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DE3856567T2 - Lumineszente Rhenium-Komplexe und Verfahren zur Herstellung - Google Patents

Lumineszente Rhenium-Komplexe und Verfahren zur Herstellung Download PDF

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DE3856567T2
DE3856567T2 DE3856567T DE3856567T DE3856567T2 DE 3856567 T2 DE3856567 T2 DE 3856567T2 DE 3856567 T DE3856567 T DE 3856567T DE 3856567 T DE3856567 T DE 3856567T DE 3856567 T2 DE3856567 T2 DE 3856567T2
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complex
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complexes
electromagnetic radiation
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DE3856567T
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DE3856567D1 (de
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Richard J. Massey
Jonathan K. Leland
Michael J. Powell
Mohindar S. Poonian
Walter J. Dressick
Janel K. Hino
Leopoldo Della Ciana
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Bioveris Corp
Original Assignee
IGEN International Inc
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Publication date
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Description

  • Diese Anmeldung stellt eine Fortsetzung der ebenfalls anhängigen, am 30. April 1986 eingereichten US-Anmeldung Nr. 858,354 und der am 30. April 1987 eingereichten PCT-Anmeldung US 87/00987 , deren Inhalt hiermit in diese Anmeldung einbezogen wird, dar.
  • Die Erfindung betrifft elektrochemolumineszente chemische Einheiten, die das Metall Rhenium enthalten. Die in dieser Anmeldung offenbarten Rhenium enthaltenden Komplexe und Marker bieten verschiedene Vorteile im Vergleich zu Tris-2,2'-bipyridinruthenium (II) und verwandten Komplexen, die zur Verwendung in Versuchssystemen vorgeschlagen worden sind. Dazu gehören: (I) Emissionsquantenausbeuten (⌀r), die im allgemeinen günstiger sind als bei Tris-2,2'-bipyridinruthenium (II)-Derivaten; (II) die Möglichkeit, die Eigenschaften der Ladungsübertragung von Metall zu Ligandem im angeregten Zustand in einem größeren Wertebereich zu wählen als bei Tris-2,2'-bipyridinruthenium (II)-Derivaten und (III) vereinfachte und wirtschaftlichere Syntheseverfahren, weil sowohl Bipyridyl- als auch nicht aus Bipyridyl bestehende Derivate verwendet werden können, um einen relevanten Analyten an den Komplex zu konjugieren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In dieser Anmeldung sind verschiedene Veröffentlichungen durch arabische Ziffern in Klammer angegeben. Am Ende der Beschreibung ummittelbar vor den Ansprüchen sind diese Veröffentlichungen mit vollem Titel aufgeführt. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen werden hiermit in diese Anmeldung einbezogen, um den Stand der Technik, auf den sie sich bezieht, umfassender zu beschreiben.
  • Es besteht nach wie vor ein ständig wachsender Bedarf nach raschen, hochspezifischen Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung chemischer, biochemischer und biologischer Substanzen. Besonders wertvoll sind Verfahren zum Messen kleiner Mangen an Pharmazeutika, Metaboliten, Mikroorganismen und anderen Materialien von diagnostischem Wert. Beispiele für solche Materialien sind unter anderem Narkotika und Gifte, zu therapeutischen Zwecken verabreichte Medikamente, Hormone, pathogene Mikroorganismen und Viren, Antikörper, Metaboliten, Enzyme und Nucleinsäuren.
  • Die Gegenwart solcher Substanzen kann oft durch Bindeverfahren nachgewiesen werden, die den hohen Spezifitätsgrad, welcher viele biochemische und biologische Systeme charakterisiert, ausnutzen. Häufig eingesetzte Verfahren basieren beispielsweise auf Antigen-Antikörper-Systemen, Techniken zur Hybridisierung von Nukleinsäuren und Protein-Liganden-Systemen. Bei diesen Verfahren wird die Gegenwart eines Komplexes von diagnostischem Wert typischerweise durch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines beobachtbaren "Markers" angegeben, der an einer oder mehreren der komplexbildenden Substanzen hängt. Das gewählte spezifische Markierungsverfahren bestimmt oft die Nützlichkeit und Vielseitigkeit eines bestimmten Systems zum Nachweis einer relevanten Substanz. Ein bevorzugter Marker sollte preiswert und sicher sein und effizient an eine Vielzahl chemischer, biochemischer und biologischer Materialien angefügt werden können, ohne die wichtigen Bindungseigenschaften dieser Materialien zu verändern. Der Marker sollte ein hochcharakterisches Signal geben und selten – am besten gar nicht – in der Natur vorkommen. Der Marken sollte stabil und über Zeiträume von mehreren Monaten in wäßrigen Systemen nachweisbar sein. Der Nachweis des Markers sollte schnell, sensibel und jederzeit wiederholbar sein, ohne daß teure spezialisierte Anlagen oder Fachpersonal erforderlich sind. Die Quantifizierung des Markers sollte relativ unabhängig von Variablen wie der Temperatur und der Zusammensetzung der zu untersuchenden Mischung sein. Am vorteilhaftesten sind Marker, die in homogenen Systemen verwendet werden können, d. h. Systemen, in denen die Trennung der im Komplex und nicht im Komplex befindlichen markierten Substanzen nicht erforderlich ist. Dies ist möglich, wenn die Nachweisbarkeit des Markers in Fällen, wo das markierte Material in einen spezifischen Komplex inkorporiert wird, moduliert wird.
  • Es sind bereits zahlreiche Marker entwickelt worden, die jeweils bestimmte Vor- und Nachteile aufweisen. Beispielsweise sind radioaktive Marker recht vielseitig einsetzbar und können in sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen werden. Sie sind jedoch teuer, nicht ungefährlich und ihr Einsatz erfordert Spezialanlagen und ausgebildetes Personal. Darüber hinaus ist die Sensibilität eines radioaktiven Markers dadurch eingeschränkt, daß das nachweisbare Ereignis aufgrund seiner Beschaffenheit nur einmal pro radioaktives Atom im markierten Material stattfinden kann. Außerdem können radioaktive Marker nicht in homogenen Verfahren verwendet werden. Deshalb besteht großes Interesse an nicht radioaktiven Markern. Dazu gehören Moleküle, die man durch Spektrophotometrie-, Spinresonanz- und Lumineszenztechniken beobachten kann, sowie Enzyme, die solche Moleküle erzeugen. Zu den nützlichen, nicht radioaktiven Markermaterialien gehören organometallische Verbindungen. Wegen der Seltenheit einiger Metalle in biologischen Systemen können Verfahren, die spezifisch die Metallkomponente der organometallischen Verbindungen bestimmen, erfolgreich eingesetzt werden. Beispielsweise offenbart Cais in US-A-4,205,952 (1980) die Verwendung von Markern aus immunchemisch aktiven Materialien mit bestimmten organometallischen Verbindungen beim Einsatz in der quantitativen Bestimmung spezifischer Antigene. Mit diesen Markern kann jedes allgemeine Verfahren zum Nachweis der gewählten Substanzen verwendet werden, einschließlich Emissions-, Absorptions- und Fluoreszenzspektroskopie, Atomabsorption und Neutronenaktivierung. Diesen Verfahren mangelt es oft an Sensibilität. Außerdem können sie selten für ein homogenes System adaptiert werden, und bei der Atomabsorption kommt es manchmal zur Zerstörung der Probe.
  • Von besonderem Interesse sind Marker, die durch photochemische, chemische und elektrochemische Mittel zum Lumineszieren angeregt werden können. "Photolumineszenz" ist das Verfahren, mit dem eine Substanz zum Lumineszieren angeregt wird, wenn sie elektromagnetische Strahlung absorbiert. Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind Typen von Photolumineszenz. "Chemilumineszenzverfahren" beinhalten die Erzeugung der lumineszenten Spezies durch chemische Energieübertragung. "Elektrochemilumineszenz" beinhaltet die Erzeugung der lumineszierenden Spezies auf elektrochemischem Weg.
  • Diese lumineszierenden Systeme werden immer wichtiger. Beispielsweise offenbart Mandle in US-A-4,372,745 (1983) die Verwendung chemilumineszierender Marker in immunchemischen Anwendungen. In den offenbarten Systemen werden die Marker auf chemische Weise wie z. B. durch die Reaktion des Markers mit H2O2 und einem Oxalat in einen lumineszierenden Zustand angeregt. In diesen Systemen wandelt H2O2 das Oxalat oxydativ zu einem Derivat mit hoher Energie um, das dann den Marker anregt. Dieses System funktioniert im Prinzip mit jedem lumineszierenden Material, das unter den oxidierenden Bedingungen des Versuchs stabil ist und durch das mit hoher Energie ausgestattete Oxalatderivat angeregt werden kann. Leider ist gerade diese Vielseitigkeit daran schuld, daß diese Technik nur eingeschränkt eingesetzt werden kann: typische biologische Flüssigkeiten, die den relevanten Analyten enthalten, enthalten auch eine große Anzahl potentiell lumineszierender Substanzen, die ein hohes Maß an Hintergrundlumineszenz verursachen können.
  • Ein weiteres Beispiel, das an denselben Nachteilen krankt, für den immunchemischen Einsatz der Chemilumineszenz geben Oberhardt et al. in US-A-4,280,815 (1981), wo die elektrochemische Erzeugung eines Oxidationsmittels (z. B. H2O2) in situ in unmittelbarer Nachbarschaft eines mit einer chemilumineszierenden Spezies markierten Immunreaktanten offenbart wird. Das elektrisch erzeugte Oxidationsmittel diffundiert in die chemilumineszierende Spezies und oxidiert sie chemisch, was zur Nettoübertragung eines oder mehrerer Elektronen auf das elektrisch erzeugte Oxidationsmittel führt. Bei der Oxidation sendet die chemilumineszierende Spezies ein Photon aus. Im Gegensatz dazu ist bei dieser Erfindung eine Direktübertragung von Elektronen von einer Quelle elektrochemischer Energie auf eine chemilumineszierende Spezies, die wiederholt Photonen aussenden kann, erforderlich.
  • Die Erfindung betrifft elektrochemilumineszierende Marker. Geeignete Marker umfassen elektrochemilumineszierende Verbindungen, darunter organische und organometallische Verbindungen. Elektrochemilumineszenzverfahren zum Nachweis markierter Substanzen werden aus vielen Gründen anderen Verfahren vorgezogen. Sie können die Gegenwart eines bestimmten Markers besonders gut diagnostizieren, sind sensibel, ungefährlich, preiswert und können in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Organische Verbindungen, die geeignete elektrochemische Marker abgeben; sind z. B. Rubren und 9,10- Diphenylanthracen. Viele organometallische Verbindungen geben geeignete elektrochemische Marker ab, doch besonders nützlich sind Verbindungen, die Ru oder Os enthalten.
  • Ru- und Os-haltige organometallische Verbindung sind in der Literatur bereist erörtert worden. Cais offenbart, daß jedes Metallelement oder eine Kombination von Metallelementen, darunter Edelmetalle aus der Gruppe VIII wie Ru, geeignete Komponenten für durch Atomabsorptionsverfahren nachweisbare organometallische Marker wären (Cais, Sp. 11, Z. 20). Jedoch ist bei Cais Ruthenium kein bevorzugtes Metall, Osmium wird nicht spezifisch erwähnt, es werden keine Daten über die Effizienz der Nutzung von Ru oder Os in einem der offenbarten Verfahren vorgelegt, und das bevorzugte Nachweisverfahren, nämlich die Atomabsorption, zieht die Zerstörung der Probe nach sich.
  • Weber offenbart in US-A-4,293,310 (1981) die Verwendung von Ru-haltigen und Os-haltigen Komplexen als elektrochemische Marker für Analyten in Immunbestimmungen. Die offenbarten Komplexe sind durch eine Bindung mit den Aminogruppen auf den Analyten verbunden. Weber weist auch auf die Möglichkeit hin, Carboxylatester zwischen den Markern und Hydroxygruppen anderer Analyten zu bilden.
  • Die Gegenwart der markierten Materialien kann laut Weber mit einem Apparat und einem Verfahren bestimmt werden, der einen Quencher und eine elektrochemische Fließzelle mit einer Lichtvorrichtung umfaßt. Der photoelektrochemisch aktive Marker überträgt bei der Photoanregung ein Elektron auf ein Quenchermolekül; anschließend wird das oxidierte Molekül mit einem Elektron von einer auf geeigneter Spannung gehaltenen Elektrode der Fließzelle reduziert. Dieses Elektron wird als Photostrom gemessen. Die Menge des freien markierten Analyten im System wird durch das Photostromsignal bestimmt. Dieses Verfahren ist die Umkehrung des elektrochemilumineszierenden Nachweises lumineszierender Materialien.
  • In späteren Veröffentlichungen erörtern Weber et al. die Probleme, die beim Einsatz dieses Verfahrens zum Nachweis Ru-haltiger Marker auftreten. In Tabelle 2 von Weber et al. ist (1) die extrapolierte Nachweisgrenze für Tris(bipyridyl)ruthenium(II) 1,1 × 10–10 Mol/l unter optimalen Bedingungen. Da sie vorhersahen, daß der tatsächliche Einsatz dieser Marker Messungen in Gegenwart komplexer Mischungen nach sich ziehen würde, führten Weber et al. Tests auf potentielle Störsubstanzen in ihrem System durch. In Tabelle 3 von Weber et al. sind Dimethylalkylamine, EDTA, N-Methylmorpholin, N,N'-Dimethylpiperazin, Hydroxid, Oxalat, Ascorbat, Harnsäure und Serum als Störsubstanzen aufgeführt, die die praktische Nachweisgrenze vermutlich auf einen erheblich über 1,1 × 10–10 Mol/l liegenden Wert anheben würden. Diese Studien wurden mit einer einfachen Ru-haltigen Verbindung durchgeführt. Weber oder Weber et al. berichten nichts über Studien bezüglich der Nachweisgrenzen komplexer, mit Ru-haltigen Markern markierter Substanzen. Auch darüber, ob die Thioharnstoffbindung zwischen dem markierten Material und dem Marker unter Versuchsbedingungen stabil ist, wird nichts erwähnt.
  • Die speziellen Marker, um die es in dieser Erfindung geht, sind elektrochemilumineszent. Sie können oft ohne Oxidation oder Reduktion in einen lumineszierenden Zustand angeregt werden, indem man die Verbindungen elektromagnetischer Strahlung oder einer chemischen Energiequelle, wie sie z. B. durch typische Oxalat-H2O2-Systeme erzeugt wird, aussetzt. Außerdem kann die Lumineszenz dieser Verbindungen durch elektrochemische Ver fahren angeregt werden, die ihre Oxidation oder Reduktion nach sich ziehen.
  • Es liegen Berichte über umfangreiche Forschungen über Verfahren zum Nachweis von Ru-(2,2'-bipyridin)3 2+ unter Einsatz photolumineszierender, chemilumineszierender und elektrochemilumineszierender Mittel (2, 3) vor. Diese Arbeiten zeigen, daß sich eine hell orangefarbene Chemilumineszenz auf die wäßrige Reaktion von chemisch oder elektrisch erzeugtem Ru(bpy)3 3+ (wobei "bpy" einen Bipyridylliganden bedeutet) mit starken Reduktionsmitteln, die als Zwischenprodukte der Oxidation von Oxalationen oder anderen organischen Säuren entstanden sind, gründet. Eine Lumineszenz läßt sich auch in Lösungen aus einem organischen Lösungsmittel und H2O durch die Reaktion von elektrisch oder chemisch erzeugtem Ru(bpy)3 1+ mit starken, während der Reduktion von Peroxydisulfat erzeugten Oxidationsmitteln erreichen. Ein dritter Mechanismus für die Erzeugung von Elektrochemilumineszenz aus Ru(bpy)3 2+ beeinhaltet die Oszillation einer Elektrodenspannung zwischen einer Spannung, die ausreichend negativ zur Erzeugung von Ru(bpy)3 1+ und ausreichend positiv zur Erzeugung von Ru(bpy)3 3+ ist. Diese drei Verfahren werden "oxydative Reduktion", "reduktive Oxidation" bzw. "regeneratives Ru(byp)3 3+/+ System" genannt.
  • Das oxydative Reduktionsverfahren kann in Wasser durchgeführt werden und erzeugt eine intensive, effiziente und stabile Lumineszenz, die relativ unempfindlich gegenüber der Anwesenheit von Sauerstoff oder Verunreinigungen ist. Diese Lumineszenz von Ru(bpy)3 2+ hängt von der Gegenwart von Oxalat oder anderen organischen Säuren wie Pyruvat, Lactat, Malonat, Tartrat und Citrat sowie einer Vorrichtung zur oxydativen Erzeugung einer Ru(bpy)3 3+-Spezies ab. Die Oxidation kann chemisch durch ein so starkes Oxidationsmittel wie PbO2 oder ein Ce(IV)-Salz erfolgen. Sie kann auch elektrochemisch durch eine ausreichend positive Spannung, die entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich angelegt wird, durchgeführt werden. Geeignete Elektroden für die elektrochemische Oxidation von Ru(bpy)3 2+ sind beispielsweise Pt, pyrolytischer Graphit und Glaskohlenstoff. Obwohl das Oxalat oder eine andere organische Säure während der Chemilumineszenz verbraucht wird, läßt sich durch die Gegenwart eines Überschusses an dem verbrauchten Material in der Reaktionskammer über viele Stunden eine starke, konstante Chemilumineszenz erreichen.
  • Das Verfahren der reduktiven Oxidation kann in teilweise wäßrigen Lösungen durchgeführt werden, die noch ein organisches Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril enthalten. Diese Lumineszenz hängt von der Gegenwart von Peroxydisulfat und einer Methode zur reduktiven Erzeugung einer Ru(bpy)3 1+-Spezies ab. Die Reduktion kann chemisch durch starke Reduktanten wie z. B. Magnesium oder andere Metalle erfolgen. Sie kann auch elektrochemisch durch eine ausreichend negative, entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich angelegte Spannung durchgeführt werden. Eine geeignete Elektrode für die elektrochemische Reduktion von Ru(bpy)3 2+ ist beispielsweise eine polierte Glaskohlenstoffelektrode. Wie bei dem oxydativen Reduktionsverfahren läßt sich über viele Stunden eine kontinuierliche, intensive Lumineszenz erreichen, wenn man einen Überschuß an Reagenzien verwendet oder die verbrauchten Reagenzien der Reaktionsmischung kontinuierlich zuführt.
  • Das regenerative Ru(bpy)3 3+/+-System kann in organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril oder teilweise wäßrigen Systemen durchgeführt werden, indem man eine Elektrodenspannung zwischen einer für die Reduktion von Ru(bpy)3 2+ ausreichend negativen und für die Oxidation von Ru(bpy)3 2+ ausreichend positiven Spannung pulsieren läßt. Eine geeignete Elektrode für ein solches regeneratives System ist z. B. eine Pt-Elektrode. Dieses System verbraucht keine chemischen Reagenzien und kann im Prinzip unbegrenzt lange ablaufen.
  • Diese drei Verfahren zur Herstellung von lumineszierenden Ru-haltigen Verbindungen haben die wiederholte Oxidation-Reduktion oder Reduktion-Oxidation der Ru-haltigen Verbindung gemeinsam. Die Lumineszenz von Lösungen, die diese Verbindungen enthalten, hängt deshalb stark von der elektrischen Spannung der angelegten Energiequelle ab und kann daher die Gegenwart der Ru-haltigen Verbindung besonders gut diagnostizieren.
  • Mandle zitiert Curtis et al. (4) als möglichen Marker in chemilumineszierenden Anwendungen. Curtis et al. berichten nur über unveröffentlichte Beobachtungen, daß Ru-Komplexe induziert werden können, Licht auszusenden, wenn sie durch ein Oxalat/H2O2-System chemisch angeregt werden (Curtis et al., Seite 350). Weder Mandle noch Curtis erkannten die außergewöhnliche Nützlichkeit von Ruthenium- und Osmiumkomplexen in chemilumineszierenden Anwendungen oder die Nützlichkeit elektrochemilumineszierender Systeme.
  • G. Sprintschnik et al. (5) haben mit Octadecanol oder Dehydrocholesterol veresterte Komplexe von Tris(2,2'bipyridin)ruthenium(II) beschrieben und einlagige Filme aus diesen oberflächenaktiven Komplexen hergestellt. Die Komplexe waren photolumineszent. Wenn die Filme jedoch mit Wasser in Berührung kamen und dann mit Licht bestrahlt wurden, fiel die Photolumineszenz aus. Dies wurde auf die Photohydrolyse der Estergruppen in Gegenwart von Licht zurückgeführt.
  • Wie in den Stammanmeldungen Nr. 858,354 und PCT 87/00987 beschrieben, können zahlreiche relevante Analyten und an relevante Analyten bindende chemische Substanzen durch Amid- oder Aminbindungen auf einfache Weise an Ru- oder Os-haltigen Markern befestigt werden. Die markierten Substanzen sind dann auf viele verschiedene Weisen nachweisbar, wobei Photolumineszenz-, Chemilumineszenz- und Elektrochemilumineszenzmethoden bei weitem am effizientesten, verläßlichsten und sensibelsten sind. Elektrochemilumineszierende Marker einschließlich Ru- und Os-haltige Marker sind besonders vielseitig einsetzbar und vorteilhaft.
  • Die WO 86/02734 beschreibt lumineszente Metallchelate als Marker und Mittel für deren Detektion. Genauer beschreibt die WO 86/02734 elektrochemolumineszente Marker, umfassend Ruthenium und Osmium, worin die Marker an eine chemische, biochemische oder biologische Substanz angeheftet sind. Die markierten Moleküle werden dahingehend beschrieben, daß sie in Verfahren zum Detektieren und Quantifizieren von relevanten Analyten in Bindungstests und kompetitiven Bindungstests nützlich sind.
