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DE3588210T2 - Biologisch nützliche Konjugate - Google Patents

Biologisch nützliche Konjugate

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DE3588210T2
DE3588210T2 DE3588210T DE3588210T DE3588210T2 DE 3588210 T2 DE3588210 T2 DE 3588210T2 DE 3588210 T DE3588210 T DE 3588210T DE 3588210 T DE3588210 T DE 3588210T DE 3588210 T2 DE3588210 T2 DE 3588210T2
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Germany
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conjugate
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cea
antibody
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DE3588210T
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Richard T. Dean
Robert A. Nicolotti
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Mallinckrodt Inc
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Description

  • Die Erfindung betrifft biologisch verwendbare Moleküle, die mit Metallionen markiert sind und ein Kupplungsmittel umfassen. Die Ionen können entweder Radiomarkierungen oder paramagnetische Ionen sein. Radiomarkierte, biologisch verwendbare Moleküle, welche die Kupplungsmittel enthalten, sind bei therapeutischen und diagnostischen Applikationen in vivo einsetzbar. Paramagnetisch markierte, biologisch verwendbare Moleküle, welche die Kupplungsmittel enthalten, sind bei diagnostischen Applikationen in vivo einsetzbar.
  • Seit einiger Zeit sind paramagnetische Metalle, z. B. Gd (III), Mg (II), Fe (III) und Cr (II) bekannt, die die Relaxationseigenschaften der kernmagnetischen Resonanz für die Bildverstärkung beeinflussen können.
  • Die Wirksamkeit paramagnetischer Metallionen bei diagnostischen Anwendungen in vivo hängt von dem Vermögen ab, das Metall an den Zielort zu bringen und durch das Metall die Wasserrelaxation in jenem Bereich bei einem NMR-Abbildungsversuch zu beeinflussen.
  • Die Verwendung von Radionukid-Metallionen bei therapeutischen und diagnostischen Applikationen in vivo ist für einige Zeit praktiziert worden. Beispielsweise sind Gamma-emittierende Radionuklid-Metallionen, wie Indium-111, Gallium-67 und Technetium-99 m, bei der diagnostischen Szintigraphie für die Tumorbestimmung verwendet worden. Beta-emittierende Isotope, wie Rhenium- 186, Rhenium-188, Rhenium-189, Samarium-153, Yttrium-90 und Kupfer-67, können therapeutisch bei der Behandlung von Tumoren eingesetzt werden.
  • Die Wirksamkeit von Radionukliden bei diagnostischen und therapeutischen Applicationen in vivo hängt von der Fähigkeit ab, das Radionuklid an die Stelle der Zielzellen zu bringen. Ein Verfahren, um das Radionuklid an die Stelle der Zielzellen zu bringen, umfaßt die Kupplung der Radionuklid-Metallionen an biologisch verwendbare Moleküle, wie Antikörper, welche selektiv einzigartige Liganden, welche mit den Zielzellen assoziiert sind, erkennen und binden. Beispielsweise können Antigene, von denen man weiß, daß sie durch maligne Tumorzellen erzeugt oder damit assoziiert sind, durch das Antikörperkonjugierte Radionuklid zum Zwecke der diagnostischen Abbildung oder zum Zwecke der Bestrahlung des Tumors, um ihn zu zerstören, gebunden werden.
  • Goldenberg et al. (N. Eng. J. Med., 298 : 1384-1388 [1978]) beschreiben Experimente, bei denen Antikörper zu karzinoembryonalem Antigen (CEA), das ein bekanntes Tumorassoziiertes Antigen ist (Gold et al.. J. Exp. Med., 121 : 439-462 [1965]), mit Iod-131 markiert und in Patienten mit Krebsanamnese injiziert worden sind. Nach 48 Stunden wurden die Patienten mit einer Gamma-Szintillationskamera abgetastet und Tumore durch das Gamma-Emissionsmuster lokalisiert. Ähnlich hierzu beschreibt die britische Patentanmeldung GB 2,109,407 die Verwendung von monoklonalen Antikörpern zu Tumorassoziierten Antigenen, markiert mit metallischen Radionukliden, für die Tumorbestimmung und Lokalisierung in vivo.
  • Es wurde vorgeschlagen, daß radiomarkierte Antikörperfragmente, anstelle von radiomarkierten ganzen Antikörpern für diagnostische und therapeutische Applikationen in vivo verwendet werden, da die Fragmente besser fähig sein könnten, zu der erwünschten Zielstelle zu penetrieren, und da die Antikörperfragmente Probleme der Immunogenizität und Kreuzreaktivität, welche mit ganzen Antikörpern assoziiert ist, minimalisieren könnten (siehe beispielsweise U. S. -Patent Nr. 4,036,945; Lancet, Band II, Nr. 8087, 462 [1978]; Belitsky et al., J. Nukl. Med. 19 : 429 [1978]). Antikörper-Fragmente können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden. Das Antikörpermolekül kann enzymatisch behandelt werden, um die endständigen Carboxylteile der schweren Ketten (das Fc-Fragment) zu entfernen, wobei ein zweiwertiges F(ab')2-Fragment bleibt, das heißt 2 Fab'-Segmente, die durch eine oder mehrere, die schweren Ketten verbindende DisulBdbindungen, verbunden sind. Das F(ab')2-Fragment kann dann an den die zwei schweren Ketten verbindenden Disulfidbindung(en) selektiv reduziert werden, was zur Bildung von zwei einwertigen Fab'-Fragmenten führt, die jeweils eine einzige Antigen-bindende Stelle haben.
