Das Produkt wurde nach Filtration und Eindampfen des Lösungsmittels und des überschüssigen Methyltriflats erhalten. Die Reinigung wurde durch Zerstoßen des festen Rückstands in heißem Benzol oder mittels Umkehrphasen-HPLC erzielt.
Die folgenden Verbindungen wurden dargestellt, und sie sind entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen beschrieben, die in den Beispielen 1 und 2 erklärt sind.
49. 13513-246 10-Methyl-N-phenyl-N-p- toluolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 26) MS M&spplus; @ 467 Mp 210-24ºC (decomp.)
50. 13513-247 10-Methyl-N-phenyl-N-p brombenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 27) MS M&spplus; @ 531, 533 Mp 240ºC (decomp.)
51. 13513-248 10-Methyl-N-phenyl-onitrobenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 28) MS M&spplus; @ 490 Mp 248-50ºC (decomp.)
52. 13513-249 10-Methyl-N-phenyl-N- trifluormethansulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 30) MS M&spplus; @ 445
53. 13513-250 10-Methyl-N-phenyl-p- nitrobenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 29) MS M&spplus; @ 484
54. 13514-013 10-Methyl-N-isopropyl-N-p- toluolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 31) MS M&spplus; @ 433 Mp 214ºC
55. 13514-014 10-Methyl-N-isopropyl-N-p- brombenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 32) MS M&spplus; @ 497/499 Mp 200ºC (decomp)
56. 13514-018 10-Nethyl-N-isopropyl-N-onitrobenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 33) MS M&spplus; @ 464
57. 13514-021 10-Methyl-N-isopropyl-N- trifluormethansulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 34) MS M&spplus; @ 411
58. 13514-037 10-Methyl-N-butyl-N-(2,4,6- trimethylbenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 35) MS M&spplus; @ 475 Mp 227ºC (decomp.)
59. 13514-038 10-Methyl-N-butyl-N-(2,4,6- triisopropylbenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 36) MS M&spplus; @ 559 Mp 231ºC (decomp.)
60. 13514-044 10-Methyl-N-tosyl-N-(5- carboxypentyl)-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonatbenzylester (Verbindung 37)
61. 13514-079 10-Methyl-N-tosyl-N-(2- carboxyethyl)-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat-t-butylester (Verbindung 39) MS M&spplus; @ 519 Mp 207ºC (decomp.)
62. 13513-211 10-Methyl-N-butyl-N-p- toluolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 40) MS M&spplus; @ 447
63. 13513-212 10-Methyl-N-butyl-N-p- brombenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 48) MS M&spplus; @ 511 Mp 126ºC
64. 13513-215 10-Methyl-N-butyl-N-onitrophenylsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 41) MS M&spplus; @ 478 Mp 232-234ºC
65. 13513-216 10-Methyl-N-butyl-N-p- nitrophenylsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 42) MS M&spplus; @ 478 Mp 201ºC
66. 13513-230 10-Methyl-N-butyl-N-(2,4- dinitrophenylsulfonyl)-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 43) MS M&spplus; @ 523 Mp 215-220ºC
67. 14973-31B 10-Methyl-N-allyl-N-p- toluolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 47) MS M&spplus; 2 @ 433
68. 14973-47A 10-Methyl-N-(5-carboxypentyl)- N-p-nitrobenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonatbenzylester (Verbindung 45) MS M&spplus; @ 626 Mp 139-141ºC
69. 14973-90A 10-Methyl-N-methyl-N-p- toluolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 46) MS M&spplus; Ω 405
70. 14973-25A 10-Methyl-N-(5-carboxypentyl)- N-(o-brombenzolsulfonyl)-9- acridiniumcarboxamidbenzylester (Verbindung 44)

Beispiel 4

Synthese von 10-Methyl-N-tosyl-N-(6-hexanoyl-N- hydroxysuccinimid)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat

Verbindung 37 (450 mg, 0,78 mmol) wurde mit 6 ml 31% iger HBr in Essigsäure bei 50ºC 2 Stunden lang unter Stickstoff behandelt. Die Lösung wurde in 30 ml Wasser gegossen und gekühlt. Die Carbonsäureverbindung 71, 13514- 045 [N-Tosyl-N-(5-carboxypentyl)-9-acridincarboxamid] wurde durch Filtration abgetrennt.
Verbindung 71 (100 mg, 0,2 mmol) wurde in trockenem Methylenchlorid (5 ml) gelöst und mit N-Hydroxysuccinimid (23 mg, 0,2 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (41 mg) unter N&sub2; 12 Stunden lang behandelt. Nach der Reaktion wurde die Lösung filtriert und anschließend bis zur Trockne eingedampft und lieferte einen aktiven Ester, Verbindung 72, 13514-052 [N-Tosyl-N-(6-hexanoyl-N-hydroxysuccinimid)-9- acridincarboxamid].
Verbindung 72 wurde wie in Beispiel 3 methyliert und ergab Verbindung 73. Die Verbindungen 71, 72 und 73 sind unten entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen beschrieben, die in Beispiel 1 erklärt sind.
71. 13514-045 N-Tosyl-N-(5-carboxypentyl)-9- acridincarboxamid (Verbindung 37) MS M&spplus; @ 240 Mp 150-152ºC
72. 13514-052 N-Tosyl-N-(6-hexanoyl-N- hydroxysuccinimid)-9- acridincarboxamid (Verbindung 71) MS M&spplus; @ 588
73. 13514-054 10-Methyl-N-tosyl-N-(6- hexanoyl-N-hydroxysuccinimid)- 9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 72)

Beispiel 5

Synthese von 10-Methyl-N-tosyl-N-(5-pentanoyl-N- hydroxysuccinimid)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat

