DE2728685A1

DE2728685A1 - Arzneimittel

Info

Publication number: DE2728685A1
Application number: DE19772728685
Authority: DE
Inventors: Bertil Frank Harald Eriksson; Ake John Erik Helgstrand; Alfons Misiorny; Goeran Bertil Stening; Stig-Ake Alfred Stridh
Original assignee: Astra Lakemedel AB
Current assignee: Astra Lakemedel AB
Priority date: 1976-07-01
Filing date: 1977-06-25
Publication date: 1978-01-12
Also published as: SE7607496L; AU2650577A; LU88310I2; AT369014B; US4339445A; NL180068C; NO772299L; MY8500125A; NL180068B; NL930053I1; NL930053I2; US4215113A; GB1585615A; US4665062A; NL7707235A; FI772030A7; JPS562046B2; CA1077848A; US4771041A; ATA465477A

Description

Die Erfindung betrifft neue pharmazeutische Präparate und eine neue Methode zur selektiven Bekämpfung von Virusinfektionen, wie Influenzavirus-Infektionen, Herpesvirus-Infektionen usw. bei Tieren einschließlich Menschen.

Es gibt hauptsächlich drei Wege für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von Virusinfektionen, nämlich durch Verwendung von Impfstoffen, durch Verwendung chemotherapeutischer Mittel und durch Verwendung von Interferon. Von diesen bekamen Impfstoffe und chemotherapeutische Mittel die weitest vertreitete medizinische Verwendung.

Die existierenden Impfstoffe, speziell die Influenzaimpfstoffe, werden jedoch als nicht ausreichend wirksam angesehen. Bei dem Influenzavirus beruht dies teilweise darauf, daß es schwierig ist, einen Impfstoff rechtzeitig gegen einen herrschenden modifizierten Influenzavirus herzustellen. Bislang wurden auch keine chemotherapeutischen Mittel gegen Viren mit guter Ahtiviruswirkung und annehmbar geringen Nebenwirkungen gefunden. Eine besonders unerwünschte Wirkung bei verfügbaren chemotherapeutischen Antivirusmitteln ist jene, daß sie in Wechselwirkung nicht nur mit dem Virus, sondern auch mit Bestandteilen der Zellen des Patienten treten können.

Ein wirksames selektives Antivirusmittel mit annehmbaren Nebenwirkungen sollte einen selektiven Hemmeffekt auf eine spezifische Virusfunktion des zu bekämpfenden Virus haben. Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue Methode zur Bekämpfung von Virusinfektionen unter Verwendung eines Antivirusmittels zu erhalten, welches einen selektiven Hemmeffekt auf Virusfunktionen, aber nur einen vernachlässigbaren Hemmeffekt auf Funktionen der Patientenzellen hat.

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_ 4 —

Auch betrifft die Erfindung neue pharmazeutische Mittel, die
das Antivirusmittel enthalten.

Obwohl die vorliegende Erfindung allgemein gesprochen eine neue Methode zur selektiven Bekämpfung von Virusinfektionen bei Tieren und Menschen sowie pharmazeutische Präparate, die bei einer solchen Behandlung zu verwenden sind, betrifft, ist sie besonders brauchbar bei der Behandlung von Herpesvirus-Infektionen
und Influenzavirus-Infektionen.

Influenza ist eine der häufigsten Krankheiten bei Menschen,
doch ist sie äußerst schwierig zu verhindern oder zu behandeln.

Es gibt zwei Hauptvarietäten von Influenza, die allgemein als
Influenza A und Influenza B bezeichnet werden. Eine andere Influenzavarietät, die als Influenza C bezeichnet wird, existiert auch, doch kommt sie nicht so häufig wie Influenza A und Influenza B vor. Diese Influenzatypen werden durch Viren verursacht, die allgemein als Influenzavirus vom Typ A, B bzw. C bezeichnet werden.

Ein besonders wichtiges Gebiet für die Verwendung der Mittel
nach der Erfindung ist die Behandlung von Herpesvirus-Infektionen. Unter den Herpesviren können Herpes simplex vom Typ 1 und 2,
varicella (Herpes zoster), infektiöse Mononucleose verursachende Viren (d.H. Epstein-Barr-Virus) und Cytomegalovirus genannt werden. Andere Bereiche der Verwendung für die Mittel nach der Erfindung sind die Behandlung von Infektionen, die durch Viren,
wie Papillomaviren (d.h. Warzen), Adenoviren, Pockenviren,
Hepatitisvirus A und Hepatitisvirus B verursacht werden. Andere mögliche Bereiche der Verwendung für die Mittel nach der Erfin-

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dung sind die Behandlung von Infektionen, die durch Picornaviren, Arboviren, Leucoviren, Arenaviren, Coronaviren, Rhabdoviren und Paramyxoviren verursacht werden. Noch andere mögliche Gebiete für die Verwendung der Mittel nach der Erfindung sind die Behandlung von Krebs und Tumoren, besonders von jenen, die durch Viren verursacht werden.

Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß Phosphonoameisensaure der Formel

0 0

HO-C-P-OH I

OH

und physiologisch verträgliche Salze derselben bestimmte Virusfunktionen, die wesentlich für die Virusvermehrung sind, selektiv hemmen.