  • Abstract Nr. 22618b in Chem. Abstr., Band 88 (1978) beschreibt die Herstellung von zwei Maleimidverbindungen durch Kondensation von H&sub2;NCH&sub2;XCO&sub2;H(X ist 1,4-Phenyl oder 1,4-Cyclohexylen) mit Maleinsäureanhydrid mit daran anschließender Dehydratations-Cyclisierung des Kondensationsprodukts.
  • Biologisch verwendbare Moleküle können eine Anzahl reaktionsfähiger Seitenketten enthalten, die als Kupplungsstellen für die Anbindung eines Radionuklid- Metallions an das Molekül dienen können. Beispielsweise kann das Radionuklid an das Molekül durch ein Linkermolekül konjugiert werden, das mit den Carbo xylgruppen von Asparaginsäure- oder Glutaminsäureresten, den Aminogruppen von Lysinresten oder den aromatischen Gruppen des Tyrosins oder Histidins reaktionsfähig ist. Unglücklicherweise sind diese Reste statistisch über das biologisch verwendbare Molekül verteilt. Infolgedessen kann die Ankopplung eines Radionuklids durch diese reaktionsfähigen Gruppen an irgendeiner von einer Reihe von Stellen längs des biologisch verwendbaren Moleküls erfolgen. Es besteht ein Bedarf an einem Verfahren zur Ankopplung eines Radionuklid- oder paramagnetischen Metallions an ein biologisch verwendbares Molekül, welches nicht an diesen Nachteilen leidet.
  • Die vorliegende Erfindung sieht daher ein biologisch nützliches Konjugat vor, erhalten durch Verbinden eines paramagnetsichen oder Radionuklid-Metallions mit einem von einem Fab'-Fragment eines Antikörpers verschiedenen, biologisch nützlichen Molekül mit einer freien Sulfhydrylgruppe mittels eines Kupplungsmittels, umfassend eine Verbindung der Formel:
  • worin R ein zweiwertiger organischer Rest ist und R' eine Gruppe ist, die fähig ist, ein paramagnetisches oder Radionuklid-Metallion zu chelatisieren.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • Die einzige Figur stellt zu Vergleichszwecken eine Reihe von Bindungskurven dar, bei denen die Bindung eines Anti-CEA Fab' /Kupplungsmittel-Konjugats an Zellextrakte des menschlichen Kolon-Adenocarcinoms verglichen wird mit der von intaktem monoklonalem Anti-CEA IgG und F(ab')&sub2;-Fragment. Die Erfindung strebt danach, Konjugate von bifunktionellen Kupplungsmitteln und von einem Fab'-Fragment eines Antikörpers verschiedenen, biologisch verwendbaren Molekülen vorzusehen, welche mit paramagnetischen oder Radionuklid-Metallionen verbunden sind, um Materialien zur Verfügung zu stellen, welche für diagnostische und therapeutische Applikationen in vivo geeignet sind. Die biologisch ver wendbaren Konjugate werden hergestellt durch Umsetzen eines bifunktionellen Kupplungsmittels mit der freien Sulfhydrylgruppe eines biologisch verwendbaren Moleküls. Das bifunktionelle Kupplungsmittel enthält eine Maleimidgruppe, welche spezifisch bei pH 6-8 mit der freien Sulfhydrylgruppe des biologisch verwendbaren Moleküls oder mit Aminen mit pKa's ≤ 8 und einer Gruppe, welche fähig ist, mit dem paramagnetischen oder Radionuklid-Metallion einen Chelatkomplex zu bilden, reagiert.
  • Die biologisch verwendbaren Konjugate, welche das Kupplungsmittel beinhalten, können durch die allgemeine Formel wiedergegeben werden:
  • worin Ab-S der Rest des biologisch verwendbaren Moleküls ist; R ein zweiwertiger organischer Linker ist; und R' eine Gruppe ist, welche fähig ist, ein paramagnetisches Ion oder Radionuklid-Metallion zu chelatisieren.
  • Das biologisch verwendbare Konjugat der Formel I wird mit einem paramagnetischen Ion oder Radionuklid über die chelatisierende Gruppe komplexiert, um ein biologisch verwendbares Molekül-Radionuklid-Konjugat zu bilden, welches therapeutisch, beispielsweise bei der Behandlung von malignen Tumoren, oder als diagnostisches Abbildungsmittel in vivo eingesetzt werden kann.
  • Die biologisch verwendbaren Konjugate der Formel I werden hergestellt durch Umsetzen des bifunktionellen Kupplungsmittels mit einem biologisch verwendbaren Molekül, das mindestens eine Sulfhydrylgruppe aufweist. Die Sulfhydrylgruppe dient als reaktive Stelle, an welcher das biologisch verwendbare Molekül an das Kupplungsmittel gebunden wird, um das biologisch verwendbare Konjugat zu erzeugen.
  • Das biologisch verwendbare Konjugat der Formel I wird hergestellt durch Umsetzung des biologisch verwendbaren Moleküls mit einem Kupplungsmittel, das durch die Formel
  • dargestellt wird.
  • In der Formel II ist R ein zweiwertiger organischer Rest, der zur Verbindung der Maleinimidgruppe mit der R'-Gruppe dient. Es kann jeder zweiwertige organische Rest eingesetzt werden, der nicht mit den Seitenketten an dem biologisch verwendbaren Molekül reagiert. R ist vorzugsweise -(CH&sub2;)n-, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, oder Phenylen. R ist beispielhaft -(CH&sub2;)n-, worin n die Zahl 5 oder 7 ist.