Verbindung 38, 13514-062, wurde wie in Beispiel 4 behandelt und ergab Verbindung 74, 13514-065 [N-Tosyl-N-(4- carboxybutyl)-9-acridincarboxamid].
Verbindung 74 wurde an N-Hydroxysuccinimid wie in Beispiel 4 gekuppelt und lieferte Verbindung 75, 13514-067 [N-Tosyl-N-(5-pentanoyl-N-hydroxysuccinimid)-9- acridincarboxamid].
Diese Verbindung wurde wie in Beispiel 3 methyliert und lieferte Verbindung 76, 13514-078 [10-Methyl-N-tosyl-N- (5-pentanoyl-N-hydroxysuccinimid)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat].
Die Verbindungen 74, 75 und 76 sind unten entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen beschrieben, die in Beispiel 1 erklärt sind.
74. 13514-065 N-Tosyl-N-(4-carboxybutyl)-9- acridincarboxamid MS M&spplus; @ 476 Mp 152-155ºC
75. 13514-067 N-Tosyl-N-(5-pentanoyl-N- hydroxysuccinimid)-9- acridincarboxamid (Verbindung 74) MS M&spplus; @ 573
76. 13514-078 10-Methyl-N-tosyl-N-(5- pentanoyl-N-hydroxysuccinimid)- 9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 75)

Beispiel 6

Synthese von 10-Methyl-N-tosyl-N-(2-carboxyethyl)-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat

Verbindung 61, 13514-079 (50 mg, 0,072 mmol) wurde in 2 ml Trifluoressigsäure ("TFA") bei 0ºC unter N&sub2; gelöst. Nach 15 Minuten langem Rühren wurde die TFA verdampft und der Rückstand aus Methanol/Ether umkristallisiert (d. h. der Rückstand wurde in Methanol gelöst und Ether wurde zugefügt bis zur Trübung). Alternativ wurde Verbindung 61 in 1 N HCl am Rückflußkühler 3 Stunden lang erhitzt. Die wäßrige Lösung wurde bis zur Trockne eingedampft und hinterließ einen Rückstand. Der Rückstand wurde mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Verbindung 77, 13514-081 [10- Methyl-N-tosyl-N-(2-carboxyethyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat) resultierte aus beiden Ansätzen.
Die Verbindung 77 ist unten entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen beschrieben, die in Beispiel 1 erklärt sind.
77. 13514-081 10-Methyl-N-tosyl-N-(2- carboxyethyl)-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 61) MS (M + 14) @ 477; M&spplus; @ 463 Mp 227ºC (decomp.)

Beispiel 7

Darstellung von Acridincarboxamiden

Ein Amin (110 Mol-%) und Triethylamin (220 Mol-%) wurden in Methylenchlorid gelöst. Einhundert Mol-% an 9- Chlorcarbonylacridin wurden tropfenweise als Lösung in Methylenchlorid zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde unter N&sub2; 3 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde durch Silicagel filtriert und das Filtrat wurde eingedampft und hinterließ einen Rückstand. Der Rückstand wurde anschließend aus einem geeigneten Lösungsmittel (Isopropylether für Verbindung 78 und Ethylether für Verbindung 79) umkristallisiert.
Die folgenden Amide wurden dargestellt, und sie sind entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen beschrieben, die in Beispiel 1 erklärt sind.
78. 14973-15A N-Allyl-9-acridincarboxamid [Allylamin (Aldrich)] MS M&spplus; @ 262 Mp 192ºC
79. 14973-6A Benzyl-N-(5-carboxypentyl)-9- acridincarboxamid [6-Aminocapronsäure (Aldrich)] MS M&spplus; @ 458 Mp 86ºC

Beispiel 8

Synthese von Acridiniumcarboxamiden

Ein Ester (entweder Verbindung 44 oder Verbindung 68) wurde zu einer 1 N HCl-Lösung gegeben und 3-4 Stunden lang am Rückflußkühler erhitzt. Nach dem Kühlen wurde die Suspension entweder filtriert und das Produkt gesammelt oder die Suspension wurde mit einem Chloroform:Isopropanol- Gemisch (3 : 2) extrahiert, was das gewünschte Produkt (Verbindung 80 bzw. 81) nach dem Eindampfen ergab. Die Verbindungen 80 und 81 sind entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen beschrieben, die in Beispiel 1 erklärt sind.
80. 147973-27A 10-Methyl-N-(5-carboxypentyl)- N-p-brombenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 44) MS M&spplus; @ 569, 571 Mp 148-150ºC
81. 14973-51A 10-Methyl-N-(5-carboxypentyl)- N-p-nitrobenzolsulfonyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat (Verbindung 68) MS M&spplus; @ 536

Beispiel 9

Synthese von 10-(3-Sulfopropyl)-N-tosyl-N-(2-carboxyethyl)- 9-acridiniumcarboxamid

Propansulfon (260 Mol-%) wurde mit t-Butyl-N-tosyl-N- (2-carboxyethyl)-9-acridincarboxamid (Verbindung 39, 13514- 069) bei 110-120ºC 2 Stunden lang erhitzt. Nach dem Kühlen wurde der Feststoff in Methanol aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Benzol zerstoßen, um nicht-quaternisiertes Material zu entfernen.
Die Rohproduktverbindung wurde mit Trifluoressigsäure bei 0ºC behandelt, dann über einen Zeitraum von 15 Minuten auf 25ºC erwärmen lassen. Der nach der Eindampfen erhaltene Rückstand wurde chromatographisch gereinigt auf präparativen Dünnschichtchromatographieplatten (C-18 PLKC 18 F, 20·20 cm, 1000 M, erhältlich von Whatman, Clifton, New Jersey), mit 70 Teilen Methanol/30 Teilen 0,5% wäßriger Essigsäure eluiert und weiterhin durch Ionenaustausch auf Cellex-DTM- Austauscherharz (BioRad Laboratories, Richmond, California) unter Verwendung von 8% Ameisensäure zur Elution des Produkts gereinigt, und ergab Verbindung 82, die entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen unten beschrieben ist, die in Beispiel 1 erklärt sind.
82. 14496-243 10-(3-Sulfopropyl)-N-tosyl-N- (2-carboxyethyl)-9- acridiniumcarboxamid (Verbindung 39) MS M&spplus; @ 572

Beispiel 10

Synthese von 10-(3-Sulfopropyl)-N-tosyl-N-(3-sulfopropyl)-9- acridiniumcarboxamid

Fünfzig Milligramm N-Tosyl-9-acridincarboxamid (Verbindung 46, 14973-88A) wurden bei 140-150ºC unter Argon in einer abgedichteten Röhre mit 500 mg Propansulfon 3 Stunden lang erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das überschüssige Propansulfon durch Zerstoßen in Benzol (5 ml X 3) entfernt. Das Rohprodukt wurde mittels Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer BioRad AG-1-X4 Formiatformsäule (BioRad Laboratory, Richmond, California] gereinigt, mit einem Gradienten wäßriger Ameisensäure als Laufmittel. Das Produkt, Verbindung 83, ist entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen unten beschrieben, die in Beispiel 1 erklärt sind.
83. 30253-020 10-(3-Sulfopropyl)-N-tosyl-N- (3-sulfopropyl)-9- acridiniumcarboxamid (Verbindung 46) MS M&spplus; M + H @ 621.

