DE3000879A1

DE3000879A1 - Neue polyfunktionelle disulfidverbindungen

Info

Publication number: DE3000879A1
Application number: DE19803000879
Authority: DE
Inventors: Tadashioro Fujii; Kikuo Kotani; Nobuaki Nakagawa; Kunio Ohyama; Susume Watanabe
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1979-01-12
Filing date: 1980-01-11
Publication date: 1980-07-24
Also published as: NL8000188A; GB2040935A; US4287345A; DE3000879C2; SE446184B; FR2446287A1; GB2040935B; SE8000146L; CA1134830A; FR2446287B1

Description

3 O u U C 7 9

Die Erfindung betrifft eine neue polyfunktioneile Disulfidverbindung der Formel

R-S-S-X-S-S- ^y (I)

worin R 2-Benzothiazolyl oder 2-Pyridyl-N-oxid bedeutet und X eine Abstandsgruppe bedeutet, die eine Alkylengruppe, direkt an die S-S-Gruppe gebunden, enthält.

,'Die erfindungsgemäße neue polyfunktionelle Disulfidverbindung der Formel (I), die im folgenden als "polyfunktionelle Verbindung (I)" bezeichnet wird, ist als Vernetzungsreagens nützlich, da sie funktioneile. Gruppen für die S-S-Austaus ehre aktivität mit zwei unterschiedlichen Arten von Reaktivitäten enthält.

Die polyfunktionelle Verbindung (I) weist eine S-S-Austauschreaktion bei einer äquimolaren Reaktion mit einer Verbindung mit einer Thiolgruppe, z.B. einem Enzym, einer Verbindung, die bei einer Immunreaktion auftritt, wie ein Hapten, ein Antigen oder Rezeptor, einem Träger, wie einem Proteinträger oder einem immobilisierten Träger, oder einem thiolmodifizierten Derivat auf. Bei der Reaktion der ersten Stufe zeigt die S-S-Gruppe, die an die 2-Benzothiazolylgruppe gebunden ist, eine S-S-Austauschreaktion mit einer Thiolgruppe in einer Verbindung mit einer Thiolgruppe. Wird nach der ersten Stufe der Reaktion zusätzlich eine Verbindung mit einer Thiolgruppe zugegeben und umgesetzt, so zeigt die S-S-Gruppe, die an die 2-Pyridylgruppe gebunden ist₉ ..." eine S-S-Austauschreaktivität zweiter Ordnung und die an die 2-Pyridylgruppe gebundene S-S-Gruppe reagiert mit der Thiolgruppe.

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'"■'-. : : .'is.C-:^_..^L...L.Li polyfunktionelle Verbindung (I) kenn -. . j .η ocr / iitivj tat ihrer funktioneilen Gruppen bei C'^3:~^:-H,~ v,.--f,-_r /'--<-,·->ν,3 "-ic Kor.bir.?tion ir.it einer Verbindung mit einer ". .■..Loüt-.-L:; r,-, '.ic Verbitterungen, die bei Icsunreaktionen aufu-iin, irädern oder ihren thiolipodifizierten Γτ r: ve:ten, für

"-;·;; ι '..--rd-jn. Sie kann auch zusammen r:;it einen Gpfu sch avs jM.-zyren und Substanzen, die bei Immunreakt.·? rncn auftreten, zu-OpTT-^_n πΊχΐ einem i~r,cbi 1.1 vierten Enzym, eincvi Gemisch aus Ei-Lyru und unlöslichem Träger, als feste Phase für den Immunoassay, zusammen mit einem Gemisch aus Sxibstanzen, die bei Imunreaktionen auftreten und einem unlöslichen Träger, als Träger für die Affinitätschroiüatographie oder zusammen mit einem haptenisehen Gemisch für die .Antikörperbildung das E=^t-η ^τ""α einen Proteinträger enthält, verwendet werden.

Die Anmelderin hat überraschenderweise gefunden, daß die polyfurlrtionelle Verbindung (i), die bei der Umsetzung von-Carbonsäurederivaten der Formel (II)

R-S-S-CH₂-CH₂-COOH (II)

worin R die zuvor gegebene Bedeutung besitzt mit einem Aminderivat der Formel (III)

J₁^-S-S-CH₂-CH₂-NH₂ (III)

erhalten wird, eine stufenweise S-S-Austauschreaktivität aufweist, wobei die S-S-Gruppe, die an die 2-Eensothiazolyl- oder 2-Pyridyl-iJ-oxid-Gruppe gebunden ist, eine S-S-Austauschreaktion für eine Verbindung mit einer Thiolgruppe erster Ordnung zeigt und die andere S-S-Gruppe, die an die 2-Pyridy!gruppe gebunden ist, eine S-S-Austauschreaktion zweiter Ordnung aufweist.