Es wurde gefunden, daß Phosphonoameisensaure eine spezielle Funktion von Influenzavirus selektiv hemmt, nämlich die mit dem Influenzavirus verbundene RNA-Polymerase, während sie die entsprechenden Polymerasen der Patientenzelle nicht beeinflußt, d.h. kälberthymus-DNA-abhängige RNA-Polymerasen A und B. Diese Polymerasen sind Enzyme, die die Synthese von RNA in der Patientenzelle katalysieren. Es wurde auch gefunden, daß Phosphonoameisensaure eine spezifische Funktion von Herpesvirus hemmt, nämlich die induzierte Herpes simplex-Type 1-DNA-Polymerase. Sie ist nicht wirksam gegenüber E. coli-DNA-abhängiger RNA-Polymerase und Micrococcus lysodeicticus-DNA-abhängiger DNA-Polymerase. Die Hemmung der Viruspolymeräsen bedeutet, daß der Virus sich nicht vermehren kann und so die Virusinfektion verhindert wird.

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Die Phosphonoameisensäure kann für die Verwendung in der Humanmedizin und Veterinärmedizin für therapeutische und prophylaktische Verwendung eingesetzt werden. Die Verbindungen können in der Form eines physiologisch verträglichen Salzes benutzt werden. Geeignete Salze sind beispielsweise Aminsalze, wie Dimethylamin- und Triäthylaminsalz, Ammoniumsalz, Tetrabutylammoniumsalz, Cyclohexylaminsalz, Dicyclohexylaminsalz und Metallsalze, wie Mono-, Di- und Trinatriumsalz, Mono-, Di- und Trikaliumsalz, Magnesiumsalz, Calciumsalz und Zinksalz.

In der klinischen Praxis wird die Phosphonoameisensäure normalerweise örtlich, oral, intranasal, durch Injektion oder durch Inhalation in der Form eines pharmazeutischen Präparates verabreicht, das den aktiven Bestandteil in der Form der ursprünglichen Verbindung oder gegebenenfalls in der Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes derselben zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt, der ein festes, halbfestes oder flüssiges Verdünnungsmittel oder eine einnnehmbare Kapsel sein kann, und solche Präparate stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar. Die Verbindung kann auch ohne Trägermaterial verwendet werden. Als Beispiele pharmazeutischer Präparate können Tabletten, Tropfen, wie Nasentropfen, Mittel für örtliche Aufbringung, wie Salben, Gelees, Cremes und Suspensionen, Aerosole für Inhalation, Nasenspray usw. erwähnt werden. Gewöhnlich macht die aktive Substanz 0,05 bis 99 oder 0,1 bis 99 Gewichts-% des Präparates aus, wie beispielsweise 0,5 bis 20 Gewichts-% für Präparate, die für Injektionen bestimmt sind, und 0,1 bis 50 Gewichts-% für Präparate, die für orale Verabreichung bestimmt sind.

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Um pharmazeutische Präparate in der Form von Dosierungseinheiten für orale Verabreichung, die eine Verbindung nach der Erfindung enthalten, herzustellen, kann der aktive Bestandteil mit einem festen pulverförmigen Trägermaterial, wie beispielsweise Lactose, Saccharose, Sorbit, Mannit, einer Stärke, wie Kartoffelstärke, Maisstärke, Amylopectin, Laminarienpulver oder Zitruspulpepulver, einem Cellulosederivat oder Gelatine,vermischt werden und auch Schmiermittel, wie Magnesium- oder Calciumstearat oder ein Carbowachs V-/ oder andere Polyäthylenglycolwachse!enthalten und zu Tabletten oder Drageekernen verpreßt werden. Wenn Dragees erforderlich sind, können die Kerne beispielsweise mit konzentrierten Zuckerlösungen überzogen werden, die Gummi arabicum, Talkum und/oder Titandioxid enthalten können, oder stattdessen können sie mit einem filmbildenden Mittel überzogen werden, das in leicht flüchtigen organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel gelöst ist. Farbstoffe können diesen Oberzügen zugesetzt werden, wie beispielsweise, um zwischen unterschiedlichen Gehalten der aktiven Substanz zu unterscheiden. Für die Herstellung weicher Gelatinekapseln, die aus Gelatine und beispielsweise Glycerin als Weichmacher bestehen, oder zur Herstellung ähnlicher geschlossener Kapseln kann die aktive Substanz mit einem CarbowachsW oder einem geeigneten öl, wie Sesamöl, Olivenöl oder Arachisöl, vermischt werden. Harte Gelatinekapseln können Granulate der aktiven Substanz mit festen pulverförmigen Trägern, wie Lactose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Stärken (wie beispielsweise Kartoffelstärke, Maisstärke oder Amylopectin), Cellulosederivaten oder Gelatine, enthalten, und sie können auch Magnesiumstearat oder Stearinsäure als Schmiermittel jai.nschlJ.eeen.

