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DE2917001A1 - Neue disulfidverbindungen - Google Patents

Neue disulfidverbindungen

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Publication number
DE2917001A1
DE2917001A1 DE19792917001 DE2917001A DE2917001A1 DE 2917001 A1 DE2917001 A1 DE 2917001A1 DE 19792917001 DE19792917001 DE 19792917001 DE 2917001 A DE2917001 A DE 2917001A DE 2917001 A1 DE2917001 A1 DE 2917001A1
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DE
Germany
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cooh
dithio
compound
methanol
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DE19792917001
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English (en)
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Spaeter Genannt Werden Wird
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Toyo Jozo KK
Original Assignee
Toyo Jozo KK
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Publication date
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Priority claimed from JP16490978A external-priority patent/JPS5512178A/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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Description

PATENTANWÄLTE
DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER ■ DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPU-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IKMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 - TELEX O5-212156 kpatd
TELEGRAMM KRAUSPATENT
2155 AW/My
TOYO JOZO KABUSHIKA KAISHA Tagata, Japan
Neue DiSulfidverbindungen
8-09845/Ό879
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine neue DisulfidverWndung eines Trägers mit S-S-Austauschreaktivität der Formal (i)
R-S-S-X1-X2-A (I)
worin R eine 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl· ■!-oxidgruppe bedeutet; X.. eine Abstandsgruppe bedeutet; Xp eine Verbindungsgruppe bedeutet; und A den gebundenen Rest jines Trägers bedeutet.
Es sind Disulfidverbindungen, die für Träger für die kovalente Chromatographie geeignet sind, bekannt. Eine kovalente Chromatographie wird zur Trennung und Reinigung von Thiolgruppen enthaltenden Verbindungen angewendet, z.B. bei Enzymen, wie Papain, Urease, ß-Galactosidase, Aminosäuren, wie Cystein, Peptid oder Protein, z.B. Glutathion, Albumin, Hämoglobin, Cytochrom, oder sie wird für die Herstellung immobilisierter Enzyme, Antigene oder Antikörper verwendet.
Kine Disulfidverbindung der Formel (II)
OS-S-CH -CH-NHCO-CH -CH-CH-N=CrTsepha 2 ' 22I IL J
CO COOH
NH-CH-COOH
worin [Sepha] einen perlchenförmigen, gelartigen Agaroserest bedeutet, der 4% Agarose enthält, ist bekannt als aktivierte Thiol-Sepharose 4B (Warenzeichen, Pharmacia Fine Chemicals Co., Abkürzung für 2-Pyridyl-glutathion-disulfid; im folgenden wird die Bezeichnung 2-PGD-Sepharose 4B verwendet) bekannt. Jedoch ist die S-S-Austauschreaktionsrate für 2-PGD-Sepharose 4B für Thiolgruppen recht langsam und erfordert lange Zeiten, und somit ist die chromatographische Verwendung nicht sehr vorteilhaft.
BAD ORIGINAL
Es wurde gefunden, daß eine neue Di sulf idverbindung des Trägers mit einer S-S- Austauschreaktivität der Formel (I) (die im folgenden als reaktiver S-S-Austauschträger (I) bezeichnet wird), spezifisch, mit hoher Reaktionsrate und quantitativ mit einer eine Thiolgruppe enthaltenden Verbindung reagiert.
Die Umsetzung des erfindungsgemäßen reaktiven S-S-Austauschträger (I) mit einer Verbindung, die eine Thiol^ruppe enthält, wird im folgenden erläutert.
R-S-S-X1-X2-A
J B-SH
B-S-S-X1-X2-A
worin B den Thiolrest der Verbindung, die eine Thiolgruppe enthält, bedeutet und R, X1, X2 und A die zuvor gegebenen Bedeutungen besitzen.
Wenn als Thiolverbindung ein Enzym verwendet wird, erhält man ein immobilisiertes Enzym. Werden Hapten, ein Antigen oder ein Antikörper als Thiolverbindung verwendet, so erhält man eine immobilisierte Immunkomponente, nützliche Träger für die Affinitätschromatographie für die Gewinnung und Isolierung des festen Trägers oder der Immunkompononte.
Ein Träger, der eine Thiolgruppe enthält, kann übenfalls erhalten werden, wenn der reaktive S-S-Austaüschträger (I) mit einem Mittel, das die S-S-Bindung spaltet, wie die DithiothreitoljOder einer wäßrigen Losung bei einem pH-We; t von 9 bis 11 wie folgt behandelt wird.
R-S-S-X1-X2-A
Reagens, das die S-S-Gruppe spal- \U tet
HS-X1-X2-A
1098457087*
BAD ORIGINAL
worin R, X^, X2 und A die oben gegebenen Bedeutungen besitzen.
Viie zuvor ngegeben, ist der erfindungsgewäße reaktive S-S-Austauschträger (I) eine neue und nützliche Verbindung.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine neue Disulfidverbindung zur Verfügung zu stellen, die für einen reaktiven S-S-Austauschträger (l) geeignet ist.