Zwei Arten von Verbindungen mit Thiolgruppen werden stufenweise mit der Verbindung (I) umgesetzt, und die Verbindung (I) ist somit eine nützliche Verbindung für verschiedene

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v^.^ -. ;-."¹"-^: "r . ir. ο.--αεη Verbindungen .~it einer T'hiolgruppe uijiiiuu.iv _; ~--~\ie Enden der Verbindung (I) gebunden

-bin anderes Yerfchrer. ~ur P«rs"ceiiuai-; ut: j.: "I^ Γν.-¹—t? onellen Verbindung (I) Les-uc-Lu d^ri:-.. ά-ί? 2 , 2 · -Di tnic-bi£-(^G:.zci-Liavol) und 2 ,2'-Ditriio-uis-^ji iCin) **it einer Dithiolverbindung der Fomel (IV)

HS-X-SH (IV)

worin X die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, (die im folgenden als "Dithiolverbindung (IV)" bezeichnet wird) in einem inerten Medium ungesetzt werden.

Die erfindungs;:e::.3.ße polyfunktionelle Verbindung (i) kann z.B. durch Umsetzung eines funktioneilen Derivats eines Cavboiisjmroäerivats der Formel (II) mit einem Aminderivat der Formel (III) in einem inerten Medium, je in äquimolarem Verhältnis, bei -20° bis 30⁰C während 10 Minuten bis 5 Stunden hergestellt werden. Beispiele inerter Medien sind Dimethylformamid, Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran und deren Gemische„ Das gewünschte Produkt, nämlich das polyfunktionelle Derivat (I), kann nach üblichen Trenn-, Isolierungs- oder Reinigungsverfahren hergestellt werden.

Das obige Carbonsäurederivat der Formel (II) kann beispielsweise entsprechend dem in der JA-OS 53-85900 beschriebenen Verfahren erhalten v/erden. Beispielsweise wird 2,2'-Dithiobis-(benzothiazol) oder 2,2'-Dithio-bis-(pyridin-N-oxid) mit 3-Mercaptopropionsäure in einem äquimolaren Verhältnis oder in einem etwas überschüssigen Verhältnis von 3-Mercaptopropionsäure in- Benzol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Aceton, Methanol oder Äthanol bei 10 bis 70⁰C während 10 Minuten bis 5 Stunden umgesetzt. Danach kann das

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3 O C;: Γ 7 3

G?--rL-ou:vc^:iUi-ouwi*ivc.t d^:_r Formel (II) nach an sich bekannten ^τ--'-· π i P'rverf anren, vie Kühlen, Koni. ;n tr lerer oder Vs^uuiü-._--.■"..r.-i.:r, erhalten werden. Das Carbonsäurederivat wird ir. seint-n aktivierten Ester durch Behandlung· des Säurederivats rit r-PIydroxysuccinimid oder p-i:ii.i-op2:v:ic-l ^r.d Dicyclo- :.-_.-:ylc-.arbodiir:id in einem Lösungsmitxel, vie DiraethylforE-amid, Äthylacetat, Tetrahydrofuran oder Dioxan, überführt oder es wird in sein Säurechlorid durch Umsetzung mit Thionylchlorid als reaktivem Derivat eines Carbonsäurederivats der Formel (II) umgewandelt. Das reaktive Derivat wird der Kondensationsreaktion mit einem Aminderivat der Formel (III) unterworfen oder es wird direkt mit dem Arainderivat mittels eines Kondensationsrrittels, wie Dicyclohexyloarbodiimid, umgesetzt. Ein weiteres Eeispiel eines Aminderivats der Fornel (III) wird in The Journal of Organic Chemistry, 29, 1635 (1964), beschrieben; hier wird 2-ITercaptoäthylamin mit Wasserstoffperoxid unter Bildung von 2-Anincäthyl-2'-aniinoäthanthiolsulfonat oxidiert, und diese Verbindung wird mit 2-Kercaptopyridin unter Bildung des Aminderivats umgesetzt. Sie kann ebenfalls durch Umsetzung von 2,2'-Dithio-bis-(pyridin) und 2-Mercaptoäthylamin erhalten werden.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung der polyfunktionellen Verbindung (i) ist die Umsetzung von 2,2'-Dithio-bis-(benzothiazol) oder 2,2'-Dithio-bis-(pyridin) mit der Dithiolverbindung (IV) in einem inerten Medium, wie zuvor erläutert. Beispiele von inerten Medien sind Lösungsmittel, die 2,2^l-Dithio-bis-(benzothiazol), 2,2^f-Dithio-bis-(pyridin) und die Dithiolverbindung (IV) auflösen können, z.B. Alkohole, wie Methanol oder Äthanol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthyläther, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Aceton, Benzol oder deren Gemische. Es können auch Gemische der obigen organischen Lösungsmittel und Wasser oder Pufferlösungen erwähnt werden.