  • O. A. Salman und H. G. Drickamer (1982), J. Chem. Phys. 77(7), Seiten 3337–3343, beschreiben die Wirkung von Druck und Einfrieren auf die Lumineszenz von Rhenium (I)-Metallkomplexen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt ein lumineszenter Komplex des Re, befähigt zur chemischen, elektrochemischen und/oder elektromagnetischen Anregung in einen lumineszenten Zustand, wenn er sich in Anwesenheit eines interessierenden Analyten befindet, und worin der Komplex, wenn er sich in dem lumineszenten Zustand befindet, elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge im Bereich von 200 nm bis 900 nm emittiert, der Komplex umfassend:
    • – mindestens einen mittels direkter Koordination an Re gebundenen, mehrzähnigen Liganden;
    • – wahlweise mindestens einen mittels direkter Koordination an Re gebundenen einzähnigen Liganden; und
    • – eine Substanz, die entweder über direkte Koordination oder durch kovalente Anbindung an einen Liganden des Komplexes an das Re gebunden ist, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus ganzen Zellen, Viren, subzellulären Teilchen, Proteinen, Lipoproteinen, Glycoproteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Polysacchariden, Lipopolysacchariden, Lipiden, Fettsäuren, Peptiden, pharmazeutischen Mitteln, Tranquilizern, Barbituraten, Alkaloiden, Steroiden, Vitaminen, Aminosäuren, synthetischen Peptiden, synthetischen Nukleinsäuren, synthetischen Membranen, Liposomen, Vesikeln und nicht biologischen Polymeren; und worin die Gesamtzahl an Bindungen an das Re die Koordinationszahl von Re sättigt.
  • Ein erster wichtiger Vorteil der das Metall Rhenium enthaltenden elektrochemilumineszierenden chemischen Einheiten ist deren unkomplizierte Herstellung. Es können sowohl Bipyridyl als auch kein Bipyridyl enthaltende Derivate für die Synthese der Komponenten sowie in der letztendlichen Funktion dieser Komponenten bei der Konjugation eines relevanten Analyten verwendet werden.
  • Ein weiterer wichtiger Vorteil, den die Re(I)-Komplexe im Gegensatz zu den analogen Ru(II)-Komplexen bieten, liegt darin, daß sie es durch die Wahl eines oder mehrerer Substituenten auf den an Re gebundenen Liganden ermöglichen, die Emissionswellenlänge (d. h. die Farbe) für die Re(I)-Komplexe über den Großteil des sichtbaren Spektralbereichs (d. h. 500 bis 800 nm) einzustellen. Die Ursprünge für diese Eigenschaft liegen in den quantenmechanischen Eigenschaften der Komplexe. Die Quantenausbeute dieser Komplexe ist der von Ru(II) ebenfalls überlegen.
  • Die Marker eignen sich für die Verwendung in vielen Nachweis-Verfahren, die unten genauer beschrieben werden.
  • Im allgemeinen wird bei diesen Verfahren (a) unter geeigneten Bedingungen eine Reagenzmischung mit dem Re-haltigen lumineszenten Komplex nach Anspruch 1 hergestellt, (b) der lumineszente Komplex durch den Einfluß chemischer Energie, elektrochemischer Energie oder elektromagnetischer Energie dazu angeregt, elektromagnetische Strahlung auszusenden und (c) die emittierte elektromagnetische Strahlung nachgewiesen und dadurch die Gegenwart des lumineszenten Komplexes bestimmt.
  • Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von relevanten Analyten, die an einen lumineszenten Komplex nach Anspruch 1 binden, sind ebenfalls beschrieben. Das gleiche gilt für Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines relevanten Analyten, bei denen der Analyt und ein lumineszenter Komplex nach Anspruch 1 kompetitiv an ein Komplementärmaterial binden.
  • Die Erfindung beinhaltet ferner ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder der Menge eines relevanten Analyten in einer festgelegten Menge einer flüssigen Multikomponentenprobe, bei dem man (a) eine Probe mit einem Reagenz in Kontakt bringt, das einen lumineszierenden Komplex nach Anspruch 1 enthält, der (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn er dem Einfluß einer Menge an chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Aussendung von Strahlung durch den Komplex bewirkt, und (ii) mit dem relevanten Analyten kombiniert werden kann, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der Analyt und der Komplex aneinander binden; (b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die den Komplex anregen kann, wiederholt Strahlung auszusenden, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß der Komplex induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, und (c) die Menge an ausgesendeter elektromagnetischer Strahlung nachweist oder quantitativ bestimmt, um festzustellen, ob der relevante Analyt in der Probe vorhanden ist.
  • Die Erfindung besteht auch aus einem kompetitiven Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder der Menge eines relevanten Analyten in einer festgelegten Menge einer flüssigen Multikomponentenprobe verwendet werden, bei dem man (a) eine Probe mit einem Reagenz in Kontakt bringt, das einen lumineszierenden Komplex nach Anspruch 1 enthält, wobei die Verbindung (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie dem Einfluß einer Menge an chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Aussendung von Strahlen durch den Komplex bewirkt, und (ii) mit dem relevanten Analyten in Wettbewerb um Bindungsstellen auf dem normalerweise in der Probe nicht vorhandenen Komplementärmaterial treten kann, und mit dem Komplementärmaterial, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der relevante Analyt und der Komplex kompetitiv an das Komplementärmaterial binden; (b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge elektrochemischer Energie aus einer geeigneten Quelle aussetzt, die den Komplex anregen kann, wiederholt Strahlung auszusenden, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß der Komplex induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, und (c) die Menge an so ausgesendeter elektromagnetischer Strahlung nachweist oder quantitativ bestimmt, um festzustellen, ob der relevante Analyt in der Probe vorhanden ist.
  • Die Erfindung besteht auch im Verfahren zum Nachweis und zur Identifikation der Gegenwart oder der Menge einer Vielzahl relevanter Analyten in einem flüssigen Lebensmittel oder einem Lebensmittelhomogenat. Bei diesem Verfahren wird (a) ein Teil eines diagnostischen Reagenzhalters, der sich zum Eintauchen in eine flüssige oder feste Suspension eignet und auf dem eine Vielzahl von lumineszenten Komplexen nach Anspruch 1 immobilisiert ist und zwar so, daß jeder lumineszente Komplex in abgegrenzten und identifizierbaren Bereichen auf dem diagnostischen Reagenzhalter immobilisiert ist und einen Komplex mit einem einzelnen relevanten Analyten bilden kann, um die Bildung von Komplexen aus immobilisiertem lumineszenten Komplex und relevantem Analyten zu ermöglichen, (b) der diagnostische Reagenzhalter aus dem flüssigen Lebensmittel oder Lebensmittelhomogenat entfernt, (c) der diagnostische Reagenzhalter mit einer geeigneten Spüllösung gespült, (d) der Teil des diagnostischen Reagenzhalters, der die Komplexe aus immo bilisiertem lumineszenten Komplex und relevantem Analyten enthält, in eine Nachweislösung getaucht, welche mindestens ein zur Bildung von Komplexen mit den Komplexen aus immobilisiertem lumineszentem Komplex und dem relevanten Analyten fähiges Nachweisreagenz enthält, um so die Bildung von Komplexen aus immobilisiertem lumineszenten Komplex, relevantem Analyten und Nachweisreagenz zu ermöglichen, (e) die Gegenwart eines Komplexes aus immobilisiertem lumineszenten Komplex, relevantem Analyten und Nachweisreagenz auf den identifizierbaren Bereichen des diagnostischen Reagenzhalters nachweist und dadurch die Gegenwart oder die Menge einer Vielzahl von relevanten Analyten in dem flüssigen Lebensmittel oder Lebensmittelhomogenat nachweist und identifiziert.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Darstellung von Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Re-haltigen Komponenten.
  • 2 ist eine Eichkurve, die die Wirkung der Konzentration eines rheniumhaltigen Eichmittels auf die elektrochemilumineszente Intensität eines osmiumhaltigen internen Standards zeigt.
  • 3 ist eine Kurve, die die Wirkung eines osmiumhaltigen internen Standards auf die Elektrochemilumineszenz eines rheniumhaltigen Eichmittels zeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung Neue chemische Komponenten die Re enthalten
  • Die Erfindung besteht aus einem lumineszenten Komplex des Re, wie in Anspruch 1 definiert.
  • Dieser lumineszente Komplex muß mindestens einen polydentaten Liganden des Re aufweisen. Falls der Komplex mehr als einen polydentaten oder mehrzähnigen Liganden aufweist, können die polydentaten Liganden gleich oder verschieden sein. Polydentate oder mehrzähnige Liganden schließen ein Aromaten und aliphatische Liganden. Geeignete aromatische polydentate Liganden schließen aromatische heterozyklische Liganden ein. Bevorzugte aromatische heterozyklische Liganden sind Stickstoff enthaltende Liganden wie beispielsweise Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthroyl und Prophyrine.
  • Geeignete polydentate Liganden können unsubstituiert oder substituiert mit einem aus einer großen Anzahl von Substituenten, die im Stand der Technik bekannt sind, sein. Geeignete Substituenten schließen ein beispielsweise Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, substituiertes Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxy,Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidin, Ureid, Maleimid, Schwefel enthaltende Gruppen, Phosphor enthaltende Gruppen und die Carboxylatester von N-Hydroxysuccinimid.
  • Mindestens ein weiterer mehrzähniger aromatischer heterozyklischer Ligand kann vorhanden sein. Darüber hinaus kann mindestens einer dieser polydentaten aromatischen heterozyklischen Liganden Stickstoff enthalten. Geeignete polydentate Liganden schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthroyl, ein Porphyrin, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl, substituiertes Terpyridyl, substituiertes Phenanthrolyl oder ein substituiertes Porphyrin. Diese substituierten polydentaten Liganden können substituiert sein mit einem Alkyl, substitu iertem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Aralkyl-, substituiertem Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxy, Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidin, Ureid, Maleimid, einer Schwefel enthaltenden Gruppe, einer Phosphor enthaltenden Gruppe oder einem Carboxylatester des N-Hydroxysuccinimids.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung enthält der lumineszente Komplex zwei bidentate Liganden, die jeweils Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthroyl, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl, substituiertes Terpyridyl oder substituiertes Phenanthroyl sein können.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält der lumineszente Komplex drei bidentate Liganden, die jeweils Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthroyl, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl, substituiertes Terpyridyl oder substituiertes Phenanthroyl sein können. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können zwei bidentate Bipyridylliganden und ein substituierter bidentater Bipyridylligand verwendet werden.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält der lumineszente Komplex einen tetradentaten Liganden wie ein Porphyrin oder ein substituiertes Porphyrin.
  • Der lumineszente Komplex kann einen oder mehrere monodentate oder einzähnige Liganden aufweisen, von denen eine breite Vielzahl im Stand der Technik bekannt ist. Geeignete monodentate Liganden schließen ein beispielsweise Kohlenstoffmonoxid, Cyanide, Isocyanide, Halogenide und aliphatische, aromatische und heterozyklische Phosphine, Amine, Stilbine und Arsine.
  • Geeignete Liganden umfassen eine Verbindung der Struktur
    Figure 00190001
    oder
    Figure 00190002
    in der n eine ganze Zahl ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist n 2.
  • Ein weiterer geeigneter Ligand ist eine Verbindung der Struktur
    Figure 00200001
    in der n eine ganze Zahl ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist n 3.
  • Ein weiter Ligand ist eine Verbindung der Struktur
    Figure 00200002
    in der Y ein Verbindungsarm ist. In einer Ausführungsform hat Y die Struktur (CH2)m-NH-CO-(CH2)n,in der m und n ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden und größer oder gleich 1 sein können. In einer Ausführungsform der Erfindung ist m 3 und n 2.
  • Ein weiterer Ligand ist eine Verbindung der Struktur
    Figure 00210001
    in der m und n ganze Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein können. In einer Ausführungsform der Erfindung sind m und n beide 1.
  • Bevorzugte Re-enthaltende Komponenten
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Re-haltige Komponenten können die folgende Formel haben:
    Figure 00210002
    in der X und X' sowie Y und Y' gleich oder verschieden sein können, X und X' N(CH2H5)2, CH3, CH3O, C6H5, Cl, CO2CH3, CN oder NO2 bedeuten und Y und Y' entweder H oder CH3 darstellen können, mit der Maßgabe, daß dann, wenn X und X' sowie Y und Y' gleich sind und X CO2CH3 bedeutet, Y nicht H ist, und daß darüber hinaus dann, wenn X und X' sowie Y und Y' gleich sind, X und Y nicht H sind, und R ein Anion ist. Verbindungen, die besonders vorteilhaft verwendet werden können, sind solche, in denen X und Y die in der nachstehenden Tabelle 1 identifizierte Bedeutung haben. Auch das Herstellungsverfahren, die Ausbeute und 1(CH3CN) sind angegeben. Tabelle 1
    Figure 00220001
  • Spektroskopische Daten werden durch folgende Tabelle dargestellt: Spektroskopische Charakterisierung
    Figure 00230001
    • 1. Anregung bei 355
    • 2. N2-Gas-Laseranregung
    • 3. Diese Verbindungen erwiesen sich nach 15 Minuten Erhitzen in 10 × Sequenzpuffer (0,1 MTris-HCl, gepuffert bei pH 7,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 M NaCl), der 8 mal mit entionisiertem Wasser verdünnt war, als stabil. Andere Verbindungen wurden nicht getestet; man nimmt jedoch an, daß sie sich ähnlich verhalten.
  • Geeignete erfindungsgemäße Verbindungen haben die folgende Struktur:
    Figure 00240001
  • Darin ist n eine ganze Zahl, vorzugsweise 2 oder 3, m ist, 1, 2 oder 3, vorzugsweise 1, W ist CHO, COOH oder NH2, und R ist ein Anion. Die Bypyridylgruppe kann wie vorstehend beschrieben unsubstituiert oder substituiert sein.
  • Eine Verbindung kann
    Figure 00240002
    sein, wobei R ein Anion und n vorzugsweise 2 oder 3 ist.
  • Eine weitere Verbindung kann
    Figure 00250001
    sein, wobei n 2 oder 3 ist.
  • Eine weitere Verbindung kann
    Figure 00250002
    sein, wobei n 2 oder 3 ist.
  • Eine andere Verbindung kann
    Figure 00260001
    sein, wobei n 2 oder 3 sein kann.
  • Diese Verbindungen können einen lumineszenten Komplex nach Anspruch 1 umfassen, mit der Struktur X-(Y)n-Z in der X ein oder mehrere Nucleotide, die gleich oder verschieden sein können, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, einen Antikörper, einen relevanten Analyten oder ein Analog eines relevanten Analyten bedeutet, Y eine an Z angefügte Verkettungsgruppe darstellt, n eine ganze Zahl bedeutet und Z einen rheniumhaltigen Komplex bedeutet. X kann beispielsweise Theophyllin, Digoxigenin oder ein von hCG abgeleitetes Peptid sein.
  • Erfindungsgemäß wird ebenfalls bereitgestellt ein lumineszenter Komplex nach Anspruch 1 mit der Struktur X-CH=CH-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-(CH2)m,-Z worin
    X ein oder mehrere Nucleotide darstellt, die gleich oder verschieden sein können,
    Z die Re-Liganden-Komponente darstellt, n eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist und m eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist Z Bis-(2,2'bipyridin)-[4-(butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]-rhenium.
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist X eine Nucleotidsequenz, in der ein Thymidinnucleotid, bei dem es sich um ein 3' endständiges Nucleotid handelt, das an die Nucleotidsequenz
    TCACCAATAAACOGCAAACACCATCCOGTCCTGCCAG
    angefügt ist. (Diese Ausführungsform ist in Bsp. XIX veranschaulicht).
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein lumineszenter Komplex nach Anspruch 1, umfassend die Struktur [T-Y-Z]1+ (R) in der T Theophyllin darstellt, Y eine Linkergruppe, angeheftet an Z, darstellt, Z bis-(2,2'-Bipyridin)[4-methyl-2,2'bipyridin-4'-yl] (I) bedeutet und R ein Anion darstellt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist Y an den Kohlenstoff in Position 8 von T angeheftet. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung hat Y die Struktur: (CH2)m-CO-NH- (CH2)n worin m und n eine ganze Zahl darstellen, die gleich oder verschieden sein kann und größer oder gleich 1 ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist m 3 und n 4. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind m und n beide 3.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung hat Y die Struktur:
    Figure 00280001
    worin m, n und r eine ganze Zahl darstellen, die gleich oder verschieden sein kann und größer oder gleich 1 ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist m 1, n 1 und ist r 4.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist Y an den Stickstoff in Position 7 von T angeheftet. In einer Ausführungsform der Erfindung, hat Y die Struktur (CH2)n worin n eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist n gleich 4.
  • Ebenfalls umfaßt in der Erfindung ist ein lumineszenter Komplex nach Anspruch 1, mit der Struktur X-Z worin X eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, umfassend mindestens eine Aminosäure, bei der es sich um Cystein oder Methionin handelt, und Z bis-(2,2'-Bipyridin)maleimidohexansäure-4-methyl-2,2'bipyridin-4'-butylamidrhenium ist, angeheftet an den Kohlenstoff in Position 3 oder 4 des Maleimids, an einen Schwefelsubstituenten des Cysteins oder Methionins.
  • Es liegt im Bereich der Erfindung, daß eine oder mehrere der Liganden des Re an weitere chemische Marker angeheftet sind, wie beispielsweise radioaktive Isotope, fluoreszente Komponenten oder weitere lumineszente, Ruthenium enthaltende oder Osmium enthaltende Zentren.
  • Es liegt ebenfalls im Bereich dieser Erfindung, daß die markierte Substanz (B) aus Anspruch 1 durch mehr als eine, beispielsweise 2, 3, 4 oder mehr elektrochemolumineszente Zentren markiert wird.
  • Geeignete Substanzen (B) umfassen viele biologische Substanzen, z. B. ganze Zellen, Viren, subzelluläre Teilchen, Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Peptide, Nucleinsäuren, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, pharmakologische Wirkstoffe, Beruhigungsmittel, Barbiturate, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren und Zucker. Ganze Zellen können tierischer, pflanzlicher oder bakterieller Art und entweder lebensfähig oder abgestorben sein. Beispiele sind unter anderem auf Pflanzen pathogen wirkende Substanzen wie Pilze oder Nematoden. In dieser Anmeldung bedeutet der Begriff "subzelluläre Teilchen" subzelluläre Organellen, Membranteilchen wie von geplatzten Zellen, Fragmente von Zellwänden, Ribosomen, Multienzymkomplexe und andere Teilchen, die von lebenden Organismen stammen können. Außerdem bedeuten in dieser Anmeldung "Nucleinsäuren" chromosomale DNS, Plasmid-DNS, virale DNS und rekombinante DNS, die aus mehreren Quellen abgeleitet ist. Nucleinsäuren beinhalten auch RNS, z. B. Boten-RNS, Ribosomen-RNS und Transfer-RNS.
  • Zu den Polypeptiden gehören z. B. Enzyme, Transportproteine, Rezeptorproteine und strukturelle Proteine wie Proteinhüllen von Viren. Bevorzugte Polypeptide sind Enzyme und von Serum abgeleitete Antikörper. Besonders bevorzugte Polypeptide sind monoklonale Antikörper. Zu den Hormonen gehören z. B. Insulin und T4-Schilddrüsenhormon. Pharmakologische Wirkstoffe umfassen z. B. Herzglykoside. In den Rahmen der Erfindung gehören auch synthetische Substanzen, die biologischen Substanzen chemisch ähnlich sind, wie z. B. synthetische Peptide, synthetische Nucleinsäuren und synthetische Membranen, Vesikel und Liposomen. Die vorstehende Liste erhebt keinen Anspruch darauf, alle biologischen Substanzen zu enthalten, die sich zur Verwendung in dieser Erfindung eignen, sondern soll lediglich den weiten Rahmen der Erfindung veranschaulichen.
  • Die Erfindung umfaßt auch markierte nichtbiologische Substanzen, darunter auch polymere Materialien. Diese Substanzen können in Form löslicher polymerer Moleküle oder in einer der Vielzahl von bekannten makroskopischen Formen vorliegen, z. B. als Perlen oder Behälter wie Teströhrchen, Flaschen, Versuchsbehälter o. ä.
  • Biologische und nichtbiologische Substanzen (B) können an einen Liganden von Re konjugiert werden, wo eine solche Konjugation durch Amid- oder Aminbindungen erfolgt. Die Bindungen können so orientiert sein, daß das Material (B) direkt an die Carbonyl- oder Stickstoffgruppe der Amidbindung gebunden werden kann. Diese chemischen Verbindungen können ionisiert sein. Wenn dies der Fall ist, ist für Fachleute selbstverständlich, daß viele verschiedene Gegenionen dazu dienen, die Ladung der Verbindungen zu neutralisieren. Geeignete Kationen sind z. B. H+; NH4 +, Guanidinium, Ag+, Li+, Na+, K+, Mg2+, Mn2+ und Cd2+. Geeignete Anionen sind beispielsweise Halogenide, OH-, Carbonat, SO4 2–, Hexafluorphosphat und Tetrafluorborat.
  • Vorteile Re-haltiger Marker
  • Ein wichtiger Vorteil der elektrochemilumineszierenden chemischen Einheiten, die das Metall Rhenium enthalten, ist ihre einfache Herstellung. Für die Synthese der Marker sowie in ihrer letztendlichen Funktion bei der Kunjugation eines relevanten Analyten können sowohl Bipyridyl als auch Derivate ohne Bipyridyl verwendet werden.
  • Die Rheniumkomponenten können im Gegensatz zu den Osmium- und Rutheniumkomplexen, die 3, 4, oder 5 Schritte erfordern, in 2-Schritt-Verfahren synthetisiert werden. 1 beschreibt schematisch die beiden Verfahrensschritte, mit denen die erfindungsgemäßen Re-haltigen Komponenten der Erfindung hergestellt werden.
  • Wie 1 zeigt, ist das Ausgangsmaterial für die Herstellung der lumineszierenden Re(I)-Komplexe Re(CO)5Cl. Die Synthese der erwünschten Re(I)-Spezies erfolgt in zwei Schritten. Im ersten Schritt erzeugt die Substitution von CO durch einen chelatbildenden 2,2'-Bipyridinliganden das fazielle Isomer, fac-(L)Re(CO)3Cl. L ist ein chelatbildender 2,2'-Bipyridinligand, z. B. bpy, Cl2bpy, (CO2CH3)2bpy, (NO2)2bpy, Me2bpy, Ph2bpy, (CH3O)2bpy, Me4bpy, oder (NEt2)2bpy.