In der Disulfidverbindung, die für den reaktiven S-S-Austauschträger geeignet ist, bedeutet R eine 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxidgruppe und X^ bedeutet, wie zuvor angegeben, eine Abstandsgruppe. Beispiele von Abstandsgruppen X1 sind Kohlenstoffketten mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder mit Ausnahme des Fall, wo eine direkte Bindung an die S-S-Gruppe erfolgt, Molekülketten mit bis zu etwa 20 oder weniger Kohlenstoffatomen, die Kohlenstoff-, Sauerstoff- und Stickstoffatome enthalten. Diese Molekülketten können gegebenenfalls Amino-, Carboxyl- oder Hydroxylgruppen enthalten und diese Gruppen können mit Schutzgruppen geschützt sein oder sie können verzweigtkettig oder geradkettig sein. Bevorzugte Beispiele sind eine ATkylengruppe oder eine Alkylengruppe, die direkt endständig an die S-S-Gruppe gebunden ist und die mindestens eine Amidgruppu enthält.
In dein Träger ist X2 eine Verbindungsgruppe, und Beispiele sind Amid- (-CONH-), Ester- (-COO-), Äther- (-0-) oder Ami-
dino- (-Cv ) Gm--open. Die Verbindungsgruppe X9 kann nor-NNH- *
malerweise gebildet werden, indem man beliebig eine Gruppe, wie eine Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Cyano- oder Nitrogruppe, in einem Träger in ihre funktionelle Gruppe überführt und mit der funktioneilen Gruppen oder ihrem reaktiven Deri-
909845/0879
vat, z.B. dem aktiven Ester oder dem Säurechlorid der Carboxylgruppe, umsetzt und eine endständige Aminierung der Gruppe mit Hexamethylendiamin oder Dodecamothylendiamin, eine Imidierung der Nitrilgruppe oder eine Aminierung durch Reduktion der Nitrilgruppe durchführt.
A bedeutet den gebunden Rest des Trägers. Die Träger können z.B. immobilisierte Träger sein, die mindestens eine funktioneile Gruppe enthalten, wie eine Amino-, Imino-, Amid-, Hydroxyl-, Carboxyl- oder Nitrilgruppe, oder die eine funktionelle Gruppe enthalten, die in reaktive Derivate überführt werden kann. Beispiele von Trägern sind Polysaccharide, wie Cellulose, Aminoderivate der Cellulose, Dextrin oder Dextran, oder wasserunlösliche Träger oder wasserunlösliche Träger mit einer H; droxyl- oder Aminogruppen wie aminiertes Polyamid, Polyacry. jiitril oder Silan. Von dem Ausdruck "Träger" werden weiterhin jegliche Arten von bekannten und neuen Verbindungen umfaßt, die bei der vorliegenden Erfindung als Träger verwendet werden können. Beispiele von neuen Verbindungen, die eine Aminogruppe enthalten, sind γ-aminopropyliertes Polyamid, Aminoderivate von Polyacrylnitrilpolymeren oder Polyacrylnitrilpolymere. Ein γ-aminopropyliertes .Polyamid wird durch Erhitzen eines Polyamidträgers, wie 6,6-Nylon und 6-Nylon, in γ-Aminopropyl-triäthoxysilan bei 100°C während 3 Stunden hergestellt, wobei teilweise γ-Aminopropylgruppen in Amidgruppen der Polyamidverbindung eingeführt werden. Die Aminoderivate der Polyacrylnitrilpolymeren oder das Polyacrylnitrilpolymere können durch Erwärmen am Rückfluß eines Polyacrylnitrilpolymeren oder eines Polymeren, das Polyacrylnitrilgruppen enthält, in Anwesenheit von Lithiumaluminiumhydrid in einem Medium, wie Diäthyläther, Dioxan oder Tetrahydrofuran, während 1 bis 48 Stunden unter Bildung einer Aminogruppe und teilweiser Reduktion der Nitrilgruppe hergestellt werden.
809845/0879
BAD ORIGINAL
Der reaktive S-S-Austauschträger (I) kann durch Umsetzung von beispielsweise einer Verbindung der folgenden Formel (II)
R-S-S-R (II)
worin R die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, wie 2,2'-Dithio-bis-(benzothiazol) oder 2,2l-Dithio-bis~(pyridin-N-oxid), in einem inerten Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dimethylformainid, Aceton, Äthanol oder Methanol oder ihren Gemischen, mit einer äquimolaren Menge einer Verbindung der Formel (III)
HS-X1-X3 (III)
worin X^ eine Gruppe bedeutet, die mit dem Träger reagieren kann, oder eine Gruppe, die so umgewandelt werden kann, daß sie mit dem Träger reagieren kann, und X1 die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, bei 10 bis 70° C während 10 Minuten bis 5 Stunden und Gewinnung nach an sich bekannten Isolier- und Reinigungsverfahren hergestellt werden.
Die Gruppe X, in der Verbindung der Formel (IV)
R-S-S-X1-X3 (IV)
worin R, X1 und X* die oben gegebenen Bedeutungen besitzen, kann gegebenenfalls in eine reaktive Gruppe überführt werden, die mit dem Träger reagieren kann. Carboxylgruppen können in aktive Ester, wie Succinimidester oder p-Nitrophenylester, oder in ein Säurechlorid umgewandelt werden, und die Ni/trilgruppe kann in eine Imidatgruppe umgewandelt werden. Diese Bildung der reaktiven Gruppen kann nach an sich bekannten Aktivierungsverfahren durchgeführt werden.
Die Verbindung (IV)wird mit dem Träger in einem inerten Medium, wie Wasser, Aceton, Äthanol, Methanol, Dimethylformamid, Dioxan oder einem wäßrigen Medium davon, unter Kühlen oder bei
90Ö846/0Ö70
Umgebungstemperatur während 1 bis 40 Stunden umgesetzt, und dann wird zur Gewinnung der Waschlösungt η filtriert.