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iJui Leifauiel tiiniT Dixhiolverbindunf (IV) ist eine Verh^r.-πν.τ;Γ. in ^^r ''ie Cr'.irr-c, die direkt '-.r. die Thiclgruppe ^etu-ü-n. ίεΐ, ciii& Alkylengruppe ist. Die Alkylenpruppe kann /--.fciaüke'Lcig oaer verzv.'eiptkettig sein oder sie ksnn iurclj

*.".: :uiii.rt r^in, aa-ir sie ki-.nn über eine .Ather^njr"⁰ verbunden sein. Beispiele sind Oixhiolverbindungen r.it 2 bis 10 Eohlenctoff&to-.-'n, ','ie 1 ,2-Di^ercaptoäthan, 1 ,4-Dirr.i-roaptoax.han, 1 ,6-Diixiei'capöohocan, 1 ,8-Dimercaptooctan, 1 ,9-Diniercaptononan, 1 ,lO-tiinercaptodecan, 2,3-Dinercaptc-1 -propanol, Di-(2-mercapto£"llryl)-äther, Dithioerythrit odar Dithiothreit.

Das Auflösen der 2,2^f-Dithio-bis-(benzothiazol)-₉ der 2,2'-Dithio-bis-(pyridin)- und der Dithiolverbindung (IV) kann vorab oder gleichzeitig erfolgen. Das Verhältnis von jedem Rergsns beträgt ir.ehr als 1 Mol oder bevorzugt 1 bis 1 ,5 Mol an 2,2^T-Dithio-bis-(benzoxhiazol) und mehr als 1 Mol oder bevorzugt 5 bis 30 Mol an 2,2'-Dithic-bis-(pyridin) pro IiOl der Dithiolverbindung (IV)., Die Reaktionstemperatur beträgt 0 bis 40⁰C. Die Reaktionszeit kann entsprechend der Reaktionstemperatur oder des verwendeten Lösungsmittels variieren und beträgt gewöhnlich 2 bis 240 Minutenο Die Isolierung der polyfunktionellen Verbindung (I) kann nach an sich bekannten Trenn-, Isolierungs- oder Reinigungsverfahren, wie durch Lösungsmittelextraktion oder Säulenchromatographie, erfolgen.

Die polyfunktionelle Verbindung (I) hat S-S-Gruppen an beiden Seiten ihrer Abstandsgruppe, und eine 2-Benzothiazolylgruppe, eine 2-Pyridyl-N-oxid-Gruppe oder eine 2-Pyridylgruppe ist an jede S-S-Gruppe gebunden. Die Abstandsgruppe ist identisch mit der Gruppe X in der Dithiolverbindung (IV) und ist eine Gruppe mit einer Alkylengruppe, direkt gebunden an die S-S-Gruppe. Die Alkylengruppe kann gerad-

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3 Q υ υ 6 7 9

l:c-ttir oder verzv;eigtkettig sein oder sie kann Substituenten, Aiaidbindungen oder Ätherbindungen aufweisen- Beispiele sind Abstandsgruppen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen.

Die S-5-AustauB direaktivitäten der erfindungs£eaäßen polyfunktionellen Verbindung sind in Tabelle 1 aufgeführt.

In der Tabelle werden die Verbindungen der Formel (Ia) und (Ib), wie im folgenden angegeben, als erfindungsgemäße polyfunktionelle Derivate (i) verwendet.

(Ia)

(Ib)

Als Verbindung mit einer Thiolgruppe wird Glutathion in einem Holverhältnis von dem 0,5- bis 2,0fachen Überschuß, bezogen auf die polyfunktionellen Verbindungen, verwendet, wobei die S-S-Austauschreaktivität der Verbindungen (Ia) und (Ib) gemessen werden soll. Die Konzentration ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Reaktion erfolgt in einem 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, als Reaktionsmedium bei 25°C während 30 Minuten, wobei der Puffer 1 ml EDTA enthält.

Die maximalen Absorptionen bei 310 mn, 333 nm und 343 nm des so gebildeten 2-Mercaptobenzothiazole, 2-Mercaptopyridin-N-oxids oder 2-Mercaptopyridins werden bei der Konzentration einer 50fachen Verdünnung der jeweiligen Reaktionsgemische bestimmt.

Bei den Versuchen, bei denen ein höherer als äquimolarer Überschuß an Glutathion verwendet wurde, wird die Reaktion

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30ÜÜG7Ü

durchgeführt, indem man zuerst das äquimolare Verhältnis von Glutathion zugibt und nach dem Nachweis des Reaktionsproduktes die restliche überschüssige Menge an Glutathion zuiü-rt.

_£_ A gibt in der Tabelle den Unterschied der Absorption bei der jeweiligen maximalen Abscrptioncwellenlclnge zwischen, nach und vor der Reaktion an.

Die molaren Absorptionskoeffizienten bei einer maximalen Absorptionswellenlänge sind wie folgt.

2-Mercaptopyridin-N-oxid: 3830 (333 mn), 3190 (3^3 nm); 2-Mercaptobenzothiazol: 19300 (310 nm), 160 (3^3 nm); 2-Mercaptopyridin: 3170 (310 nm), 7270 (333 nm),8130 (343 nm).