  • Die Umwandlung von fac-(L)Re(CO)3 zum entsprechenden fac-(L)Re(CO)3(Etpy)(RK) (wo R CF3CO3 –, PF6 –, Clo4 – ist) erfolgt entweder durch ein Säure- oder ein Silberverfahren.
  • Das Säureverfahren eignet sich für Bipyridylliganden, die gegenüber stark sauren Medien unempfindlich, also stabil sind. Dabei wird zuerst als Zwischenprodukt die Re(I)-Triflat-Spezies hergestellt und isoliert und dann zum 4-Pyridylethanderivat umgewandelt.
  • Das Silberverfahren wird für Komplexe verwendet, bei denen sich die Bipyridylliganden in einem stark sauren Umfeld zersetzen können, z. B. L = (CH3O)2bpy oder (COOCH3)2bpy. Bei diesem Verfahren wird ein lösliches Silbertrifluormethansulfonatsalz mit der fac-(L)Re(CO)3Cl-Spezies zur Umsetzung gebracht, um die fac(L)Re(CO)3-(O3SCF3)-Komponente und unlösliches AgCl zu bilden. Nach der Entfernung des AgCl-Niederschlags durch Filtration wird die Lösung in situ mit 4-Pyridylethan zur Umsetzung gebracht, um das erwünschte Produkt herzustellen.
  • Ein weiterer wichtiger Vorteil, den die hier beschriebenen Re(I)-Komplexe im Vergleich mit den analogen Ru(II)-Komplexen bieten, betrifft ihre Fähigkeit, die Emissionswellenlänge (d. h. die Farbe) für die Re(I)-Komplexe über den größten Teil des sichtbaren Spektralbereichs (d. h. 500 bis 800 nm) einzustellen. Die Ursprünge für diese Eigenschaft liegen in den quantenmechanischen Eigenschaften des Lichtemissionsprozesses für die Komplexe.
  • Eine quantenmechanische Analyse des Lumineszenzprozesses für Ru(II)-Komplexe ergibt, daß (1) mit wenigen Ausnahmen die Beobachtung der Lumineszenz in flüssigen Lösungen bei Raumtemperatur die Koordination drei chelatbildender Liganden vom Bipyridyl- oder Phenanthroyltyp an den Ru(II)-Komplex erfordert; (2) die Quantenzu stände bei Energiewerten nahe dem Emissionszustand die durch Ru(II)-Komplexe bereitgestellte Lumineszenzintensität einschränken; (3) die Substitution von Gruppen auf den chelatbildenden Bipyridyl- oder Phenanthroylliganden nur begrenzte Veränderungen in der Emissionsenergie der Ru(II)-Komplexe bewirkt und (4) die Lumineszenzeffizienz im allgemeinen abnimmt, wenn die maximale Emissionswellenlänge für die Ru(II)-Komplexe steigt. Diese Faktoren begrenzen den nutzbaren Wellenlängenbereich auf 580 bis 750 nm bei Raumtemperatur in flüssiger Lösung.
  • Eine ähnliche Analyse des Emissionsprozesses für Rheniumkomplexe ergibt, daß (1) die Emission aus flüssigen Lösungen bei Raumtemperatur nur die Anwesenheit eines koordinierenden Bipyridyl- oder Phenanthroylliganden im Re(I)-Zentrum erfordert. Obwohl auch 3 CO-Liganden benötigt werden, ist man in der Wahl des endgültigen koordinierenden Monodentatliganden (z. B. Cl, Pyridyn, CH3CN usw.) relativ frei. Das Maximum der Emissionswellenlänge wird durch die Identität dieses Monodentatliganden und das Substitutionsmuster an der chelatbildenden Bipyridyl- oder Phenantroylkomponente gesteuert. Dies führt dazu, daß im Vergleich mit der Ru(II)-Spezies für diese Komplexe ein größerer Bereich für die Emissionswellenlänge zur Verfügung steht.
  • Es gibt keine Quantenzustände mit Energien nahe dem Emissionszustand, die die Emission in den Re(I)-Komplexen hemmen könnten. Im Gegensatz dazu sinkt bei den Ru(II)-Komplexen die Emissionseffizienz im allgemeinen, wenn die Wellenlänge des Emissionsmaximums zunimmt.
  • Somit liegt der nutzbare Wellenlängenbereich der Emission für die Re(I)-Komplexe bei ungefähr 500 bis 800 nm. Die leichte Zunahme in der Rotantwort für die Re(I)-Komplexe im Vergleich mit Ru(II)-Komplexen ist hauptsächlich auf die etwas gestiegene Breite der Re(I)-Emissionsspektren im Vergleich mit den Ru(II)-Emissionsspektren zurückzuführen.
  • Somit weisen die Re(I)-Komplexe im Vergleich mit den Ru(II)-Verbindungen einen erhöhten Bereich zugänglicher Emissionswellenlängen auf. Die einzigartige Struktur der Re(I)-Komplexe ermöglicht auch eine größere Flexibilität und Einfachheit bei der Wahl der erwünschten maximalen Emissionswellenlänge durch die strukturelle Modifikation des Komplexes als mit den Ru(II)-Komplexen möglich ist. Der größere Bereich der zur Verfügung stehenden Wellenlängen für Re(I) im Vergleich zu Ru(II) macht es möglich, die Emission aus einem Re(I)-Komplex in einer. Lösung mit verschiedenen lumineszierenden Re(I)-Spezies mit minimalen Störungen oder Irrtümer durch konkurrierende lumineszierende Re(I)-Substanzen zu messen.
  • Verbesserte Untersuchungen bei Verwendung Re-haltiger Einheiten
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines lumineszenten Komplexes nach Anspruch 1. Bei diesen Verfahren wird (a) unter geeigneten Bedingungen eine Reagenzmischung mit dem Re-haltigen lumineszenten Komplex hergestellt, (b) der lumineszente Komplex zur Aussendung elektromagnetischer Strahlung angeregt, indem man die Reagenzmischung dem Einfluß chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aussetzt und (c) die ausgesendete elektromagnetische Strahlung bestimmt und dadurch die Gegenwart des lumineszenten Komplexes und somit auch der chemischen Substanz nachweist.
  • Geeignete Bedingungen zur Herstellung der Reagenzmischung sind Fachleuten bekannt und hängen vom Typ der jeweiligen Reagenzmischung ab. Beispielsweise können die geeigneten Bedingungen für eine wäßrige Reagenzmischung geeignete Konzentrationen an Liganden und anderen Reagenzien wie z. B. Oxidationsmittel, sowie Mittel zur Anpassung des pH und der Salzkonzentration beinhalten. Für eine feste Probe können geeignete Bedingungen für die Herstellung einer Reagenzmischung auch bedeuten, daß eine leitfähige Flüssigkeit zugegeben wird.
  • Zu den Verfahren der Erfindung können auch Methoden zum Nachweis eines lumineszenten Komplexes nach Anspruch 1 gehören, in denen der lumineszente Komplex an eine Substanz bindet. Geeignete Substanzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Zellen, Viren, subzelluläre Teilchen, Nucleinsäuren, Polysaccharide, Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Lipide, Fettsäuren, Peptide, Hormone, pharmakologische Wirkstoffe, Beruhigungsmittel, Barbiturate, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren, Zucker oder nichtbiologische Polymere. In einer Ausführungsform kann die Substanz auf der Oberfläche eines Versuchsgefäßes immobilisiert werden. Die Substanz kann in einer anderen Ausführungsform ein von einem Serum abgeleiteter Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper sein. Von besonderem Interesse sind Antikörper-Antigen-Materialpaare. Dieses Bindeverfahren kann dazu verwendet werden, die Gegenwart markierter Antigene wie z. B. Dioxin oder Digitoxin in komplexen Mischungen wie Blut, Urin oder synthetischen Reaktionsmischungen nachzuweisen, indem man die Mischung zuerst dem Einfluß von immobilisierten, für das relevante Antigen spezifischen Antikörpern aussetzt und dann die Menge an markiertem Material mißt, die an die immobilisierten Antikörper gebunden hat.
  • Die Erfindung umfaßt auch Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart von relevanten Analyten, die an den lumineszenten Komplex nach Anspruch 1 binden. Bei diesem Verfahren wird (a) unter geeigneten Bedingungen eine Reagenzmischung hergestellt, die den lumineszenten Komplex enthält; (b) der lumineszente Komplex zur Aussendung elektromagnetischer Strahlung angeregt, indem man die Reagenzmischung dem Einfluß chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aussetzt, und (c) die ausgesendete elektromagnetische Strahlung nachgewiesen und dadurch die Gegenwart des relevanten Analyten bestimmt.
  • Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines relevanten Analyten, bei denen der Analyt und ein lumineszenter Komplex nach Anspruch 1 kompetitiv an ein Komplementärmaterial binden. Mit "Komplementärmaterial" ist jede Substanz gemeint, die sowohl mit dem relevanten Analyten als auch einem markierten relevanten Analyten und einem markierten Analog des relevanten Analyten Komplexe bilden kann. Bei diesem Verfahren wird: (a) das Komplementärmaterial, der 1umineszente Komplex und der Analyt unter geeigneten Bedingungen miteinander in Kontakt gebracht, um eine Reagenzmischung herzustellen; (b) der lumineszente Komplex zur Aussendung elektromagnetischer Strahlung angeregt, indem man die Reagenzmischung dem Einfluß chemischer, elektrochemische oder elektromagnetischer Energie aussetzt, und (c) die ausgesendete elektromagnetische Strahlung und dadurch der relevante Analyt nachgewiesen.
  • Der Ausdruck "zur Aussendung elektromagnetischer Strahlung anregen" bedeutet, daß man eine Komponente in einen Zustand anregt, so daß sie bei Umgebungstemperaturen bei Wellenlängen zwischen 200 und 900 nm luminesziert. Abwandlungen in der chemischen Struktur der Liganden können den Wert der Energiezufuhr verändern, die zur Herbeiführung des lumineszierenden angeregten Zustandes erforderlich ist. Ähnlich hängt die Wellenlänge der ausgesendeten elektromagnetischen Strahlung von der Beschaffenheit und dem Umfeld des rheniumhaltigen Materials ab.
  • Im allgemeinen tritt die Anregung und Ausstrahlung von Photolumineszenz durch elektromagnetische Strahlung zwischen etwa 200 und etwa 900 nm Wellenlänge ein.
  • Ähnlich kommt es im allgemeinen zu chemilumineszierender und elektrochmemilumineszierender Ausstrahlung, wenn die ausgesendete elektromagnetische Strahlung zwischen etwa 200 und etwa 900 nm Wellenlänge liegt. Die Spannung, bei der es zur Reduktion oder Oxidation des lumineszenten Komplexes kommt, hängt von dessen genauer chemischer Struktur sowie Faktoren wie dem pH der Lösung und der Beschaffenheit der verwendeten Elektrode ab. Es ist allgemein bekannt, wie man die optimale Emission und die Anregungswellenlängen in einem photolumineszierenden System sowie die optimale Spannung und Emissionswellenlänge eines elektrochemilumineszierenden und chemilumineszierenden Systems bestimmt.
  • Es gibt viele Verfahren zur Quantifizierung der vorhandenen lumineszierenden Spezies. Die Geschwindigkeit der Energiezufuhr in ein System kann ein Maß der lumineszierenden Spezies zur Verfügung stellen. Geeignete Messungen sind unter anderem z. B. Messungen des elektrischen Stroms, wenn die lumineszierende Spezies elektrochemisch erzeugt wird, die Geschwindigkeit der Verwendung von Reduktions- oder Oxidationsmitteln bei einer chemischen Erzeugung der lumineszierenden Spezies oder die Absorption von elektromagnetischer Energie in photolumineszierenden Techniken. Außerdem kann die lumineszierende Spezies durch Messen der ausgesendeten elektromagnetischen Strahlung nachgewiesen werden. Alle diese Messungen können entweder kontinuierlich, auf Geschwindigkeitsbasis oder als kumulatives Verfahren durchgeführt werden, bei dem das Signal über einen längeren Zeitraum addiert wird. Messungen auf Geschwindigkeitsbasis können mit Photomultiplier-Röhren, Photodioden oder Phototransistoren durchgeführt werden, um elektrische Ströme zu erzeugen, deren Stärke proportional zur Intensität des einfallenden Lichts ist. Man kann auch ladungsgekoppelte Vorrichtungen verwenden. Beispiele für kumulative Verfahren sind die Integration von Daten auf Geschwindigkeitsbasis sowie der Einsatz photographischer Filme, um die kumulativen Daten direkt zur Verfügung zu stellen.
  • Alle diese Verfahren auf Lumineszenzbasis beinhalten eine wiederholte Lumineszenz durch die rheniumhaltige Verbindung. Die Wiederholbarkeit des nachweisbaren Ereignisses unterscheidet diese Marker von radioaktiven Isotopen oder gebundenen chemilumineszierenden Molekülen wie Luminol. Letztere Marker erzeugen nur einmal pro Molekül (oder Atom) des Markers ein nachweisbares Ereignis, weshalb ihre Nachweisbarkeit auch eingeschränkt ist.
  • In den für diese Verfahren nützlichen lumineszenten Komplexen können biologische und nichtbiologische Substanzen (B) durch Koordination direkt mit Re oder durch Anfügen an einen Liganden von Re an die Einheiten gebunden werden. Das Anfügen kann durch kovalentes Binden, durch elektrostatisches Binden oder eine Wasserstoffbindung erfolgen. Es stehen viele verschiedene Mittel zur Herstellung kovalenter Bindungen der Substanzen an Re-Liganden zur Verfügung. Die Verkettung kann z. B. durch eine Amid- oder Aminbindung, einen Ester, Thioester, Thioether oder ein beliebiges der vielen anderen in der Technik bekannten Verkettungsverfahren erfolgen. Der Verkettungstyp wird durch die Substituenten des Liganden und die geeigneten chemischen Gruppen bestimmt, die zur Verbindung mit dem Liganden auf der zu markierenden Substanz zur Verfügung stehen.
  • Bei dem relevanten Analyten und dem lumineszenten Komplex kann es sich um jedes Paar Substanzen handeln, die auf spezifische Weise aneinander binden können, relevante Substanzen sind beispielsweise ganze Zellen, Viren, subzelluläre Teilchen, Nucleinsäuren, Polysaccharide, Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine, Lipopnlysaccharide, Lipide, Fettsäuren, Peptide, Hormone, pharmakologische Wirkstoffe, Beruhigungsmittel, Barbiturate, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren, Zucker und nichtbiologische Polymere. Von besonderem Interesse sind Antikörper-Antigen-Paare. Eine Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung markierter Antikörper zur Verfügung, um die Gegenwart von Antigenen der Zelloberfläche nachzuweisen oder bestimmte Zellen für den Nachweis durch Zellsortierverfahren zu markieren.
  • Antigene, die beispielsweise durch Anfügen an immobilisierte unmarkierte Antikörper immobilisiert worden sind, können mit einer allgemein als "Sandwich"-Verfahren bekannten Methode durch markierte Antikörper nachgewiesen werden.
  • In einer Ausführungsform ist B ein Nucleotid oder Polynucleo tid. In einer anderen Ausführungsform ist B ein von einem Serum abgeleiteter Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper.
  • In kompetitiven Bindeversuchen kann die Verbindung B die gleiche Substanz wie der relevante Analyt oder ein Analog des Analyten sein und besitzt die Fähigkeit, bei der Herstellung eines spezifischen Komplexes mit einem Komplementärmaterial mitzuwirken. Solche Analyten und Komplementärmaterialien umfassen ganze Zellen, Viren, subzelluläre Teilchen, Nucleinsäuren, Polysaccharide, Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Lipide, Fettsäuren, Peptide,
  • Hormone, pharmakologische Wirkstoffe, Beruhigungsmittel, Barbiturate, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren, Zucker und nichtbiologische Polymere. Beispiele für solche Analyten und Komplementärsubstanzen sind unter anderem Insulin, Digoxin, Digitoxin, T4-Schilddrüsenhormon, Pilze oder Nematoden, ein von einem Serum abgeleiteter Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper, ein DNS-Fragment oder ein RNS-Fragment. Von besonderem Interesse sind Verfahren auf der Basis von Antikörper-Antigen. Diese Verfahren sind analog zu dem in der Technik allgemein bekannten Radioimmuntest und können im Prinzip vorteilhaft eingesetzt werden, indem man anstelle der radioaktiv markierten Verbindungen erfindungsgemäße Marker verwendet.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin heterogene und homogene Bindungsverfahren, welche die hierin bereitgestellten lumineszenten Komplexe nutzen. In heterogenen Bindungsverfahren muß die gebundene markierte Substanz physikalisch von der ungebundenen markierten Substanz getrennt werden, ehe man die Messung auf die Gegenwart einer Markierung vornimmt. In Antikörper-Antigen-Systemen erreicht man das oft dadurch, daß man eine Komponente, z. B. den Antikörper, immobilisiert, indem man ihn an eine unlösliche Matrix wie einen Filter, die Oberfläche von Perlen oder Reaktionsgefäße wie Teströhrchen anfügt. Die antigenhaltige Lösung wird durch den Filter oder in das Reaktionsgefäß gegossen und dann vom Filter oder den Seiten des Reaktionsgefäßes abgewaschen. Nur Antigen, das spezifisch an Antikörper gebunden ist, wird zurückbleiben und nachgewiesen werden können.
  • In homogenen Verfahren sind dagegen das gebundene und das ungebundene markierte Material in der gleichen Reaktionsmischung vorhanden, wenn die Anwesenheit des Markers gemessen wird. Dies ist dann möglich, wenn das Binden die Eigenschaften des aus dem Marker nachweisbaren Signals verändert. Es gibt viele Möglichkeiten, lumineszierende Marker in homogenen Systemen einzusetzen. Beispielsweise kann das Binden des Analyten an den lumineszenten Komplex das von dem Marker nachweisbare Signal direkt beeinflussen. Außerdem kann ein Lumineszenzquencher auf einem Antikörper positioniert werden, so daß das Binden eines markierten Antigens an den Antikörper zur Unterdrückung der Lumineszenz des Markers durch den Lumineszenzquencher auf dem Antikörper führt. In der Technik sind viele homogene Verfahren für lumineszierende Marker bekannt; über einige davon schreiben Boguslaski und Li in "Homogeneous Immunoassays" in Applied Biochemistry and Biotechnology, 7: 401–414 (1982).
  • In einer Ausführungsform ist der Analyt auf einer unlöslichen Matrix fixiert. Ein solches Verfahren kann als "Sandwichtest" durchgeführt werden, d. h. der lumineszente Komplex bindet an den immobilisierten Analyten und ungebundener lumineszenter Komplex wird von der Matrix abgespült. In einer weiteren Ausführungsform wird der lumineszente Komplex auf einer unlöslichen Matrix fixiert und ist der Analyt eine Komponente einer biologischen Flüssigkeit oder einer Reaktionsmischung. Das Komplementärmaterial kann auch an einer unlöslichen Matrix befestigt sein. Sowohl in den heterogenen als auch den homogenen kompetitiven erfindungsgemäßen Verfahren kann das Komplementärmaterial ein monoklonaler Antikörper und die unlösliche Matrix die Oberfläche eines Versuchsgefäßes sein.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können dadurch durchgeführt werden, daß man die Reaktionsmischung dem Einfluß chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aussetzt. Man kann die Reagenzmischung auch dem Einfluß einer Kombination aus chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aussetzen.
  • Die chemische Einheit kann dadurch oxidiert werden, daß man sie dem Einfluß einer Energiequelle aussetzt. Eine solche Quelle ist ein chemisches Oxidationsmittel. Beispiele für solche Oxidationsmittel sind unter anderem Ce(IV)-Salze oder PbO2. Die chemische Einheit kann durch den Einfluß einer Energiequelle auch reduziert werden. Eine solche Energiequelle kann ein chemisches Reduktionsmittel sein. Ein Beispiel für ein geeignetes Reduktionsmittel ist Magnesium. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die mehr als einmalige Anregung zur Emission elektromagnetischer Strahlung.
  • Die Reagenzmischung kann Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Tartrat, Citrat oder Peroxydisulfat enthalten. Darüber hinaus kann der lumineszente Komplex dadurch reduziert werden, daß man ihn dem Einfluß einer Energiequelle aussetzt, und die Reaktionsmischung kann Peroxydisulfat enthalten. Darüber hinaus kann der lumineszente Komplex dadurch reduziert werden, daß man ihn dem Einfluß einer Energiequelle aussetzt, und die Reagenzmischung kann Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Citrat oder Tartrat enthalten.
  • Nachweisverfahren für den lumineszenten Komplex werden bereitgestellt, in denen man die Reagenzmischung kontinuierlich dem Einfluß einer Elektrode aussetzt, deren Spannung zwischen einem für die Reduktion des lumineszenten Komplexes ausreichenden Wert und einem für die Oxidation desselben ausreichenden Wert oszilliert.
  • Der lumineszente Komplex kann dadurch oxidiert werden, daß man ihn dem Einfluß einer Elektrode aussetzt, deren Spannung oberhalb und unterhalb eines Wertes schwankt, der zur Oxidation des lumineszenten Komplexes ausreicht, und die Reagenzmischung kann Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Citrat, Tartrat oder Peroxydisulfat enthalten. Der lumineszente Komplex kann auch dadurch oxidiert werden, daß man ihn dem Einfluß einer Energiequelle aussetzt, und die Reagenzmischung kann Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Citrat oder Tartrat enthalten.
  • Der lumineszente Komplex kann auch dadurch reduziert werden, daß man ihn dem Einfluß einer Elektrode aussetzt, deren Spannung oberhalb und unterhalb eines Wertes schwankt, der zu seiner Reduktion ausreicht, wobei die Reagenzmischung Peroxydisulfat enthält. Eine solche Reagenzmischung kann außerdem Acetonitril enthalten. Darüber hinaus kann der lumineszente Komplex durch den Einfluß einer Elektrode reduziert werden, deren Spannung konstant ist und zur Reduktion des Markers ausreicht, wobei die Reagenzmischung Peroxydisulfat enthält. Eine solche Reagenzmischung kann auch Acetonitril enthalten.