Beispiel 11

Beurteilung der Chemilumineszenz von N- Sulfonylacridiniumcarboxamid

Acridiniumverbindungen, die auf ihre Chemilumineszenz geprüft werden sollten, wurden in Dimethylformamid ("DMF") gelöst und anschließend mit 0,05 M Natriumcitratpuffer (pH 5,0) oder 0,05 Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) verdünnt und ergaben Lösungen von etwa 3·10&supmin;&sup9; M. Zwanzig Mikroliter jeder gepufferten Lösung wurde mit 300 ul 0,1 N HCl verdünnt und die Chemilumineszenz wurde mit 150 ul 0,03% H&sub2;O&sub2; in 0,2 N NaOH ausgelöst.
Das erzeugte Licht wurde auf einem Photonenzähler- Luminometer über einen Zeitraum von 10 Sekunden aufgezeichnet, es sei denn, in der Tabelle 2 ist ein längerer Zeitraum angegeben. Die spezifische Aktivität jeder Verbindung ist in Tabelle 2 in der Form Zählimpulse/Mol angegeben. TABELLE 2 Verbindung Nr. Identifikationsnr. ZI/Mol sec

Beispiel 12

Stabilitätstest von Verbindung 62 (13513-221)

Verbindung 62 (2 mg) wurde in 1 ml Methanol gelöst. Fünfzig Mikroliter dieser Lösung wurden jeweils folgenden Puffern zugesetzt:
1) 500 Mikroliter 0,05 M Natriumphosphat, pH 5,0
2) 500 Mikroliter 0,05 M Natriumphosphat, pH 5,5
3) 500 Mikroliter 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,0
4) 500 Mikroliter 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,5
5) 500 Mikroliter 0, 05 M Natriumphosphat, pH 7,0
Jede Lösung wurde mit einem Perkin-Elmer Series 4-HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen-Trennsäule (C-18 u Bondapak, 3,9 mm·30 cm, erhältlich bei Waters Associates, Milford, Massachusetts) analysiert. Die Elution erfolgte mit 75% Methanol und 25% 5 mM Pentansulfonsäure in 1% wäßriger Essigsäure bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min. Die ablaufende Flüssigkeit wurde bei 254 nm überwacht.
Nach 4 Wochen bei Raumtemperatur zeigten die Lösungen mit pH 5,0, pH 5,5 und pH 6,0 keine Anzeichen einer Zersetzung, während bei pH 6,5 und pH 7,0 20% bzw. 70% Zersetzung zu erkennen waren.

Beispiel 13

Vergleich der Temperatur- und pH-Stabilität von Acridiniumverbindungen in Pufferlösungen von pH 7,2