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Tabelle 1

> O

O Q

	^s^ Zugegebene ^s. Menge (Mol- · ^v. verhältnis) ^\[Konzentra- \. tion] Verbin- ^^ dung (I) \. [Konzentrat.] \^	Zugegebenes Glutathion	0,5 [0,8 x 10~³ M/l]	1,0 [1,6 χ 10~³ M/l]	1,0 + 0,5 [2,4 χ 10~³ M/l]	1,0 + 1,0 [3,2x10~³ M/:
	(Ia) [1,6 χ 10~³ M/l]	_Δ A₃₁₀=O,293 Δ A₃₄₃=O,002	^A₃₁₀ = 0,601 AA₃₄₃ = 0,013	AA₃₁₀ = 0,464 AA₃₄₃ = 0,127	AA₃₁₀=0,693 AA₃₄₃=O,249
0 3 0 030/	[1,6 χ 10"³ M/l]	+1	+2	+3	+3
ο	Bemerkungen	Δ^Α ₃₃₃=Ο,Ο58 AA₃₄₃=O,048	AA₃₃₃ = 0,122 AA₃₄₃ = 0,103	AA₃₃₃ = 0,228 AA₃₄₃ = 0,221	^333^=O'³³⁷ AA₃₄₃=O,343
ro	+4	+5	+6	+6
	(D	(ID	(III)	(IV)

OO O O

er»

3 Ü υ ί' υ / J

Bemerkungen:

+1 - es wird nur die Absorption von 2-Mercaptobenzothiazol nachgewiesen;

+2 - es wird eine Absorption von etwa 3% 2-Mercaptopyridin nachgewiesen?

+3 - nach der Zugabe von 1 Mol Glutaftiion wird eine starke Absorption von 2-Mercaptopyridin und keine Absorptionsänderung von 2-Mercaptobenzothiazol nachgewiesen;

+4 - es wird nur eine Absorption von 2-Mercaptopyridin-N-oxid nachgewiesen;

+5 - es wird eine Absorption von etwa 1,4% 2-Mer-/ captopyridin nachgewiesen;

+6 - nach der Zugabe von 1 Mol Glutathion wird eine starke Absorption von 2-Mercaptopyridin und keine Absorptionsänderung von 2-Mercaptopyridin-N-oxid nachgewiesen.

(I) S-S-Austauschreaktion, bei der fast das gesamte Glutathion mit der S-S-Gruppe, die an die 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxidgruppe gebunden ist, reagiert hat. Man beobachtet eine hohe Reaktivitätsrate.

(II) Fast quantitative S-S-Austauschreaktion für die S-S-Gruppe, die an die 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxidgruppe gebunden ist, wird beobachtet, mit der Ausnahme, daß eine S-S-Austauschreaktion von mehreren Prozent des Glutathions für die S-S-Gruppe, die an die 2-Pyridylgruppe gebunden ist, festgestellt wird.

(III) Bis zur Zugabe von 1 Mol Glutathion verläuft die S-S-Austauschreaktion für die an die 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxidgruppe gebundene S-S-Gruppe. Bei weiterer Zugabe von Glutathion verläuft die Reaktion stufenweise mit der verbleibenden S-S-Gruppe, die an die 2-Pyridylgruppe gebunden ist.

(IV) Gleich wie oben bei (III).

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ο η Fι r, r, -7 Q - 12 -

Wie aus Tabelle 1 folgt, ist die erfindungsgeiaäße polyfunktionelle Verbindung (I) eine neue Verbindung mit einer S-S-Austauschreaktivität, die in zwei stufenweise Reaktivitäten für eine Verbindung mit einer Thiolgruppe zerfällt. Die S-S-Austauschreaktivität ist für die Reaktionsrichtung konstant und quantitativ.

Eine andere S-S-Austauschreaktivität kann beispielsweise festgestellt werden, wenn die polyfunktionelle Verbindung (I) in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), der 10% Dimethylformamid enthält, gelöst und 2-Mercaptoäthanol zugegeben wird. Die Mengen an gebildetem 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercaptopyridin werden analysiert, wodurch die S-S-Austauschreaktivität der Verbindung bestätigt wird.

Die erfindungsgemäße polyfunktionelle Verbindung (I) besitzt verschiedene Verwendungsmöglichkeiten, z.B. als Vernetzungsmittel für einen gebundenen Komplex aus Enzym und Hapten, Antigen, Antikörper oder Rezeptor bei einem Enzym-Immunassay und einem Enzym-Rezeptorassay; als Vernetzungsmittel für einen gebundenen Komplex aus Hapten und einem Enzym bei der Antigenbildung; als Immobilisierungsmittel für die Immobilisierung eines festen Trägers und Hapten, Antigen, Antikörper oder Rezeptor bei einem Immunoassay; als Immobilisierungsreagens für einen gebunden Komplex aus Enzym und Träger bei einem immobilisierten Enzym; oder als Immobilisierungsreagens für Hapten, Antigen, Antikörper oder Rezeptor und Träger bei der Affinitätschromatographie. Weiterhin können reaktive Derivate der obigen physiologisch aktiven Substanzen oder Träger mit S-S-Austauschreaktivität erhalten werden, indem man diese Substanzen oder den Träger und die polyfunktionelle Verbindung umsetzt.