Durch Verwendung mehrerer Schichten des aktiven Mittels, die durch langsam sich lösende überzüge voneinander getrennt sind, erhält man Tabletten mit verzögerter Wirkstoffabgabe. Ein anderer Weg zur Herstellung von Tabletten mit verzögerter Wirkstoff abgabe ist der, die Dosis des aktiven Mittels auf Granalien mit überzügen unterschiedlicher Dicke zu verteilen und die Granalien zusammen mit der Trägersubstanz zu Tabletten verpressen. Die aktive Substanz kann auch in langsam sich lösende Tabletten eingearbeitet werden, die beispielsweise aus Fett- und Wachssubstanzen bestehen, oder sie kann gleichmäßig in einer Tablette einer unlöslichen Substanz, wie einer physiologisch inerten Kunststoffsubstanz, verteilt werden.

um Dosierungseinheiten für orale Präparate, Tabletten, Kapseln usw., zu erhalten, die dazu bestimmt sind, die Abgabe und mögliche Zersetzung der aktiven Substanz im Magensaft zu verhindern, können die Tabletten, Dragees usw. für die Auflösung im Darm entsprechend beschichtet werden, d.h. mit einer Schicht eines gegenüber dem Magensaft resistenten Darmfilmes oder Überzugs mit solchen Eigenschaften versehen werden, daß dieser überzug sich nicht bei saurem pH-Wert im Magensaft löst. So wird die aktive Substanz erst abgegeben, wenn das Präparat den Darm erreicht. Als Beispiele solcher Darmüberzüge können Celluloseacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalate, wie jene

unter den Handelsbezeichnungen HP 55 und HP 50 sowie Eudragit^—' und Eudragitv^S erwähnt werden.

Brausepulver werden hergestellt, indem man den aktiven Bestandteil mit nichtgiftigen Carbonaten oder Hydrogencarbonaten von Natrium, Kalium oder Calcium, wie Calciumcarbonat, Kaliumcarbo-

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nat und Kaliumhydrogencarbonat, festen, nichtgiftigen Säuren, wie Weinsäure, Ascorbinsäure und Zitronensäure, und beispielsweise Aromastoff vermischt.

Flüssige Präparate für orale Verabreichung können in der Form von Elixieren, Sirupen oder Suspensionen bereitet werden, wie beispielsweise Lösungen, die etwa 0,1 bis 20 Gewichts-% aktive Substanz, Zucker und ein Gemisch von Äthanol, Wasser, Glycerin, Propylenglycol und gegebenenfalls Aromastoff, Saccharin und/oder Carboxymethylcellulose als Dispergiermittel enthalten.

Für parenterale Verabreichung durch Injektion können Präparate eine wäßrige Lösung eines wasserlöslichen pharmazeutischen verträglichen Salzes der aktiven Säuren nach der Erfindung, erwünschtermaßen in einer Konzentration von 0,5 bis 10 %, und gegebenenfalls auch ein Stabilisierungsmittel und/oder Puffersubstanzen in wäßriger Lösung umfassen. Dosierungseinheiten der Lösung können vorteilhafterweise in Ampullen eingeschlossen werden.

Für örtliche Aufbringung, besonders für die Behandlung von Herpesvirus-Infektionen auf der Haut, sind die Präparate zweckmäßig Salben, Gele, Suspensionen, Cremes und dergleichen. Die Menge der aktiven Substanz darin kann variieren, wie beispielsweise zwischen 0,05 und 20 Gewichts-% der aktiven Substanz. Solche Präparate für örtliche Aufbringung können in bekannter Weise hergestellt werden, indem man die aktive Substanz mit bekannten Trägermaterialien, wie Isopropanol, Glycerin, Paraffin, Stearylalkohol, PolyäthylengIycol usw., vermischt. Der pharmazeutisch verträgliche Träger kann auch einen bekannten chemischen Absorptionspromotor einschließen. Beispiele von Absorp-

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tionspromotoren sind Dimethylacetamid (US-PS 3 472 931), Trichloräthanol oder Trifluoräthanol (US-PS 3 891 757) , bestimmte Alkohole und Gemische derselben (GB-PS 1 001 949). Ein Trägermaterial für örtliche Aufbringung auf die unverletzte Haut ist auch in der GB-PS 1 464 975 beschrieben, nämlich ein Trägermaterial, das aus einem Lösungsmittel aus 40 bis 70 % (Volumen je Volumen) Isopropanol und 0 bis 60 % (Volumen je Volumen) Glycerin besteht, wobei der Rest gegebenenfalls aus einem inerten
Bestandteil eines Verdünnungsmittels besteht, der 40 % des Gesamtvolumens des Lösungsmittels nicht überschreitet.

Die Dosierung, in der die aktiven Bestandteile verabreicht werden, kann in einem weiten Bereich variieren und hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie beispielsweise von der Stärke der
Infektion, dem Alter des Patienten usw., und kann individuell
eingestellt werden. Als ein möglicher Bereich für die Menge an Phosphonoameisensäure, die je Tag verabreicht werden kann, sei ein Bereich von etwa 0,1 mg bis etwa 2OOO mg oder von 1 mg bis etwa 2000 mg erwähnt.

Die pharmazeutischen Präparate, die die aktiven Bestandteile
enthalten, können zweckmäßig derart zusammengesetzt werden, daß man Dosen innerhalb dieser Bereiche entweder als einzelne Dosierungseinheiten oder als mehrfache Dosierungseinheiten bekommt.

Es wurde somit nach der Erfindung gefunden, daß Phosphonoameisensäure und deren physiologisch verträgliche Salze verwendet
werden können, um selektiv Virusfunktionen von Herpesvirus und Influenzavirus zu hemmen. Da die fraglichen Funktionen wesentlich für die Vermehrung des Virus sind, sind Phosphonoameisensäure und physiologisch verträgliche Salze derselben brauchbar

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- Il -

für die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung von Virusinfektionen.