  • R' ist eine Gruppe, die zur Chelatierung des paramagnetischen oder Radionuklid- Metallions befähigt ist. Bei der Auswahl einer geeigneten chelatbildenden Gruppe ist eine Anzahl von Kriterien zu berücksichtigen. Die chelatbildende Gruppe sollte eine genügend hohe Stabilitätskonstante haben, um den Austausch des paramagnetischen Ions oder Radionuklids mit zirkulierendem Transferrin zu minimieren. Der Chelatkomplex sollte unter physiologischen Bedingungen thermodynamisch beständig sein. Er sollte sich von einem Chelatbildner ableiten, der für den Wirt ungiftig ist. Außerdem sollte die chelatbildende Gruppe schwach sauer sein, so daß das Molekül infolge Bioträgerabbau extrazellulär abgesondert und dann in dem Urin ausgeschieden wird.
  • Es folgen beispielhafte Kupplungsmittel, die dazu dienen können, das Radionuklid-Metallion an das biologisch verwendbare Molekül anzufügen:
  • Verbindungen der Formel IIa und analoge Verbindungen können nach dem folgenden Reaktionsschema hergestellt werden:
  • Verbindungen der Formel IIb und analoge Verbindungen können nach dem folgenden Reaktionsschema hergestellt werden:
  • Das Kupplungsmittel der Formel II wird mit dem biologischen verwendbaren Molekül unter Bildung des biologisch verwendbare Konjugats der Formel I umgesetzt. Die Umsetzung kann wie folgt dargestellt werden:
  • worin Ab-SH den Rest des biologisch verwendbaren Moleküls und freie Sulfhydrylgruppe darstellt und R und R' die oben definierten Bedeutungen haben. Die Reaktion erfolgt in einer geeigneten Pufferlösung, wie z. B. 20 mM Phosphat, pH 7,0. Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch und liegt vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur. Bei Raumtemperatur geht die Reaktion in etwa 1 Stunde zuende. Das Produkt kann durch herkömmliche chromatographische Mittel isoliert werden, etwa durch Chromatographie an einer DEAE-Säule.
  • Das biologisch verwendbare Konjugat der Formel I wird unter Chelatbildungsbedingungen mit einem paramagnetischen oder Radionuklid-Metallion komplexiert. Es können alle paramagnetischen oder Radionuklid-Metallionen eingesetzt werden, die bei therapeutischen oder diagnostischen Verfahren in vivo brauchbar sind und die für die Bindung an das biologisch verwendbare Molekül erwünscht sind. Als solche paramagnetischen Ionen kann man nur beispielhaft.. nennen Gadolinium (III), Eisen (III), Mangan (II) und Chrom (II), und als Radionuklid-Metallionen Gamma-emittierende Radionuklide, welche in der diagnostischen Szintigraphie geeignet sind, wie etwa Indium-111, Gallium-67 und Technetium-99 m, und Beta-emittierende Nuklide, welche bei therapeutischen Applikationen nützlich sind, wie etwa Yttrium-90 und Kupfer-67, Rhenium-186, Rhenium-188, Rhenium-189 und Samarium-153. Weitere brauchbare Klassen von Radionukliden umfassen die alpha-emittierenden, Positron-emittierenden und Auger-Elektron-emittierenden Radionuklide. Der Komplex kann durch Umsetzung des Konjugats der Formel I mit dem Radionuklid in einer gepufferten Lösung gebildet werden, in der das Konjugat physiologisch beständig ist. Das paramagnetische Ion oder Radionuklid kann nötigenfalls der Lösung als Komplex mit einem Chelatbildner-Zwischenprodukt zugeführt werden, d. h. mit einem Chelatbildner, der einen Chelatkomplex bildet, der das Metallion oder Radionu klid bei dem physiologischen pH-Wert des biologisch verwendbaren Konjugats löslich macht, aber weniger thermodynamisch beständig als der Chelatkomplex ist, der mit biologisch verwendbaren Konjugat der Formel I gebildet wird. Beispielsweise ist Indium-111 als Chloridsalz unlöslich in einer Lösung eines biologisch verwendbaren Moleküls bei physiologischem pH. Es ist bevorzugt, das Indium-111 der Chelatierungsreaktion in Form eines Zwischenproduktkomplexes mit 4,5-Dihydroxy-1,3-benzoldisulfonsäure (Tiron) vorzusehen, welcher das Indium-111 bei physiologischem pH löslich macht, jedoch das Indium-111 leicht überträgt, um mit dem biologisch verwendbaren Konjugat einen stabilen Chelatkomplex zu bilden. Die Kupplung des paramagnetischen Ions oder Radionuklids an das biologisch verwendbare Konjugat der Formel I erzeugt ein Konjugat biologisch verwendbares Molekül-Radionuklid der Formel
  • worin Ab und R die oben beschriebenen Bedeutungen haben und R" einen Chelatkomplex zwischen dem paramagnetischen oder Radionuklid-Metallion und der oben beschriebenen Gruppe R darstellt.