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Die erfindungsgemäße Verbindung kann erhalten werden, indem man in einem inerten Lösungsmittels wie Wasser, Phosphatpuffer, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder ihren Lo= sungsmittelmischungen, bei Umgebungstemperatur während 10 Minuten bis 24 Stunden umsetzt.

Die oben erwähnten, physiologisch aktiven Substanzen oder Träger sind nicht auf eine Verbindung mit einer Thiolgruppe₉ bzw. Enzyme wie ß-Galactosidase und Urease, oder im Handel erhältliche Träger mit Thiolgruppen, wie Acrylamidpolythiol oder eine Glasverbindung mit Thiolgruppe beschränkt. Physiologisch aktive Substanzen oder Träger, wie ein Protein oder ein Peptid mit einer S-S-Gruppe im Molekül, können nach der Reduktion der S-S-Gruppe verwendet werden» Die Thiolgruppe kann in eine funktionelle Gruppe, wie eine Aminogruppe,eingeführt werden, z. B. unter Verwendung von S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid [Arch„Bioehern» Biophys., 96, 605-612 (1962)]„ Das funktionelle Derivat des Disulfidderivats mit einer 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxidgruppe wird mit der Aminogruppe in der physiologisch aktiven Substanz oder dem Träger umgesetzt (JA-OS 53-85900) und die S-S-Gruppe wird durch Behandlung mit Dithiothreit oder Alkalis wie einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert über 9_S5_S zur Einführung der Thiolgruppe behandelt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.,

Beispiel 1

(1) Zu 40 g 2,2'~Dithio=bis~(benzothiazol) gibt man 1,5 1 Benzol und 8,0 g 3-Mercaptopropionat und setzt 3 h bei 70°C unter Rühren um» Danach wird das Reaktionsgemisch auf Zimmertemperatur abgekühlt, im Vakuum konzentriert und über Nacht bei 5°C stehengelassen« Dabei fallen rohe Kri-

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. -14-

stalle aus, die aus Benzol umkristallisiert werden; man erhält 16,25 g 3-(2'-Benzothiazolyldithio)-propionatkristalle

-CH₉-COOH; Fp. 163 Ms 164⁰C.

Zu 8,13 g 3-(2'-Benzothiazolyldithio)-propionat in 80 ml Dimethylformamid gibt man 34,5 g N-Hydroxysuccinimid und 6,8 g Dicyclohexylcarbodiimid, rührt 1 h unter Eiskühlung und 2 h bei Umgebungstemperatur. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird in 10 Vol. Wasser gegeben. Der sich bildende Niederschlag wird filtriert, getrocknet und wiederholt aus Benzol umkristallisiert; man erhält 7,18 g 3-(2'-Benzothiazolyl -dithio)-propionat-N-succinimid-ester-Kristalle.

0 .

Fp. 122 bis 123°C.

λ __ = 270 nm [Dimethylformamid:Phosphatpuffer max

(0,1 M, pH 7,5) = 1:5]. R_f = 0,53 (Silikagel TLC, Benzol:Äthylacetat = 3:1)

(2) Zu 10,0 g 2-Mercaptoäthylamin-hydrochlorid, gelöst in 40 ml Wasser, gibt man tropfenweise unter Rühren und Küh len im Verlauf von 30 min 4,5 ml 30%iges wäßriges Wasserstoffperoxid. Man fügt 9,0 ml 30%iges wäßriges Wasserstoffperoxid zu und läßt 24 h bei Zimmertemperatur stehen. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum unter Bildung eines Sirups konzentriert. Wasserfreies Äthanol wird zugesetzt zur Bildung von 10,7 g roher Kristalle, die aus Essigsäure umkristallisiert werden; man erhält 9,77 g 2-Aminoäthyl-2'-äminoäthan-thiolsulfonat-2-hydrochlorid in Form weißer, nadeiförmiger Kristalle.

H₂N-CH₂CH₂SO₂-S-CH₂-Ch₂-NH₂.2HCl; Fp.165 bis 166°C.

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O U U L ι_· , vJ

7,7 g 2-Aminöäthyl-2^I-aminoäthan-thiosulfonat»2HCl, gelöst in 12 ml einer 3 ml konz. Chlorwasserstoffsäure enthalten= den, wäßrigen Lösung,werden tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur mit 12 ml Äthanollösung aus 3933 g 2-Mercaptopyridin versetzt» Nach 20stündigem Rühren wird Äthanol aus dem Reaktionsgemisch abdestilliert (unter vermindertem Druck) und Chloroform zur Extraktion der nichtumgesetzten Verbindung zugegeben. Eine kalte, wäßrige Lösung, die 8,4 g Kaliumhydroxid enthält, wird zugegeben und dann wird mit Chloroform extrahiert« Anschließend wird noch zweimal mit Chloroform extrahiert» Diese Extrakte werden sofort mit konz= HCl geschüttelt» Die konz» HCl-Schichten werden vereinigt und konzentriert» Man erhält eine sirupartige Substanz. Wasserfreies Äthanol wird zur Ausfällung der rohen Kristalle (4,91 g) zugegeben, die aus wasserfreiem Äthanol umkristallisiert werden; man erhält 3,68 g 2=Pyridyl=2'·= aminoäthyldisulfid.2HCl»