  • Wenn der lumineszente Komplex dem Einfluß elektrochemischer oder chemischer Energie ausgesetzt wird, läßt sich die ausgesendete elektromagnetische Strahlung kontinuierlich nachweisen. Solche elektromagnetische Strahlung läßt sich durch Augenschein oder eine Photodiode detektieren. Darüber hinaus kann die ausgesendete Strahlung in Fällen, wo der lumineszente Komplex dem Einfluß elektrochemischer oder chemischer Energie ausgesetzt wird, kumulativ detektiert werden, z. B. mit einem photographischen Film.
  • Die Erfindung umfaßt Systeme zur Detektion der Anwesenheit oder zum Messen der Quantität eines lumineszenten Komplexes gemäß Anspruch 1. Das System umfaßt: (a) eine Reagenzmischung, umfassend den lumineszenten Komplex; (b) Mittel zum Induzieren bzw. Anregen des lumineszenten Komplexes, damit dieser elektromagnetische Strahlung emittiert; und (c) Mittel zum Detektieren der emittierten elektromagnetischen Strahlung.
  • Die Erfindung umfaßt auch Systeme zum Detektieren der Anwesenheit oder zum Messen der Menge eines relevanten Analyten, der an einen lumineszenten Komplex nach Anspruch 1 bindet.
  • Das System umfaßt: (a) den lumineszenten Komplex; (b) ein Mittel zum In-Kontakt-Bringen des lumineszenten Komplexes mit dem relevanten Analyten, um eine Reagenzmischung zu bilden; (c) Mittel zum Induzieren des lumineszenten Komplexes, damit dieser elektromagnetische Strahlung emittiert; und (d) Mittel zum Detektieren der emittierten elektromagnetischen Strahlung.
  • Die Erfindung stellt eine einzigartige und besonders nützliche Klasse von homogenen Bindungstests zur Verfügung. Wie vorstehend beschrieben, können diese Marker elektrochemisch gemessen werden, indem man eine Lösung der markierten relevanten Substanz dem Einfluß einer Elektrode aussetzt. Eine markierte Substanz, die in der Lösung vorhanden ist, jedoch nicht an die Oberfläche der Elektrode gelangen kann, wird nicht nachgewiesen. Dies kann beispielsweise dann vorkommen, wenn die markierte Substanz direkt oder indirekt an die Oberfläche des Reaktionsgefäßes gebunden ist, in das man die Elektrode legt, oder dann, wenn der Marker tief im Inneren des spezifischen Komplexes eingebettet ist, wie z. B. in einem Antigen-Antikörper-Komplex, oder wenn die Elektrode selbst mit einer Schicht beschichtet ist, die von markierten, nicht jedoch von in einem Komplex befindlichen markierten Substanzen durchdrungen werden kann. Außerdem sollte es möglich sein, die Oberfläche einer Elektrode mit Antikörpern zu beschichten, so daß nur an die immobilisierten Antikörper gebundenes markiertes Antigen Zugang zur Elektrode erhalten und damit nachgewiesen werden kann. Dieses spezielle homogene Verfahren kann am effektivsten sein, wenn die erforderliche Elektrodenspannung in kurzen Stößen angelegt wird.
  • Die erfindungsgemäßen Marker können durch eine Kombination von Methoden nachgewiesen werden. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, die Gesamtmenge an markierter Substanz durch eine Methode zu messen, die nicht zwischen gebundener und ungebundener markierter Substanz unterscheidet, wie z. B. Photolumineszenz oder Chemilumineszenz, und die Menge an gebundener markierter Substanz durch eine Methode zu bestimmen, die zwischen gebundener und ungebundener markierter Substanz unterscheidet, wie z. B. Elektrochemilumineszenz. Eine solche Kombination von Verfahren könnte bei der gleichen Probe angewendet werden und dabei eine bessere Informationsquelle über die Probe darstellen als jedes einzeln verwendete Verfahren. Innerhalb der Erfindung können in gleichen Reaktionsmischungen zwei oder mehr unterschiedlich markierte Verbindungen nachgewiesen werden. Dies ist entweder dann möglich, wenn die Marker elektromagnetische Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen aussenden oder wenn die Marker dazu angeregt werden können, elektromagnetische Strahlung auszusenden, indem man sie dem Einfluß von Energie mit verschiedenen Werten oder aus verschiedenen Quellen aussetzt.
  • Testverfahren
  • Die Erfindung liegt auch im verbesserten Verfahren, in einem festgelegten Volumen einer flüssigen Multikomponentenprobe einen relevanten Analyten bei einer Konzentration von weniger als etwa 10–3 Molar nachzuweisen. Dabei wird (a) eine Probe mit einem einen lumineszenten Komplex enthaltenden Reagenz in Kontakt gebracht, der bzw. das (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn sie dem Einfluß einer Menge an chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Aussendung von Strahlung durch den lumineszenten Komplex bewirkt, und (ii) mit dem relevanten Analyten kombiniert werden kann, wobei der Kontakt unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß sich der Analyt und der lumineszente Komplex aneinander binden; (b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt, die den lumineszenten Komplex anregen kann, wiederholt Strahlung auszusenden, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß der lumineszente Komplex induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, und (c) die emittierte elektromagnetische Strahlung detektiert wird, um festzustellen, ob der relevante Analyt in der Probe vorhanden ist.
  • Der Begriff "Molar" bedeutet die Konzentration eines Analyten in Lösung in Mol pro Liter oder die Menge an teilchenförmiger Materie, die in einer flüssigen Probe in Teilchen oder Einheiten pro Liter vorhanden ist. Beispielsweise kann der Wert 1 × 1023 Teilchen pro Liter als 1 Molar ausgedrückt werden.
  • Die Verfahren können als heterogene Tests durchgeführt werden, d. h. Verfahren, in denen ungebundenes markiertes Reagenz von gebundenem markiertem Reagenz getrennt wird, ehe man das gebundene markierte Reagenz dem Einfluß elektrochemischer Energie aussetzt. Möglich sind auch homogene Tests, in denen ungebundenes markiertes Reagenz und gebundenes markiertes Reagenz zusammen dem Einfluß elektrochemischer Energie ausgesetzt werden. In homogene Tests der Erfindung kann man die vom gebundenen markierten Reagenz ausgesendete elektromagnetische Strahlung von der vom ungebundenen markierten Reagenz ausgesendeten Strahlung unterscheiden, und zwar als Zunahme oder Abnahme in der Menge an vom gebundenen markierten Reagenz im Vergleich mit dem ungebundenen markierten Reagenz ausgesendeten Strahlung oder als elektromagnetische Strahlung mit einer anderen Wellenlänge.
  • Dementsprechend kann in einer Ausführungsform jeder lumineszente Komplex, der nicht mit dem relevanten Analyten verbunden ist, von der Probe abgetrennt werden, die vor dem Einfluß elektrochemischer Energie mit dem lumineszenten Komplex in Kontakt gebracht wurde. In einer Alternative wird die Probe vor dem Kontakt mit dem lumineszenten Komplex behandelt, um den relevanten Analyten zu immobilisieren.
  • Methoden zum Immobilisieren relevanter Analyten sind in der Technik allgemein bekannt, und umfassen das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Poylstyrol-, Nitrocellulose oder Nylonoberfläche oder einer mit ganzen Zellen, subzellulären Teilchen, Viren, Prionen, Viroiden, Lipiden, Fettsäuren, Nucleinsäuren, Polysacchariden, Proteinen, Lipoproteinen, Lipopolysacchariden, Glykoproteinen, Peptiden, Hormonen, pharmakologischen Wirkstoffen, Beruhigungsmitteln, Barbituraten, Alkaloiden, Steroiden, Vitaminen, Aminosäuren, Zucker, nicht biologischen Polymeren, synthetischen organischen Molekülen, organometallischen Molekülen, oder anorganischen Molekülen beschichteten Oberfläche. Der relevante Analyt kann jede dieser Substanzen oder eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, Prion, Viroid, eine Nucleinsäure, ein Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glykoprotein, Peptid, Hormon, pharmakologischer Wirkstoff, nichtbioluogisches Polymer, synthetisches organisches Molekül, organometallisches Molekül oder anorganisches Molekül sein, das in der Probe in einer Konzentration von unter etwa 10–12 Molar vorhanden ist. Der relevante Analyt kann eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, Prion, Viroid oder eine Nucleinsäure sein, die in der Probe in einer Konzentration unter etwa 10–15 Molar vorhanden sind.
  • Der lumineszente Komplex, der mit der Probe in Kontakt gebracht wird, ist eine Re-enthaltende, elektrochemilumineszente, chemische Einheit, die an eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, Prion, Viroid, eine Fettsäure, Nucleinsäure, ein Polysaccharid, Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glykoprotein, Peptid, ein Hormon, einen pharmakologischen Wirkstoff, ein Beruhigungsmittel, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, eine Aminosäure, Zucker, ein nichtbiologisches Polymer, synthetisches organisches Molekül, organometallisches Molekül oder anorganisches Molekül, Biotin, Avidin oder Streptavidin konjugiert ist. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der lumineszente Komplex eine Re-enthaltende elektrochemilumineszierende Einheit, die an einen Antikörper, ein Antigen, eine Nucleinsäure, Hapten, einen Liganden oder ein Enzym, oder Biotin, Avidin oder Streptavidin konjugiert ist.
  • Die Probe kann von einem Feststoff, einer Emulsion, Suspension, Flüssigkeit oder einem Gas abgeleitet sein. Darüber hinaus kann die Probe aus Wasser, Lebensmitteln, Blut, Serum, Urin, Kot, Gewebe, Speichel, Ölen, organischen Lösungsmitteln oder Luft stammen. Darüber hinaus kann die Probe Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, n-Methylpyrrolidon oder tert-Butylalkohol enthalten. Die Probe kann auch ein Reduktions- oder Oxidationsmittel umfassen.
  • Die Erfindung liegt auch in verbesserten kompetitiven Verfahren, um in einem festgelegten Volumen einer flüssigen Multikomponentenprobe einen relevanten Analyten nachzuweisen, der in einer Konzentration von weniger als 10–3 Molar vorhanden ist. Dabei wird (a) eine Probe mit einem Reagenz in Kontakt gebracht, das einen lumineszenten Komplex nach Anspruch 1 enthält, der (i) induziert werden kann, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, wenn er dem Einfluß einer Menge an chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt wird, die die Induktion einer wiederholten Aussendung von Strahlung durch den lumineszenten Komplex bewirkt, und (ii) mit dem relevanten Analyten in Wettbewerb um Bindungsstellen auf einem normalerweise nicht in der Probe vorhandenen Komplementärmaterial treten kann, und mit dem Komplementärmaterial, wobei der Kontakt mit dem Komplementärmaterial unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß der relevante Analyt und das Reagenz kompetitiv an das Komplementärmaterial binden; (b) die entstehende Probe der Einwirkung einer Menge an chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aus einer geeigneten Quelle ausgesetzt, die den lumineszenten Komplex anregen kann, wiederholt Strahlung auszusenden, wobei diese Exposition unter solchen Bedingungen erfolgt, daß der lumineszente Komplex induziert wird, wiederholt elektromagnetische Strahlung auszusenden, und (c) die Menge an ausgesendeter elektromagnetischer Strahlung detektiert und dadurch die Anwesenheit des relevanten Analyten in der Probe detektiert.
  • Beispiele
  • Einleitung
  • Materialien und Verfahren
  • Liganden:
    2,2'-Bipyridin (bpy) (Aldrich) wurde ohne weitere Reinigung verwendet. 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridin(Me2bpy) (Reilly Tar Chemicals) wurde vor der Verwendung sublimiert (90 bis 100°C, 10–3 torr). 4,4'-Diphenyl-2,2'-bipyridin (Ph2bpy) (Aldrich) wurde vor der Verwendung einmal aus Benzol/Petroleumether umkristallisiert. 4-Ethylpyridin (Etpy) (Aldrich) wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Außerdem wurden folgende andere Pyridyl- und Bipyridylliganden verwendet:
    4,4'-Bis(N,N-diethylamino)-2,2'-bipyridin [(NEt2)2bpy] (Maeker, G. und Case, F.H., J. Amer. Chem. Soc. 80: 2745 (1958));
    4,4'-(Dimethoxy)-2,2'-bipyridin [(CH3-O)2bpy] (Wenkert, D., Woodward, R.B., J. Org. Chem. 48: 283 (1983)); 4,4'-5,5'-Tetramethyl-2,2'-bipyridin (Me4bpy) (Elliot, M.C., Freitag, R.A., Blaney, D.D., J. Amer. Chem. Soc. 107: 4647 (1985)); 4,4'-Dichlor-2,2'-bipyridin (Cl2bpy) (Wenkert, D., Woodward, R.B. (1983) siehe oben;
    4,4'-Bis(carbomethoxy)-2,2'-bipyridin ((CO2CH3)2bpy) (Maeker, G. und Case, F.H., (1958), siehe oben; 4,4'-Dinitro-2,2'-bipyridin ((NO2)2pby) (Maeker, G. und Case, F.H. (1958), siehe oben).
  • Lösungsmittel:
    Methylenchlorid (CH2Cl2), Petroleumether, Diethylether (wasserfrei) und Methanol wurden jeweils in der Qualität "Chempure" von Curtin Matheson Scientific (Florence, New York) bezogen und unverändert verwendet. Aceton (A.C.S, Reagenzqualität) und Acetonitril (Omni-Solv) von EM Scientific (Cherry Hill, New Jersey) wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Benzol wurde in der Qualität A.C.S. Reagenz von Fisher Scientific (Springfield, New Jersey) bezogen und unverändert verwendet. Toluol (analysiertes Baker-Reagenz, Qualität HPLC) von J.T. Baker Chemicals (Phillipsburg, New Jersey) wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Tetrahydrofuran von J.T. Baker Chemicals wurde unmittelbar vor der Verwendung durch Destillation aus Natrium/Benzophenon unter einer Argonatmosphäre getrocknet. Wasserfreies Ethanol (mit einem Proofgrad von 200) wurde von Warner-Graham Co. (Cockeyesville, Maryland) bezogen. 2-Methoxyethanol (Aldrich, Qualität HPLC) wurde unverändert verwendet. Pyridin (Aldrich Gold Label) wurde in der wasserfreien Form bezogen und bis zur Verwendung in Sure-Sea®-Flaschen (Aldrich) gelagert. Dimethylformamid (DMF) wurde in der A.C.S.-Reagenz-Qualität unverändert verwendet. Wasser wurde mit dem Millipore Milli-Q-System entionisiert.
  • Chromatographie
  • Neutrales absorbierendes Aluminiumoxid (Fisher) wurde unverändert verwendet. Ottawa-Sand und Glaswolle für die Chromatograpie wurden von Aldrich bezogen. Sephadex LH-20 wurde von Pharmacia bezogen und vor der Verwendung aktiviert, indem man es unmittelbar vorher 12 Stunden in gerührtem Methanol suspendierte. SP-Sephadex C-25 (Sigma, St. Louis, Missouri) wurde aktiviert, indem man es unmittelbar vor der Verwendung zwei Stunden in siedendem Wasser rührte.
  • Andere Reagenzien
  • Natriummetall, Benzophenon (Gold Label), Trifluormethansulfonsäure (HO3SCF3, d. h. "Triflic"-Säure) und Silbertrifluormethansulfonat (AgCF3SO3, d. h. Silbertriflat) wurden alle wie von Aldrich geliefert verwendet. Trifluormethansulfonsäureanhydrid ((CF3SO2)2O) (Alfa-Ventron, Danvers, Massachusetts) wurde wie geliefert verwendet. Ammoniumhexafluorphosphat (NH4PF6) (Aldrich) wurde ohne weitere Reinigung verwendet. NaCl und NaC1O4 waren beide von der Qualität eines A.C.S.-Reagenz von Fisher Scientific und wurden unverändert verwendet. Pentacarbonylrhenium(I)-Chlorid, (CO)5ReCl wurde von Pressure Chemical Co. (Pittsburgh, Pennsylvania) bezogen. Wasserfreies Natriumsulfat und Drierite® mit Anzeigequalität (CaSO4, wasserfrei) wurden von Adrich bezogen. Argongas von Robert's Oxygen Company (Rockville, Maryland) wurde getrocknet, indem man es vor der Verwendung durch eine Kolonne (3 inches Innendurchmesser × 12 inches Höhe) von Drierite® mit Anzeigequalität leitete.
  • 1,3-Dimethyl-4,5-diaminouracil (DADMU) von Aldrich wurde vor der Verwendung aus Methanol/Petroleumether unter Argon umkristallisiert. Wasserfreies LiClO4 und Isonicotinoylchloridhydrochlorid wurden wie von Aldrich geliefert verwendet. NaOH der Qualität A.C.S.-Reagenz von Fisher wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Isopropanol (Chempure) von Curtin Matheson Scientific wurde wie geliefert verwendet.
  • Synthese von Re(I)-Modellkomplexen
  • Das allgemeine Syntheseschema für lumineszierende Re(I)-Komplexe ist in 1 gezeigt. Das Ausgangsmaterial für die Herstellung der lumineszierenden Re(I)-Komplexe war Re(CO)5Cl. Die Synthese der getrockneten Re(I)-Spezies beinhaltete zwei Schritte. Im ersten Schritt wurde durch die Substitution von CO durch einen chelatbildenden 2,2'-Bipyridinliganden das fazielle Isomer, fac-(L)Re(CO)3Cl hergestellt. L ist ein chelatbildender 2,2'-Bipyridinligand, z. B. bpy, Cl2bpy, (CO2CH3)2bpy, (NO2)2bpy, Me2bpy, Ph2bpy, (CH3O)2bpy, Me4bpy oder (NEt2)2bpy. Das allgemeine Syntheseverfahren wird nachstehend beschrieben.
  • In einen mit einem Rückflußkondensator und einem Rührstab ausgerüsteten 250 ml-Kolben gab man 361,7 mg (1 mMol) (CO)5ReCl, 1,02 mMol des erwünschten Bipyridylliganden, z. B. 187 mg Me2bpy und 80 bis 100 ml Toluol. Die Lösung wurde 15 Minuten mit Argonbläschen entgast und unter Rühren und Argon 90 Minuten am Rückfluß gehalten. Während dieser Zeit fällt das Produkt üblicherweise aus der Lösung aus. Nachdem der Kolben auf Raumtemperatur abgekühlt worden war, wurde das ausgefallene Produkt durch Saugfiltrieren gesammelt, zweimal mit 15 ml-Portionen kaltem Toluol und dann mit drei 15 ml-Portionen Diethylether gewaschen und anschließend 30 Minuten durch Luftzug getrocknet. Das Tocknen wurde über Nacht in einem Vakuumexsikkator über CaSO4 abgeschlossen. Wenn das Produkt beim Abkühlen nicht ausfiel, wurde die Ausfällung durch die tropfenweise Zugabe von Diethylether zu der gerührten Toluollösung ausgelöst. Das aus dieser Reaktion erhaltene Produkt war analytisch rein. Die Ausbeute des Produkts fac-(1)Re(CO)3Cl betrug bezogen auf das ursprüngliche (CO)5ReCl mehr als 90%.
  • Die Umwandlung von fac-(L)-Re(CO)3 zum entsprechenden fac-(L)Re(CO)3(Etpy)(R) (wobei R CF3CO3 –, PF6 – oder ClO4 – ist) erfolgte durch eines der folgenden beiden Verfahren.
  • Verfahren I – Säureverfahren
  • Dieses Verfahren eignet sich für Bipyridylliganden, die gegenüber stark sauren Medien unempfindlich, also stabil sind. Dabei wird zuerst als Zwischenprodukt die Re(I)-Triflat-Spezies hergestellt und isoliert und dann zum 4-Pyridylethanderivat umgewandelt. Folgendes Beispiel veranschaulicht das Verfahren:
  • Herstellung von fac-T(NEt2)2bpy(Re(CO3SCF3)
  • In einen mit einem Rührstab ausgerüsteten 250 ml Rundbodenkolben gab man 456 mg (0,75 mMol) fac-[(NEt2)2 bpy]Re(CO)3Cl und 30 ml Methylenchlorid. Die gerührte Suspension wurde mit 1,34 ml (dem 20-fachen der erforderlichen Menge) Trifluormethansulfonsäure HO3SCF3 und 3 bis 5 Tropfen Trifluuormethansulfonsäureanhydrid (CF3SO2)2O versetzt. Der Feststoff löste sich sofort auf und ergab eine dunkelgelbe Lösung. Der Kolben wurde verschlossen und die Lösung 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach isolierte man das Produkt durch die tropfenweise Zugabe von 200 ml wasserfreiem Diethylether zu der gerührten Lösung. Das gelbe Produkt, fac[(Net2)2bpy]Re(CO)3(O3SCF3), wurde durch Saugfiltration isoliert. Das ausgefällte Produkt wurde mit sechs 30 ml-Portionen wasserfreiem Diethylether gewaschen, um die Spuren von Trifluormethansulfonsäure zu entfernen, und 30 Minuten mit Luft getrocknet. Das Trocknen wurde über Nacht im Vakuumexsikkator über CaSO4 abgeschlossen. Die Ausbeute betrug 500 mg [(Net2)2bpy]Re(CO)3(O3SCF3) (93% bezogen auf [(Net2)2bpy]Re(CO)3Cl). Das Produkt war so rein, daß es in späteren Reaktionen verwendet werden konnte. Die vorstehend beschriebene Re(I)-Triflatspezies kann wie in 3 gezeigt zum entsprechenden Etpy-Komplex umgewandelt werden. Das Verfahren wird im folgenden veranschaulicht.