  • Das biologisch verwendbare Molekül-Metallion-Konjugat der Formel III kann in einem physiologisch zulässigen Puffer für die therapeutische oder in vivo diagnostische Verwendung formuliert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein biologisch verwendbares Molekül an ein Kupplungsmittel der Formel II konjugiert, in der R -(CH&sub2;)- ist und R' die Gruppe -N[CH&sub2;CH&sub2;N(CH&sub2;OO&sub2;H)&sub2;]&sub2; ist. Das biologisch verwendbare Konjugat wird mit einem Gamma-emittierenden Radionuklid, wie etwa Indium-111 chelatiniert und als ein in vivo Tumorabbildungsmittel unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Fotoabtast-Verfahren eingesetzt. Das biologisch verwendbare Molekül-Radionuklid-Konjugat wird intravenös verabreicht und das Subjekt nachfolgend einem Fotoscanning unterzogen, um die Aufnahmestelle des Radionuklid-Konjugats in vivo zu bestimmen.
  • Die folgenden Beispiele sollen die praktische Durchführung der Erfindung weiter erläutern. Die Beispiele II bis VI sind Vergleichsbeispiele, bei denen das biologisch verwendbare Molekül ein Fab'-Fragment eines Antikörpers ist. In den Beispielen haben die folgenden Bezeichnungen und Abkürzungen die unten angegebenen Bedeutungen.
  • Kupplungsmittel [((7-Maleinimidoheptyl)imino) bis(ethylennitrilo)]tetraessigsäure
  • Mab Monoklonaler Antikörper
  • SDS Natriumdodecylsulfat
  • EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
  • 3H-NEM N-[Ethyl-2-³H]-maleinimid
  • MES 2-N-Morpholinethansulfonsäure
  • Tiron 4,5 -Dihydroxy-1,3 -benzoldisulfonsäure
  • IgGSORB Staphylococcus aureus, Stamm. Cowan I Formalin-fixiert, durch Wärme abgetötet.
    • Iodierung von Antigen
  • CEA wurde durch die Iodogenmethode radiomarkiert, wobei 50 ug Antigen zu einem mit 2 u,g Iodogen beschichteten Microfuge-Röhrchen gegeben wurden. Ein Mci von Na¹²&sup5;I wurde hinzugefügt und bei 4ºC während 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden 20 ul von 10 mg/ml Histidin hinzugefügt, um mit freiem Iod zu reagieren. Iodhisitidin wurde durch Gelfütration auf einer Sephadex G-25M-Säule (Pharmacia, Piscataway, N. J.) entfernt.
    • Herstellung von Zellextrakten des menschlichen Kolon-Adenocarcinoms
  • Zellextrakte wurden hergestellt aus Kolon-Adenocarcinom. Gewebe wurde zerstückelt und 3 Minuten bei 4ºC in 10 mM tris-HCl (pH 7,2), 0,2 mM CaCl&sub2; (1 gm / 10 ml) homogenisiert und dann 10 Minuten bei 1000 · g zentrifugiert. Die Tablette wurde in Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung erneut suspendiert pnd bei 4ºC 1 Minute mit Intervallen von 15 Sekunden beschallt. Das beschallte Material wurde 15 Minuten mit 10 000 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde für Festphase-Radioimmunountersuchungen benutzt (Beispiel V).
    • Beispiel I Herstellung von [((7-Mäleinimidoheptyl)imino)bis- (ethylennitrilo)]tetraessigsäure (a) Herstellung von (6-Cyanohexyl)bis(2-phthalimidoethyl)amin.
  • Ein Gemisch aus 6-Bromhexylcyanid (13,88 g, 0,073 Mol), Bis(2-phthalimidoethyl)amin (26,52 g), 0,073 Mol) und Triethylamin (7,37 g, 0,073 Mol) in DMF (120 ml) wurde 20 Stunden auf 100ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde der gebildete Niederschlag durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde in Eis (1000 ml) eingegossen.
  • Die wässrige Lösung wurde mit Dichlormethan (3 · 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab ein Rohprodukt, das an Kieselgel chromatographiert wurde (Hexane 30% Ethylacetat/Hexane Gradienteneluierung). Die unreinen Fraktionen wurden erneut chromatographiert, um insgesamt 14,1 g (6-Cyanohexyl)bis(2- phthalimidoethyl)amin(41%) als Öl zu ergeben. Das Produkt ergab einen Fleck auf Tlc. Das IR-Spektrum war in Übereinstimmung mit der zugeschriebenen Struktur.
    • (b) Herstellung von (6-Cyanohexyl)bis(2-aminoethyl)amin.
  • Eine Lösung von (6-Cyanohexyl)bis(2phthalimidoethyl)amin (13,8 g, 0,029 Mol) und Hydrazin (2,15 g, 0,067 Mol) in Methanol (150 ml) wurde 1,5 Stunden unter Rückfluß gehalten und über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand in Wasser (200 ml) aufgenommen und mit MCI auf einen pH-Wert von 2 gebracht. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde mit festem NaOH basisch gemacht. Die Lösung wurde dann unter Vakuum konzentriert und mit Dichlormethan (4 · 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft. Die Kugelrohrdestillation des Rückstands ergab reines (6-Cyanohexyl)bis(2-aminoethyl)amin als eine wasserweiße Flüssigkeit (4,1 g - 67%), die bei 0,07 mm Hg (9,33 Pa) zwischen 120 und 140ºC (Blasentemperatur) aufgefangen wurde. Das IR-Spektrum war in Übereinstimmung mit der zugeschriebenen Struktur, ebenso die Elementaranalyse.