-S-S-CH₂-CH₂=NH₂ο2HCl5 Fp» 150⁰C (Zers»)»

(3) 2,0 g 2-Pyridyl-2^!~aminoäthyldisulfid»2HCl werden in 20 g Wasser gelöst» Nach Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf 10 durch Zugabe von 1N wäßrigem Kaliumhydroxid wird mit Äthylacetat extrahiert» Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Zu der Äthylacetatschicht gibt man tropfenweise unter Kühlen und Rühren eine Äthylacetatlösung von 2,27 g 3-(2'-BenzothiazoIyIdithio)-propionat-N-succinimid= ester, setzt 90 min um, filtriert den gebildeten Niederschlag und trocknet. Dieser wird weiterhin in Chloroform gelöst, unter Eiskühlen mit 5%igem wäßrigem Natriumhydrogen= carbonat gewaschen, „dann mit Wasser gewaschen„ über was= serfreiem Natriumsulfat getrocknet und als Chloroform= schicht konzentriert. Hexan wird zu dem Konzentrat zugegeben; man erhält 2,07 g N~[2=(2«-Pyridyldith±o)-äthyl]~ 3-(2·-benzothiazolyldithio)-propionamido

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3 O O j ^; '< 7 y

E^_m = 235 [Dimethylformamid:0,1 M Phosphat-ι cm

puffer (pH 7,5) = 1:9] j

R_f = 0,41 (ChloroformtÄthylacetat =1:1, Silikagel TLC);

R_f = 0,12 (Benzol:Äthylacetat = 3:1, Silkagel TLC).

Die Reaktivität sowie die Nützlichkeit dieser Verbindung gehen klar aus den folgenden Ausführungen hervor.

Zu 0,85 M NaCl, enthaltend Antiinsulin-Antikörper-Fab' (2,0 mg) und Phosphatpuffer, enthaltend 1 mM EDTA (im folgenden als "PBS" bezeichnet), 0,01 M, pH 7,2, (2,0 ml) gibt man 10%ige Dimethylformamidlösung von PBS (0,01 M, pH 7,2), enthaltend 50/ug/ml Lösung von N-[2-(2'-Pyridyldithio)-äthyl]-3-(2'-benzothiazolyldithio)-propionamid (365/ul), und setzt 30 min bei 25°C um. Die Absorptionen bei 310 und 343 nm des Reaktionsgemisches \erden gemessen. Man stellt in dem Reaktionsgemisch 96% 2-Mercaptobenzothiazol und 3% 2-Mercaptopyridin in N-[2-(2'-pyridyldithio)-äthyl]-3-(2^t-benzothiazolyldithio)-propionamid fest.

Zu einer Probe dieses Reaktionsgemisches gibt man 2-Mercaptoäthanol. Man beobachtet keine Absorption des 2-Mercaptobenzothiazols, jedoch wird eine Absorption von 2-Mercaptopyridin beobachtet wovon 93% gebildet wurden'.

Als Ergebnis stellt man fest, daß etwa 96% Antiinsulin-Antikörper-Fab¹ beiMer S-S-Austauschreaktion mit der S-S-Gruppe, die an die 2-Benzothiazolylgruppe gebunden ist, reagiert haben»

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3GGVC79

Nach Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches (0,5 ml) mit 0,1N wäßrigem NaOH auf 8,5 wird eine Lösung von ß-Galactosidase (4,37 mg), gelöst in PBS (0,01 M, pH 8,5),1 h bei 25°C inkubiert. Eine Gelfiltration (Entwickler: PBS (0,01 M, pH 7,2) unter Verwendung von Sephadex G-50 (Warenzeichen, Pharmacia Finechemicals Co.)-Säule (1,5 x 8,4 cm) wird durchgeführt und die Fraktionen Nr.11 bis 13 mit je 5,0 ml Fraktion werden gesammelt. Diese Fraktionen enthalten 4,6% nichturngesetzte ß-Galactosidase und nichtumgesetzter Antiinsulin-Antikörper-Fab¹ wird nicht nachgewiesen.

Aus diesen Ergebnissen stellt man bei dieser Untersuchung fest, daß Antiinsulin-Antikörper-Fab' in einem Verhältnis von 1:1 für ß-Galactosidase gebunden ist» Die SH-Gruppe des Antiinsulin-Antikörper-Fab¹ hat bei der S-S-Austauschreaktion mit der an die 2-Benzothiazolylgruppe gebundene S-S-Gruppe reagiert, und die SH-Gruppe von ß-Galactosidase hat bei der -S-Austauschreaktion mit der an die 2-Pyridylgruppe gebundene S-S-Gruppe reagiert.

Der obige Antiinsulin-Antikörper-Fab' wird wie folgt hergestellt.