  • Herstellung von fac-[(Net2)2bpy]Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)
  • In einen mit einem Rührstab und einem Rückflußkondensator ausgerüsteten 250 ml Rundbodenkolben gab man 150 mg (0,2 mMol) fac-[(Net2)2bpy]Re(CO)3(O3SCF3) und 50 ml Ethanol. Zu dieser Mischung gab man 0,24 ml (das 10fache der erforderlichen Menge) 4-Pyridylethan. Die Lösung wurde 15 Minuten mit Argonbläschen entgast und 2 Stunden unter Rühren unter einer Argonatmosphäre am Rückfluß gehalten. Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde das Ethanol durch Verdampfen unter Verwendung eines Rotationsverdampfers (Buchi Modell Re-121) entfernt. Die verbleibende Probe bestand aus dem rohen Produkt fac-[(Net2)2bpy]Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3), das in überschüssigem 4-Pyridylethan aufgelöst war. Die Probe wurde in einem minimalen Volumen (5 bis 15 ml) von CH3CN und Toluol im Verhältnis 1 : 2 aufgelöst und auf neutralem Aluminiumoxid (Adsorptionsaluminiumoxid, Fisher Scientific) unter Verwendung einer Kolonne von 30 cm Länge und 3 cm Innendurchmesser chromatographiert. Durch Elution mit CH3CN und Toluol im Verhältnis 1 : 2 wurde überschüssiger 4-Pyridylethanligand entfernt. Das gelbe Produktband, fac[(Net2)2bpy]Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3) wurde mit CH3CN und Toluol im Verhältnis 1 : 1 eluiert. Obwohl eine gewisse Schwanzbildung zu beobachten war, erreichte man die völlige Abtrennung von einer kleinen Menge einer unidentifizierten lilafarbenen Spezies. Die das Produkt enthaltende Lösungsmittelfraktion wurde auf dem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit verdampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Methylenchlorid aufgelöst und das Lösungsmittel erneut mit dem Rotationsverdampfer verdampft. Hellgelbe Flocken von fac-[(Net2)2bpy]Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3) wurden in 50% Ausbeute (bezogen auf [(Net2)2bpy]Re(CO)3 (CF3SO3) als Ausgangsmaterial) erhalten. Das Produkt ist analytisch rein. C29G35N5O6SF3Re
    Figure 00570001
  • Verfahren II- Silberverfahren
  • Das Silberverfahren wird bei Komplexen mit Bipyridylliganden angewendet, die in stark saurer Umgebung zur Zersetzung neigen, z. B. L=(CH3O)bpy oder (COOCH3)2bpy. Bei diesem Verfahren wurde ein lösliches Silbertrifluormethansulfonatsalz mit der fac-(L)Re(CO)3Cl-Spezies zur Umsetzung gebracht, um die fac-(L)Re(CO)3(O3SCF3)-Komponente und unlösliches AgCl herzustellen. Nach der Entfernung des AgCl-Niederschlags durch Filtration wurde die Lösung in situ mit 4-Pyridylethan zur Umsetzung gebracht, um das erwünschte Produkt herzustellen. Man versuchte bei diesem Verfahren nicht, die als Zwischenprodukt angefallenen fac(L)Re(CO)3-(O3SCF3)-Salze zu isolieren. Im folgenden wird das Verfahren veranschaulicht:
  • Herstellunq von fac-[Cl2bpy]Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)
  • Weil Silbertrifluormethansulfonat, AgCF3SO3, lichtempfindlich ist, wurden sämtliche Betriebsschritte in einem abgedunkelten Bereich unter einer roten Sicherheitslampe durchgeführt.
  • Tetrahydrofuran (THF) wurde 90 Minuten durch Rückfluß unter einer Argonatmosphäre über Na/Benzophenon getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unmittelbar vor der Verwendung durch Destillation gesammelt.
  • In einen mit einem Rührstab und einem Rückflußkondensator ausgerüsteten 250 ml Rundbodenkolben gab man 500 mg (0,04 mMol) fac-(Cl2bpy)Re(CO)3Cl, 242 mg (0,94 mMol) AgCF3SO3 und 100 ml trockenes THF. Der Kolbeninhalt wurde 15 Minuten mit Argonbläschen entgast und 3 Stunden unter Rühren unter einer Argonatmosphäre am Rückfluß gehalten. Dann wurde der Kolbeninhalt unter Verwendung eines mit Glasfritte (von feiner Porosität) gefüllten Trichters saugfiltriert, um den AgCl-Niederschlag zu entfernen. Der AgCl-Niederschlag wurde dreimal mit 15 ml-Portionen Methanol gewaschen. Das abgespülte CH3OH wurde mit dem Filtrat kombiniert und in einen mit einem Rührstab ausgerüsteten sauberen 250 ml Rundbodenkolben gefüllt. 0,75 g (6,59 mMol) 4-Pyridylethan wurden zugegeben, die Lösung 15 Minuten mit Argonbläschen entgast und 2 Stunden unter einer Argonatmosphäre am Rückfluß gehalten.
  • Nachdem die orangebraune Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurden Methanol und THF unter Einsatz des Rotationsverdampfers entfernt. Die verbleibende Produktaufschlämmung wurde mit einem der beiden folgenden Verfahren gereinigt:
  • Verfahren 1
  • Eine Aluminiumoxidkolonne (15 Inches Höhe × 2 inches Innendurchmesser) mit CH3CN/Toluol im Verhältnis von 1 2 wurde wie in Verfahren I für die Reinigung von fac[(Net2)2bpy]Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3) vorbereitet. Die Probe wurde in 10 bis 15 ml CH3CN und Toluol im Volumen-Verhältnis 1 : 2 aufgelöst und in die Kolonne eingebracht. Durch Elu tion mit CH3CN und Toluol im Volumen-Verhältnis 1 : 2 wurde ein kleines gelbes Band entfernt, das als (Cl2bpy)Re-(CO)3Cl identifiziert wurde. Die Elution mit CH3CN und Toluol im Verhältnis 1 : 1 (V/V) entfernte ein kompaktes orangebraunes Band. Diese Überlappung schränkt die Ausbeute der Reaktion bezogen auf fac-(Cl2bpy)Re(CO)3Cl auf 17% ein. Obwohl bei der gelben Produktbande eine Schwanzbildung zu beobachten war, ließ es sich auf der Kolonne sauber von einer Anzahl hinterherfließender gelber, lilafarbener und brauner Banden trennen. Man unternahm keinen Versuch, diese Nebenprodukte zu isolieren oder identifizieren. Die Isolierung des fac(Cl2bpy)Re(CO)3-(Etpy)(CF3SO3)-Produkts war der in Verfahren I für fac-[(Net2)2bpy]Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3) beschriebenen identisch.
  • Verfahren 2
  • Die Ausbeute an dem Komplex ließ sich durch Einsatz von Ionenaustauschchromatographie als Reinigungsverfahren verbessern. Eine Kolonne (2 cm Innendurchmesser, 30 cm Länge) von SP-Sephadex C-25 Ionenaustauschharz wurde in Wasser hergestellt. Die aus der Produktaufbereitung erhaltene Aufschlämmung wurde mit ungefähr 10 ml H2O vermischt und tropfenweise mit Aceton versetzt, bis man eine homogene Lösung beobachten konnte. SP-Sephadex C-25-Harz wurde der Lösung aus der Rohproduktaufschlämmung zugesetzt, bis das Harz das Produkt absorbiert hatte. Das Aceton wurde durch Verdampfung mittels des Rotationsverdampfers entfernt. Das Harz, das die absorbierten Reaktionsprodukte enthielt, wurde auf die Kolonne aufgebracht. Die Elution mit H2O entfernte 4-Pyridylethan, und ungeladenes fac-(Cl2bpy)Re(CO)3(Etpy)+-Kation wurde unter Verwendung von wäßriger 0,25 M NaCl-Lösung als Cl-Salz eluiert. Die Nebenprodukte der Reaktion verblieben auf der Kolonne. Das Produkt wurde als PF6-Salz isoliert, indem man gesättigte wäßrige NH4PF6-Lösung tropfenweise zu der das Produkt enthaltenden 0,25 M NaCl-Lösung gab. Das Präzipitat aus fac(Cl2bpy)Re(CO)3(Etpy)(PF6) wurde mittels Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter (mittlere Porosität) gesammelt. Das Produkt wurde in 10 ml H2O, enthaltend 1 Tropfen einer gesättigten NH4PF6-Lösung, suspendiert. Aceton wurde zugegeben, bis sich der Feststoff vollständig auflöste. Der Komplex wurde durch langsames Verdampfen des Acetons auf dem Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur in reiner Form ausgefällt. Der Komplex wurde durch Saugfiltration auf dem Glasfrittenfilter (von mittlerer Porosität) gesammelt und mit 10 ml eiskaltem H2O gewaschen. Dann wurde der Komplex mit zwei 15 ml-Portionen Diethylether gewaschen und dreißig Minuten bei Unterdruck mit Luft getrocknet. Das Trocknen wurde über Nacht über CaSO4 im Vakuumexsikkator abgeschlossen. Man erhielt, bezogen auf (Cl2bpy)Re(CO)3Cl, eine Ausbeute von 24%. Die kleinen hellgelben Kristalle von fac-(Cl2-bpy)Re(CO)3-(Etpy)(PF6) waren analytisch rein. C2OH15N3O3Cl2RePF6
    Figure 00600001
  • Im allgemeinen reagieren Komplexe, die elektronenfreisetzende Substituenten wie NEt2, CH3O, CH3 usw. enthalten, sauber und lassen sich mit dem Verfahren 1 auf einfache Weise reinigen. Komplexe, die elektronenentziehende Substituenten wie Cl oder NO2 auf dem 2,2'-Bipyridinliganden enthalten, werden am besten mit Verfahren 2 gereinigt. Die elektronenentziehende Beschaffenheit des 2,2'-Bipyridynliganden in solchen Kom plexen zieht die Elektronendichte aus dem formellen Re(I)-Zentrum heraus. Die daraus resultierende Zunahme in der positiven Teilladung am Re-Zentrum führt zu einer größeren elektrostatischen Anziehung zwischen dem Re(I) und Cl–. Die daraus resultierende Stärkung der Re-Cl-Bindung verringert die Effektivität von Cl- als Fluchtgruppe in Gegenwart von Silberkationen, Ag+ oder HO3SCF3. Deshalb wird der Angriff dieser Spezies an anderen Punkten innerhalb des Re(I)-Cl-Komplexes zur Erzeugung von Nebenprodukten mit einer einfachen C1–-Verdrängung kompetitiv. Die geladenen Produkte, die augenscheinlich dabei entstehen, lassen sich am besten mittels Ionenaustauschharzen abtrennen.
  • 4 zeigt eine Zusammenfassung der bisher synthetisierten fac-(L)Re(CO)3(Etpy)(CF3SO3)-Komplexe sowie die Ausbeuten nach der Reinigung und Herstellungsverfahren (Säure – Verfahren I; Silber – Verfahren II). Auch die Emissionsmaximalwerte für die Komplexe in CH3CN sind aufgeführt. Die Emissionsspektren erhielt man unter Verwendung eines Spektrofluorimeters von Perkin-Elmer, Modell LS-5.
  • Die Emissionsspektren wurden nicht auf Variationen in der Detektorsibilität mit der Wellenlänge korrigiert und sollen nur eine qualitative Veranschaulichung des Emissionswellenlängenbereichs geben, der unter Verwendung dieser Verbindungen zugänglich ist.
  • Auch zwei lumineszierende Re(I)-Theophyllinspezies wurden als Modell für Sensor-Analyt-Konjugate hergestellt. Dabei bediente man sich folgenden Verfahrens:
  • Beispiel 1
  • Herstellung von Theophyllin-8-buttersäure-3-propylpyridylamid (T8BA3PPA): Verbindung I
  • 0,163 g (1,2 mMol) 3-(4-Pyridyl)-propylamin wurden mit 0,776 g (1 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml wasserfreiem Pyridin kombiniert. Die dabei entstehende Lö sung wurde über Nacht gerührt. Ausgefällter Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat unter Vakuum konzentriert. Der verbleibende Feststoff wurde durch Sieden in 50% wäßrigem Isopropanol aufgelöst. Beim Abkühlen war eine kleine Menge an Feststoff ausgefallen, die abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde konzentriert, um ein Öl zu ergeben, daß sich beim Stehen langsam verfestigte. Der Feststoff wurde in 10 ml 0,1N HCl aufgelöst und erneut filtriert, um eine kleine Menge an unlöslichen Substanzen zu entfernen. Dann wurde der pH mit wäßrigem Natriumcarbonat auf 7 eingestellt. Die Lösung wurde auf Eis gekühlt, wodurch man ein kristallines weißes Produkt erhielt (Ausbeute 0,149 g, 39%). Das Produkt wurde durch Elementaranalyse und Protonen-NMR charakterisiert und hatte folgende Struktur:
    Figure 00620001
  • Beispiel 2
  • Herstellung von fac-(bpy)Re(CO)3(T8BA3PPA)(ClO4)
  • Verbindung II
  • Fac-(bpy)Re(CO)3(O3SCF3) wurde wie vorstehend beschrieben unter Verwendung des Säureverfahrens (Verfahren I) hergestellt.
  • In einen mit einem Rührstab und einem Kondensator ausgerüsteten 100 ml Rundbodenkolben gab man 155 mg (0,27 mMol) fac-(bpy)Re(CO)3(O3SCF3), 129 mg (0,37 mMol) der Verbindung I, 20 ml H2O und 20 ml Ethanol. Die Lösung wurde 15 Minuten mit Argonbläschen entgast und 3 Stunden unter einer Argonatmosphäre am Rückfluß gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel auf einem Rotationsverdampfer verdampft. Der trockene Feststoff wurde in 10 bis 15 ml Methanol aufgelöst und mit 0,2 g wasserfreiem LiClO4 versetzt. Als das LiClO4 aufgelöst war, wurde die Lösung in eine Sephadex LH-20-Kolonne (75 cm Höhe × 2 cm Innendurchmesser) zur chromatographischen Reinigung umgefüllt. Die Kolonne wurde mit Methanol ins Gleichgewicht gebracht. Man ließ die Probe mit einer Fließgeschwindigkeit zwischen 0,1 bis 0,2 ml/min durchlaufen. Es wurden drei Banden abgetrennt. Die führende Bande fluoreszierte bei 567 nm in CH3OH und war das erwünschte Produkt (Verbindung II). Es ließ sich sauber von den übrigen Banden abtrennen. Man versuchte nicht, die durch diese Banden darge- stellte kleinere Produkt zu identifizieren. Das Produkt wurde durch Verdampfen von CH3OH auf dem Rotationsverdampfer isoliert. Der Komplex wurde in 5 ml CH3OH aufgelöst und floß durch die Schwerkraft in 150 ml gerührten wasserfreien Diethylether. Der Komplex wurde als helles gelbgrünes Pulver ausgefällt. Es wurde durch Saugfiltration auf einem mit Glasfrittenfilter (von mittlerer Porosität) gesammelt und mit 15 ml-Portionen wasserfreiem Diethylether gewaschen. Das Trocknen mit Luft bei Unterdruck wurde vermieden. Über Nacht wurde der Komplex im Vakuumexsikkator über CaSO4 zu Ende getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 48%, bezogen auf fac-(bpy)Re(CO)3(O3SCF3). Der Komplex war analytisch rein. C32H32N8O10ClRe [910,05 gt/mMol]
    Figure 00630001
  • Das Produkt hatte folgende Struktur:
    Figure 00640001
  • Beispiel 3
  • Herstellung von 1,3-Dimethyl-4-amino-5-(isonicotinylamid)uracil
  • Verbindung III
  • Die Verbindung III wurde durch die Reaktion von Isonicotinylchloridhydrochlorid (INC) mit 1,3-Dimethyl-4,5-diaminouracil (DADMU) in trockenem Pyridin wie im folgenden beschrieben hergestellt.
  • DADMU wurde durch Umkristallisation aus Methanol unter einer Argonatmosphäre gereinigt und über Nacht über CaSO4 im Vakuumexsikkator getrocknet. Die hellgelbe Verbindung wurde unter Argon gelagert.
  • Ein mit einem Rührstab ausgerüsteter 100 ml Rundbodenkolben wurde mit Argongas entlüftet und in einem Eisbad gekühlt. Mit einer Spritze wurden 35 ml trockenes Pyridin eingespritzt und das System mit Argon entlüftet.
  • Nach 15 Minuten wurden 1,04 g (5,84 mMol) Isonicotinoylchloridhydrochlorid über einen Zeitraum von 15 Minuten in drei Portionen zugegeben. Die Substanzen lösten sich zu einer braunen Lösung auf. Dieser Lösung gab man unter Rühren in einer Argonatmosphäre 0,98 g (5,76 mMol) DADMU zu. Man befestigte einen Rückflußkondensator am Kolben und legte ihn in ein Wasserbad. Der Kolbeninhalt wurde unter Rühren bei 80°C 2,5 Stunden unter Argon am Rückfluß gehalten. Man ließ die braune Mischung unter Argon über Nacht langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Ein gelbbrauner Niederschlag wurde durch Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter (von mittlerer Porosität) gesammelt.
  • Der Niederschlag wurde mit vier 15 ml-Portionen kaltem Toluol gewaschen, um Pyridin und eine lösliche braune Verunreinigung zu entfernen. Das ausgefällte Produkt wurde mit drei 30 ml-Portionen Diethylether gewaschen und über Nacht über CaSO4 im Vakuumexsikkator getrocknet. Dann wurde das Produkt aus CH3OH/Diethylether unter einer Argonatmosphäre umkristallisiert und ergab 0,52 g der Verbindung III als gelbes Produkt (38 bezogen auf das ursprüngliche INC). Das Produkt hatte folgende Struktur:
    Figure 00650001
  • Beispiel 4
  • Herstellung von 8-(4-Pyridyl)theophyllin
  • Verbindung IV
  • Die Verbindung III ließ sich durch folgendes Verfahren auf einfache Weise zu der entsprechenden Theophyllinspezies (Verbindung IV) cyclisieren.
  • In einen 300 ml Erlenmeyer-Kolben mit einem Rührstab gab man 6,75 g (24 mMol) der Verbindung III und ausreichend 2,5 M wäßriges NaOH (ungefähr 100 ml), um die Verbindung III aufzulösen. Die gelb-orangefarbene Lösung wurde unter sanftem Rühren erhitzt, bis sie zu sieden begann. Man ließ sie 30 Minuten leicht weitersieden, während ein Niederschlag sich abzutrennen begann. Man ließ die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und stellte den pH unter Verwendung von 6 M HCl (wäßrig) sorgfältig auf einen Wert zwischen 5 und 6 ein. Während der Neutralisierung löste sich der anfängliche Niederschlag zu einer orangefarbenen Lösung auf. Als sich die Neutralisierung ihrem Abschluß näherte, fiel erneut ein Niederschlag aus. Die Lösung wurde eine Stunde auf einem Eisbad gekühlt und der hellgelbe Niederschlag durch Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter (mittlerer Porosität) gesammelt. Der Niederschlag wurde mit drei 20 ml-Portionen Diethylether- gewaschen. Das rohe Produkt wurde über Nacht in einem Vakuumexsikkator über CaSO4 getrocknet. Das Produkt wurde durch Umkristallisation aus Dimethylformamid (DMF) gereinigt. Kristalle wurden wie vorstehend beschrieben durch Saugfiltration gesammelt und zweimal mit 20 ml-Portionen eiskaltem Isopropanol und dann mit drei 30 ml-Portionen Diethylether gewaschen. Das Trocknen wurde über Nacht in einem Vakuumexsikkator abgeschlossen. Die Ausbeute betrug 1,87 g metallische weiße Kristalle der Verbindung IV (30% bezogen auf die ursprüngliche Menge der Verbindung III). Die Verbindung IV schmolz bei 337,9 bis 339,5°C zu einer klaren orangefarbenen Flüssigkeit.