Drei verschiedene Acridiniumverbindungen, Verbindung 62, 13513-221, eine Verbindung mit der Kennummer 13514-020 [4-(Carbobenzyloxymethyl)-phenyl-10-methyl-9- acridiniumcarboxylattrifluormethansulfonat] dargestellt, wie in Weeks, et al., Clin. Chem., 29, 1474-79 (1983) beschrieben, und Verbindung 83, 30253-020, wurden auf ihre Temperatur- und pH-Stabilität hin verglichen. Der Vergleich wurde in Methanol oder Wasser bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml (was etwa 1,6·10&supmin;³ M entspricht) durchgeführt. Jede Probe wurde in einer sauren Lösung mit einem Teil 0,1 N HCl und einem Teil phosphatgepufferter Salzlösung ("PBS") pH 6,8 mit 0,01% Tween 20® (erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) auf 1 : 100 verdünnt. Der endgültige pH-Wert der verdünnten Lösung betrug etwa 1,5. Die Molarität jeder Lösung betrug 1,6·10&supmin;&sup5; M.
Jede Lösung wurde zum Aufzeichnen eines Absorptionsspektrums im UV/VIS-Bereich durchgemessen, um die molaren Extinktionskoeffizienten zu bestimmen und um alle merklichen Unterschiede in den Absorptionsspektren nachzuweisen. Die Absorptionsspektren im UV/VIS-Bereich dieser Acridiniumverbindungen haben die in Tabelle 3 dargestellten Eigenschaften. TABELLE 3 Verbindung Identifikations Wellenlänge Beobachtete Absorbtion
Für alle drei Verbindungen ist &sub3;&sub7;&sub0; = 18 000 und &sub2;&sub6;&sub3; = 87 000.
Die Spektren zeigen, daß es sowohl bei der Absoprtion im UV/VIS-Bereich als auch bei den molaren Extinktionskoeffizienten, zwischen diesen drei Verbindungen nur geringe Unterschiede gibt. Tatsächlich wurden innerhalb der experimentellen Fehlergrenzen wenige oder gar keine spektralen Unterschiede beobachtet.
Die 1,6·10&supmin;&sup5; M-Stammlösungen der drei Verbindungen wurden fortlaufend 10-fach verdünnt in 0,01 M Natriumphosphat mit 0,05% Normalhumanserum bei pH 4,8. Sie wurden ebenfalls fortlaufend 10-fach in PBS (pH 7,2) mit 0,01% Tween 20® verdünnt.
Da bekannt ist, daß im allgemeinen Acridiniumverbindungen bei einem sauren pH stabiler sind, wurde angenommen, daß die Zählimpulse, die von den in pH 4,8-Puffer verdünnten Proben erhalten wurden, für die maximale Stabilität bei maximaler Chemilumineszenz-Abgabe repräsentativ sein würden. Alle drei Verbindungen wurden fortlaufend 10-fach auf eine Endkonzentration von 1,6·10&supmin;¹&sup0; M verdünnt. Ein 10 ul Aliquot jeder Probe wurde zu 90 ul 0,05 N HCl zugefügt. Die Chemilumineszenz wurde mit 200 ul 0,03% H&sub2;O&sub2; in 0,25 N NaOH ausgelöst und die Zählimpulse wurden auf einem Luminometer 6 Sekunden lang überwacht mit den in Tabelle 4 dargestellten Ergebnissen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 für alle drei Durchgänge dargestellt. Verbindung Nr Identifikations Nr ZI/6 Sekunden
Innerhalb der experimentellen Fehlergrenzen unterschieden sich die Chemilumineszenz-Abgaben zwischen den einzelnen Verbindungen nicht, wie in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 Chemilumineszenz-Abgabe bei pH 4,8 Verbindung Nr. Identifikations Nr. ZI/Mol
Wenn 10 ul der gleichen Verbindungen auf 1,6·10&supmin;¹&sup0; M in 90 ul PBS-Puffer (pH 7,2) mit 0,01 Tween 20® verdünnt wurden und nicht angesäuert wurden, bevor die Bestimmung der Chemilumineszenz-Abgabe wie oben ausgeführt wurde, waren die Ergebnisse etwas anders, insbesondere für die Acridiniumcarboxylatverbindung 13514-020, wie in Tabelle 6 gezeigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 für alle drei Durchgänge dargestellt. TABELLE 6 Chemilumineszenz-Abgabe bei pH 7,2 Verbindung Nr. Identifikations Nr. ZI/6 Sekunden
Die Verbindung mit der Kennumer 13514-020 erzeugte lediglich 4,4·10¹&sup8; Zählimpulse/Mol im pH 7,2-Puffer, nahezu eine Größenordnung weniger Zählimpulse als bei pH 4,8. Dies kann durch die Pseudobasen-Bildung eines großen Anteils der Moleküle bei dem stärker alkalischen pH verursacht sein, da die Pseudobase wesentlich weniger chemilumineszent ist als die korrespondierende positiv geladene Acridiniumverbindung.
Die N-Sulfonylacridiniumcarboxamidverbindungen zeigten lediglich einen kleinen Abfall der Zählimpulse bei der Inkubation bei pH 7,2. Dies läßt vermuten, daß sie keine merkliche Pseudobasen-Bildung eingehen, zumindest nicht bei diesem pH.
Die Verdünnungsreihe aller drei Acridiniumverbindungen in pH 7,2-Puffer wurden über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend untersucht. Beide N- Sulfonylacridiniumcarboxamidverbindungen zeigten so gut wie keine Änderung der Chemilumineszenz. Das Phenylacridiniumcarboxylat zeigte einen signifikanten Abfall nach 20 Stunden bei Raumtemperatur.
Die Proben wurden dann in einen Inkubator bei 45ºC gestellt. Jeden Tag wurden sie während des Untersuchungszeitraums aus dem Inkubator entnommen, auf Raumtemperatur gekühlt, und 10 ul Aliquote wurden in 90 -1 PBS-Puffer (pH 7,2) verdünnt und auf Chemilumineszenz untersucht.
Keines der N-Sulfonylacridiniumcarboxamide zeigte irgendwelche signifikanten Veränderungen in der Chemilumineszenz-Abgabe, weder bei der Verdünnung in 0,05 N HCl oder in PBS-Puffer bei pH 7,2. Das Acridiniumcarboxylat 13514-020 zeigte jedoch eine signifikant unterschiedliche Chemilumineszenz-Abgabe bei der Verdünnung in 0,05 N HCl oder in PBS-Puffer bei pH 7,2. Bei der Verdünnung in PBS- Puffer (pH 7,2) erzeugte das Acridiniumcarboxylat durchweg mindestens 10 mal weniger Zählimpulse als bei der Verdünnung in 0,05 N HCl.
Das 10,N-bis-(3-Sulfopropyl)acridiniumcarboxamid (Verbindung 83, 30253-020) scheint bei pH 7,2 und 45ºC ziemlich stabil zu sein. Nach 10 Tagen unter diesen Bedingungen wurde kein merklicher Verlust an Chemilumineszenz beobachtet. Verbindung 13513-211 erzeugte 10 mal weniger Zählimpulse, und das Acridiniumcarboxylat 13514-020 erzeugte 103 mal weniger Zählimpulse unter den gleichen Bedingungen.

Beispiel 14

Präparation von markiertem IgG

Die Disulfopropylverbindung 83, 30253-020, wurde durch Behandlung mit Phosphoroxychlorid in Acetonitril bei 45ºC 12 Stunden lang unter Argon aktiviert. Das Lösungsmittel und überschüssiges POCL&sub3; wurden unter Vakuum entfernt und die aktivierte Verbindung wurde direkt in der Markierungsreaktion verwendet.
Dann wurden 10 mg Kaninchen-IgG (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (2 ml, pH 7,0) mit 1% Tween 80® gelöst. Ein ml dieser Lösung wurde mit etwa 2 mg des bis-Sulfonylchlorids gemischt. Die Lösung wurde periodisch durch Beschallung und durch Rühren eine Stunde lang bei Raumtemperatur durchmischt.
Ein Aliquot (0,5 ml) der Reaktionslösung wurde an Sephadex® G-25 (10 cm·0,75 cm), erhältlich von Pharmacia, Piscataway, New Jersey, chromatographiert und mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) eluiert.
Das markierte Protein eluierte als schwachgrüne Fluoreszenzbande. Das markierte Protein wurde weiter mittels HPLC unter Verwendung einer Bio-Sil® TSK-250-Trennsäule (BioRad, Richmond, California) gereinigt. Das resultierende Konjugat (30253-34) enthielt 0,8 Markierungen/Protein, wie aus dem Verhältnis der Absorption bei 370 nm ( = 10 000, Acridiniumsalz) zu der Absoprtion bei 280 nm ( = 210 000, IgG) bestimmt wurde.