    • (c) Herstellung von [((6-Cyanohexyl)imino)bis(ethylennitrilo)[tetraessigsäure
  • Eine Lösung von Chloressigsäure (7,0 g, 0,0074 Mol) in Wasser (20 ml) wurde durch Zusatz der erforderlichen Menge einer Lösung von Natriumhydroxid (5,92 g, 0, 148 Mol) in Wasser (30 ml) neutralisiert. (6-Cyanohexyl)bis(2-amino ethyl)amin (3,72 g, 0,0175 Mol) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde sieben Stunden auf 45ºC erwärmt. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert der Lösung durch Zusatz der übrigen NaOH-Lösung zwischen 10 und 11 gehalten. Nach zweitägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit konzentrierter HCl auf pH 7 gebracht, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in heißem Methanol (300 ml) aufgenommen und filtriert. Die Entfernung des Methanols unter Vakuum ergab [((6- Cyanohexyl)imino)bis(ethylennitrilo))tetraessigsäure. Dieses Material wurde in Chargen von 2 g an einer 2 · 30 cm Säule aus Ionenaustauscherharz BioRad AG 7 · 8 in der Formiatform (Gradienteneluierung, 0-1M Ameisensäure) chromatographiert, wobei sich insgesamt 4,3 g (55%) der Tetrasäure ergaben. Das Produkt war ein Fleck auf Tlc (Ethanol, 7% wässr. NH&sub3;, 4 : 1, Siliziumdioxidplatte). Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum war in Übereinstimmung mit der zugeschriebenen Struktur.
  • (d) Herstellung von [((7-Aminoheptyl)iminol)bis(ethylennitrilo)]ltetraessigsäure. Eine Lösung von [((6-Cyanohexyl)imino)bis(ethylennitrilo)]tetraessigsäure (0,85 g, 0,0019 Mol) in Essigsäure (50 ml) wurde mit Platinoxid (0,15 g) behandelt und über Nacht bei 45 psi (310,264 Pa) hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt, und das Filterkissen wurde mit Wasser gespült. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, wobei sich ein Rohprodukt ergab, das an einem Ionenaustauscherharz Bio Rad AG 1 · 8 in der Formiatform chromatographiert wurde. Die Eluierung mit Wasser ergab reine [((7- Aminoheptyl)imino)bis(ethylennitrilo))tetraessigsäure (0,70 g, 82%). Das Produkt war ein Fleck auf Tlc. Das Proton-NNR-Spektrum und das Kohlenstoff- M4R-Spektrum waren in Übereinstimmung mit der zugeschriebenen Struktur.
  • (e) Herstellung von [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(ethylennitrilol)[tetraessigsäure. Eine Lösung von [((7-Aminoheptyl)imino)bis(ethylennitrilo)]tetraessigsäure (0,72 g, 1,6 mMol) in gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (15 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt, und N-Carboxymethoxymaleinimid (hergestellt nach Helv. Chim. Acta. 58, 531 (1975)) (0,25 g, 1,6 mMol) wurde in einer Portion zugesetzt. Nach 20-minütigem Rühren wurde das Eisbad entfernt, und die Rührung wurde 30 Minuten fortgesetzt. Die Lösung wurde mit 1 N HCl auf pH etwa 6 gebracht und unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde an einer 2 · 30 cm Säule aus Ionenaustauscherharz Bio-Rad AG 1 · 8 in der Formiatform (Gradienteneluierung, 0-1 M Ameisensäure) chromatographiert, wobei 0,61 g leicht unreines Produkt anfielen. Dieses Material wurde wie oben erneut chromatographiert, wobei sich reine [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis- (ethylennitrilo)]tetraessigsäure (0,42 g, 50%) ergab.
  • Das Produkt zeigte einen Fleck auf Tlc (Ethanol, 7% wässriges NH&sub3;, 4 : 1 Kieselgelplatte).
  • Die Maleinimide konnten auf Tlc als weiße Flecken auf hellgelbem Hintergrund durch Besprühen mit Reagenz A und anschließend mit Reagenz B festgestellt werden.
  • Reagenz A: 0,1% 5,5'-Dithio-bis-2-nitrobenzoesäure (DTNB) in Ethanol/tris-HCl-Puffer (pH 8,2), 1 : 1.
  • Reagenz B: 2% Natrium-2-mercaptoethansulfonat in 80%-igem wässrigen Ethanol.
    • Vergleichsbeispiel II Herstellung von, Konjugat des Anti-CEA-Fab' und der [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(ethylennitrilo)]tetraessi säure
  • (a) Herstellung von F(ab')&sub2;-Fragment aus Anti-CEA-monoklonalem Antikörper (Unterklasse IgG&sub1;). Murin-anti-CEA-monoklonaler Antikörper (Unterklasse IgG&sub1;) wurde aus ascitischer Flüssigkeit durch (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fällung und Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. Die enzymatische Fragmentierung von intaktem Antikörper IgG&sub1; unter Bildung von F(ab')&sub2; erfolgte unter Benutzung von Thiol-freiem, vor aktiviertem Papain nach Parham et al. J. Immunol. Methods. 53, 133-73 (1982). Gereinigtes F(ab')&sub2;-Fragment wurde durch sequentielle Säulenchromatographie über Whatman DE-52- und Sephadex G-100-Harze erhalten. Die denaturierende Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zeigte, daß das isolierte Protein eine Reinheit von mehr als 95% hatte.