Zu IgG enthaltendem Antiinsulin-Antikörper (50 mg), gelöst in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5, 2 ml), gibt man 1 mg Pepsin (Sigma Co.), inkubiert 16 h bei 37°C. Die Lösung wird einer Gelfiltration unter Verwendung von einer Sephadex G-150'^R'-Säule [1,5 x 50 cm, Entwicklers 0,1 M Boratpuffer (pH 8,0)] unterworfen, wobei man eine aktive Fraktion erhält, die F(ab')₂ enthält. Die Fraktion wird mit einer Collodion-Packung konzentriert und gegenüber 0,1 M Acetatpufferlösung (pH 5,0) bei 4°C über Nacht dialysiert. Zu der inneren Lösung gibt man Mercaptoäthanolamin mit einer Konzentration von 10 mM und inkubiert 90 min

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• - 18 -

bei 37°C. Das Reaktionsgemisch wird für die Gelfiltration

unter Verwendung einer Sephadex G-25^V '-Säule [1,5 x 50 cm, Entwickler: 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,0)] genommen; man erhält die Fab·-Fraktion (15 mg). Die SH-Gruppe pro 1 Mol
des so erhaltenen Antiinsulin-Antikörper-Fab¹ beträgt etwa 0,95 Mol [J.Immunol., VUi (6), 1554 (1976)].

Beispiel 2

5.05 g 2,2'-Dithio-bis-(pyridin-N-oxid) v/erden in 200 ml
Chloroform aufgelöst und tropfenweise mit 2,55 g 3-Mercapto-

.. propionat versetzt. Das Gemisch wird 1 h bei 40°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt und die rohen, ausfallenden Kristalle werden abfiltriert und aus Chloroform umkristallisiert; man erhält Kristalle von 3-(2'-Pyridyl-N-oxid-dithio)-propionat (3,72 g) [R_f =0,63 (TLC, Silikagel, n-Butanol:Essigsäure!Wasser = 4:1:1)].

20 g 2-Pyridyl-2'-aminoäthyldisulfid.2HCl, erhalten gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, werden in 20 ml Wasser gelöst. Man stellt den pH-Wert auf 10 unter Eiskühlen und Zugabe von wäßrigem NaOH ein und extrahiert mit
Chloroform. Die Chloroformschicht wird gesammelt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.

Zu dem obigen 3-(2^f-Pyridyl-N-oxid-dithio)-propionat (1,19 g), gelöst in 50 ml Tetrahydrofuran, gibt man tropfenweise unter Kühlen und Rühren 2 ml einer Tetrahydrofuranlösung aus

.,06 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 20 min wird diese Lösung mit der obigen konzentrierten Lösung unter Rühren und Eiskühlen 1 h und bei Zimmertemperatur während 3 h vermischt.

Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, zu dem Filtrat gibt man Wasser und extrahiert mit Chloroform.

030030/0752

Op " O U V.,

Die Chloroformschicht wird mit 5%iger HCl, 5%igem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Chloroform wird abdestilliert; man erhält H-[2-(2'-Pyridyldithio)-äthyl]-3-(2"' -pyridyl-N-oxid-di thio) -propionamid.

-S-S-CH₉-CH₉-CO-NH-Ch₉-CH₉-S-S- L!

C- C. C. d. IM

R = 0,55 (obere Schicht aus n-ButanolsPyridinsEssigsäure:Wasser = 1Os3sO_?1s1i5 Silikagel TLC),

Beispiel 3

Zu 20 mg 2,2'-Dithio-bis-(benzothiazol), gelöst in 3 1 0_p1 M Phosphatpuffer (pH, 6,4, enthaltend 1 mM EDTA)₉ der 40% Äthanol enthält, gibt man tropfenweise 397 mg 2,2'-Dithio= bis-(pyridin), gelöst in 1 1 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,4, enthaltend 1 mM EDTA), der 40% Äthanol enthält, und 5,7 mg 1,2-Dimercaptoäthan, gelöst in 1 1 des gleichen Pufferlösungsgemisches, unter Rühren im Verlauf von 60 min zu» Nach der Reaktion wird Äthanol abdestilliert und dreimal mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wird gesammelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine Silikagel-Säule (1,0 χ 40 cm) gegeben und mit BenzolsÄthylacetat (20si) eluigert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum eingedampft; man erhält 13,2 mg 1-(2'-BenzothiazoIyI-dithio)-2-(2'-pyridyldithio)-äthan mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

^max = ¹79 nm [Dimethylformamid:0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) = 1:9;

R_f = + 0,51- (Silikagel TLC, Benzol:Äthylacetat=10si)

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BAD ORIGINAL

3 O r ^

- 20 -

ff

Zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 0,030 mMol dieser Verbindung, gelöst in 10% Dimethylformamid, gibt man 2-Mercaptoäthanol bei 0,1%. 2-Mercaptobenzothiazol (0,029 mMol) und 2-Mercaptopyridin (0,028 mMol) werden freigesetzt.