Der so erhaltene, reaktive S-S-Austauschträger (i) ist eir· nützliche und neue Verbindung und enthält eine Benzo thiazo 2·-yl-dithiogruppe oder eine Pyridin-N"Oxid-2'~yl-dithiogruppe. Die Verbindung (I) besitzt bei der S-S-Austauschreaktion die Aktivität und verbindet den Träger mit einer Verbindung, die eine Thiolgruppe enthält, z.B. einem Enzym, wie Peroxidase, Catalase, ß-Galactosidase oder alkalische Phosphatase oder Hapten, Antigen und Antikörper, wobei die Thiolgruppe durch S-Acetylmercapto-bemsteinsäureanhydrid eingeführt wird [Arch. Biochem. Biophys., £6, 605-612, (1962)].
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des reaktiven S-S-Austauschträgers (I), wie es im folgenden beschrieben wird.
Eine Thiolagaroseverbindung der Formel (V), die im folgenden als "Thiolagaroseverbindung (V)" bezeichnet wird
HS-CH-CH-NH-CO-CH-CH-CH-N=CCn^[A] 2I 2 2,0
CO COOH (V)
NH-CH-COOH
worin [A] den Rest eines Agarosemoleküls bedeutet, wird mit einem Disulfidreagens unter Herstellung der neuen Disulfidverbindung der Formel (I1)
R-S-S-CH2-CH-Nh-CO-CH2-CH2-CH-N=C^A] i1' )
CO-NH-CH2-COOH COOH
umgesetzt.
I0984S/087Ö
BAD ORIGINAL
Die Thiolagaroseverbindung (V) kann nach einem bekannten Verfahren [vergl.z.B. Biochem. J.ijg, 573-584 (1973), ' "Practice and Application; Affinity Chromatography, S.64 bis 65, Kodansha Publisher, 1976 (auf Japanisch)1] oder durch Reduzierung der im Handel erhältlichen aktivierten Thiolsepharose mit Dithiothreitol hergestellt werden. Als Agarosemolekülrest kann eine Agarose, die nach an sich bekannten Verfahren hergestellt wurde oder im Handel erhältliche, gelartige, perlchenartige Agarose, wie Sepharose 2B (Agarosegehalt etwa 2%, gequollene Korngröße etwa 60 bis 250/μ, Warenzeichen der Firma Pharmacia Fine Chemicals Co.), Sepharose 4B (Agarosegehalt etwa 4%, gequollene Korngröße etwa 40 bis 190/u) oder Spharose 6B (Agarosegehalt etwa 6%, gequollene Korngröße etwa 40 bis 210/u), verwendet werden. Perlenartige, gelartige Agarose (Gelperlen ergeben eine in Wasser unlösliche tridimensionale Struktur) werden bevorzugt wegen ihrer Permeabilität verwendet.
Die Thioiagaroseverbindung wird mit dem Disulfidreagens, wie 2,2»-D5 3iio-bis-(pyridin-N-oxid) oder 2,2'-Dithio-bis~ (benzo thiazol) und wäßrigen Äthanol, das EDTA in Tris-HCl-Puffer enthält, unter Rühren über Nacht umgesetzt, dann wird durch ein poröses Glasfilter filtriert und gegebenenfalls mit Äthanol, Benzol oder entionisiertem Wasser gewaschen. Man erhält das Produkt (I1)· Das Produkt wird in einer 0,1#igen Agaroselösung suspendiert und unter Kühlen gelagert.
Vergleich der S-S-Austauschreaktionsrate mit der Verbindung, die eine ThioJgruppe enthält, und der erfindungsgemäßen Verbindungen sowie der bekannten, aktivierten Thiol sepharose 4B folgt. Die Thiolgruppen enthaltenden Verbindungen sird Glutathion und Rinderserumalbumin (BSA). Das Analysenverfahren ist wie folgt. 1,5 ml Disulfidverbindung (I) oder aktivierte Thiol-Sepharose 4B in 0,196 Agarose werden zu 1,45 ml 1 mM EDTA in 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)
009845/0870
BAD ORIGINAL
291
oder in Natriumcarbonatpuffer (pH 9,5) gegeben. Dazu gibt man 50 /ul 10 mM Glutathion oder 200/ul 2,5 mM BSA und bestimmt die erhöhte Absorption/min für Glutathion oder pro 20 min für BSA bei den jeweiligen maximalen Absorptionswellenlängen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und
II aufgeführt.
Tabelle I (Glutathion)
Vergleich R pH 7,5 Wellenlänge
(nm)		 Reaktions-
rate
(μπιοί /min)		 pH 9,5 Reaktions
rate
(Vimol /min)
•Η MJ
Φ bO		 ο- 343 8,7 Wellenlänge ,
(nm)		 28,2
71;9*
Ό 324 52,0 343
287		 14,3
co 276 2,2 261 131*
Q 333 92^8 333
+ Kompensierte Reaktionsrate durch Abbau der Disulfidverbindung bei pH 9,5.
ORIGINAL INSPECTED
291
TabeJlle_II (BSA)
R pH 7;5 Wellenlänge
(nm)		 Reaktions
rate
(ymol /min)		 pH 9,5 Reaktions
rate
Cvimol /min)
Q 343 0;96 Wellenlänge
(nm)		 7;20
12^8***
Vergleich O- 324 1,04 343 7,33
"ö ί
•H:cd,
U S
U Φ
CJ ho		 CO 450 0^00 287 44^7*
_**
333 3;14 368
310 7;65 333
309
+ Kompensierte Reaktionsrate durch Abbau der Disulfidverbindung bei pH 9,5;
-H- nicht bestimmt, wegen des schnellen Abbaus der Disulfid verbindung;
+++ Reaktionsrate, berechnet durch die verminderte Konzentration, an BSA.