  • Die Verbindung IV war analytisch rein. C12H11N5O2 [257,17 g/Mol]
    Figure 00670001
  • Das Produkt hatte folgende Struktur:
    Figure 00670002
  • Beispiel 5
  • Herstellung von fac-(bpy)Re(CO)3[8-(4-Pyridyltheophyllin)-CF3SO3]
  • Verbindung V
  • In einen mit einem Rührstab ausgerüsteten 100 ml Rundbodenkolben gab man 150 mg (0,261 mMol) fac-(bpy)Re(CO)3O3SCF3, 250 mg (1,04 mMol) 8-(4-Pyridyl)theophyllin und 40 ml 2-Methoxyethanol. Man verwendete 2-Methoxyethanol als Lösungsmittel, weil 8-(4-Pyridyl)theophyllin in Ethanol und Wasser unlöslich ist. Nach 15 Minuten Entlüftung mit Argon wurde die Lösung unter einer Argonatmosphäre 4 Stunden am Rückfluß gehalten. Nach dem Abkühlen wurde das Lösungsmittel durch Verdampfen auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Feststoff wurde mit 20 ml Methanol extrahiert und durch einen Glaswollestopfen filtriert, um unlöslichen 8-(4-Pyridyl)theophillin-Liganden zu entfernen. Das Filtrat wurde auf einer Sephadex LH-20-Kolonne (75 cm hoch × 2 cm Innendurchmesser) unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Es waren zwei Banden zu beobachten. Bei der führenden Bande (Hauptprodukt) handelte es sich um die Verbindung V, die von einer geringeren, nicht identifizierten Bande aus Verunreinigungen abgetrennt wurde. (Elutionsgeschwindigkeit 0,1 bis 0,2 ml/min.). Die Konzentration der die Verbindung V enthaltenden Fraktion auf 5 ml Methanolvolumen auf dem Rotationsverdampfer und die anschließende erneute Ausfällung in 100 ml gerührtem Diethylether ergab die Verbindung V als hellgrünes Pulver. Die Verbindung V wurde durch Saugfiltration auf einem Glasfrittenfilter (mittlerer Porosität) gesammelt und über Nacht über CaSO4 in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die Ausbeute betrug 120 mg (42%, bezogen auf fac-(bpy)Re(CO)3(O3SCF3)). Das Produkt war analytisch rein. C26H19O8F3ReS [832,6 g/Mol]
    Figure 00680001
  • Das Produkt hatte folgende Formel:
    Figure 00680002
  • Beispiel 6
  • Herstellung von fac-(bpy)Re(CO)3[3-(4-Pyridyl)propionsäure]ClO4·H2O
  • Verbindung VI
  • In einen mit einem Rührstab ausgerüsteten 250 ml Rundbodenkolben gab man 300 mg (0,522 mMol) fac-(bpy)Re(CO)3CF3SO3, 79,2 mg (0,524 mMol) 3-(4-Pyridyl)propionsäure, 70 ml Ethanol (absolut) und 30 ml Wasser. Die Mischung wurde 15 Minuten mit Argon entlüftet und dann 4 Stunden unter einer Argonatmosphäre am Rückfluß gehalten. Die Lösung wurde abgekühlt und das Lösungsmittel abgetrieben. Der Rückstand wurde in einer minimalen Menge Wasser aufgelöst, auf eine SP-25 Sephadex-Kolonne gelegt, mit Wasser gewaschen und mit 0,25 M NaCl eluiert. Die erste gelbgrüne Fraktion wurde gesammelt und das Volumen auf dem Rotationsverdampfer auf etwa 25 ml reduziert. Der Kolbeninhalt wurde mit einer Wärmepistole erwärmt und tropfenweise mit 1 ml konzentrierter Perchlorsäure versetzt. Es bildeten sich limonengrüne Kristalle. Diese wurden durch Saugfiltration auf einem 15 ml, mit Glasfritte mittlerer Porosität gefüllten Trichter isoliert, mit einer sehr geringen Menge Eiswasser gewaschen und 30 Minuten luftgetrocknet. Die Kristalle wurden außerdem über Drierit® in einem Vakuumexsikkator getrocknet. C21H17O9N3ReCl-H2O [695,04 g/Mol]
    Figure 00690001
  • Das Produkt hatte folgende Formel:
    Figure 00700001
  • Beispiel 7
  • Elektrochemilumineszenz verschiedener Rheniumverbindungen
  • Die Elektrochemie verschiedener Rheniumverbindungen wurde als 1 mM Lösung in 10 ml mit Stickstoff gespültem Acetonitril mit 0,1 M Tetrabutylammoniumtetrafluorborat als Trägerelektrolyt gemessen. Die Arbeitselektrode war eine von Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, Indiana, bezogene Platinscheibe. Ein Platindraht wurde als Gegenelektrode verwendet, und ein 1,0 mm Silberdraht diente als Bezugselektrode. Die Messungen wurden durch Scannen von –2,2 V bis +2,2 V (gegenüber SCE) mit einer Abtastgeschwindigkeit von 100 m.V/sec. vorgenommen. Nach jeder elektrochemischen Messung wurde die Spannungsdifferenz zwischen einer Bezugselektrode aus gesättigtem Kalomel (SCE) und dem Silberdraht bestimmt. Folglich sind die angegebenen Werte auf die Spannung gegenüber SCE bereinigt.
  • Die Messungen der Elektrochemilumineszenz (ECL) erfolgten in wäßrigen Lösungen, die 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer (pH 4,2), 25 mM Oxalsäure und 1% Triton® X-100 enthielten. Das verwendete Elektrodensystem bestand aus zwei Elektroden aus Platingaze (Größe 52), die durch einen 0,1 inch Platindraht an eine Radio Shack Transistorbuchse (Nr. 276–548) angeschlossen waren. Die Elektroden waren auf der Außenseite eines 60 mm dicken Stücks aus Celluloseacetatkunststoff angebracht. Der Kunststoff wurde maschinell so bearbeitet, daß Lösung durch ein Loch von 1/4 inch Durchmesser problemlos zwischen der Arbeits- und der Gegen-/Bezugselektrode hin und her fließen konnte. Die Elektroden wurden an ein Gerät zur Messung der Spannung angeschlossen, so daß eine Elektrode als Arbeitselektrode (die dem Photomultiplier-Röhrchen näher war) und eine Elektrode als Gegen- und Bezugselektrode diente. Die Messungen wurden vorgenommen, indem man mit einer Abtastgeschwindigkeit von 50 mV/sec. über den Bereich von 1,5 bis 2,5 V (Vorspannung) hinwegging. Die ECL-Messungen sind als das Verhältnis von Signal zu Geräusch (oder Signal zu Hintergrund) für eine bestimmte Konzentration der Verbindung wiedergegeben. Der Hintergrund ist als Lumineszenzzählmarke angegeben, die in Anwesenheit von Puffer ohne Zusatz von ECL-Verbindungen zu beobachten ist. Die Lumineszenzmessungen waren der Spitzenlichtausstoß, der während des ersten oder zweiten linearen Abtastens zu beobachten war.
  • Sowohl die Messungen der Elektrochemilumineszenz (ECL) aus auch der cyclischen Voltammetrie jeder Lösung wurde entweder mit einem EG&G Spannungsmeßgerät, Modell 273, oder einem Oxford-Bipotentiostat (Ursar Scientific Instruments) vorgenommen. Der Photonenfluß jeder ECL-Messung wurde mit einem Gerät zur Messung der Lumineszenz von Berthold bestimmt, welches so modifiziert war, daß man in die 0,5 ml Meßlösung entweder ein Zwei- oder ein Dreielektrodensystem einbringen konnte. Sowohl die Elektrochemie- als auch die Elektrochemilumineszenz-Messungen wurden auf einem Aufzeichnungsgerät von Kipp & Zonen, Modell BD 91 X, Y, Y' vorgenommen.
  • Die Messungen der Fluoreszenz erfolgten mit 50 mikromolaren Lösungen der erwünschten Verbindungen in 3,0 ml des vorstehend beschriebenen ECL-Puffers oder, wenn sie im Puffer nicht löslich waren, in Acetonitril. Die Messungen erfolgten auf einem LS-5 Fluoreszenzspektrophotometer von Perkin Elmer. Die Anregungs- und die Emissionsspektren der Lösungen wurden zuerst einmal abgetastet, ehe man sie aufzeichnete, so daß man das Emissionsspektrum messen konnte, während man mit maximaler Anregungswellenlänge bestrahlte, und umgekehrt das Anregungsspektrum aufzeichnen konnte, während man die maximale Emissionswellenlänge überwachte.
  • Tabelle 2 faßt die Elektrochemilumineszenzdaten verschiedener Verbindungen zusammen. Tabelle 2
    Figure 00730001
  • Die Elektrochemilumineszenz wurde in der angegebenen Konzentration gemessen und die Ergebnisse als Verhältnis von Signal zu Hintergrund ausgedrückt.
  • Beispiel 8
  • Verwendung eines internen Standards für einen Test auf ECL-Basis
  • Es wurden verschiedene Experimente durchgeführt, um die Verwendung eines internen Standards für Elektrochemilumineszenz (ECL) zu untersuchen. Für die Verwendung eines internen Standards für ECL-Messungen ist die Zugabe eines zweiten Leuchtstoffs oder Markers in die Probelösung erforderlich. Ein Marker ist die Eichsubstanz oder der Analyt und der zweite ist der interne Standard. Die Lichtemission von jedem Marker muß unabhängig und gleichzeitig gemessen werden. Dies läßt sich dadurch erreichen, daß man optische Filter verwendet, weil die beiden Marker bei verschiedenen Wellenlängen ausstrahlen.
  • Material und Ausrüstung
  • Die ECL sowohl des internen Standards als auch der Eichsubstanz wurden in einem "Flo-Thru"-Gehäuse gemessen. Das Gehäuse bestand aus einer lichtundurchlässigen Umfassung, in der Flüssigkeit und elektrische Anschlüsse an eine elektrochemische Zelle angeschlossen sind und die Zelle auf der Kopfseite auf ein Photomultiplier-Röhrchen ausgerichtet ist. Die Lichtintensitäten wurden mit einem Hamamatsu Photomultiplier (PMT) und einem PMT-Nachweissystem von Oriel, Modell 7070, gemessen. Der Potentiostat war von Princeton Applied Research (PAR), Modell 173, und mit einem PAR Modell 175 programmiert (Abtasten zwischen 1,8 und 1,0 V gegen Ag/AgCl bei 100 mV/sec.). Die elektrochemische Zelle war von Bioanalytical Systems und so modifiziert, daß sie im Zellblock einen Lösungseinlaß und -auslaß aufwies. Das Material für die Arbeitselektrode war im Block eingebettetes Gold. Eine Platte aus rostfreiem Stahl mit einem Fenster für den PMT zur Zelle wurde als Gegenelektrode verwendet. Die Bezugselektrode (Ag/AgCl) befand sich außerhalb des Zellblocks und war diesem nachgeordnet. Der Flüssigkeitsstrom und die Einleitung der Probe wurden manuell mit einer peristaltischen Pumpe geregelt. Die Profile der Lichtintensität wurden auf einem Aufzeichnungsgerät von Kipp & Zonen, Modell X-Y-Y, aufgezeichnet. Stammlösungen der Marker stellte man dadurch her, daß man sie im Puffer auflöste. Der Puffer bestand aus 0,15 M Phosphat, 0,10 M Tripropylamin und 0,05% Tween 20 mit einem pH von 7,0.
  • Eichstudien
  • Man untersuchte die ECL von OS(bpy)3 2+, OsTAG. Beim Abtasten der Spannung in Richtung der Anode sind zwei Lichtemissionsprofile zu beobachten. Lichtemission in Form eines Plateaus ist nahe der formellen Spannung von OS(bpy)3 3+/2+ (0,8 V gegen Ag/AgCl) zu beobachten. Die zweite Emission erfolgt positiver bei 1,46 V und weist einen Peak auf. Diese zweite Emission ist viel intensiver und der Tripropylaminoxidation näher. Die extrapolierte Nachweisgrenze betrug 100 pM (bei Verwendung eines Hamamatsu-PMT R 374).
  • Die ECL von (Me4bpy)Re(4-Et-pyr)(CO)3 +,ReTAG wurde untersucht. Die formelle Spannung für die Oxidation ist 1,7 V gegenüber Ag/AgCl (gemessen in Acetonitril durch cyclische Voltammetrie). Die maximale ECL verschiebt sich bezogen auf OsTAG ins Positive (1,58 V), was eine wesentlich positivere formelle Spannung für die Oxidation widerspiegelt. Dieses Material ist von besonderem Interesse, weil es bei 545 nm (Wasser) ausstrahlt. Die ReTAG-Emission ist in der Wellenlänge klar von der von Os(bpy)3 2+ (750 nm) abgetrennt und ermöglicht dadurch die optische Trennung unter Einsatz einfacher Filter. Die extrapolierte Nachweisgrenze für ReTAG beträgt 100 pM (Hamamatsu-PMT R268).
  • Auf der Grundlage der ECL-Leistung in den beiden beschriebenen Verfahren wurden diese Verbindungen dazu verweNdet, die Möglichkeit der Verwendung eines internen Standards für ECL zu testen. Ein Kriterium für einen internen Standard (OsTAG) beSteht darin, daß es unabhängig von der Eichsubstanz (ReTAG) Licht aussendet, d. h. folgende Quenchreaktion sollte nicht eintreten: Os(bpy)3 2+ + (me4bpy)Re(4-Et-pyr)(CO)3 +*------ Os(bpy)3 2+* + (Me4bpy)Re(4-Et-pyr)(CO)3 +
  • Folgendes Experiment wurde durchgeführt. Bei einer konstanten OsTAG-Konzentration (1 Mikromolar) und verschiedenen ReTAG-Konzentrationen (0 bis 100 nm) wurde die ECL von OSTAG unter Verwendung eines R258 PMT und eines LP 700 Langfilters beobachtet (siehe 2). Innerhalb der experimentellen Fehlergrenze war kein Einfluß auf die OsTAG-ECL durch ReTAG zu beobachten.
  • Das gleiche Experiment wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß der LP-700 Filter durch einen 620 Kurzfilter ersetzt wurde, um nur die ReTAG-ECL zu beobachten. Die Eichkurve für ReTAG ist in 3 gezeigt. Auch eine Eichkurve für ReTAG ohne OsTAG ist in 3 gezeigt. Wiederum hatte im Rahmen des experimentellen Fehlerbereichs die Zugabe von OsTAG keinen Einfluß auf die ReTAG-ECL. Die Daten weisen darauf hin, daß Os(bpy)3 2+ sich gut als interner Standard mit ReTAG als Analyten eignet.
  • Beispiel 9
  • Sensibilität des Nachweises der Elektrochemilumineszenz von mit Rhenium markiertem Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin G (IgG)-Antikörper
  • Die Elektrochemilumineszenz von mit fac-(bpy)Re(CO)3[3-(4-Pyridyl)propionsäure]CLO4·H2O (Verbindung VI) markiertem anti-Maus-IgG-Antikörper (mit Rhenium markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper) wird in einem 15 ml Dreihals-, Rundbodenkolben gemessen, der folgendes enthielt: 10 ml einer wie nachstehend beschrieben hergestellten Lösung, einen 1,5 mm × 10 mm magnetischen Rührstab, eine Quasibezugselektrode aus Silberdraht mit 1,0 mm Durchmesser, eine Gegenelektrode aus Platindraht der Größe 28 und eine Arbeitselektrode, die aus einem Platindraht der Größe 22 bestand, welche an ein quadratisches Stück von 1 × 1 cm aus 0,1 mm dicker, hoch polierter Platinfolie geschweißt war. (Die Arbeitselektrode aus Platinfolie ist zu einem Halbkreis von 3/16 inch Durchmesser geformt, der die Gegenelektrode aus Platindraht der Größe 28 in einem gleichbleibenden Abstand von 3/32 inch umgibt).
  • Der Silberdraht wird an eine Elektrometersonde von EG&G, Modell 178, des Potentiostats/Galvanostats 173 von EG&G angeschlossen. Die Gegenelektrode aus Platindraht und die Platinarbeitselektrode werden an die Anode bzw. Kathode des EG&G-Potentiostats, Modell 173 angeschlossen. Die Vorrichtung wird geerdet.
  • Die von der mit Rhenium markierten Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörperlösung ausgehende Elektrochemilumineszenz wird mittels eines Photomultiplier-Röhrchens R928 von Hamamatsu nachgewiesen, das sich innerhalb eines mit einem Kodak Nr. 23A Gelatine-(Rot)-Filter ausgerüsteten Gehäuses für Photomultiplier von Products for Research, Modell Pr1402RF, befindet. Das Gehäuse für das Photo multiplier-Röhrchen ist an ein Photomultiplier-Nachweissystem von Oriel, Modell 7070, angeschlossen.
  • Die Elektrochemilumineszenz wird dadurch angeregt, daß man zwischen 0 und –2,0 V Kathodenspannung Stromstöße in Intervallen von einer Sekunde pulsieren läßt. Die Messungen der Elektrochemilumineszenz erfolgen durch Integration des resultierenden Signals aus dem ECL-Photomultiplier-Röhrchen unter Verwendung eines Integrators, der an ein digitales Vielfachmeßinstrument von Micronta, Modell 22191, angeschlossen ist. Das ECL-Signal wird während der Stromstöße 10 Sekunden integriert und in Millivolt aufgezeichnet.
  • Eine Stammlösung aus 1,25 × 10–7 M mit Rhenium markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper wird aus einer konzentrierten Lösung (2 mg/ml, 7,5 Re/Antikörper) des markierten Antikörpers durch Verdünnen in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (phosphate buffered Saline = PBS) hergestellt. Ein aliquoter Teil dieser Lösung (80 Mikroliter) wird im Reaktionsgefäß zu 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO)/entionisiertem destilliertem Wasser (1 : 1), das 0,1 M Tetrabutylammoniumtetrafluorborat (TBABF4) und 18 mM Ammoniumpersulfat enthält, zugegeben. Die endgültige mit Rhenium markierte Antikörperkonzentration beträgt 1 × 10–9 M. Die Elektrochemilumineszenz wird wie vorstehend beschrieben gemessen.
  • Weitere Lösungen, die verschiedene Verdünnungen der mit Rhenium markierten Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper-Stammlösung darstellen, werden hergestellt und aliquote Teile (80 Mikroliter) dieser Lösungen der gleichen Lösung von mit Rhenium markiertem Antikörper im Reaktionsgefäß nach und nach zugesetzt. Dabei entstehen folgende Konzentrationen an markiertem Antikörper: 5 × 10–8 M, 1 × 10–8 M und 5 × 10–8 M. Die Elektrochemilumineszenzmessungen werden wie beschrieben für jede Lösung vorgenommen. Die Ergebnisse zeigen die Sensibilität des ECL-Nachweises von markiertem Antikörper (1 × 10–9 M) und die Abhängigkeit der Intensität der Elektrochemilumineszenz von der Konzentration des mit Rhenium markierten anti-Maus-IgG-Antikörpers.
  • Beispiel 10
  • Homogener ECL-Immuntest für Antikörper auf Rinderserumalbumin (BSA)
  • Eine Lösung, die 7,8 × 10–6 M mit fac-(bpy)Re(CO)3[3-(4-Pyridyl)propionsäure]-ClO4·H2O (Verbindung VI) markiertes Rinderserumalbumin (mit Rhenium markiertes HSA) enthält, wird aus einer Stammlösung von mit Rhenium markiertem BSA (2,5 mg/ml, 6 Re/BSA) durch Verdünnen in mit Phosphat gepufferter Salzlösung hergestellt. 26 Mikroliter dieser Lösung werden im Reaktionsgefäß 10 ml DMSO/entionisiertem destilliertem Wasser (1 : 1), das 0,1 M TBABF4 und 18 mM Ammoniumpersulfat enthält, zugegeben. Die endgültige mit Rhenium markierte BSA-Konzentration ist 2 × 10–8 M. Die Elektrochemilumineszenz wird gemessen wie in Beispiel 9 beschrieben.
  • Analog wird eine Lösung, die 7,8 × 10–6 M unmarkiertes BSA enthält, hergestellt und dem Reaktionsgefäß zugesetzt, um eine endgültige unmarkierte BSA-Konzentration von 5 × 10–8 M zu ergeben. Die Elektrochemilumineszenz dieser Lösung und einer ähnlichen Lösung ohne BSA wird gemessen.
  • Eine Lösung, die 3,75 × 10–5 M Kaninchen-anti-BSA-Antikörper enthält, wird aus einer Stammlösung von Kaninchen-anti-BSR-Antikörper (6,0 mg/ml) durch Verdünnen in PBS hergestellt und ein aliquoter Teil (26 Mikroliter) im Reaktionsgefäß zu der Lösung von mit Rhenium markiertem BSA zugegeben, um eine endgültige Kaninchenanti-BSA-Antikörper-Konzentration von 1 × 10–7 M zu er geben.
  • Die Elektrochemilumineszenz der resultierenden Mischung von mit Rhenium markiertem BSA-Antigen und Antikörper (Kanichen-anti-BSA) wird gemessen. Die Ergebnisse zeigen eine Verringerung in der Elektrochemilumineszenz des mit Rhenium markierten BSA bei Zugabe von Kaninchen-anti-BSA-Antikörper, was beweist, daß ein homogener ECL-Nachweis von Antikörper auf BSA möglich ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse ist einem Fachmann klar, daß ein homogener ECL-Immuntest zum Nachweis anderer relevanter Analyten entwickelt werden kann.
  • Beispiel 11
  • Heterogener ECL-Immuntest auf Legionella unter Verwendung eines Maus-anti-Legionella-Immunglobulin G (IgG) Antikörpers und eines mit Rhenium markierten Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin G (IgG) Antikörpers
  • Eine mit Formaldehyd behandelte Suspension des Bakteriums Legionella micdadei wird durch Verdünnung mit PBS Puffer auf eine optische Dichte (bei 425 nm) von 1,00 gebracht. Ungefähr 3 × 109 Zellen werden in ein konisches Mikrozentrifugenröhrchen eingebracht. Die Zellen werden zentrifugiert (10 Minuten; 10.000 upm), der Überstand abdekantiert und die Zellen erneut in einer 1 50 Verdünnung eines Maus-monoklonalen-IgG-Antikörpers (1,45 mg/ml), der für Legionella micdadei spezifisch ist, in PBS suspendiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur werden die Zellen zentrifugiert, der Überstand dekantiert, die Zellen in PBS Puffer erneut suspendiert und wieder zentrifugiert. Nach Abdekantieren des Überstands werden die Zellen von neuem in einer 1 : 50 Verdünnung (in PBS) von Kaninchen-anti-Maus IgG-Antikörper, der mit fac-(bpy)Re(CO)3[3-(4-Pyridyl)propionsäure]Clo4·H2O (Verbindung VI), d. h. mit Rhenium markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper (2 mg/ml, 7,5 Re/Antikörper) markiert ist, suspendiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur werden die Zellen zentrifugiert, der Überstand abdekantiert, und die Zellen wieder in PBS suspendiert und wie zuvor zweimal unter Zentrifugieren gewaschen. Nach der letzten Wäsche werden die Zellen in 200 Mikroliter PBS suspendiert. 100 Mikroliter der Zellsuspension gibt man in das Reaktionsgefäß, das 10 ml DMSO / entionisiertes destilliertes Wasser (1 : 1) mit 0,2 M TBABF4 und 18 mM Ammoniumpersulfat enthält. Die Elektrochemilumineszenz wird für die Zellsuspension gemessen. Weitere 100 Mikroliter der Zellsuspension werden dem Reaktionsgefäß zugegeben und die Elektrochemilumineszenz gemessen. Die Elektrochemilumineszenz wird nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren als Kontrolle auch für die Lösung ohne Zellen gemessen. Ein heterogener ECL-Immuntest für Legionella unter Verwendung von mit Rhenium markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper kann erfolgreich durchgeführt werden.
  • Beispiel 12
  • Herstellung von 2-[3-(4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-propyl]-1,3'-Dioxolan
  • Unter einer inerten Argonatmosphäre wurden 30 ml trockenes Tetrahydrofuran (THF) und 7,65 ml trockenes Diisopropylamin (54,5 mMol) in einen gerührten 600 ml Kolben eingespritzt. Die Lösung wurde durch Eintauchen des Kolbens in eine Mischung aus Trockeneis und Isopropanol in einem tiefen Becher abgekühlt. 21,6 ml 2,5 M n-Butyllithium (54 mMol) wurden dem Kolben langsam zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde 15 Minuten gerührt und eine in 100 ml trockenem THF aufgelöste Lösung aus 9,58 g 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (52 mMol) über den Zeitraum von einer Stunde tropfenweise durch eine Kanüle zugegeben. Dabei wurde gerührt.