  • (b) Bestimmung der Anzahl der zwischenkettigen Disulfidbindungen in dem F(ab')&sub2;-Fra ment. Das durch Papain-Spaltung des IgG&sub1; - anti-CEAmonoklonalen Antikörpers erzeugte F(ab')&sub2;-Fragment hatte nach Bestimmung eine die zwei schweren Ketten verbindende, zwischenkettige Disulfidbindung. Diese Bestimmung erfolgte durch Reduktion des F(ab')&sub2;-Antikörper-Fragments mit Dithiothreit unter milden Reduktionsbedingungen, um die die zwei schweren Ketten verbindenden zwischenkettigen Disulfidbindungen und die die schweren und leichten Ketten verbindenden, zwischenkettigen Disulfidbindungen aufzutrennen und dabei die innerkettigen Disulfidbindungen intakt zu lassen.
  • Die reduzierten Fragmente wurden dann mit ³H-NEM, das mit den freien Sulfhydrylgruppen reagiert, umgesetzt und über SDS-Polyacrylamid-Gele gefahren, wobei sich Bänder entsprechend den schweren und leichten Ketten ergaben, deren freie Sulthydrylgruppen tritiummarkiert waren. Das Gel wurde Protein-gefärbt, mit Fluorophor getränkt, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt, um die relative Intensität in den Bändern der schweren und leichten Ketten zu bestimmen. Die Fluorophor-getränkten Bänder wurden ausgeschnitten und in einen Szintillationszähler gebracht. Unter Benutzung der Zählungen pro Minute für das der leichten Kette zugeordnete Band als ein Maß für eine Sulfhydrylgruppe wurde gefunden, daß die schwere Kette zwei Sulfhydryle enthält, von denen eine der zwischenkettigen Disulfidbindung der leichten Kette entspricht. Daher entspricht das andere Sulfhydryl einer einzigen zwischenkettigen Disulfidbindung zwischen den schweren Ketten des durch die Papain-Spaltung des gesamten CEA-Antikörpers gebildeten F(ab')&sub2;-Fragments.
  • (c) Herstellung von anti-CEA-Fab'-Fragment. Das eine einzige zwei schwere Ketten verbindende, zwischenkettige Disulfidbindung enthaltende anti-CEA- F(ab')&sub2;-Fragment wurde mit Cystein unter einer N&sub2;-Atmosphäre bei einer Protein-Konzentration von 1 bis 10 mg/ml reduziert. Die optimale Konzentration des Reduktionsmittels und die Inkubationszeit wurden so eingestellt, daß mehr als 85% des F(ab')&sub2; zu Fab' reduziert wurden und weniger als 15% zu individuellen leichten und schweren Ketten reduziert wurden. Die optimalen Reaktionsbedingungen wurden wie folgt bestimmt.
  • Fab')&sub2;-Fragmente von monoklonalem anti-CEA (Unterklasse IgG&sub1;), die durch Papain-Spaltung des ganzen Antikörpers gebildet worden waren, wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in einem Puffer von pH etwa 7,4 bei Cystein- Endkonzentrationen von 0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 und 40 mM reduziert. Die resultierenden reduzierten Fragmente wurden mit NEM umgesetzt, das die freien Sulfhydrylgruppen in einer dem Kupplungsmittel [((7-Maleinimidoheptyl)imino)- bis(ethylennitrilo)]tetraessigsäure analogen Weise alkyliert. Die mit verschiedenen Cystein-Konzentrationen erzeugten reduzierten Fragmente wurden in getrennten Streifen mit dem ganzen Antikörper und mit F(ab')&sub2;-Fragment als Kontrollproben auf SDS-Polyacrylamid-Gele gefahren, und die Gele wurden Protein-gefärbt. Die Beobachtung der gefärbten-Gele zeigte an, daß mit wachsender Cystein-Konzentration das F(ab')&sub2;-Band allmählich verschwand und ein in dem Molgewicht dem Fab'-Fragment entsprechendes Band erschien. Die fortgesetzte Zunahme in der Cystein-Konzentration führte zu einem Ver schwinden des Fab'-Bandes bei gleichzeitigem Auftreten von zwei niedermolekularen Bändern entsprechend der individuellen schweren und leichten Kette. Die optimale Cysteinkonzentration, d. h. die Konzentration, bei der das F(ab')&sub2;-Band verschwand, aber die Bänder der individuellen schweren und leichten Kette noch nicht auftraten, wurde zu 10 mM ermittelt.
  • Ähnliche Untersuchungen ergaben typische Cystein-Konzentratlonen (für optimale Reduktion von F(ab')&sub2; zu Fab') von 5 mM bis 15 mM und Inkubationszeiten von 2 bis 4 Stunden bei den folgenden N&sub2;-durchgasten Puffern: 25 mM NaPO&sub4;, 2 mM Na&sub2;EDTA, 0,02% Gew. /Vol. NaN&sub3; pH 7,4; 57,4 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 17,6 mM KH&sub2;PO&sub4;, 75 mM NaCl, 5 mMNa&sub2;EDTA, 0,02% Gew. /Vol. NaNg pH 7,2 (RIA-Puffer); oder 25 mM Tris, 2 mM Na&sub2;EDTA, 0,02% Gew./Vol. NaN&sub3;, pH 8,0. (d) Koniugationsreaktion. Das nach der oben beschriebenen Arbeitsweise hergestellte reduzierte anti-CEA-Fab'-Protein wurde unter einer N&sub2;-Atmosphäre durch erschöpfenden Pufferaustausch in 50 mM MES, 2 mM Na&sub2;EDTA, pH 6,5 bis 6,8, durch Membranfiltration mit einer PM1O-Membran von überschüssigem Thiol-Reagenz befreit. Ein aliquoter Teil der resultierenden Lösung wurde mit ³H-NEM von bekannter spezifischer Aktivität fitriert, um die Anzahl der durch das Reduktionsverfahren erzeugten freien SH-Gruppen je Fab-Molekül zu bestimmen. Der Rest wurde mit 10-25 mM Kupplungsmittel des Beispiels I, d. h. [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(ethylennitrilo)]tetraessigsäure, 2 bis 4 Stun - den bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4ºC umgesetzt.