Wie aus den Tabellen I und II folgt, zeigen die erfindungsgemäßen Disulfidverbindungen eine sehr gute und hohe S-S-Adstauschreaktionsrate, verglichen mit dem bekannten Disulf id.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
909846/0879
B e i s pi β 1
Thiol-Sepharose 4B-Perlen (1,6 g, Naßgewicht) der Formel
,ο*
HS-CH-CH-NH-CO-CH-CH-Ch-N=C 2 ι 2 2, N
CO COOH
NH-CH-COOH
(V)
worin (A1) den perlenartigen, gelartigen Agarosemolekül-(Sepharose 4B)-Rest, enthaltend etwa k% Agarose, bedeutet, werden in ein 50 ml Polyäthylenglas gegeben und 10 mMol 2,2»-Dithio-bis-(pyridin-N-oxid) und 50# Äthanol, enthaltend 1 mM EDTA in 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5),(4o ml) werden zugesetzt. Nach mäßigem Rühren über Nacht wird das Reaktionsgemisch durch ein poröses Glasfilter filtriert, dreimal mit 50&Lgem Äthanol (40 ml) und fünfmal mit entionisiertem Wasser (40 ml) gewaschen; man erhält die Disulfidverbindung
S-S-CH-CH-NH-CO-CH-CH-CH-N=Cx [Α1] (ύι\
Xn CO COOH
O ι
NH-CH-COOH
worin [A1] die zuvor gegebene Definition besitzt.
Das Altraviolettabsorptionsspektrum der Disulfidverbindung (I1) in 1,5 ml 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 1 mMol EDTA in 0,1# Agaroselösung, ist in Fig. 1 (gestrichelte Linie) dargestellt. Weiterhin ist das Absorptionsspektrum der reduzierten Form der Disulfidverbindung (I1) mittels 0,1 M Dithiothreitol (50/ul) in Fig. 1 (ausgezogene Linie) dargestellt. 4,85/uMol 2-Thiopyridin-N-oxid (Mdekülextinktionskoeffizient 3830 bei 333 nm; pH 7,5) pro 76,4 mg (Trockengewicht) der Disulfidverbindung (I1) werden freigesetzt, woraus berechnet wird, daß $3»5/uMol 2-Pyridyl-N-
I098A5/O87t
oxid-glu thiondisulfidgruppe in 1 g (Trockengewicht) der Disulfidverbindiang (I1) vorhanden sind.
In Beispiel 1 wird 2,2l--Dithio-bis-(pyridin~N-oxid) durch 2,2'-Dithio-bis-(benzothiazol) ersetzt und das übrige Verfahren wird fast wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Produkt wird mit einem porösen Glasfilter filtriert, dreimal mit Äthanol (40 ml), dreimal mit Benzol (40 ml), dreimal mit Äthanol (40 ml), fünfmal mit entionisiertem, destilliertem Wasser (40 ml) gewaschen; man erhält die Verbindung der folgenden Formel (I")
CH -CH-NH-CO-CH-CH -CH-N=C λ I ^2I Vv
CO COOH V-1- /
NH-CH-COOH
worin [A1] die zuvor gegebene Bedeutung besitzt.
Das Ultravic i.ettabsorptionsspektrum der Disulf idverbindung (IM) und seiner reduzierten Form sind in Fig. 2 als gestrichelte bzw. ausgezogene Linie gezeigt.
1,88/uMol 2-Thiobenzothiazol (Molekülextinktionskoeffizient 19 300 bei 310 nm) pro 60,3 mg (Trockengewicht) der Disulfidvertdndung (ln) werden freigesetzt, wodurch berechnet wird, daß 31,2/uMol 2-Benzothiazol-glutathion-disulfidgruppe in ί g (Trockengewicht) des Disulfids (I") vorhanden sind.
Das Ausgangsmaterial Thiol-Sepharose 4B (V) wird wie folgt erhalten.
2-PGD-Sepharose 4B (Lot No.3196, Pharmacia Fine Chemicals Co.) (10 g, Naßgewicht) wird in 30 mM Dithiothreitol und
809845/087&
0,2 M Tris-HCl'-Puffer (7,5), enthaltend 1 ι Μ EDTA, suspendiert. Nach 20 min wird das Reaktiönsgemisch durch tin poröses Glasfilter filtriert, und die obige Reaktion wird dreimal zur Vervollständigung der Reduktion -wiederholt. Die Filtration durch as poröse Glasfilter wird wiederholt, dann wird das Filtrat mit entionisiertem, destilliertem Wasser (100 ml) zur Entfernung von restlichem Dithiothreitol gewaschen, wobei man Thiol-Sepharose 4B, wie zuvor angegeben, der Fornx.l (V) erhält« Das Ultraviolettabsorptionsspektrum der Verbindung (V) ist in Fig. 3 dargestellt.
B e 1 s ρ i e 1 3
■ !■II I Il Mil IMI III Il I I I I W I III !■
100 g 6,6-Nylonperlen (Durchmesser 4,8 mm), suspendiert in 100 ml y-Aminopropyltriäthoxysilan, werden 3 h bei 100°C erhitzt. Nach dem Erhitzen werden die Perlen abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet; man erhält y-aminopropylierte Perlen.
Das y-Aminopropylierungsverhältnis pro eine Perle:54 γ sekundäres Antikörperprotein gebunden.