  • Die resultierende braune Mischung wurde bei –78°C zwei Stunden weitergerührt. Dann spritzte man 10 g 2-(2-Bromethyl)-1,3-dioxolan (55 mMol) ein und rührte die dabei entstehende Mischung 5 Minuten bei –78°C. Dann wurde das Reaktionsgefäß in ein Eisbad (10°C) gelegt. Nach 30 Minuten begann sich die Farbe des Inhalts zu verändern. Nach einer Stunde war sie dunkelviolett, nach zwei Stunden blau, nach zweieinhalb Stunden grün und nach 3,25 Stunden zitronengelb.
  • Die Reaktionsmischung wurde mit 30 ml gesättigtem NaCl und anschließend 10 ml Wasser und 50 ml Ether abgeschreckt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit 300 ml Ether extrahiert und die kombinierten Etherphasen mit 100 ml Wasser rückextrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
  • Um das Reaktionsprodukt zu reinigen, wurde die Probe auf Aluminiumoxid (Merck) 90, Aktivität III, neutral, getrennt. Die verwendeten Elutionsmittel waren Petroleumether/Diethylether (1 : 1). Das Ausgangsmaterial eluiert vollständig mit Petroheumether/Diethylether (2 : 1). Das Produkt folgt.
  • Die Protonen NMR-Analyse bestätigte, daß das isolierte Reaktionsprodukt folgende Struktur hatte:
    Figure 00820001
  • Beispiel 13
  • Herstellung und Reinigung von 4-(Butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin
  • 2 g 2-[3-(4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-dioxolan wurden in 50 ml 1N HCl aufgelöst und 2 Stunden bei 50°C erwärmt. Die Lösung wurde abgekühlt, mit Natriumbicarbonat auf einen pH zwischen 7 und 8 eingestellt und zweimal mit 100 ml Chloroform extrahiert.
  • Die kombinierten Chloroformphasen wurden mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und rotationsverdampft, um ein gelbes Öl zu ergeben.
  • Das gelbe Öl wurde auf einer Silicagelkolonne unter Verwendung von Ethylacetat/Toluol (1 : 1) als Elutionsmittel eluiert, wobei die Verunreinigung mit Methanol eluiert wurde.
  • Die Protonen-NMR-Analyse [1·96–2·11 (m, 2H); 2.43 (s, 3H); 2·46–2·50 (t, 2H), 2·53–2·80 (M, 2H); 7·12–7·14 (m, 2H): 8·17–8·21 (br. s, 2H); 8·52–8·58 (m, 2H); 9.89 (s, 1H)] bestätigte, daß das Reaktionsprodukt folgende Struktur hatte:
    Figure 00830001
  • Beispiel 14
  • Herstellung von 4-(4-Methyl-2 2'-bipyridin-4'-yl]buttersäure
  • 0,5 g 4-(Butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin (2,0 mMol) wurden in 10 ml absolutem Aceton aufgelöst. 225 mg fein pulverisiertes Kaliumpermanganat (KMnO4; 1,42 mMol) wurden der Lösung unter Rühren in Portionen zugegeben. An die Reaktion schloß sich Dünnschichtchromatographie an (Kieselsäuregel; Ethylacetat/Toluol 50 50). Diese ergab, daß sich ein Bipyridin von geringem Rf bildete, während das Aldehyd allmählich verschwand.
  • Nachdem die Reaktion zum Abschluß gekommen war, wurde Wasser zugesetzt und das MnO2 filtriert und mit kleinen Portionen Na2CO3 (wäßrig) gewaschen. Das Aceton wurde rotationsverdampft und der Rückstand mit CH2Cl2 extrahiert, um nichtsaure Bipyridine zu entfernen. Die wäßrige Lösung wurde durch vorsichtige Zugabe von 1,0 N HCl auf einen pH von 4,8 angesäuert. Die Lösung wurde teilweise wolkig, als sie sich diesem pH näherte, wobei sich die Suspension bei einem geringeren pH wieder auflöste. Die Mischung wurde fünfmal mit gleichen Teilen CH2Cl2 extrahiert, über Na2SO4 getrocknet und zu einem Öl rotationsverdampft, das sich im Vakuum sofort verfestigte. Der rohe Feststoff wurde aus Chloroform Petroleumether umkristallisiert, um weiße Kristalle zu erhalten.
    Schmelzpunkt: 103,5 bis 105,5°C, IR: 1704 cm–1. Die Protonenanalyse entsprach folgender Struktur:
    Figure 00840001
  • Beispiel 15
  • Modulation eines ECL-Signals das durch ein Re(I)-Theophyllin-Konjugat unter Verwendung von für Theophyllin spezifischen Antikörpern erzeugt wurde
  • Die kovalent an Theophyllin gebundene Verbindung VI (Konjugat) wird unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer, der einen pH von 6,0 aufweist und 0,35 M Natriumfluorid (PBF Puffer) enthält, auf eine Endkonzentration von 150 nM verdünnt. Für Theophyllin spezifischer monoklonaler Antikörper (Klonzahl 9–49, Aszites-Los-Zahl WO399, Cat-Zahl 046} wird von Kallestad Laboratories, Inc., (Chaska, MN) bezogen. Der monoklonale Antikörper wird unter Verwendung von PBF Puffer zu verschiedenen Konzentrationen verdünnt (zwischen 21,9 Mikrogramm Protein/ml und 700 Mikrogramm/ml).
  • Ein weiterer monoklonaler Antikörper (Kontroll-MAB), der nicht mit Theophyllin reagiert, wird von Sigma (St. Louis, Mo.) bezogen und unter Verwendung von PBF Puffer zu verschiedenen Konzentrationen zwischen 21,9 Mikrogramm Protein/ml und 700 Mikrogramm/ml verdünnt. Unter Verwendung von Theophyllin, das von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, Cat-Zahl 26-240-8, Molekulargewicht 180,17) bezogen wurde, wird eine Standard Theophyllinlösung hergestellt. Theophyllin wird in PBF Puffer aufgelöst, um eine Endkonzentration von 75 Mikromolar zu ergeben und wird zur Verwendung in Tests mit PBF Puffer auf 6 Mikromolar verdünnt. Vor der Durchführung von ECL-Messungen wird eine Lösung, die 250 mM Oxalsäure und 5% Triton-X 100 enthält (ECL-Lösung) zu der Reaktionsmischung gegeben. Die Messungen werden mit einem Berthold-Lumineszenzmeßgerät durchgeführt, das so modifiziert ist, daß in das die Reaktionslösung enthaltende Teströhrchen zwei Elektroden aus Platingaze eingebracht werden können. Die Elektroden werden an einen Potentiostat angeschlossen und die Elektrochemilumines zenz gemessen, indem man eine angelegte Spannung von 1,5 bis 2,5 V mit einer Abtastgeschwindigkeit von 50 mV/sec über die Elektroden führt. Das für die Messung verwendete Lumineszenzmeßgerät von Berthold weist ein hochempfängliches, rotempfindliches Photomultiplier-Röhrchen auf. Die Ausgabe des Lumineszenzmeßgeräts an das Aufzeichnungsgerät wird auf 105 Zähler/Volt eingestellt. Die Messungen werden auf einem X-Y-Y'-Aufzeichnungsgerät aufgezeichnet und die Peak-Höhe zur Messung der Elektrochemilumineszenz verwendet. Zwischen den Messungen reinigt man die Elektroden durch Abspülen mit einer Pufferlösung mit einem pH von 4,2, die 0,1 M Phosphat, 0,1 Citrat, 0,025 M Oxalsäure und 1% Triton X-100 enthält. Man läßt die Elektroden 60 Sekunden in dieser Lösung zwischen +2,2 und –2,2V pulsieren und legt anschließend 10 Sekunden –2,2 V an. Als nächstes werden die Elektroden aus dieser Lösung genommen, in destilliertem Wasser gespült und abgetrocknet. Das Experiment wird wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
  • Eine Lösung aus monoklonalen Kontrollantikörpern, Antikörpern gegen Theophyllin oder PBF Puffer wird in einen Satz Teströhrchen gegeben (Schritt 1). Diesen Röhrchen setzt man eine Lösung von Theophyllin oder PBF Puffer zu (Schritt 2). Die Lösungen werden gemischt, indem man die Teströhrchen kurz schüttelt und sie 25 Minuten bei Raumtemperatur reagieren läßt. Dann wird eine Lösung des Konjugats in die Röhrchen gegeben (Schritt 3). Die Teströhrchen werden geschüttelt und 15 Minuten auf Raumtemperatur gehalten. Schließlich werden 100 Mikroliter der ECL-Lösung in jedes Röhrchen gegeben und die Elektrochemilumineszenz wie vorstehend beschrieben gemessen. Experimentalaufbau zum Studium der Auswirkungen der Wechselwirkungen von Antikörper-Re(I)-Theophyllin-Konjugat (Konjugat) auf die Elektrolumineszenz
    Figure 00870001
  • Das Experiment zeigt, daß ein monoklonaler Antikörper, der Theophyllin spezifisch erkennt, bei Kontakt mit Theophyllin, an das eine Rheniumverbindung (Verbindung VI) angefügt ist, d.h. ein Re(I)-Theophyillin-Konjugat, die Elektrochemilumineszenz senkt. Die Abnahme in der Elektrochemilumineszenz ist proportional zur Antikörperkonzentration, wenn die Konjugatkonzentration konstant gehalten wird. Wenn ein Antikörper verwendet wird, der nicht mit Theophyllin reagiert, ist bei der höchsten Antikörperkonzentration nur eine leichte Abnahme in der Elektrochemilumineszenz zu verzeichnen.
  • Die Daten zeigen auch, daß dann, wenn Theophyllin mit dem anti-Theophyllin-Antikörper in Kontakt gebracht und das Konjugat der Mischung anschließend zugesetzt wird, die Menge an Elektrochemilumineszenz größer ist. Dies zeigt, daß Theophyllin in Wettbewerb darum tritt, den Antikörper zu binden, was in einer größeren zur Erzeugung von Elektrochemilumineszenz fähigen Konjugatmenge resultiert.
  • Beispiel 16
  • Test auf Theophyllin in Serum auf der Basis eines homogenen ECL-Immuntests
  • Auf der Grundlage der in Beispiel 15 beschriebenen Ergebnisse wird ein homogener Immuntest auf Theophyllin unter Verwendung eines Antikörpers auf Theophyllin und des in Beispiel 15 beschriebenen Re(I)-Theophyllin-Konjugats (Konjugat) in einem kompetitiven Bindeformat entwickelt. Es werden die gleichen Materialien wie in Beispiel 15 verwendet mit dem Unterschied, daß es sich bei dem PBF Puffer um 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 6,0 handelt, der 0,1 M Natriumfluorid enthält. Für diesen Test wird eine spezifische Konzentration von monoklonalem Antikörper gegen Theophyllin gewählt. Die Antikörperkonzentration beträgt 55 Mikrogramm/ml. Die Konjugatkonzentration wird auf 175 nM eingestellt. Theophyllin wird menschlichem Serum zugesetzt, um Endkonzentrationen von 2,5, 5, 10, 20 und 40 Mikrogramm Theophyllin pro ml Serum zu ergeben.
  • Bei dem Test werden 10 Mikroliter Serum zu 290 Mikroliter monoklonalem anti-Theophyllin-Antikörper gegeben und die Lösung 25 Minuten auf Raumtemperatur gehalten. Dann werden in jedes Röhrchen 100 Mikroliter Konjugat gegeben, um eine Endkonzentration von 35 nM zu ergeben. Diese Lösung wird 15 Minuten auf Raumtemperatur gehal ten. 100 Mikroliter der in Beispiel 34 beschriebenen ECL-Lösung werden dann in jedes Röhrchen gegeben und die ECL-Eigenschaften jeder Lösung wie zuvor beschrieben gemessen, und zwar mit einem Abtastmodus für 1,5 bis 2,5 V bei 50 mV/sec. Die Ergebnisse zeigen, daß ein Zusammenhang zwischen der Theophyllinkonzentration in einer Serumprobe und der von der Reaktionsmischung ausgestrahlten Elektrochemilumineszenzmenge besteht. Diese Beobachtung zeigt, daß es möglich ist, einen Test auf Theophyllin zu entwickeln.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wäre es einem Fachmann möglich, einen homogenen ECL-Immuntest zum Nachweis und zur Quantifizierung eines relevanten Analyten in einer biologischen Matrix zu entwickeln.
  • Beispiel 17
  • Test auf Theophyllin in hämolysierten lipämischen ikterischen und normalen Serumproben auf der Basis eines homogenen ECL-Immuntests und Vergleich mit einem Fluoreszenzpolarisationstest
  • Die Theophyllinkonzentration in verschiedenen Typen von Serumproben wird unter Verwendung eines homogenen ECL-Immuntests bestimmt. Das Format des Tests ist ein kompetitiver Bindungstest unter Verwendung eines für Theophyllin spezifischen monoklonalen Antikörpers und des in Beispiel 15 beschriebenen Konjugats. Die Reagenzien und Verfahren für die Elektrochemilumineszenz sind im vorstehenden Beispiel beschrieben.
  • Der zur Messung der Theophyllinkonzentration in anderen Serumproben verwendete Fluoreszenzpolarisationstest wird unter Verwendung eines automatisierten TDX-Instruments von Abbott Laboratories (North Chicago, IL) durchgeführt. Hämolysierte, lipämische, ikterische und normale Sera wurden in den Tests verwendet; die Daten für die abnormen Sera sind nachstehend aufgeführt.
  • Eigenschaften des homogenen Theophyllintests von potentiell problematischem Serum
    Figure 00900001
  • Verschiedene Mengen Theophyllin werden den Serumproben zugesetzt, um Endkonzentrationen zwischen 2,5 und 40 Mikrogramm Theophyllin/ml zu ergeben. Die Daten werden für den homogenen ECL-Immuntest erhoben.
  • Jede Serumprobe wird auch durch einen Fluoreszenzpolarisationstest auf ihre Theophyllinkonzentration analysiert. Die im homogenen ECL-Immuntest gemessene Theophyllinkonzentration und die Ergebnisse des Fluoreszenzpolarisationstests werden verglichen. Dann werden die Daten als Streuaufzeichnung gesammelt. Die Datenpunkte werden durch lineare Regression analysiert und die Korrelationskoeffizienten kalkuliert. Die Analyse zeigt eine ausgezeichnete Korrelation zwischen den beiden Tests. Die Korrelationskoeffizienten (r) sind hoch. Die Neigung der Kurven für normale, hämolysierte und lipämische Serumproben liegt zwischen 0,8 und 1,2, was für eine ausgezeichnete Gewinnung von Theophyllin aus diesen Proben spricht.
  • Obwohl die durch die Theophyllin enthaltenden ikterischen Serumproben ausgestrahlte Elektrochemilumineszenz höher als bei den anderen Serumproben ist, ist sie bei jeder Theophyllinkonzentration proportional höher. Der Korrelationskoeffizient für die Datenpunkte ist im Vergleich von Elektrochemilumineszenz und Fluoreszenzpolarisation hoch; jedoch zeigt die Neigung, daß in einer ikterischen Serumprobe mehr Theophyllin zurückgewonnen wird.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse kann die Konzentration von Theophyllin in einer ikterischen Probe dadurch bestimmt werden, daß man eine Standardkurve für die Probe anlegt, indem man bekannte Mengen des Konjugats zu aliquoten Teilen des ikterischen Serums gibt. Diese Daten zeigen, daß ein homogener ECL-Immuntest dazu verwendet werden kann, um die Theophyllinkonzentration in Serumproben zu messen, die abnorme Mengen an Hämoglobin, Lipid und Bilirubin aufweisen.
  • Ein homogener ECL-Immuntest bietet gegenüber dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren Vorteile, weil der ECL-Nachweis wesentlich vielseitiger ist, d. h. er ist sensibler für den Nachweis bei höheren Konzentrationen biologischer Moleküle.
  • Außerdem ist ein homogener ECL-Immuntest im Vergleich mit dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren auch insofern vorteilhaft, als keine Quelle für einfallendes Licht erforderlich ist; um effizient Licht zu erzeugen, ist lediglich die elektrische Anregung erforderlich. Folglich ist keine anspruchsvolle optische Ausrüstung erforderlich. Da das Meßprinzip eine durch elektrochemische Stimulation ausgelöste rein spezifische Photonenemission ist, ist die Sensibilität des Systems potentiell wesentlich größer als bei der Fluoreszenzpolarisation, und es steht ein breiterer Dynamikbereich zur Verfügung. Auch beim homogenen ECL-Immuntest im Vergleich mit dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren ist die Messung mehrerer verschiedener Analyten möglich und man erreicht einen größeren Dynamikbereich. Auch ist beim homogenen ECL-Immuntest im Vergleich mit dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren aufgrund der selektiven Modulation der elektrisch stimulierten Chemilumineszenz durch biomolekulare Erkennungsereignisse, d. h. die Wechselwirkungen von Antikörper und Antigen, die Messung mehrerer verschiedener Analyten möglich.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse ist einem Fachmann klar, daß homogene ECL-Immuntests zum Nachweis anderer relevanter Analyten in abnormen Serumproben entwickelt werden können.
  • Beispiel 18
  • Test auf Theophyllin in einem Serum auf der Basis eines heterogenen ECL-Tests
  • Unter Verwendung eines immunometrischen Testformats wird ein heterogener Test auf Theophyllin unter Verwendung eines mit der Verbindung VI markierten anti-Theophyllin-Antikörpers und von auf magnetischen Teilchen von Biomag immobilisiertem Theophyllin-BSA entwickelt. Die Antikörperkonzentration beträgt 20 Mikrogramm/ml. Die Konzentration der magnetischen Teilchen ist 1% Feststoffe (Gew.-/Vol.) Theophyllin wird bis zu einer Endkonzentration von 10 und 40 Mikrogramm/ml Serum zugesetzt. Die Theophyllin-Serum-Standardsubstanzen werden tausendfach in PBF Puffer (Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 0,1 M Natriumfluorid) mit 0,1% BSA verdünnt.
  • Der Test wird durch Zugabe von 75 Mikrolitern der verdünnten Serum-Standardsubstanzen zu 75 Mikrolitern des an die Verbindung VI konjugierten Antikörpers und 20 Minuten Inkubieren der Lösung bei Raumtemperatur durchgeführt. Dann werden 50 Mikroliter der Theophyllin-BSA- Biomag-Teilchen zugesetzt und die Suspension 5 Minuten stehengelassen. Die Teilchen werden magnetisch getrennt und 100 Mikroliter des Überstands auf Elektrochemilumineszenz gemessen.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wäre ein Fachmann imstande, einen heterogenen ECL-Immuntest für andere relevante Analyten in einer biologischen Matrix zu entwickeln.
  • Beispiel 19
  • Markieren von DNS mit einer elektrochemilumineszierenden Komponente
  • Folgendes Verfahren ist zum Markieren von DNS mit einer elektrochemilumineszierenden Komponente verwendet worden.
  • 1,0 A260 des speziell synthetisierten 38 mer (MBI 38)
    TCACCAATAAACCGCAAACACCATCCCGTCCTGCCAGT*
    wo T* Thymidin ist, das an der Kohlenstoffposition 5 mit -CH=CH-CO-NH-(CH2)7-NH2 modifiziert ist, werden in 100 Mikrolitern 0,01 M Phosphatpuffer, pH 8,7 aufgelöst. 100 Mikroliter einer Lösung von fac-(bpy)Re(CO)3[3-(4-bipyridyl)propionsäure]ClO4·H2O (Verbindung VI) (2,3 mg in 300 Mikroliter 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,7 werden zugesetzt. Der Inhalt wird gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen.
  • 100 Mikroliter einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumborhydrid werden der Mischung zugesetzt, um die reversible Imin-Schiffsche Base-Verkettung in eine nicht reversible Aminverkettung umzuwandeln. Man läßt die Reaktion zwei Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Anschließend behandelt man die Lösung sorgfältig mit einigen Tropfen verdünnter Essigsäure, um überschüssiges Natriumborhydrid-abzuschrecken. Die Reaktionslösung wird in eine P-2 Gelfiltrationskolonne (18 inches × 1/2 inch) eingebracht, die zuvor mit 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 6,77, ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Kolonne wird mit dem gleichen Puffer eluiert und 2 ml Fraktionen mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h gesammelt. In den Fraktionen 9 und 10 eluierte DNS wird gut von nicht umgesetztem Rheniumkomplex abgetrennt. Die gesammelte DNS-Probe weist eine typische UV-Absorption sowie bei Anregung außerdem ein fluoreszierendes Emissionsspektrum auf. Die Fluoreszenzemission zeigt, daß die Rheniumkomponente in der DNS-Probe vorhanden ist. Das Produkt läuft bei der Polyacrylamidgelelektrophorese als einzelnes fluoreszierendes Band durch. Die elektrophoretische Beweglichkeit der markierten DNS (MBI 38-Verbindung VI-Konjugat) ist ungefähr die gleiche wie die von unmarkierter DNS.
  • Beispiel 20
  • Elektrisch erzeugte Chemilumineszenzeigenschaften von markierter DNS
  • Die markierte DNS-Probe aus Beispiel 19, Synthese A (MBI 38-Verbindung I) wird dazu verwendet, ihre ECL-Eigenschaften zu studieren. Verschiedene Konzentrationen markierter DNS werden in 0,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 4,2, der 0,1 M Citrat, 25 mM Oxalat und 1,0 Triton X-100 enthält, aufgelöst und auf einem modifizierten Lumineszenzmeßgerät von Berthold gemessen. Das ECL-Signal spricht auf verschiedene DNS-Konzentrationen an.
  • Beispiel 21
  • Hybridisierungsstudien eines mit der Verbindung VI markierten Oligonucleotids
  • Der Komplementärstrang des in Beispiel 20 beschriebenen 38 mer wird unter Verwendung des DNS-Synthetisiergeräts von ABI, Modell 380 B, synthetisiert und mit MGEN-38 bezeichnet.