    • Vergleichsbeispiel III Herstellung des Chelatkomplexes von Indium-111 und Anti-CEA Fab'-Konjugat
  • Zur Herstellung eines Antikörper-Radionuklid-Konjugats wurden 10 ul ¹¹¹InCl&sub3; (etwa 50 bis 100 uCl) in 50 mM HCl (Rad-Pharm) zu 5 ul 10 mM Tiron, 4 mM HCl, pH 2,4, zugesetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 10 ul 200 mM MES, pH 6,0, und 10 ul 2-15 mg/ml des nach der Arbeitsweise des Vergleichsbeispiels II hergestellten Konjugats von anti- CEA-Fab' und Kupplungsmittel zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, worauf 2-5 ul zur elektrophoretischen Analyse auf einen Celluloseacetat-Streifen getüpfelt wurden. Die Elektrophorese wurde unter Benutzung von 50 mM Hepes, pH 7,0, als Elektrodenpuffer durchgeführt. In dem elektrophoretischen Feld blieb das ¹¹¹In-chelatierte anti- CEA-Fab'-Konjugat an der Ausgangsstelle, und das nicht umgesetzte Indium- 111 wanderte als separate Spitze. In einer getrennten Elektrophorese wurden 7 ul des Chelatkonjugat-Reaktionsgemisches vor der Elektrophorese erst mit 2 ul einer 200 mM Na&sub2;EDTA, pH 6,0, inkubiert. Die Zugabe der EDTA verursachte eine Verschiebung der Chelatkonjugat-Spitze, wodurch angezeigt wurde, daß das chelatierte Antikörper-Konjugat beständiger als das ¹¹¹In-Tiron-Chelat war.
  • Das anti-CEA-Fab'/Indium-111-Konjugat kann in Form einer physiologisch annehmbaren, gepufferten Lösung als Tumor-Abbildungsmittel intravenös verabreicht werden, z.B. zur Abbildung der KolonTumore unter Benutzung der bekannten Photoscanning-Verfahren.
    • Vergleichsbeispiel IV Immunoaffinität des Konjugats von Anti-CEA-Fab' und [((7-Maleinimidoheptyl)imino)bis(ethylennitrilo)]tetraessigsäure
  • Die Immunoaffinität des nach der Arbeitsweise des Vergleichsbeispiels II erzeugten Konjugats monoklonales anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel wurde durch Radioimmunountersuchung mit CEA-Antigen bestimmt. IgGSORB (Staph A) (Enzyme Center, Boston, Massachusetts), das mit Ratte-anti-Maus- Kappa (300 ug Ratte-anti-Maus-Kappa/ 1 ml Staph A) beschichtet war, diente zur Trennung des gebundenen von dem freien Antigen. Verdünnungsreihen des anti- CEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugats (Proteinkonzentration 3,7 · 10&supmin;&sup8; M) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit einer fixierten Menge ¹²&sup5;I-markiertem CEA-Antigen (218 ng) und veränderlichen Mengen unmarkiertem CEA-Antigen inkubiert. Anschließend an die Inkubation wurden 20 ul beschichtetes IgGSORB jedem Behälter zugesetzt, und die Inhalte wurden 3 Stunden inkubiert. Das IgGSORB wurde dreimal durch wiederholte Zentrifugierung und erneute Suspendierung in RIA-Puffer gewaschen. Die schließlich erhaltene Tablette wurde in einen Gamma-Zähler getan und auf Gamma-Emission analysiert. Zur Kontrolle wurden Radioimmunountersuchungen in der gleichen Weise unter Benutzung des ganzen monoklonalen anti-CEA-IgG und des F(ab')&sub2;-Fragments gefahren.
  • Die Bindungskurven (Zählungen pro Minute gegen Verdünnung des Antikörpers) wurden für jeden Antikörper oder jedes Fragment sowie für jede Konzentration des unmarkierten Antigens aufgestellt. In jedem Fall verringerte der Zusatz von unmarkiertem CEA die Bindungsaktivität. Die maximale Bindung für das monoklonale anti-CEA-IgG war 30 000 cpm (Zählungen pro Minute), für das anti- CEA-F(ab')&sub2; war sie 25 000 cpm und für das monoklonale anti-CEAFab'/Kupplungsmittel-Konjugat war sie 19 000 cpm. Doppeltreziproke Bindungsdarstellungen (1/gebunden gegen 1/frei) wurden bei unterschiedlichen Antikörperverdünnungen für den Antikörper und die Fragmente aufgestellt. Aus den Neigungen und den Abschnitten wurde die Bindungsaffinität für jeden Antikörper oder jedes Fragment und für jede Verdünnung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabille I angegeben. Sie zeigen, daß die durchschnittliche Bindungsaffinität des monoklonalen anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugats etwa die gleiche uur wie die des monoklonalen anti-CEA-IgG und des anti-CEA-F(ab')&sub2;. TABELLE I
    • Vergleichsbeispiel V Bindungsprofil bei der Festphase-Radioimmunountersuchung
  • Fünfzig ul Zellextrakte des menschlichen Kolon-Adenocarcinoms wurden dem Polyvinylplattenbehälter zugesetzt und auf einer Bahnrümlüatue der liudaing Überlassen. Dann wurden 200 ul 1%-iges Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung zugesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden 150 ul Antikörper (monoklonaler anti-CEA-IgG, F(ab')&sub2;-Fragment oder anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugat) unterschiedlichen Verdünnungen zugesetzt und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Behälter wurden dreimal gewaschen, und radiojodiertes Ratten-anti-Maus-Kappa wurde zugesetzt und eine Stunde inkubiert. Die Behälterinhalte wurden fünfmal mit Phosphat-Puffer gewaschen und dann auf Gamma-Emissionen analysiert.