Beispiel 15

Untersuchungen zur Hitzebeständigkeit

Das Konjugat 30253-34, wie in Beispiel 14 synthetisiert, wurde stufenweise 10-fach in drei Pufferlösungen (0,1 M Natriumphosphat, 0,01% Tween 20®, pH 6,3 0,01 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, 0,01% Tween 20®, pH 6,80 und 0,01 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, 0,01% Tween 20®, pH 7,2) auf eine Konzentration von 2·10&supmin;&sup9; M IgG und 1,6·10&supmin;&sup9; M Acridinium verdünnt. Eine Verdünnungsreihe wurde erstellt und die Anfangszählimpulse wurden durch Entnahme von 10 ul der Probe, Verdünnung mit 90 ul PBS-Puffer bei pH 6,3, pH 6,8 oder pH 7,2 und anschließender Auslösung der Chemilumineszenz mit 200 ul 0,03% H&sub2;O&sub2; in 0,25 N NaOH aufgezeichnet. Eine 100 ul-Probe des PBS-Puffers wurde bei jeder Reihe als Kontrollprobe verwendet.
Die Zählimpulse in Tabelle 7 sind Mittelwerte der Ergebnisse aus Untersuchungen an doppelten Proben am selben Tag, an dem die Verdünnungsreihe erstellt wurde. Die in Tabelle 7 gezeigte Konzentration ist die Konzentration der Probe vor der Verdünnung. Die Angabe in Klammern für jeden Eintrag in Tabelle 7 ist die Menge an vorhandenem Konjugat in der Probe. TABELLE 7 Konzentration (Menge) ZI/6 Sekunden Puffer (0 Mole)
Jede Verdünnungsreihe wurde in einem Warmluftinkubator bei 45ºC untergebracht, nachdem der Anfangswert bestimmt worden war. Eine zweifache Ablesung wurde täglich an jeder Probe vorgenommen und die abgelesenen Zahlenwerte wurden gemittelt.
Wenn das Konjugat bei pH 6,8 und 45ºC gelagert wurde, gab es über einen Beobachtungszeitraum von 15 Tagen bei keiner Verdünnung einen Verlust an Chemilumineszenz- Aktivität der Markierung. Es wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse beobachtet, wenn das Konjugat in PBS- Puffer mit pH 7,2 aufbewahrt wurde.

Beispiel 16

Vergleich zwischen CLIA und RIA

A. Herstellung von acridiniummarkiertem Anti-HBsAg-Konjugat

Verbindung 75 (13514-081, Beispiel 6) (12,5 umol) wurde in 200 ul DMF gelöst, mit NHS (gelöst in 50 ul DMF) und Dicyclohexylcarbodiimid ("DCC", gelöst in 50 ul DMF) behandelt, und 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung des aktivierten Esters wurde mit monoklonalem Mäuse-Anti-HBsAg in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,3) in einem Molverhältnis von 100 : 1 bei 4ºC 12 Stunden lang gemischt.
Das Konjugat wurde dann gegen PBS-Puffer, pH 6,3, dialysiert, bis die Absorption des Dialysats keine freie Markierung anzeigte. Eine UV-Spektralanalyse zeigte zwischen 2 und 6 Markierungen/Antikörper (wie aus dem Verhältnis der Absorptionen wie in Beispiel 14 bestimmt wurde).

B. Assay für HBsAg

HBsAg, entweder vom Typ Ad oder vom Typ Ay (200 ul) wurde in Kälberserum verdünnt und mit monoklonalen Antikörperperlen AuszymeTM (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) und 2·10&sup5; an Zählimpulsen von ¹²&sup5;I- markiertem monoklonalem Mäuse-Anti-HBsAg-Antikörper (40 ul, im RIA) oder einem acridiniummarkierten monoklonalen Mäuse- Anti-HBsAg-Antikörper (40 ul, im CLIA) in PBS mit 50% Kälberserum, 10% Humanserum, 0,05% Tween 20® und 5 mM EDTA (pH 6, 3) drei Stunden lang bei 40ºC umgesetzt. Die Perlen wurden anschließend 6 mal mit Wasser gewaschen und auf ihre Aktivität ausgezählt. Kälberserum wurde als Negativkontrollprobe verwendet.
Im CLIA wurden Polystyrolperlen mit daran adsorbiertem Konjugat mit 250 ul Phosphatlösung, 0,5 mM, pH 5,3, in einem geeigneten Glasgefäß gemischt, das für die Verwendung in einem Luminometer geeignet ist. Als die Probe in der Meßstellung war, wurden 0,2 ml 0,03% H&sub2;O&sub2; in 0,25 N NaOH in das Glasgefäß injiziert. Das emittierte Licht wurde im Luminometer gemessen. Die Ablesung wurde 0,012 Sekunden vor der Initiierung der chemischen Reaktion begonnen und 6 Sekunden fortgesetzt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt. TABELLE 8 Konzentration CLIA RIA Kälberserum Cut-off
Unter den gegebenen Bedingungen war die Empfindlichkeit für das CLIA kleiner als 0,125 ng/ml für die beiden HBsAg-Typen Ad und Ay. Für das RIA betrug die Empfindlichkeit 1,0 ng/ml für beide Typen. Der Cut-off- Zählimpuls war das 2,1-fache der Negativkontrollprobe.
Tabelle 8 zeigt deutlich, daß Chemilumineszenz- Immunoassays gemäß der vorliegenden Erfindung empfindlicher als vergleichbare Radioimmunoassays sind.