Anylsenverfahren: Die obigen Perlen in Dimethylformamidlösung (150 ml), enthaltend Bernsteinsäureanhydrid (20 g), werden über Nacht stehengelassen. Nach dem Filtrieren und Waschen wird der Niederschlag mit Dicyclohexylcarbodiimid (20 g) und N-Hydroxysuccinimid (11,5 g) in Dimethylformamid (150 ml) über Nacht umgesetzt und anschließend mit Dimethylformamid gewaschen.
Die erhaltenen Perlen werden dreimal mit 0,05 M Phosphatpuffer, (pH 7,4), enthaltend 0,196 NaN,, 3 mM MgCl2 und 0,15 M NaCl gewaschen, dann wird sekundärer Antikörper (Kaninchens Anti-Meerschweinchen IgG, abgekürzt Abp) zugegeben und dann wird 17 h bei 5°C umgesetzt. Die Abp-gebundenen Perlen werden nach dem Filtrieren und dreimaligen Wa-
§09845/0879
BAD ORIGINAL
sehen mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend O,1# NaN3, O,25# Rinderserumalbumin, 3 mM MgCl2 und 0,15 M NaCl (im folgenden als Antigen-Antikörper-Reaktionspuffer bezeichnet) erhalten. Zu zwei Perlen davon gibt man 1 ml ß-Galactosidase, vernetzt mit Meerschweinchens Anti-Rinderinsulin (2γ) und läßt während 20 h bei 5°C stehen. Anschließend wird mit dem Antigen-Antikörper-Reaktionspuffer gewaschen.
200/Ul Reagens für die ß-Galactosidase-Farbreaktion, enthaltend 5 mg/ml o-Nitrophenylgalactosid in 0,1 M Phosphatpuffer (6,7), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, und 10 mM Mercaptoäthanol werden bei 44°C umgesetzt. Nach 20 min wird Glycinpuffer (pH 10,5, 2,5 ml) zugegeben, um die Reaktion zu beendigen,und dann wird colorimetrisch bei 420 nm bemessen, um das gebundene Ab2 durch Enzymimmuno-Assayverfahren zu bestimmen.
ß-Galactosidase, vernetzt mit Anti-Rinderinsulin, wird hergestellt durch Umsetzung einer Dimethylformamidlösung von 3-(Benzothiazol-2' -y"1 -dithioj-propionat-succiniinidester mit 0,1 M VeronalpufferlCsung (pH 7,5) des Anti-Rinderinsulins in einem äquimolaren Verhältnis bei Umgebungstemperatur während 4 h. Das Reaktionsprodukt wird durch isoelektrische Präzipitation ausgefällt, durch Zentrifugieren gewonnen und in Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst. Dazu gibt man eine äquimolare'Menge an ß-Galactosidase, setzt während 1 h bei Umgebungstemperatur um, dann wird die aktive Fraktion durch Se,phadex G-100 gesammelt; man erhält vernetztes Anti-Rinderinsulin, und ß-Galactosidasekonjugat.
Die y-aminopropylierten Perlen (20 Perlen) werden 5n Dimethylformamid (5 ml) gegeben, dann wird weiter 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionat.Succinimidester (2,0 mg) in Dimethylformamid (1 ml) zugegeben und dann wird 4 h bei Um-
gebungstemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und mit Dimethylformamid-0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen; man erhält einen reaktiven SS-Austauschperlenträger, in dein die 3-(Benzothiazol-21 -yl-dithio)-propionylgruppe in die γ-Aminogruppe eingeführt worden ist.
Zu diesen reaktiven SS-Austauschperlen gibt man ß-Galactosidase (3 mg) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), setzt 2 h bei Umgebungstemperatur um, filtriert und wäscht; man erhält immobilisierte ß-Galactosidaseperlen. Das Produkt zeigt eine Aktivität von 6 Einheiten ß-Galactosidase/eine Perle, bestimmt durch colorimetrische ß-Galactosidasereaktion.
Der obige 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionat-succinimidester wird wie folgt hergestellt.
Zu 2,2l-Dithio-bis-(benzothiazol) (13,2 g) gibt man Benzol (400 ml) und 3-Mercaptopropionat (6 g) und setzt 3 h bei 70°C unter Rühren um. Dann wird das Reaktionsgemisch im Eisbad zur Ausfällung der rohen Kristalle (13,8 g) abgekühlt, die aus Benzol umkristallisiert werden. Man erhält 3-(Benzothiazol-2 '-yl-dithio )-propionatkristalle (12 g).
Fp. 162 bis 164°C
Zu 3-(Benzothiazol-21-yl-dithio)-propionat (3 g) in Äthylacetat (200 ml) gibt man N-Hydroxysuccinimid (1g) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,7 g) und rührt 3 h bei Umgebungstemperatur. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, und dasFiltrat wird mit Phosphatpuffer (pH 7,5) zur Entfernung der nichtumgesetzten freien Säure gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert, getrocknet und aus heißem Petroleumäther umkristallisiert; man erhält Kristalle aus 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionatsuccinimidester (2,4 g)
§09845/0673
291
Fp. 114 bis 115°C, korrigierter Jert: 121 bis 123°C.
Beispiel 4
Eine poröse, granuläre oder filamentartige Substanz, die freie Amino- und Nitrilgruppen enthält und die wie im folgenden erläutert hergestellt wird, wird anstelle der γ-aminopropylierten Perlen von Beispiel 3 verwendet.Die Reaktion wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 3 und bei den gleichen Bedingungen durchgeführt, wobei man eine granuläre oder filamentartige, reaktive SS-Austauschträgerverbindung erhält, in der die 3-(Benzothiazol-2l-yl-dithio)-propionylgruppe in die freie Aminogruppe eingeführt worden ist.