Der bevorzugte Aspekt nach der Erfindung ist die Verwendung von Phosphonoameisensäure oder eines physiologisch verträglichen Salzes derselben bei der Behandlung von Herpesvirus-Infektionen.

Phosphonoameisensäure ist eine bekannte Verbindung. Ihre Synthese und ihr Trinatriumsalz sind beispielsweise von Nylen in Chem. Berichte 57B, Seiten 1023 bis 1038 (1924) beschrieben. Da Phosphonoameisensäure in der Form ihrer freien Säure instabil ist, wird sie bevorzugt in der Form ihrer Salze verwendet.

Biologische Tests

Die Hemmwirkung von Phosphonoameisensäure auf Influenza- und Herpesviren wurde unter Anwendung der nachfolgend beschriebenen Methoden getestet. Die Testmethode für die Ermittlung der Wirkung von Phosphonoameisensäure auf Patientenzellenfunktionen ist ebenfalls nachfolgend beschrieben. In den Experimenten A bis K wurde Phosphonoameisensäure in der Form ihres Trinatriumsalzes verwendet.

I. Hemmung_von_Virus-_und_Zellgolvineräsen

Polymerase, Nucleinsäurematrize, Nucleosidtr!phosphate, von denen Guanosintriphosphat mit Tritium markiert war, Salz und Puffer wurde bei 0° C in einem Gesamtvolumen von 125,ul (für Herpes-DNA-Polymerase, siehe den nachfolgenden Schmelzpunkt) vermischt. Die Konzentrationen der Nucleosidtriphosphate UTP (üridintriphosphat), CTP (Cytidintriphosphat), GTP (Guanosintriphosphat) und ΆΤΡ (Adenosintriphosphat) waren allgemein 400, 400, 400 bzw. 2000yUMol. Die Testverbindung wurde auch in verschiede-

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nen Konzentrationen zu dem erhaltenen Gemisch zugesetzt. Ein Standardgemisch ohne Testverbindung wurde ebenfalls unter Verwendung der gleichen Mengen der Bestandteile hergestellt. Die Enzymreaktion, d.h. die Synthese von Nucleinsäure, begann durch Inkubieren des Gemisches bei 37° C. Für Influenza-RNA-Polymerasen lag die Temperatur bei 33° C. Man ließ die Reaktion 60 Minuten in dem Versuch mit Influenza und Micrococcuspolymerasen ablaufen. Für E. coli-DNA-abhängige RNA-Polymerasen lag die Zeit bei 20 Minuten, und für Herpes-DNA-Polymerasen lag sie bei 30 Minuten. Die Inkubationszeit für KäIberthymuspolymerasen lag bei 10 Minuten. Die Einarbeitung von markiertem Monomer in trichloressigsäureunlösliches Nucleinsäureprodukt wurde auf folgende Weise gemessen. Vor und nach der Inkubationsperiode wurden 50 ,ul von dem Gemisch abgenommen und auf Filterscheiben aufgebracht. Diese wurden in eine 5 %-ige Trichloressigsaurelosung getaucht, und mehrfach gewaschen. Nach dem Trocknen wurden die Scheiben hinsichtlich der Radioaktivität in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. Der Unterschied der Radioaktivität zwischen den Proben mit und ohne zugesetzte Verbindung wurde verwendet, um die Hemmung der Polymeraseaktivität zu berechnen. Die Hemmung wurde als Prozentsatz Hemmung unter Verwendung der Radioaktivität der Standardprobe als Grundlage ausgedrückt.

A. Hemmunc[_von_inf luenzavirus-TYg_A-verbundener_RNA-Polvmerase

Influenza-A -Aichivirus wurde nach der Methode von Pons und Hirst, Virology, 34, Seite 385 (1968) gereinigt. Das Versuchsgemisch ist von Bishop, Obijeski und Simpson in J. Virol., 8, Seite 66 (1971) beschrieben. Der Hemmeffekt von Phosphonoameisensäure ist in der nachfolgenden Tabelle I gezeigt.

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Hemmung von Typ A-Influenzavirus-verbundener RNA-Polymerase durch Phosphonoameisensäure

Phosphonoameisensäurekonzen- Hemmung tr a tion ( ,uMol) (%)

0,1 21

0,50 67

1,00 79

10 91

100 95

500 93

a) Mittel von zwei Experimenten
B. Hemmun2_von_Typ-B2lnf luenzavirus-verbundener_RNA-t|olymer ase

Polymerase von Influenza B-Hongkong 8/73 wurde in gleicher Weise wie Influenza-A_-Aichi in dem Experiment A untersucht. Die Hemmwirkung von Phosphonoameisensäure ist in der nachfolgenden Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Hemmung von Typ B-Influenzavirus-verbundener RNA-Polymerase durch Phosphonoameisensäure^a)

Phosphonoameisensäurekonzen- Hemmung tr ation ( ,uMol) (%)

1,0 77

500 1OO

a) in diesem Experiment lag die Konzentration von GTP bei 235.UMoI.