Beispiel 17

Vergleich zwischen CLIA und EIA

A. Herstellung von markiertem Anti-hTSH (30234-207)

Verbindung 75 (13514-081, Beispiel 6) (2 mg, 4,3 umol) in 200 ml Acetonitril wurde mit 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (Sigma, St. Louis, Missouri) (10 umol) in 100 ul Acetonitril und N- Hydroxysuccinimid (4-9 umol) in 100 ul Acetonitril 12 Stunden lang bei 25ºC im Dunkeln behandelt.
Der aktive Ester wurde mit Anti-hTSH in PBS-Puffer mit 0,5% 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1- propansulfonat ("CHAPS") bei pH 6,5 in einem Verhältnis von 50 : 1 (Antikörper:aktivem Ester) gemischt. Nach 3-stündigem Laufen der Kupplungsreaktion bei 25ºC wurde der markierte Antikörper gegen PBS-Puffer mit 0,5% CHAPS und pH 6,5 dialysiert, bis keine freie Markierung mehr im Dialysat vorhanden waren (nachgewiesen durch UV).
Auf der Grundlage der UV-Spektra wurden für das Konjugat im Mittel 10 Markierungen je Antikörper bestimmt.

B. Assay für hTSH

Das CLIA und das EIA wurden unter Verwendung des Abbott hTSH-EIA-Kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) verglichen, mit der Ausnahme, daß für das CLIA das Anti-hTSH-Acridiniumkonjugat anstelle des Anti-hTSH-HRPO- Konjugats im Kit verwendet wurde. Dann wurde eine Standardkurve durch Inkubation des Kitstandards mit den Kitkügelchen bei 37ºC für eine Stunde und anschließendem dreimaligem Waschen erzeugt. Für das CLIA wurde das oben hergestellte Konjugat 1 : 5000 mit PBS-Puffer, enthaltend 50% Kälberserum, 1% Normalmäuseserum, 0,05% Tween 20® und 20 mM EDTA bei pH 6,3, verdünnt. Einhundert Mikroliter dieser Lösung wurden mit den Perlen eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann viermal gewaschen.
Die Perlen wurden einzeln in das Reaktionsgefäß eines Luminometers mit 400 ul Wasser überführt und mit 200 ul 0,03% H&sub2;O&sub2; in 0,2 N NaOH umgesetzt. Die Photonenzählimpulse wurden 6 Sekunden lang aufgezeichnet.
Das EIA wurde nach den Anweisungen des Kits auf einem Quantum II® Spektrophotometer (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) ausgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgeführt. TABELLE 9 Konzentration CLIA EIA (Zählimpulse)
Unter diesen Bedingungen war die Empfindlichkeit des CLIA 0,016 uIE/ml (0 Standard + 2 SA), während das EIA eine Empfindlichkeit von 0,05 uIE/ml aufwies.

Beispiel 18

Darstellung von 5-Methyl-6-[N-tosyl-N-(2-carboxyethyl)phenanthridiniumcarboxamid

Phenanthridin-6-carbonsäure (400 mg, 1,8 mmol) [dargestellt nach dem Verfahren von Wittig et al., Justus Liebig's Ann., 577, 1 (1952)] wurde in Methylenchlorid (20 ml, über P&sub2;O&sub5; destilliert) suspendiert und unter Stickstoff auf 0ºC gekühlt. Oxalylchlorid (320 ul, 3,6 mmol) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) wurde zugefügt, gefolgt von DMF (5 ml). Als das Reaktionsgemisch eine Stunde lang bei 0ºC und 30 Minuten lang bei 25ºC gerührt wurde, löste sich die gesamte Carbonsäure. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft und ergab das Säurechlorid, das ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
Methyl-N-tosyl-β-alanin wurde aus Methyl-β-alanin (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin) und Tosylchlorid (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin) nach dem Verfahren nach Beispiel 1 hergestellt. Kalium-t-butoxid (600 mg, 5,4 mmol, frisch sublimiert) wurde zu einer Lösung von 1,3 g (5,4 mmol) Methyl-N-tosyl-β-alanin in 50 ml THF zugefügt. Nach 15 Minuten langem Rühren bei Raumtemperatur unter N&sub2; wurde die Suspension bis zur Trockne eingedampft. Das Kaliumsalz des Methyl-N-tosyl-β-alanins wurde in 20 ml THF resuspendiert, mit dem Säurechlorid (in 20 ml THF) gemischt und 12 Stunden lang gerührt.
Die resultierende Suspension wurde in 100 ml Ethylacetat gegossen, mit 50 ml Wasser gewaschen und zweimal mit 25 ml Salzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über MgSO&sub4; und Eindampfen bis zur Trockne wurde der Rückstand an einem ChromatatronTM Chromatograph (erhältlich bei Harrison Research, Palo Alto, California) unter Verwendung eines 4 mm Slicarotors und Verwendung eines 25/75 Ethylacetat/Hexan- Gradienten chromatographiert. Das Produkt (Rf 0,2) wurde gesammelt, dann aus Benzol/Hexan umkristallisiert (d. h. das Produkt wurde in Benzol gelöst und Hexan wurde bis zur Eintrübung zugefügt) und ergab 130 mg Methyl-6-[N-tosyl-N- (2-carboxyethyl)]-phenanthridincarboxamid, Verbindung 84, 13514-225.
Verbindung 84, 13514-225, wurde entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 3 methyliert und ergab Methyl-5- methyl-6-[N-tosyl-N-(2-carboxyethyl)]-phenanthridiniumcarboxamid, Verbindung 85, 13514-227. Verbindung 85 wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 8 hydrolisiert und ergab 5- Methyl-6-[N-tosyl-N-(2-carboxyethyl)]-phenanthridiniumcarboxamid, Verbindung 86, 13514-228.
Die Verbindungen 84, 85 und 86 sind unten entsprechend der Numerierungen, Symbole und Abkürzungen beschrieben, die in Beispiel 1 erklärt sind.
84. 13514-225 6-[N-Tosyl-N-(2- carboxyethyl)]phenanthridincarboxylatmethylester MS M + H @ 463
85. 13514-227 5-Methyl-6-[N-tosyl-N-(2- carboxyethyl)]phenanthridiniumcarboxamidmethylester MS M&spplus; @ 477 Mp 136ºC
86. 13514-228 5-Methyl-6-[N-tosyl-N-(2- carboxyethyl)]phenanthridiniumcarboxamid MS M&spplus; @ 463
Obwohl die vorliegende Erfindung anhand von bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich von selbst, daß Abwandlungen und Verbesserungen Fachleuten möglich erscheinen.