Ein 500 ml Dreihalskolben wird in ein Wasserbad bei 35°C gegeben und dann wird während 15 min mit Stickstoffgas gespült. 120 ml destilliertes Wasser, 2 g Natriumalkylsulfonat, 80 g Acrylnitril, 0,1 g Natriumpersulfat und 0,033 g Natrium-Hydrogensulfit werden zugegeben. Man rührt während etwa 3 h und erhält eine Emulsion, die auf 500 ml Wasser gegossen wird. Zur Ausfällung des Produktes wird Natriumchlorid zugegeben. Der Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält Polyacrylnitril (logarithmische Viskosität bei 30°C, 0,5% in Dimethylformamid: etwa 10,5). 10 g Polyacrylnitril werden in 150 ml Dimethylformamid gelöst und daraus wird ein poröses, filamentartiges Polyacrylnitril hergestellt.
10 g Polyacrylnitril werden weiterhin in 2O?6iges wäßriges Dimethylformamid unter Verwendung eines Bechers einer Atomisiervorricatung getropft, wobei poröses, granuläres Polyacrylnitril erhalten wird.
90984S/087ä
BAD ORIGINAL
291700T
In den Dreihaiskolben werden IAthiumaluminiumhydrid und 100 ml trockener Äther gegeben und unter Rühren werden weiter 2 g des obigen porösen, granulären Polyacrylnitrile zugegeben* Dann wird 16 h bei 500C am Rückfluß erhitzt und unter Eiskühlung wird Wasser tropfenweise zur Zersetzung des nichtumgesetzten Lithiuinäluminiumhydrids zugenetzt, das dann durch tropfenweise Zugabe von 1N HCl aufgelöst wird. Das Aminoderivat des Polyacrylnitrile wird durch Filtration, Vaschen mit 1N HCl, Wasser, 1N NaOH, Wasser und 0,1 M Phosphatpuffer in der angegebenen Reihenfolge isoliert; man erhält eine poröse, granuläre Substanz mit freien Amino- und Nitrilgruppen.
Das obige poröse, granuläre Polyacrylnitril wird durch das poröse, filamentartige Polyacrylnitril ersetzt; man erhält eine poröse, filamentartige Substanz, die freie Amino- und Nitrilgruppen aufweist.
Das quantitative Analysenverfahren für die Aminogruppen in diesen Substanzen ist wie folgt.
Die r"»rose Substanz, die freie Amino- und Nitrilgruppen enthält, wird mit 12,5% Glutar-aldehyd-Boratpuffer (pH 8,5) 20 min bei 0°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, mit Boratpuffer gewaschen und dann zu 7 ADCA (T-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gegeben und 60 min bei 300C unter Rühren umgesetzt. Die Menge an 7-ADCA, die in der überstehenden Flüssigkeit verbleibt, wird anschließend durch Flüssigkeitschromatographie analysiert. Das Ergebnis zeigt, daß 33 his 35/UM 7-ADCA/1 g poröse Substanz gebunden werden können.
Die obige, mit Glutaraldehyd behandelte Substanz wird ebenfalls mit 0,2 M Hexamethylendiamin (pH 9,5) 2 h bei Zimmertemperatur behandelt und weiter mit Glutaraldehyd und dann
809845/08
mit 7-ADCA umgesetzt. Die Menge an gebundenem 7-ADCA beträgt 42 bis 46/uM/g.
B e i s ρ i e_l_ _ J?
In Beispiel 3 wird 3~(Benzothiazol--2!--yl-dithio)-propionat durch 3-(Pyridin-N-oxid-2l-yl~dithio)-propionat, wie im folgenden erläutert, ersetzt vnd die Umsetzung erfolgt auf gleiche Weise wie in Beispiel 3. Man erhält eine perlenförraige, reaktive S-S-Austauschsubstanz, in der die (3-Hyridin-N-oxid-2Lyl-dithio)-propionylgruppe in die γ-arainopropylierten Perlen eingeführt ist.
4,3 g 2,2'-Dithio--bis-(pyridin~N-oxid) werden zu 200 ml Chloroform und 3 g 3-Mercaptopropionat gegeben, nd dann wird 3 h bei 70°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt, die rohen Kristalle fallen aus und werden aus Chloroform umkristallisiert; man erhält Kristalle aus 3~(Pyridin-N-oxid-2'-yl-dithio)-propionat (4,1 g).
C /-S-S-CH-CVCOOH Fp. 126 bis 128°C.
Ein aktiver Ester, n?Cmlich der 3-(Pyridin-N-oxid-2·-yl-dithio)-propionat-succinimidester, wird durch umsetzung der freien Säure und N-Hydroxysuccinimid und Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt. UV-Absolution: Λ max = 260 nm 5η Methanol, Rf = 0,25 (Dünnschichtchromatographie, Silikagel; Benzol:Äthylacetat = 3 s1)·
Beispiel 6
Die im folgenden aufgeführten Verbindungen (1) bis (29) können anstelle von 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionat und 3-(Pyridin-N-oxid-2·-yl-dithio)-propionat in den zuvor beschriebenen Beispielen verwendet werden.
90984 5/0879
BAD ORIGINAL
Bei der Umsetzung der aufgeführten Verbindtmgen mit dem Carrier, der funktioneile Gruppen, bevorzugt Aminogruppen, enthält, können bekannte Kondensationsreaktionen verwendet werden, um die vorteilhaften reaktiven S-S-Austuuschträgerverbindungen herzustellen.