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C. HKlbthDNAbhäi£SN^APi

Die Reinigung der Enzyme erfolgte gemäß der Methode von Kedinger et al, Eur. J. Biochem., 28, Seite 269 (1972). Die Enzymfraktionen DCB und DCA wurden für alle Experimente verwendet. Das Prüfgemisch von Kedinger, a.a.O., wurde verwendet. Die Testergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

Hemmung von Kälberthymus-DNA-abhängigen RNA-Polymerasefraktionen B und A durch Phosphonoameisensäure

Phosphonoamelsensäurekonzen- Hemmung (%) tr ation ( ,uMol) DCB DCA

500 0 -3

Das Enzym wurde bei der Firma Sigma gekauft. Die verwendete Matrize war aus E. coli gemäß Marmur, J. Mol. Biol., 3, Seite 208

(1961) extrahierte DNA, und das Prüfgemisch war im wesentlichen jenes, wie es von Burgess in J. Biol. Chem., 244, Seite 6160

(1969) beschrieben ist. Die Testergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Hemmung von E. coli-abhängiger RNA-Polymerase durch Phosphonoameisensäure

Phosphonoameisensäurekonzen- Hemmung

Lon ι

500

tr ation ( ,uMol) (%)

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E. ii§njmung_vgn_Microcgccus_luteus-DNA-abhängiger_DNA-PglYmerase durch_Piiosplionoamei.sensä.ure

Die Polymerase wurde von der Firma Sigma gekauft und im wesent lichen gemäß Harwood et al, J. Biol. ehem., 245, Seite 5614 (1970) untersucht. Die Testergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V

Hemmung von Micrococcus luteus-DNA-abhängiger DNA-Polymerase durch Phosphonoameisensäure

Phosphonoameisensäurekonzen- Hemmung tr ation ( ,uMol) (%)

500 6

Reinigung des Enzyms erfolgte gemäß der Methode von Weissbach et al, J. Biol. Chem., 248, Seite 6270 (1973).

Das Versuchsgemisch (200 ,ul) enthielt 200 ,ug/ml aktivierter Kälberthymus-DNA und 0,05 mMol (3H) dTTP (spezifische Aktivität 130 cpm/pMol). Alle anderen Bestandteile waren die gemäß Weissbach (siehe oben). Die Ergebnisse sind in der Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

Hemmung von Herpes simplex-Virus Typ 1-induzierter DNA-Polymerase durch Phosphonoameisensäure

Phosphonoameisensäurekonzen- Hemmung tr ation ( ,uMol) (%)

5 15

20 43

1OO 76

⁵⁰⁰ ?*e&2*u ⁹⁰

I. Heminun2_der_Virusvermehrun2_in_Zellkulturen Die Hemmung von Influenzavirus und Herpesvirus durch Phosphonoameisensäure wurde als Fleckenverminderung nach den folgenden Verfahren gemessen.

G. HeimTiun2_der_Influenzaf lecken_^WSN;Wilson_Smith-neurotroge Type_A)__durch_Phosghonoameisensäure

wurde Die Methode des Fleckenversuches für Influenza/von Bently et al in Archiv für die Gesamte Virusforschung, 33 (1971), Seite 234, beschrieben. Monoschichten von MDCK (Madin Darby-Hundeniere)-Zellen auf Kunststoffpetrischalen von 5 cm wurden mit 100 flekkenbildenden Einheiten von Influenzavirus (WSN) beimpft. Nach der Virusabsorption wurde eine darüberliegende Agaroseschicht von 5 ml mit einem Gehalt unterschiedlicher Konzentrationen an Phosphonoameisensäure zugegeben, und die Platten wurden 4 Tage bei 34° C inkubiert. Die zu diesem Zeitpunkt gebildeten Flecken wurden ausgezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Tabelle VII

Hemmung der Influenzavirus (WSN)-Flecken auf MDCK-Monoschichten durch Phosphonoameisensäure

Phosphonoameisensäurenkonzen- Hemmung^a' trat ion (,uMol) (%)

100 10

250 50

500 95

a) Mittel von drei verschiedenen Experimenten

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Der Fleckenverminderungsversuch für Herpes simplex Typ 1 wurde auf GMK (Grünaffenniere)-Zellen durchgeführt, wie von Ejereito et al, J. Gen. Virol., 2 (1968), Seite 357 beschrieben ist. Monoschichten auf Petrischalen von 5 cm wurden verwendet, und nach der Virusadsorption wurde Phosphonoameisensäure dem Medium zugesetzt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle VIII aufgeführt.

Tabelle VIII

Hemmung der Herpes simplex-Typ 1-Flecken auf GMK-Monoschichten durch Phosphonoameisensäure

Phosphonoameisensäurekonzen- Hemmung^a' tr ation ( ,uMol) (%)

1 0

15 50

100 90

a) Mittel von drei verschiedenen Experimenten

Phosghongamei-

sensäure

Der Fleckenverminderungsversuch für Herpes simplex Typ 2 wurde auf gleiche Weise wie das Experiment H durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle IX

Hemmung von Herpes simplex-Typ 2-Flecken, von Patienten isoliert, auf SIRC (Staatens Serum-Institut-Kaninchenhornhaut)-Monoschichten

Phosphonoameisensäurekonzen- Hemmung tr ation ( ,uMol) (%)

5OO >99,9

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J. AkutejToxizität

Phosphonoameisensäure wurde hinsichtlich der akuten Toxizität bei Mäusen getestet. Die Verbindung (als ihr Natriumsalz) wurde als Lösung i.p. in Dosen von 250, 500, 1OOO, 20OO und 4000,uMol/kg verabreicht. Gruppen von vier männlichen Mäusen vom Stamm NMRI mit einem Gewicht von 18,5 bis 20,5 g wurden für jede Dosis verwendet. Man fand einen LD_ -Wert zwischen 4000 und 2000 ,uMol/kg Körpergewicht.