Beispiel 4

Zu einer Lösungsmischung aus 20 mg 2,2'-Dithio-bis(benzothiazol), gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,4, enthaltend 1 mM EDTA) (3 l), enthaltend 40% Äthanol, und 132 mg 2,2·- Dithio-bis-(pyridin, gelöst in 1 1 der gleichen Pufferlösung, gibt man tropfenweise 12,4 mg 1,10-Dimercaptodecan, gelöst in 1 1 der gleichen Pufferlösung, bei Zimmertemperatur unter Rühren zu und setzt 90 min um.

Nach der Reaktion wird Äthanol im Vakuum abdestilliert und dreimal mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten werden gesammelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine Silikagelsäule (1,0 χ 20 cm) gegeben und mit Benzol:Äthylacetat (20:1) eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum eingedampft; man erhält 19,5 mg 1-(2'-Benzothiazolyl-dithio)-10-(2'-pyridyldithio)-decan mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften.

Λ_ _. = 279 nm [Dimethylformamid:0,1 M Phosphat-

IHcLX

puffer (pH 7,5) = 1:9]

R_f = 0,51 (Benzol:Äthylacetat = 10:1, Silikagel TLC) R_f = 0,75 (Benzol:Äthylacetat = 3:1, Silkagel TLC)

3 0/0752 BAD ORIGINAL

- 21 -

Zu einer Lösung dieser Verbindung (0,030 M) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 10% Dimethylformamid, gibt man 2-Mercaptoäthanol bei einer Konzentration von 0,1%. 2-Mercaptobenzothiazol (0,029 mM) und 2-Mercaptopyridin (0,029 mM) werden freigesetzt.

Beispiele 5 bis 12

Man verwendet 2,2'-Dithio-bis-(benzothiazol), 2,2'-Dithiobis-(pyridin)sowie die folgende Dithiolverbindung (IV) und arbeitet gemäß dem Verfahren von Beispiel 3, wobei man jeweils die entsprechende polyfunktionelle Verbindung (I) erhält.

Die verwendeten Dithiolverbindungen (IV) sinds 1,4-Dimer= captobutan, 1,6-Dimercaptohexan_s 1_}8-Dimercaptooctan, 1,9-dimercaptononan, Di-(2-mercaptoäthyl)-äther, Dithioerythrit und Dithiothreit.

Die in der folgenden Tabelle 2 gewählten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:

2,2'-DBB = 2,2'-Dithio-bis-(benzothiazol) 2,2'-DBP = 2,2'-Dithio-bis-(pyridin).

030030/0752

BAD ORIGINAL

Tabelle 2

Dithiolverb.'(I) Very.Menge (mMol) an ________

u.ihre verwende- 2,2'-DBB 2,2'-DBP Struktur te Menge (mMol)

1,4-Dimercaptobutan 0,06

Polyfunktionelle Verbindung (I)

0,06 1,80 0^^S^-S-S-CH₂-(CH₂)2-CH₂-S-S-y 14,5 279

Ausbeu- λ max+ Rf^x . te(mg) (nm)

0,51

1,6-Dimercaptohexan 0,06

0,06

0,60 j^Y^S^-S-CH₂-(CH₂)₄-CH₂-S-S-Q 16,2 279 0,51

^ 1,8-Dimercapto- 0,06 ο octan 0,'06

0,60 (^Y^S ^-.S-S-CH₂(CH₂) ₆-CH₂-S-S- ζΐ 17,5 279 0,54

_ω cj 1,9-Dimercapto- > ° nonan 0,06

0,06

0,60 ,-(CHp)₇-CHo-S-S-O 18,6 279

0,58

Di-(2-mercaptoäthyl)-äther 0,06

0,06

0,60

0,50

Dithio erythrit 0,06

0,06

0,60

Dithiothreit 0,06 0,06

0,60

OH

"^S-S-CHoCH-CH-CHo-S-S-O

15,8 279

0,53

+ Dimethylformamid:0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) = 1:9, Silikagel TLC ++ BenholgÄthylacetat = 10:1, Silikagel TLC

30Q0879

Die obige polyfunktionelle Verbindung (I) in 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5), die 10% Dimethylformamid enthält, setzt 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Merca.ptopyridin entsprechend einer 97 bis 93% molaren Menge der polyfunktionellen Verbindung (i) bei der Zugabe von 2-Mercaptoäthanol frei*

Ende der Beschreibung.

030030/0752

^DAri ORlGSNAL

Claims

Patentansprüche 1 ./ Polyfunktionelle Disulfidverbindungen der Formel

R-S-S-X-S-S- ¹C_nJ (I)

worinR2-Benzothiazolyl oder N-Pyridyl-N-oxid bedeutet und X eine Abstandsgruppe bedeutet, die eine Alkylengruppe, direkt an die S-S-Gruppe gebunden, enthält=
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Abstandsgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die gegebenenfalls eine Substituentengruppe enthält.
3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Abstandsg-fuppe mit einer Amidbindung ist.

7624

3QÖ30/0752

BAD ORIGINAL

3000979
4. Verbindlang nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstandsgruppe X eine Alkylengruppe ist.
5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Abstandsgruppe mit einer Ätherbindung ist.

Ö3O03O/O7S2

BAD ORIGINAL