3 g 3-(Benzothiazol-2 l-yl-dithio)~proi>ionat, erhalten nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 3 beschrieben, 1,2 g p-K'.trophenol und 2,1 g Dicyclohexylcarbodiimid werden in 20 ml Äthyl-acetat aufgelöst und 3 h bei Zimmertemperatur gerührt. Das restliche Verfahren ist so, wie es in Beispiel 3 erläutert wurdej man erhält 3-(Benzothiazol-2l-yl-dithio)-propionat-p-nitrophenylester (18,5 g) in Form von Kristallen.
Vs-S-CH2-CH2-COO
Fp. 113 bis 114°C. ■
(2) 3g 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithioj-propionat, gelöst in 10 ml Thionylchlorid, werden 2 h bei 25°C umgesetzt und dann wird das Thionylchlorid im Vakuum entfernt; man erhält 3-(Benzothiazol-2 l-yl-dithio)-propionylChlorid als ölige Substanz.
i-S-Ctfi-CHjXOCJL
Λ max = 272 nm (Methanol)
Rf = 0,25 (TLC, Benzol).
(3) 1,3g 3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionatsuccinimidester, hergestellt gemäß dem Verfahren von Beispiel 3» und 0,6 g £-Aminocapronsäure werden zu 50 ml Tetrahydrofuran gegeben, über Nacht bei Zimmertemperatur umgesetzt,
809845/0879
das Tetrahydrofuran wird im Vakuum entfernt, anschließend wird in heißem Isopropanol gelöst und abgeki. ilt; man erhält Kristalle der 6~N-[3-(Benzothiazol~2'-yi-dithio)-propionyl]-aminohexansäure (0,8 g).
rCOOH
Λ max = 272 nm (in Methanol)
Rf = 0,07 (TLC Silikagel, Benzol : Äthyl-acetat = 1:2)
(4) 500 mg der oben erhaltenen Verbindung, 200 mg N-Hydroxysuccinimid und 340 mg Dicyclohexylcarbodiimid, ,elöst in 10 ml Tetrahydrofuran, werden 3 h bei Zimmertemperatur umgesetzt. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Tetrahydrofuran abdestilliert. Der Rückstand wird in heißem Petroläther gelöst und abgekühlt; man erhält Kristalle des 6-N-[3-(Benzothiazol-2'-yl-dithio)-propionylj-aminohexanat-succinimidesters (430 mg).
\max: 271 nm
Rf: 0,42 (TLC Silikagel, Benzol : Äthyl-acetat =3 :1).
(5) 1*1 g 2,2»-ϋ1ΐΜο-ο1ΐ3-θ56ηζοΐηΐ3Ζθΐ) und 3-Mercaptopropionitril, gelöst in 50 ml Benzol, werden unter Rühren 3 h bei 70°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit Eis-Wasser zur Ausfällung der rohen Kristalle abgekühlt und aus Benzol umkristallisiert; man erhält 750 mg 3-(Benzothiazol-2l-yl-dithio)-propionitril. 700 mg davon werden in 50 ml einer Methanollösung, die 19 g HCl enthält, gegeben und über Nacht bei 5°C umgesetzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert; man erhält ein rohes Pulver, das nach dem Waschen mit Benzol Me thyl-3- ( benzothiazol-2 · -yl-dithio ) -propionimidat-hydrochlorid (720 mg) liefert.
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BAD ORIGINAL
λ wax: 272 nm (!!ethanol)
Rf: 0,05 (TLC, Silikagel, Benzol : Äthyl-acetat ~ 1 :2)
2,2«-Dithio-bis- (benzothlazol) oder 2,2«~Dithio--bis~(pyridin-N-oxid), wie zuvor beschrieben, wird zusammen mit Thioglykolsäure, Thiomilchsäure, Cystein, Thioapfelsäure, Penicillamin, N- (2"Mercaptopropionyl) -glycin oder Glutathion 1'oi den gleichen Reaktionebedingungen, wie ravor beschrieben, umgesetzt, und die folgenden Verbindungen werden erhalten. Diese Verbindungen können für die Umsetzung mit dem Träger, der funktioneile Gruppen enthält, verwendet werden. In den Beispielen sind die Rf-Werte aufgeführt, die man bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel erhält.
<6> 0^-S-S-CH1COOH
;\.max: 727 nm (Methanol)
Rf: 0,36 (Benzol : Methanol = 1 : 2)
S-S-Austausch-Reaktionsrate: 35 >6/uMol/min
(7) φζ^ε-S-CH-COOH
Λ max: 272 nmj Rf 0,38 (Benzol : Methanol = 1 :2)
Λ max: 271 nm (Methanol; Rf: 0,08 (Benzol : Methanol = 1 :2)
0,60 (obereSchicht; ButanolEssigsäure :Wasser = 4:1:5)
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BAD ORIGINAL
: 271 ran (Mathanol) Rf : 0;15 CBonzol· : Äthyl-acetat =1:2)
Amax : 271 nm (pH 7.5, Phosphafe-*P^uffer)
Rf : 0,60 (Butanol : Essigsäure : Wasser= 4:1:5 obere Schicht)
CH3
S-C-CH-COOH CH, NHi-HCJl
λ max : 271 nm (Methanol) Rf : 0.30 (obere Schicht; Butanol:Essigsäure:Wasser. =
4:1:5)
S-S -Austauschreaktionsrate: 35.5 yinol /min.)