K. Andere_Tierversuche

Vorversuche mit auf der Haut mit Herpes Typ 1 infizierten Meerschweinchen zeigten, daß Phosphonoameisensäure in der Form ihres Trinatriumsalzes in örtlichen Präparaten gemäß den nachfolgenden Beispielen 15, 16 und 17 eine therapeutische Wirkung besitzt.

Diskussion der Testergebnisse

Der Zweck der obigen Versuche A, B und G bestand darin, die Wirkung der Phosphonoameisensäure gegen Influenzaviren festzustellen. Der Zweck der Versuche F, H und I war der, die Wirkung von Phosphonoameisensäure gegen Herpesviren festzustellen. Der Zweck der Versuche C, D und E bestand darin, das Fehlen einer Wirkung von Phosphonoameisensäure auf Zellpolymerasen zu ermitteln. Wie aus den Tabellen I bzw. II ersichtlich ist, hemmt Phosphonoameisensäure die Influenza-B-Viruspolymeraseaktivität um mehr als 50 % bei einer Konzentration von 0,SyUMoI und die Inf luenza-B-Viruspolymeraseaktivität um mehr als 50 % bei einer Konzentration von 1,0,uMol. Wie aus Tabelle VII ersichtlich ist, hemmt Phosphonoameisensäure die entsprechende Fleckenbildung um 50 % bei einer Konzentration von 250,uMol. Wie aus den Tabellen VI, VIII und IX ersichtlich ist, hemmt Phosphonoameisensäure

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die Herpes simplex-Virus-Typ 1-induzierte DNA-Polymeraseaktivität um mehr als 50 % bei einer Konzentration von 100,uMol, die Fleckenbildung von Herpes simplex-Virus-Typ 1 um 50 % bei einer Konzentration von 15 .uMol und die Fleckenbildung des Herpesvirus Typ 2 um mehr als 99,9 % bei 500,uMol. In den Tabellen III, IV und V ist ersichtlich, daß Phosphonoameisensäure keine wesentliche Wirkung auf Kälberthymus-DNA-abhängige RNA-Polymerasen oder 0 % bzw. -3 % Hemmung bei einer Konzentration von 50OyUMoI hat, daß praktisch inaktiv gegen E. coli-DNA-abhängige RNA-Polymerase bzw. 3 % Hemmung bei einer Konzentration von SOO.uMol hat, und daß sie praktisch inaktiv gegen Micrococcus luteus-DNA-abhängige DNA-Polymerase ist bzw. 6 % Hemmung bei einer Konzentration von 500,uMol zeigt. Die akute Toxizität von Phosphonoameisensäure ist gering, d.h. der LD_5Q-Wert liegt zwischen 2000 und 4000,uMol/kg bei Mäusen i.p. Somit zeigt Phosphonoameisensäure eine selektive Wirkung auf Influenza- und Herpesviren. Der selektive Effekt von Phosphonoameisensäure auf die Viruspolymerase ergibt eine molekulare Grundlage für einen selektiven Antiviruseffekt bei Tieren und Menschen.

Salze der Phosphonoameisensäure

Physiologisch verträgliche Salze von Phosphonoameisensäure werden nach bekannten Methoden hergestellt, wie äie durch das Folgende erläutert sind. Metallsalze können durch Umsetzung eines Metallhydroxids mit einem Alkylester mit Phosphonoameisensäure hergestellt werden. Beispiele von Metallsalzen von Phosphonoameisensäure, die auf diese Weise hergestellt werden können, sind Salze, die Li, Na, K, Ca, Mg, Zn, Mn und Ba enthalten.

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Ein weniger lösliches Metallsalz kann aus einer Lösung eines stärker löslichen Salzes durch Zugabe einer geeigneten Metallverbindung ausgefällt werden. So können beispielsweise Zn-, Mg- und Mn-Salze von Phosphonoameisensäure aus Natriumsalzen der Phosphonoameisensäure hergestellt werden. Das Metallion eines Metallsalzes von Phosphonoameisensäure kann durch Wasserstoffionen, andere Metallionen, Ammoniumion und durch Ammoniumionen, die durch einen oder mehrere organische Reste substituiert sind, unter Verwendung eines Kationenaustauschers ausgetauscht werden, wie in den folgenden Beispielen gezeigt ist.

Beispiel 1

Phosphonoameisensäuretrinatriumsalz (1,30 g) wurde in 50 ml Wasser aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Rühren ein Kationenaustauscher Dowex 50 W χ 2 in Säureform zugesetzt, bis ein pH-Wert von 5,35 erhalten worden war. Der Ionenaustauscher wurde abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äthanol unter Kühlen angerieben. Die Ausbeute an Dinatriumsalz lag bei 0,65 g. Es enthielt 8,3 % Wasser. Titration als Base ergab ein Äquivalentgewicht von 168,2 (korrigiert für 8,3 % Wasser) und Na 27,3 % (korrigiert für Wasser). Berechnet für CHO₅P · 2Na Formelgewicht 170,0, Na 27,1 %.