  • Für jeden Antikörper oder jedes Fragment wurde eine Bindungskurve (Zählungen pro Minute gegen Antikörperverdünnung) aufgestellt. Die übereinanderliegenden Kurven sind in der Figur gezeigt. Aus der Figur ist ersichtlich, daß das monoklonale anti-CEA-Fab'/Kupplungsmittel-Konjugat eine Bindungskurve zeigt, die im wesentlichen mit der des monoklonalen anti-CEA-IgG und des anti- CEA-F(ab')&sub2; identisch war.
    • Vergleichsbeispiel VI Bioverteilung von In-111 /Anti-CEA-Fab'-Konjugat und I-125-unspezifischen Fab'-Fragmenten
  • Weibliche, aus der Kreuzung entfernt verwandter Individuen gezüchteter, Hsd athymischer nackter Mäuse (nu/nu) von Harlin Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, Indiana) wurden subcutan mit 10&sup7; LS 174 CEA geimpft, das menschliche Tumorzellen erzeugt. Als nach drei (3) Wochen die Tumore etwa 6 Gramm erreicht hatten, wurden zwei (2) Tieren entweder In-111- chelatmarkiertes Fab'-Fragment eines nach der Beschreibung in Vergleichsbeispiel IV hergestellten anti-CE-monoklonalen Antikörpers oder das I-125- markierte Fab'-Fragment eines isotyp angepaßten unspezifischen monoklonalen Antikörpers injiziert. Jede Gruppe von Tieren erhielt 12,5 uCi in einem ml Phosphat-gepufferter Salzlösung. Nach 24 Stunden wurde jedes Tier getötet, und Organe, Tumor und Blut wurden durch Gamma-Szintigraphie vereinigt. Die Tabelle II zeigt die Bioverteilung der spezifisch In-111-markierten und unspezifisch I-125-markierten Antikörper-Fragmente. Es ist ersichtlich, daß sich das spezifisch markierte Antikörper-Fragment an dem Tumor 5,2-fach stärker als der unspezifische Antikörper lokalisierte (Lokalisierungsindex). Die höheren Dosen von In-111 in der Niere und der Leber sind einer im Vergleich zu In-111 schnelleren Ausscheidung des I-125 aus diesen Organen zuzuschreiben und weniger einer Differenz in der Aufnahme, wie sich aus der Kinetik der Leber- und Nierenaufnahme und -ausscheidung ergab (Werte nicht gezeigt). TABELLE II Bioverteilung von In-111-markierten spezifischen und I-125- unspezifischen Antikörper-Fab'-Fragmenten in tumorhaltigen nackten Mäusen

Claims (7)

1. Biologisch nützliches Konjugat, erhalten durch Verbinden eines paramagnetischen oder Radionuklid-Metallions mit einem von einem Fab'-Fragment eines Antikörpers verschiedenen, biologisch nützlichen Molekül mit einer freien Sulfhydrylgruppe mittels eines Kupplungsmittels, umfassend eine Verbindung der Formel:
worin R ein zweiwertiger organischer Rest ist und R' eine Gruppe ist, die fähig ist, ein paramagnetisches oder Radionuklid-Metallion zu chelatisieren.
2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei R aus -(CH&sub2;)n-, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, und Phenylen gewählt ist.
3. Konjugat nach Anspruch 1, wobei R -C&sub7;H&sub1;&sub4;- oder -C&sub5;H&sub1;&sub0;- ist.
4. Konjugat nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei R' aus -N(CH&sub2;CH&sub2;N(CH&sub2;CO&sub2;H)&sub2;)&sub2; und -CH(N(CH&sub2;CO&sub2;H)&sub2;)CH&sub2;N(CH&sub2;CO&sub2;H)&sub2; gewählt ist.
5. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Kupplungsmittel eine Verbindung der Formel umfaßt:
6. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Kupplungsmittel eine Verbindung der Formel umfaßt:
7. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats nach Anspruch 1, umfassend das Konjugieren eines von einem Fab'-Fragment eines Antikörpers verschiedenen, biologisch nützlichen Moleküls mit einer freien Sulfhydrylgruppe mit einem Kupplungsmittel, umfassend eine Verbindung der Formel:
worin R ein zweiwertiger organischer Rest ist und R' eine Gruppe ist, welche fähig ist, ein paramagnetisches oder Radionuklid-Metallion zu chelatisieren, und danach Chelatisieren mit einem paramagnetischen oder Radionuklid-Metallion.
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