Claims

1. Eine chemilumineszente Verbindung, die aus Verbindungen entsprechend den folgenden Formeln gewählt ist

wobei R, R' und R'' unabhängig voneinander ein Glied aus der Gruppe bestehend aus Alkylen-, Arylen-, substituierten Alkylen- und substituierten Arylengruppen enthalten derart, daß:

einer oder mehrere Wasserstoffe des Glieds durch eine Alkyl-, Aryl-, substituierte Alkyl-, substituierte Aryl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-, geschützte Amino-, substituierte Amino-, Hydroxy-, geschützte Hydroxy-, Oxo-, Thio-, Imino-, Mercapto- oder substituierte Mercaptogruppe ersetzt sind;

oder derart, daß ein oder mehrere Kohlenstoffatome des Glieds durch ein Heteroatom ersetzt ist;

wobei X¹, X² und X³ unabhängig voneinander Glieder der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Carboxy-, Carboalkoxyl-, Carboxamido-, Carboaryloxy-, Cyano-, Carboximido- Isocyanat-, Isothiocyanat-, Sulfo-, Sulfonylhalogenid-, Carbonylhalogenid-, N-Succinimidylcarboxy- und der N- Maleinimidgruppe sind; oder

wobei einer der Reste R¹-X² oder R-X³ entweder ein Nitrobenzol ist, vorausgesetzt, daß der andere aus Phenyl, Iso-Propyl, n-Butyl oder Benzyl-5-carboxypentyl gewählt ist, oder aber einer ist ein Dinitrobenzol, vorausgesetzt, daß der andere Rest aus n-Butyl oder Phenyl gewählt ist; und

wobei Y ein geeignetes Gegenion ist;

vorausgesetzt, daß R-X³, R¹-X² und R''-X¹ ebenfalls unabhängig voneinander Wasserstoff sein können, und unter den weiteren Vorbehalt, daß, wenn in den Verbindungen nach Formel I entweder in R'-X² oder R-X³, X² oder X³ aus einer Carbopentachlorphenoxy-, Carbo-p- nitrophenoxy-, Carboximido, Isothiocyanat-, N-Maleinnimid- und N-Succinimidylcarboxygruppe gewählt ist, und der andere Rest aus R¹-X² und R-X³ aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Benzyl, oder solchem Aryl oder Benzyl, das durch Alkoxy, Aryloxy, Amino oder Hydroxy substituiert ist, gewählt ist;

dann X¹ kein Wasserstoff und R''-X¹ kein Wasserstoff ist;

und außerdem aus 10-Methyl-N-allyl-N-p-toluolsulfonyl- 9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat.

2. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y&supmin; ein Gegenion, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfat, Alkylsulfat, Halogensulfat, Halogenborat, Halogenacetat, Halogenphosphat, Phosphat, Halogenid und Trifluormethansulfonat ist.

3. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Heteroatom aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Sauerstoff gewählt ist.

4. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei R, R' und R'' unabhängig voneinander die Formel

-(CH&sub2;C)nhaben, mit n = 0-50.

5. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei R'' gleich -CH&sub2;- ist, X¹ gleich -H ist, und R'-X² durch die folgende Formel beschrieben wird:

6. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 5, wobei die Verbindung 10-Methyl-N-[2-carboxyethyl]-N-tosyl-9- acridiniumcarboxamid ist.

7. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 5, wobei die Verbindung 10-Methyl-N-[4-carboxybutyl]-N-tosyl-9- acridiniumcarboxamid ist.

8. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 5, wobei die Verbindung 10-Methyl-N-[5-carboxypentyl]-N-tosyl- 9-acridiniumcarboxamid ist.

9. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei R'' gleich -(CH&sub2;)&sub3;- ist, X¹ gleich -SO&sub3;- ist, und R'-X² durch die folgende Formel beschrieben wird:

10. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung 10-(3-Sulfopropyl)-N-(2-carboxyethyl)- N-tosyl-9-acridiniumcarboxamid ist.

11. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung 10-(3-Sulfopropyl)-N-(3-sulfopropyl)-N- tosyl-9-acridiniumcarboxamid ist.

12. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹-X² durch die folgende Formel beschrieben wird:

und wobei R-X³ durch die folgende Formel beschrieben wird

13. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus 10-Methyl-N-phenyl-N-tosyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N- phenyl-N-(p-bronbenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N-phenyl-N-(pnitrobenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N-phenyl-N-(onitrobenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat oder 10-Methyl-N-phenyl-N- trifluormethansulfonyl-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat gewählt ist.

14. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 10-Methyl-N-isopropyl-N-tosyl-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N- isopropyl-N-(p-brombenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N-isopropyl-N-(onitrobenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat oder 10-Methyl-N-isopropyl-N- trifluormethansulfonyl-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat ist.

15. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 10-Methyl-N-butyl-N-(2,4,6- trimethylbenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N-butyl-N-(2,4,6-triisopropylbenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N-butyl-N-tosyl-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N-butyl-N-(p-bronbenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10- Methyl-N-butyl-N(o-nitrophenylsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluorinethansulfonat, 10-Methyl-N-butyl-N(pnitrobenzolsulfonyl)-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, 10-Methyl-N-butyl-(2,4-dinitrobenzolsulfonyl)-9- acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat oder 10-Methyl-N- allyl-N-tosyl-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat ist.

16. Die chemilumineszente Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 6-[N-Tosyl-N-(2-carboxyethyl)]phenanthridincarboxamid, Methylester, 5-Methyl-6-[-N-tosyl- N-(2-carboxyethyl)]-phenanthridiniumcarboxamid, Methylester oder 5-Methyl-6-[N-tosyl-N-(2-carboxyethyl)]phenanthridiniumcarboxamid ist.