Beispiel 2

Ein Kationenaustauscher Dowex 50 W χ 2 (75 g) in der Säureform wurde mit Cyclohexylamin (10 g) gesättigt, in eine Säule (Durch

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messer 2 cm) gegossen und frei von überschüssigem Cyclohexylamin gewaschen. Eine Wasserlösung von Phosphonoameisensäuretrinatriumsalz (1,3 g in 40 ml Wasser) wurde langsam durch die Säule geführt, und anschließend wurden etwa 100 ml Wasser hindurchgeführt und das vereinigte Eluat wurde bei vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene Salz wurde aus Äthanol-Wasser umkristallisiert. Das Endprodukt war kristallin und besaß einen Schmelzpunkt von 215 bis 218° C (Zersetzung) und enthielt 27,0 % Wasser. Titration als Säure ergab ein Äquivalentgewicht von 220,5 (korrigiert für 27,0 % Wasser). Berechnet für CH₃O₅P · CgH-.N, Formelgewicht 225,2. Das NMR-Spektrum zeigte, daß das Salz nur einen Cyclohexylaminrest enthielt (eine kleinere Verunreinigung in Form von Äthanol wurde festgestellt).

Beispiele anderer brauchbarer Salze, die auf diese Weise hergestellt werden können, sind die Salze der allgemeinen Formel

O O

HO-C-P-OH OH

II

worin η 1, 2 oder 3 bedeutet, und X eine salzbildende Komponente ist, wie NH₃, CH₃NH₂, C₃H₅NH₂, C₃H₇NH₂, C₄H₉NH₂, C₅H₁₁NH₂, C₆H₁₃NH₂, (CH₃) ₂NH, (C₂H₅J₂NH, (C₃H₇J₂NH, (C₄H₉J₂NH, (C₅H₁ ^₂NH (C₆H₁₃J₂NH, (CH₃J₃N, (C₂H₅J₃N, (C₃H₇J₃N, (C₄H₉J₃N, (C₅H₁₁J₃N, (C₆H₁₃J₃N, CgH₅CH₂NH₂, HOCH₂CH₂NH₂, (HOCH₂CH₂J₂NH, C₂H₅NH(CH₂CH₂OHJ, C₂H₅N(CH₂CH₂OHJ₂, (HOH₂C)₃CNH₂ und

CH CH ^

NH

CH₂CH₂

Weitere Beispiele anderer brauchbarer Salze, die nach der Ionenaustauschmethode hergestellt werden können, sind quaternäre

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Ammoniumsalze von Phosphonoameisensäure, d.h. Salze, in denen 1 bis 3 der Wasserstoffatome in der Phosphonoameisensäure (Strukturformel I) durch quaternäre Ammoniumionen ersetzt sind, wie durch (CH₃J₄N, (C₂H₅J₄N, (C₃H₇J₄N, (C₄H₉J₄N, (C₅H_nJ₄N, (CgH₁₃J₄N und C₂H₅N(CH₂CH₂GH)₃. Lipophile Salze dieser Type können auch durch Vermischen eines Salzes von Phosphonoameisensäure mit einem quaternären Ammoniumsalz in Wasser und Herausextrahieren des resultierenden quaternären Ammoniumsalzes von Phosphonoameisensäure mit einem organischen Lösungsmittel, wie Dichlormethan, Chloroform, Äthylacetat oder Methylisobutylketon, hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung pharmazeuti scher Präparate nach der Erfindung. Die Phosphonoameisensäure wird vorzugsweise in der Forin ihres Natriumsalzes verwendet.

Beispxel 3	(als ihr Trinatriumsalz)	1,00	g
Aerosol für Inhalation		0,20	g
Phosphonoameisenäsure	4 auf	1OO,O	g
Miglyol®
Frigen® 11/12/113/11
Beispiel 4	• •
Tabletten	(als ihr Trinatriumsalz)	20,0	mg
Jede Tablette enthielt		25,0	mg
Phosphonoameisensäure		190,0	mg
Maisstärke		1.5	mq
Lactose
Gelatine

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Talkum
Magnesiumstearat

Beispiel 5

Suggositorien Jedes der Suppositorien enthielt:

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz)

Ascorbylpalmitat

Suppositoriengrundlage (Imhausen H oder
Whitepsol^H) auf

Beispiel 6

Sirug

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz)

Flüssige Glucose Rohrzucker Ascorbinsäure Natriumpyrosulfit Dinatriumedetat Orangenessenz Farbstoff

Gereinigtes Wasser auf Beispiel 7

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz)

Natriumpyrosulfit Dinatriumedetat

Natriumchlorid

Steriles Wasser für Injektion auf

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12,0 mg

1,5 mg

150,0 mg

20,0 mg 1,0 mg

2000,0 mg

0,200 g

30,0 g

50,0 g

0,1 g

0,01 g

0,025 g

0,015 g

100,0 g

0,550 mg 0,500 mg 0,10O mg 8,500 mg 1,00 ml

Beispiel 8

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 5,00 g

Natriumpyrosulfit 0,10 g

Dinatriumedetat 0,10 g

Natriumchlorid 0,85 g

Gereinigtes Wasser auf 100,0 ml

Beispiel 9

Subling_ual tabletten	(als ihr Trinatriumsalz)	5,0	mg
Phosphonoameisensäure		85,0	mg
Lactose		5,0	mg
Talkum		5,0	mg
Agar