  • Um festzustellen, ob die kovalente Anfügung der Verbindung I an den Oligonucleotiden die Hybridisierungseigenschaften des MBI 38 Oligonucleotiden beeinträchtigt, wird folgendes Experiment durchgeführt. Verschiedene Konzentrationen des Zielfragments (MGEN-38) werden auf eine Folie aus Gelman RP Nylonmembran getupft, fixiert und entweder mit MBI 38 oder MBI-38-Verbindung VI getestet. Beide Fragmente werden mit T4 Polynucleotidkinase und γ 32P[ATP] behandelt und am 5'-Ende mit 32P markiert. Dann werden die Hybridisierungssensibilitäten von DNS und mit Verbindung VI markierter DNS verglichen.
  • Konzentrationen von MGEN-38 DNS im Bereich von 50 ng bis zu nur 0,05 ng werden auf eine Nylonmembran getupft und an der Luft trocknen gelassen. Dann werden Duplikatmembranen angelegt. Die Blots werden jeweils zwei Minuten in folgenden Substanzen behandelt: 1,5 M NaCl-0,5 NaOH, um die DNS vollständig zu denaturieren; 1,5 M NaCl–0,5 M TRIS, um den Blot zu neutralisieren und schließlich in 2X SSC. Der Blot wird zwei Stunden bei 80°C in einem Vakuumofen gebacken.
  • Die Hybridisierungsprobe wird wie folgt hergestellt: 3 Mikrogramm MBI 38 und MBI 38-Verbindung I werden mit 10 Einheiten T4-Kinase und 125 Mikrocurie γ 32P-ATP kinasiert. Der Prozentsatz der Isotopinkorporierung in die DNS wird bestimmt.
  • Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösungen werden gemäß Maniatis (24) hergestellt. Blots werden vier Stunden bei 53°C mit 50 Mikrogramm/ml Kalbsthymus-DNS prähybridisiert. Dann werden die Blots in eine Hybridisierungslösung gelegt, die die jeweiligen Proben bei 10.000.000 cpm enthält, und über Nacht (12 Stunden) bei 53°C hybridisieren gelassen. Am folgenden Tag werden die Blots wie folgt gewaschen:
    • – zweimal mit 2X SSC + 0,1% SDS bei 53°C, und zwar 15 Minuten pro Wäsche
    • – zweimal mit 0,2X SSC + 0,1% SDS (wie oben)
    • – zweimal mit 0,16% X SSC + 0,1% SDS (wie oben)
  • Dann werden die Blots an der Luft getrocknet und bei –70°C mit einem Kodak X-omat Film photographiert.
  • Die Analyse des Röntgenbildes zeigt, daß bei der MBI 38- und der MBI 38-Verbindung VI-Probe sehr ähnliche Hybridisierungsmuster zu beobachten sind. In beiden Fällen ist die Hybrisidierung der Probe bis auf 0,5 ng des Zielwertes zu beobachten, und schwache Spuren von Hybridisierung werden bis zu 0,05 ng der Ziel-DNS beobachtet. Keine Hybridisierungsaktivität durch die Probe ist bei der negativen Kontroll-DNS (Phage λ DNS, bei 50 ng betupft).
  • Beispiel 22
  • Die 38-mer E. coli Probe, markiert mit
    Figure 00960001
    wie in Beispiel 21 beschrieben, wurde mit einer Probe von E. coli Nucleinsäure gemäß Maniatis hybridisiert [Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J., Molecular Cloning: A laboratory manual, S. 150–160, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY (1982)]. Dann wurde der hybridisierte Komplex durch eine andere, an eine feste Unterlage gebundene Probe eingefangen, die komplementär zu einer anderen Sequenz der E. coli DNS neben der Signalprobe ist. Bei dem Einfangverfahren bediente man sich der gleichen Hybridisierungsbedingungen wie im ersten Teil dieses Protokolls. Der hybridisierte Komplex wurde durch Zentrifugieren und wiederholtes Waschen von den einsträngigen Nucleinsäuren getrennt. Dann wurde der isolierte Komplex bei 100°C fünf Minuten in Wasser erhitzt, um ihn zu dissoziieren. Die jetzt in die Lösung freigesetzte markierte Probe wurde in eine entsprechende Substanz gegeben, um das elektrochemilumineszierende Signal zu messen. Die Intensität des Signals entsprach auf lineare Weise der Menge der Ziel-DNS.
  • Die Probe der aminoverketteten DNS (a 38-mer, das 15 Nucleotidconsensus-Sequenzen von E. coli enthielt) wurde in 100 μl 0,01 M Phosphatpuffer, pH 8,7, aufgelöst. 100 μl einer Lösung des Osmiumkomplexes
    Figure 00970001
    2,3 mg in 300 Mikrolitern 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,7) wurden zugesetzt. Der Inhalt wurde gerührt und bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen.
  • 100 Mikroliter einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumborhydrid wurden der Mischung zugesetzt, um die reversible Imin-Schiffsche Base-Verkettung in eine nicht reversible Aminverkettung umzuwandeln. Man ließ die Reaktion zwei Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Die markierte Probe wurde durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Die markierte DNS-Probe wies spektroskopische Eigenschaften auf, die der Anfügung des Osmiumkomplexes entsprachen.
  • Die mit dem Osmiumkomplex markierte Probe wurde mit einer Probe von E. coli Nucleinsäure nach Maniatis (siehe oben) hybridisiert. Dann wurde der hybridisierte Komplex durch eine andere an eine feste Unterlage gebundene Probe eingefangen, die komplementär zu einer anderen Sequenz von E. coli DNS neben der Signalprobe war. Bei dem Einfangverfahren verwendet man die gleichen hybridisierten Bedingungen wie im ersten Teil dieses Protokolls. Der hybridisierte Komplex wird durch Zentrifugieren und wiederholtes Waschen von den einsträngigen Nucleinsäuren abgetrennt. Anschließend wird der isolierte Komplex in Wasser bei 100°C 5 Minuten erhitzt, um ihn zu dissoziieren. Die jetzt in die Lösung freigesetzte Probe wird in eine entsprechende Substanz umgefüllt, um das elektrochemilumineszierende Signal zu messen. Die Intensität des Signals entspricht auf lineare Weise der Menge der Ziel-DNS.
  • Der Rheniumkomplex
    Figure 00980001
    wird zuerst in ein N-Hydroxysuccinimid-Derivat umgewandelt, indem man 3 mg in 60 Mikrolitern wasserfreiem Dimethylformamid auflöst und mit einer Lösung von N-Hydroxysuccinimid (52 mg) in 200 Mikrolitern wasserfreiem DMF in Gegenwart von 94 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) behandelt. Man läßt die Reaktion 4 Stunden bei 0°C ablaufen. Ausgefällter Dicyclohexylharnstoff wird durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand (200 Mikroliter) wird zu der Lösung der aminoverketteten DNS (ein 38-mer mit 15 Nucleotidconsensus-Sequenzen von E. coli) in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 8,77 (2A260 in 100 Mikroliter Puffer) gegeben. Man läßt die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen. In der Reaktion fällt eine erhebliche Menge an Feststoffen an, die durch Filtration durch Glaswolle entfernt werden. Das Filtrat wird konzentriert und in 0,5 ml 1 M Triethylammoniumacetat (pH 6,8) aufgelöst. Dann wird die Reaktionsmischung auf einer Gelfiltrationskolonne chromatographiert. Die markierte DNS-Probe weist spektroskopische Eigenschaften auf, die der Anfügung des Rheniumkomplexes (em 594 nm) entsprechen.
  • Die mit Rhenium markierte Probe wird mit einer Probe von E. coli Nucleinsäuren nach Maniatis (siehe oben) hybridisiert. Dann wird der hybridisierte Komplex durch eine andere an eine feste Unterlage gebundene Probe eingefangen, die komplementär zu einem anderen Segment von E. coli DNS neben der Signalprobe war. Bei dem Einfangverfahren verwendet man die gleichen hybridisierten Bedingungen wie im ersten Teil dieses Protokolls. Der hybridisierte Komplex wird durch Zentrifugieren und wiederholtes Waschen von den einsträngigen Nucleinsäuren abgetrennt. Anschließend wird der isolierte Komplex in Wasser bei 100°C 5 Minuten erhitzt, um ihn zu dissoziieren. Die jetzt in die Lösung freigesetzte Probe wird in eine entsprechende Substanz umgefüllt, um das elektrochemilumineszierende Signal zu messen. Die Intensität des Signals entspricht auf lineare Weise der Menge der Ziel-DNS.
  • Die unabhängig mit Ruthenium-, Rhenium- und Osmiumkomplexen markierte 38-mer DNS-Probe von E. coli wird in verschiedenen Experimenten verwendet, um mit ihren Komplementärsequenzen zu hybridisieren. Das Elektrochemilumineszenzsignal des Duplex wird mit dem Elektrochemilumineszenzsignal der entsprechenden markierten einsträngigen Probe verglichen. In jedem Fall ist bei dem Duplex eine Modulation des Elektrochemilumineszenzsignals zu beobachten.
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Claims (38)

  1. Lumineszenter Komplex des Re, befähigt zur chemischen, elektrochemischen und/oder elektromagnetischen Anregung in einen lumineszenten Zustand, wenn er sich in Anwesenheit eines interessierenden Analyten befindet, und worin der Komplex, wenn er sich in dem lumineszenten Zustand befindet, elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge im Bereich von 200 nm bis 900 nm emittiert, der Komplex umfassend: – mindestens einen mittels direkter Koordination an Re gebundenen, mehrzähnigen Liganden; – wahlweise mindestens einen mittels direkter Koordination an Re gebundenen einzähnigen Liganden; und – eine Substanz, die entweder über direkte Koordination oder durch kovalente Anbindung an einen Liganden des Komplexes an das Re gebunden ist, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus ganzen Zellen, Viren, subzellulären Teilchen, Proteinen, Lipoproteinen, Glycoproteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Polysacchariden, Lipopolysacchariden, Lipiden, Fettsäuren, Peptiden, pharmazeutischen Mitteln, Tranquilizern, Barbituraten, Alkaloiden, Steroiden, Vitaminen, Aminosäuren, synthetischen Peptiden, synthetischen Nukleinsäuren, synthetischen Membranen, Liposomen, Vesikeln und nicht biologischen Polymeren; und worin die Gesamtzahl an Bindungen an das Re die Koordinationszahl von Re sättigt.
  2. Komplex gemäß Anspruch 1, enthaltend einen mehrzähnigen Liganden, ausgewählt unter Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthrolyl, einem Porphyrin, einem substituierten Bipyridyl, einem substituierten Bipyrazyl, einem substituierten Terpyridyl, einem substituierten Phenanthrolyl, oder einem substituierten Porphyrin.
  3. Komplex gemäß Anspruch 1, enthaltend 2 bidentate Liganden, worin jeder bidentate Ligand Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthrolyl, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl, substituiertes Terpyridyl oder substituiertes Phenanthrolyl darstellt.
  4. Komplex gemäß Anspruch 1, enthaltend 3 bidentate Liganden, worin jeder bidentate Ligand Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthrolyl, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl, substituiertes Terpyridyl oder substituiertes Phenanthrolyl darstellt.
  5. Komplex gemäß Anspruch 1, worin der mindestens eine mehrzähnige Ligand ein Bipyridyl ist, substituiert mit einem Alkyl, substituierten Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Aralkyl, substituertem Aralkyl, einem Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxy, Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidin, Ureid, einer schwefelhaltigen Gruppe, einer phosphorhaltigen Gruppe oder dem Carboxylatester von N-Hydroxysuccinimid.
  6. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin einer der mindestens einem einzähnigen Liganden ein Carbonylligand ist.
  7. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin einer der mindestens einem einzähnigen Liganden substituiert ist mit einem Alkyl, substituierten Alkyl, Aryl, substituierten Aryl, Aralkyl, substituiertem Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxy, Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidin, Ureid, einer schwefelhaltigen Gruppe, einer phosphorhaltigen Gruppe oder dem Carboxylatester von N-Hydroxysuccinimid.
  8. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus ganzen Zellen, Viren, subzellulären Teilchen, Proteinen, Lipoproteinen, Glycoproteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Polysacchariden, Lipopolysacchariden, Lipiden, Fettsäuren, Barbituraten, Alkaloiden, Steroiden, Vitaminen und Aminosäuren.
  9. Komplex nach Anspruch 8, worin die Substanz ein Serum abgeleiteter Antikörper oder monoclonaler Antikörper ist oder von diesen abgeleitet ist.
  10. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Substanz an einen oder mehrere Liganden des Komplexes durch eine oder mehrere direkte Amidbindungen gebunden ist.
  11. Komplex gemäß Anspruch 1 mit der Formel: [X-(Y)u-Z]v+(R)w worin X eins oder mehrere Nukleotide, die gleich oder verschieden sind, eine oder mehrere Aminosäuren, die gleich oder verschieden sind, einen Antikörper, einen interessierenden Analyten oder ein Analogon eines interessierenden Analyten darstellt; Y eine Linkergruppe ist; Z Re, mindestens einen mehrzähnigen Liganden und wahlweise mindestens einen einzähnigen Liganden umfasst; R ein Anion darstellt; u 0 oder eine ganze Zahl ist; v 0, 1, 2 oder 3 ist und w 0 oder 1 ist, mit der Maßgabe, dass dann, wenn w 0 ist, v 0 ist.
  12. Komplex gemäß Anspruch 11, worin Y(CH2)n-, -CH=CH-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-(CH2)m-, -(CH2)m-CO-NH-(CH2)n- oder -(CH2)m-C(CH3)2(CH2)n-CO-NH(CH2)r ist und m, n und r alle gleich oder ungleich sind und jedes eine ganze Zahl größer oder gleich 1 darstellt.
  13. Komplex gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin i bis(2,2'-Bipyridin)[4-butan-1-al-4'-methyl-2,2'bipyridin]-rhenium, (2,2'-bipyridin)maleimidohexansäure; 4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamidrhenium oder bis(2,2'-Bipyridin)[4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl]-rhenium ist.
  14. Komplex gemäß Anspruch 11, Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin X Theophyllin ist und u, v und w 1 bedeuten.
  15. Verbindung zur Verwendung bei der Herstellung des Komplexes aus Anspruch 1 mit der Struktur:
    Figure 01050001
    worin X und X' und Y und Y' gleich oder verschieden sein können, X und X' H, N(CH2H5)2, CH3, CH3O, C6H5, Cl, CO2CH3, CN oder NO2 sein können und Y und Y' entweder H oder CH3 sein können, mit der Maßgabe, dass dann, wenn X dasselbe bedeutet wie X' und Y dasselbe bedeutet wie Y' und X CO2CH3 bedeutet, Y nicht H ist, und weiterhin mit in der Maßgabe, dass dann, wenn X und X' dasselbe bedeuten und Y und Y' dasselbe bedeuten, X und Y nicht H sind; und worin R ein Anion ist.
  16. Verbindung zur Verwendung bei der Herstellung des Komplexes gemäß Anspruch 1 mit der Formel
    Figure 01060001
    worin W ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus CHO, COOH, NH2 und Br, R ein Anion ist, n eine ganze Zahl ist, m 1, 2 oder 3 bedeutet und die Bipyridylgruppe substituiert oder unsubstituiert ist.
  17. Verbindung gemäß Anspruch 16 mit der Formel:
    Figure 01060002
    worin n 1, 2 oder 3 ist und R ein Anion darstellt.
  18. Verbindung zur Verwendung bei der Herstellung des Komplexes gemäß Anspruch 1 mit der Formel:
    Figure 01070001
    worin n 1, 2 oder 3 ist und R ein Anion darstellt.
  19. Zubereitung, die den Komp1ex nach einem der Ansprüche 1 bis 14 sowie einen oder mehrere andere Komplexe umfasst, von denen jeder zur Emission elektromagnetischer Strahlung einer unterschiedlichen Wellenlänge indziert werden kann.
  20. Zubereitung gemäß Anspruch 19, worin die Komplexe jeweils an verschiedene interessierende Analyten angeheftet sind.
  21. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines Komplexes, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, das die Bildung einer Reagenzmischung, enthaltend den Komplex, und das Detektieren der Anwesenheit des Komplexes umfasst.
  22. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit des Komplexes gemäß Anspruch 19 oder 20, das umfasst: (a) Ausbilden einer Reagenzmischung unter geeigneten Bedingungen, enthaltend die Komplexe; (b) Induzieren der Komplexe zur Emission elektromagnetischer Strahlung durch Exposition der Reagenzmischung an elektromagnetische Energie, chemische Energie oder elektrochemische Energie; und (c) Detektieren der emittierten elektromagnetischen Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen und dadurch Bestimmen der Anwesenheit der Komplexe.
  23. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von einem der mehreren interessierenden Analyten, die selektiv an die verschiedenen Komplexe gemäß Anspruch 20 binden, das umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Analyten mit den Komplexen unter geeigneten Bedingungen, um eine Reagenzmischung zu bilden; (b) Induzieren der Komplexe zur Emission elektromagnetischer Strahlung durch Exposition der Reagenzmischung an elektromagnetische Energie, chemische Energie oder elektrochemische Energie; und (c) Detektieren der emittierten elektromagnetischen Strahlung verschiedener Wellenlängen und dadurch Bestimmen der Anwesenheit jedes der interessierenden Analyten.
  24. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines interessierenden Analyten, der an einen Komplex bindet, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, das Verfahren umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen des Analyten mit dem Komplex unter geeigneten Bedingungen, um eine Reagenzmischung zu bilden; (b) Induzieren des Komplexes zur Emission elektromagnetischer Strahlung durch Exposition der Reagenzmischung an chemische, elektrochemische oder elektromagnetische Energie; und (c) Detektieren der emittierten elektromagnetischen Strahlung und dadurch Bestimmen der Anwesenheit des interessierenden Analyten.
  25. Verfahren zur Detektion eines interessierenden Analyten in einem vorbestimmten Volumen einer flüssigen Mehrkomponentenprobe, wobei der Analyt in der Probe in einer Konzentration unterhalb von etwa 10–3 Molar vorhanden ist, das umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Reagenz, umfassend einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1–14, wobei der Komplex mit dem interessierenden Analyten kombinieren kann, wobei der Kontakt unter geeigneten Bedingungen bewirkt wird, so dass der Analyt und der Komplex kombinieren; (b) Exponieren der resultierenden Probe an eine Menge an chemischer, elektrochemischer oder elektromagnetischer Energie aus einer geeigneten Quelle, wirksam zum Induzieren des Komplexes zur wiederholten Emission von Strahlung, wobei die Exposition unter geeigneten Bedingungen bewirkt wird, um den Komplex zur wiederholten Emission elektromagnetischer Strahlung zu induzieren; und (c) Detektieren der so emittierten elektromagnetischen Strahlung und dadurch Detektieren der Anwesenheit des interessierenden Analyten in der Probe.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 25, worin die Probe an elektrochemische Energie exponiert wird und die emittierte elektromagnetische Strahlung Elektrochemolumineszenz darstellt.
  27. Verfahren zum Etablieren eines internen Standards für ein elektrochemo-lumineszentes Testsystem, umfassend die Schritte: (1) Bilden einer Lösung, enthaltend: (a) einen Analyten, umfassend einen ersten elektrochemolumineszenten Komplex, und (b) einen internen Standard, umfassend einen zweiten elektrochemolumineszenten Komplex, wobei die erste und zweite Verbindung elektrochemolumineszente Eigenschaften aufweisen, die im Wesentlichen voneinander unabhängig sind, so dass keine Interferenz zwischen beiden auftritt, und elektrochemolumineszenten Emissionen bei ausreichend unterschiedlichen Wellenlängen aufweisen, so dass sie unabhängig voneinander betrachtet werden können, und (2) unabhängiges Messen der Elektrochemolumineszenz des Analyten und des internen Standards, und (3) worin der erste, der zweite oder sowohl der erste als auch der zweite elektrochemolumineszente Komplex Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 14 sind.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 25, worin eine Vielzahl von Analyten in einer Mehrkomponentenmischung vorliegen und der Test gleichzeitig bezüglich dieser Vielzahl von Analyten durchgeführt wird unter Anwendung einer Kombination von elektrochemolumineszenten Einheiten, enthaltend: (1) Ruthenium und Rhenium, (2) Osmium und Rhenium oder (3) Ruthenium, Osmium und Rhenium.
  29. –
  30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, worin die Reagenzmischung an eine Kombination aus elektromagnetischer Strahlung, chemischer Energie und elektrochemischer Energie exponiert wird.
  31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 30, worin die Reagenzmischung Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Citrat, Tartrat oder Peroxydisulfat enthält.
  32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 30, worin die Verbindung durch die Exposition an die Energiequelle oxidiert wird.
  33. Verfahren gemäß Anspruch 32, worin die Energiequelle ein chemisches Oxidationsmittel, vorzugsweise ein Ce (IV)-Salz, PbO oder Magnesium ist.
  34. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 33, worin die Reagenzmischung kontinuierlich an eine Elektrode exponiert wird, deren Potential zwischen einem Potential, ausreichend, um die Reduktion des Komplexes zu bewirken, und einem Potential, ausreichend, um die Oxidation des Komplexes zu bewirken, oszilliert.
  35. System zum Bestimmen der Anwesenheit eines Komplexes, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, das System umfassend: (a) eine Reagenzmischung, umfassend den Komplex; (b) Mittel zum Induzieren des Komplexes zur Emission elektromagnetischer Strahlung; und (c) Mittel zum Detektieren der emittierten elektromagnetischen Strahlung.
  36. System gemäß Anspruch 35 zum Bestimmen der Anwesenheit eines interessierenden Analyten, der an einen Komplex bindet, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, worin (a) die Reagenzmischung einen Komplex umfasst, der an den interessierenden Analyten bindet.
  37. Verwendung eines Rheniumkomplexes, enthaltend mindestens einen mehrzähnigen Liganden als elektrochemolumineszenten Marker zum Detektieren und/oder Quantifizieren einer chemischen, biochemischen oder biologischen Substanz.
  38. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1–14, Verbindung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21–34, System gemäß den Ansprüchen 35 oder 36 oder Verwendung gemäß Anspruch 37, worin Re Re(I) darstellt.
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