17. Verfahren zur Darstellung einer chemilumineszenten Verbindung, das folgende Schritten umfaßt:

Zusammenbringen eines Amins mit der Formel

X³-R-NH&sub2;

mit einem Sulfonylhalogenid mit der Formel

W-SO&sub2;-R'-X²

in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart einer Base unter Bildung eines Sulfonamids mit der Formel

X³RNHSO&sub2;R'X²; und

Eintragen des Sulfonamids in ein inertes Lösungsmittel in Gegenwart einer Base unter Bildung eines Sulfonamidanions mit der Formel

X³-R-N&supmin;-SO&sub2;-R'-X² M&spplus;; und

a) Acylierung mit einer aktivierten 9-Acridincarbonsäure mit der Formel

zur Darstellung der chemilumineszenten Verbindung mit der Formel

wie in Anspruch 1 definiert,

oder von

10-Methyl-N-allyl-N-p-toluolsulfonyl-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat; oder

b) Acylierung mit einer aktivierten Phenanthridin-6-carbonsäure mit der Formel

zur Darstellung der chemilumineszenten Verbindung mit der Formel

wie in Anspruch 1 definiert;

wobei W aus der Gruppe bestehend aus Chlor- und Fluorgruppen gewählt ist; und

wobei M aus der Gruppe bestehend aus Li, Na und K gewählt ist; und

wobei Z aus der Gruppe bestehend aus Halogen-, Imidazol-, N-Hydroxysuccinimidyl- und Azidgruppen gewählt ist.

18. Verfahren zur Darstellung einer chemilumineszenten Verbindung, bestehend aus den Schritten:

Zusammenbringen eines Amins mit der Formel

X³-R-NH&sub2;

mit einem Sulfonylhalogenid mit der Formel

W-SO&sub2;-R'-X²

X³RNHSO&sub2;R'X²; und

X³-R-N&supmin;-SO&sub2;-R'-X² M&spplus;; und

a) Acylierung mit einer aktivierten 9-Acridincarbonsäure mit der Formel

zur Darstellung einer Verbindung mit der Formel

und Zusammenbringen dieser Verbindung mit einem alkylierenden Agens mit der Formel

Y-R''-X¹

zur Darstellung einer chemilumineszenten Verbindung mit der Formel

wie in Anspruch 1 definiert,

oder von 10-Methyl-N-allyl-N-p-toluolsulfonyl-9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat, oder

b) Acylierung mit einer aktivierten Phenanthridin-6-carbonsäure mit der Formel

zur Darstellung einer Verbindung mit der Formel

Y-R''-X¹

zur Darstellung der chemilumineszenten Verbindung mit der Formel

wie in Anspruch 1 definiert;

wobei W aus der Gruppe bestehend aus Chlor- und Fluorgruppen gewählt ist; und

wobei M aus der Gruppe bestehend aus Li, Na und K gewählt ist; und

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Heteroatom aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Sauerstoff gewählt ist.

20. Ein Konjugat, das von einem an eine chemilumineszente Verbindung entsprechend Anspruch 1 konjugiertem Antikörper oder Antigen gebildet wird, unter der weiteren Voraussetzung, daß, wenn in der chemilumineszenten Verbindung nach Formel I entweder X² oder X³ in R'-X² oder R'-X³ eine Carboxy-, Carboalkoxy-, Carboxamid- oder Carboaryloxygruppe ist, und wenn der jeweils andere Rest aus R'-X² und R-X³ aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Benzyl oder einem solchen Aryl oder Benzyl gewählt ist, das durch eine Alkoxy-, Aryloxy-, Amino- oder Hydroxygruppe substituiert ist, X¹ und R''-X¹ nicht Wasserstoff sind.

21. Verfahren zur Durchführung eines Chemilumineszenz- Immunoassays zum Nachweis auf Anwesenheit eines Antigens oder Antikörpers gegen ein Antigen nach Anspruch 20, umfassend den Schritt des Aussetzens einer Probe gegenüber einem Konjugat nach Anspruch 20.

22. Ein Konjugat, das aus einer an eine chemilumineszente Verbindung konjugierte Nucleinsäuresonde gebildet ist, wobei die chemilumineszente Verbindung aus Verbindungen entsprechend den folgenden Formeln gewählt ist:

wobei R, R' und R'' unabhängig voneinander ein Glied, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkylen-, Arylen-, substituierten Alkylen- und substituierten Arylengruppen enthalten, derart daß ein oder mehrere Wasserstoffe dieses Glieds durch eine Alkyl-, Aryl-, substituierte Alkyl-, substituierte Aryl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-, geschützte Amino-, substituierte Amino-, Hydroxy-, geschützte Hydroxy-, Oxo-, Thio-, Imino-, Mercapto- oder substituierte Mercaptogruppen ersetzt sind, oder daß ein oder mehrere Kohlenstoffatome des Glieds durch ein Heteroatom ersetzt sind;

wobei X¹, X² und X³ unabhängig voneinander Glieder der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Carboxy-, Carboalkoxyl-, Carboxamido-, Carboaryloxy-, Cyano-, Carboximido-, Isocyanat-, Isothiocyanat-, Sulfo-, Sulfonylhaiogenid-, Carbonylhalogenid-, N-Succinimidyloxycarbonyl- und der N- Maleinimidgruppe sind; oder

wobei einer der Reste R'-X² oder R-X³ entweder ein Nitrobenzol ist, vorausgesetzt, daß der andere Rest aus Phenyl, Iso-Propyl, n-Butyl oder Benzyl-5-carboxypentyl gewählt ist, oder aber einer ist ein Dinitrobenzol ist, vorausgesetzt, daß der andere Rest aus n-Butyl oder Phenyl gewählt ist; und

wobei Y ein geeignetes Gegenion ist;

vorausgesetzt, daß R-X³, R'-X² und R''-X¹ außerdem unabhängig voneinander Wasserstoff sein können; und außerdem aus 10-Methyl-N-allyl-N-p-toluolsulfonyl- 9-acridiniumcarboxamidtrifluormethansulfonat

23. Verfahren zur Durchführung eines Chemilumineszensassays zum Nachweis des Vorhandenseins einer Nucleinsäure nach Anspruch 22, welches den Schritt des Aussetzens einer Probe gegenüber einem Konjugat nach Anspruch 22 umfaßt.