100,0 mg

Beispiel 10

Dr ogs

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 2,00 g

Ascorbinsäure 1,00 g

Natriumpyrosulfit 0,10 g

Dinatriumedetat 0,10 g

Flüssige Glucose 50,00 g

Absoluter Alkohol 10,00 g

Gereinigtes Wasser auf 100,0 ml

Beispiel 11

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 0,200 g

FIUSSi₉SGlUCOSe _7M882/MU 30.0 ,

Rohrzucker 50,0 g

Ascorbinsäure 0,1 g

Dinatriumedetat 0,01 g

Orangenessenz mit Löslichmacher 0,25 g

Chlorwasserstoffsäure bis pH 6,0 - 6,5

Gereinigtes Wasser auf 100,0 g

Beispiel 1 2

Lösung

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 0,500 mg

Dinatriumedetat 0,100 mg

Natriumchlorid 8,500 mg

Chlorwasserstoffsäure bis pH 6,5 - 7,0

Steriles Wasser für Injektion auf 1,00 ml

Beispiel 13

Lösunc[_für_Inhalation

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 5,00 g

Dinatriumedetat 0,10 g

Natriumchlorid 0,85 g

Chlorwasserstoffsäure bis pH 6,5 - 6,9

Gereinigtes Wasser auf 100,0 ml

Beispiel 14

Dr ogs

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 2,00 g

Zitronensäure 1,00 g

Dinatriumedetat 0,10 g

Flüssige Glucose 50,00 g

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Äthanol, 95 %-ig 10,00 g

Natriumhydroxid und Chlorwasserstoffsäure
bis pH 6,2 - 6,8

Gereinigtes Wasser auf 100,0 ml

Beispiel 15

Lösung_für_örtliche_Aufbringung

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 2,00 g

Isopropanol 38,0 g

Glycerin 13,6 g

Chlorwasserstoffsäure bis pH 5,0 - 7,0

Gereinigtes Wasser auf 100,0 g

Präparate, die 0,2, 0,5 und 1,0 g Phosphonoameisensäuretrinatriumsalz enthielten, wurden ebenfalls hergestellt.

Beispiel 1 6

Gelee

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz)

Methocel^-^

Methylparaoxybenzoat

Propylparaoxybenzoat

Natriumhydroxid und Chlorwasserstoffsäure
bis pH 6,7

Destilliertes Wasser auf 1OO,O g

Beispiel 17

Salbe_I

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 2,5 g

Cetyltrimethylammoniumbromid 0,6 g

Stearylalkohol 2,25 g

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4,0	g
4,0	g
0,12	g
0,05	g

Cetanol 6,75 g

Flüssiges Paraffin 17,0 g

Glycerin 12,0 g Chlorwasserstoffsäure bis pH 6,5

Destilliertes Wasser auf 100,0 g

Präparate, die 0,2, 0,5, 1,0 und 2,0 g Phosphonoameisensäure trinatriumsalz enthielten, wurden ebenfalls hergestellt.

Beispiel 18

Salbe_II

Phosphonoaroeisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 2,5 g

Polyäthylenglycol 1500 50 g

Polyäthylenglycol 40OO 15 g

Propylenglycol auf 100 g

Beispiel 19

Salbe_III

Phosphonoameisensäure (als ihr Trinatriumsalz) 3,0 g

Sorbitanmonooleat 5,0 g

Vasiline auf 100 g

Beispiel 20

Tabletten gemäß Beispiel 4 wurden mit einer Darmüberzugslösung folgender Zusammensetzung beschichtet:

Celluloseacetatphthalat 12OfO g

Propylenglycol 30,0 g

Sorbitanmonooleat 10,0 g

Äthanol, 95 %-ig 450,0 ml

*"*" 709882/OeU ^qS· ^{au£ 10OO}'°

Das überziehen erfolgte nach einem Gießverfahren in einer herkömmlichen Beschichtungspfanne oder durch Besprühen der Tabletten in einem Pfannenspruhtablettenbeschichter.

ORIGINAL INSPECTED 709882/08U

Claims

Dr. Hans-Heinrich Willrath t Dr. Dieter Weber Dipl.-Phys. Klaus Seiffert PATENTANWÄLTE d-62 Wiesbaden ι 24. Juni 1977 Dr.We/Wh Giisuv-Freyu«-Stnie «S « (O 61 ti I 3717 10 Telefrimm«dre.M: WILLPATENT T«lex:4 - 186 247 LA 521-1 Astra Läkemedel Aktiebolag, Kvarnbergagatan 16, S-151 85 Södertälje Arzneimittel Priorität: Schwedische Patentanmeldung Nr. 7607496-2 vom 1. Juli 1976 Patentansprüche

1. Arzneimittel, enthaltend Phosphonoameisensäure der Formel

O O

HO-C-P-OH OH

und/oder ein physiologisch verträgliches Salz derselben, gegebenenfalls im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Tr ägermateriaI.

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ORIGINAL INSPECTED

2. Arzneimittel nach Anspruch 1 in der Form von Dosierungseinheiten.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 und 2 für örtliche Aufbringung.

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