CH3
c„c-—-cH-cooH
S 1
CH3 NH
O2N
λ max : 271 nm, 418 nm (Methanol)
Rf : 0,. 2 3 (obere Schicht; Butanol Essigsäure: Wasser 4:1:5)
9098AS/0879
BAD ORIGINAL
CH3
Xmax : 271 nm (Methanol)
Rf: 0,48 (Benzol : Äthyl-acetat =3 :1) (14)
Cl Vs-S-CH-CO- NH-CH9-(CH9) ,-CH9-COOH ^^lr j c c ά c
CH3
Xinax : 271 nm (Methanol)
Rfs 0,12 (Benzol s Ithyl-acetat « 3% 1). (15)
S-S-Austauschreaktionsrate s 35,0/
CH
CH3
Xmax ί 278 nm
Rf: 0,80 (Benzol s Ithyl-acetat - 3 :1) (16) $
CH3 " .
Xinax s 271nm (Methanol)
"Rf: 0,15 (Benzol : Ithyl-acetat = 3 si) S-S-Austauschreaktionsrate t 36»6 /vMol/min
(17) o^
-S-S-CH-CONHCH„CO0-M
Ämax : 271 nm (Methanol^) ■ Rf s Ό ,80 (Benzol i lÄjlacetaf
Rf: 0,10 (Benzol : Äthyl-acetat = 3 :1) S-S Austauschreaktionsrateι 35,7/uMol/min
CH3
CM3 MH2-HGi
Xrnax : 271 nm (Methanol)
Rf : 0.05 ß,enzOl_ : Äthyl-acetat =3:1)
^-S-S-CHi-CH-CONHcH2COOH
NHCOCHJtCH2. CH-COOH I NH2
Ainax : 272 nm (Methanol)
Rfs 0,51 (obere Schicht; ButanolEssigsäure:Wasser =
4:1:5) S-S-Austauschreaktionsrate: 35»2 uMol/min.
4,
ο
Xmax : 270 nm (Methanol)
Rf: 0,7 (obere Schicht; ButanolEssigsäure:Wasser
4:1:1)
S-S-Austauschreaktionsr&tes 92,8 /uMol/min.
o ^H3
Amax : 270 nm (Methanol)
Rfs 0s66 (ButanolEssigsäuresWasser = 4:1 si, obere
Schicht
S-S-Austauschreaktionsrate s 93 1 2/Äel/min.
009845/0879
S-S-CH-1
Amax : 310 nm Methanol)
Rf : 0.82 (Benzol : Äthyl-acetat =3:1) (24)
-J3CHiCOOH 4/ - I
0 CHi
Xmax : 271 nm (Methanol) Rf: 0,41 (Butanol!Essigsäure:¥asser = 4:1:1) S-S-Austauschrcaktionsrate: 92,6yuMol/min.
<25> A
\/- S-S-CH E-CHCOOH 0 , ^Hz
Amax : 271 nm (Methanol) Rf : 0.25 (Butanol : Essigsäure : Wasser= 4 : ι : l)
θ' CH2COOH
Xniax : 270 nm (Methanol) Rf: 0,32 (Butanol:Essigsäure:Wasser =4:1:1) S-S- Austauschreaktionsrate: 90,1/uMol/min.
I NHCOCHz.cH^CHCO0H
KHz
Ämax : 270 nm
Rf: 0,20 (ButanolEssigsäure:Wasser = 4:1:1) S-S-Austauschreaktionsrate: 91,5/uMol/min.
909845/0879
S Ch1Vh,
Xmax : 270 nra
Rf : 0,.4I (Butanol : Essigsäure" : Wasser = 4:1:1) (29)
y-S-S-c -cH-cooH x I11 I
Iw Kl LJ
OV-O ι IV Π *
Ainax : 270 ran Rf : 0,25 (Butanol : Essigsäure ". : Wassc-r = 4:1: 1).
909845/0879

Claims (5)

  1. Patentansprüche
    ί Λ·, Disulfidverbindung eines Trägers mit S-S-Aus-
    tauschreaktivität der Formel (i)
    R-S-S-X1-X2-A (I)
    worin R eine 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl~N~oxid-Gruppe bedeutet; X^ eine Abstandsgruppe bedeutet; Xp eine Verbindungsgruppe bedeutet; und A den gebundenen Rf st des Trägers bedeutet.
  2. 2. Disulfidverbindung der Formel
    -λ ο
    T-S-S-CH -CH-Nh-CO-CH-CH-CH-N=C A V 2 I 2 2, \ /
    N. CO COOH
    ο ι
    NH-CH-COOH
    worin A einen perlchenförmigen, gelartigon Agaroserest bedeutet .
  3. 3. ' Disulfidverbindung der Formel
    s\ A
    Λ-S-S-CH -CH-NH-CO-CH^-CH^-CH-N=C A N/ 2 « 2 2, v /
    • · GO COOH
    I
    NH-CH2-COOH
    worin A einen perlchenförmigen, gelartigen Agaroserest bedeutet.
    109845/0671
  4. 4. Disuifidverbindung der Formel
    3-S-CH-CH-CO-A
    worin A einen γ-aininopropylierten, perlchenartißcn Nylonrest oder einen Rest von partiell reduzierten, porösen PoIyacrylnitrilkörnchen oder -fasern bedeutet.
  5. 5. Disulfidverbindung der Formel
    > S-S-CH -CH -CO-A
    O
    worin A die gleiche Bedeutung wie in Anspruch Iy besitzt.
    80984 5/087Ö
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