DE2545749A1 - Verfahren zur koagulierung und trennung von blut - Google Patents
Verfahren zur koagulierung und trennung von blutInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufspaltung "bzw.
Trennung von Blut in einzelne Bestandteile, insbesondere leichtere und schwerere Phasen.
Die Blutgerinnung in vitro und die dabei ablaufenden enzymatischen
Umsetzungen können bekanntlich durch Kontakt mit kieselsäurehaltigen Stoffen wie Glas, Kaolin, Bentonit,
hydratiertem Aluminiumsilikat, Diatomeenerde oder Kieselgur gefördert werden; vgl. J.P. Soulier und O. Prou-Wartelle,
in British Journal of Haematology, Band 6, S. 88 - 101.
Die Bluttrennung in vitro wird bisher in der Weise durchgeführt, daß eine Blutmenge in einen Glasbehälter eingegeben
und eine Weile ruhig stehen gelassen wird, damit die durch den Kontakt mit der Glaswand aktivierten Gerinnungsfaktoren
bis zur Mitte der Probe diffundieren können, bis
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die Probe koaguliert ist. Erst dann, wird das koagulierte
^ Blut zentrifugiert und in eine lichtere, das Serum ent-
* haltende Phase sowie eine schwerere, Zellen und Gewebe- .
material enthaltende Phase getrennt. ; · _.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein weniger langwieriges und umständliches Verfahren zur Bluttrennung bereitzustellen.
Eine weitere bei Anwendung des bekannten Verfahrens entstehende Schwierigkeit hängt mit der eventuell eintretenden
Fibrinbildung in der. leichteren Serumphase zusammen.
Wird die Blutprobe zentrifugiert, bevor die Koagulation abgeschlossen ist, so entstehen durch Umsetzung von Fibrinogen
und Aktivierungsstoffen in der leichteren Phase Fibrinfasern. Für die zur Analyse der Serumphase verwendeten
Vorrichtungen ist diese Verunreinigung mit Fibrin störend oder sogar schädlich.
Erfindungsgemäß soll auch diese Schwierigkeit behoben werden.
Schließlich entsteht bisher auch häufig eine Verunreinigung
mit Fibrin in Form einer an der Phasengrenzfläche gebildeten sogenannten "weißen Schicht" aus auch nach dem Zentrifugieren
in Suspension verbleibenden faserigen Fibrin. Bei der Serumentnahme muß durch sorgfältigstes Absaugen eine Verunreinigung
mit Fibrin auch aus dieser Schicht vermieden werden,
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•Auch, dieses !Problem soll erfindungsgemäß gelöst werden.
Wünschenswert ist ferner die Verwendbarkeit auch von Gefäßen,
welche kein Glas oder keine Kieselsäure enthalten» z.B. aus Kunststoff oder Metall. Die Erfindung ermöglicht auch diese
Anwendung,
Zwar wurde bereits die Verwendung von Kunststoffröhrchen vorgeschlagen, welche zur Koagulationsanregung einzelne Glas-
oder Kaolinpartikel enthalten und kräftig bewegt werden. Es ist aber umständlich und ungünstig, eine derartige Durchmischung
zur Koagulation vor dem Zentrifugieren vornehmen zu müssen. Die Erfindung schafft auch hier Abhilfe.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Koagulierung
und Trennung von Blut in leichtere und schwerere Phasen, bei dem in ein Gefäß Partikel eines koagulationsfordernden, kontaktaktivierenden
Materials wie Glas, Kaolin, Bentonit, hydratiertes Aluminiumsilikat, Kieselgur, Diatomeenerde,
oder dergleichen gegeben werden, sodann Blut eingefüllt, koagulieren gelassen und zentrifugiert wird, dadurch gekennzeichnet,
daß Größe und Dichte der Partikel im Hinblick auf eine ohne Rühren und Schütteln nahezu gleichzeitig mit der
Bluteingabe erfolgende und bis zur vollständigen Eoagulierung
verbleibende gleichmäßige Suspension in der gesamten Blutmenge gewählt werden.
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-A-
Ferner wird ein Verfahren zum Herstellen der verwendeten
Partikel offenbart, nach dem Glaspulver einer Dichte
größer als die Serumphase mit einer Flüssigkeit einer Dichte nicht größer als die des zu trennenden Blutes gemischt
werden, die Mischung bis zur Ausfällung der schwereren Partikel stehen gelassen wird, das Sediment abgetrennt und
die überstehende Flüssigkeit langer und stärker als bei der normalen Blutzentrifugierung zentrifugiert wird, und die
hierbei ausgefällten Partikel entfernt und getrocknet werden.
Die Zeichnungen zeigen geschlossene Gefäße in verschiedenen Stadien der Bluttrennung mit Hilfe kontaktfördernder Partikel.
In das mit einem Stöpsel 13 oder dergleichen verschlossene Gefäß 10 aus chemisch trägem, und für Aufrechterhaltung eines
Vakuums geeignetem Material, z.B. Glas, Kunststoff usw. wird zunächst das kontaktaktivierende, gerinnungsfordernde Material
in Form von Pulver oder Partikeln gegeben.
Das Gefäß soll mit dem zu trennenden Blut nicht in Umsetzung
treten und die erforderlichen Zentrifugalkräfte aushalten. Der Verschluß 13 ist vakuumdicht und kann mit einer Nadel,
Kanüle oder dergleichen durchstoßen werden, sodaß z.B. eine siphonartige Blutentnahme möglich ist, vgl. z.B. US-PS 2,460,641.
Nicht erforderlich ist, daß das Gefäßmaterial selbst gerinnungsaktivierend ist, jedoch ist wegen seiner Dauerhaftigkeit und
guten Adsorption der gerinnungsfördernden Stoffe ein Borsilikatglas wie Corning PYREX^, Nr. 7740 besonders geeignet.
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Die kontaktaktivi er enden Partikel bestehen "beispielsweise
aus Glas, Kaolin, Bentonit, hydratiertem Aluminiumsilikat,
Kieselgur, Diatomeenerde usf. Die Dichte ist größer als die Serumphase. Ihre Größe ist so klein, daß sie beim Einfüllen
oder Einziehen des Blutes in den Behälter 10 im Blut gleichmäßig suspendiert werden und zumindest während der einsetzenden
Koagulierung ohne Rühren in Suspension bleiben, andererseits sind die Partikel aber so groß und dicht, daß sie durch
Zentrifugieren ohne Schwierigkeit ausgefällt werden können, z.B. im Falle des erwähnten Borsilikatglases von einer Dichte
im Bereich von 2,16 - 2,45 g/ccm. Durch die Größenwahl läßt sich ein zu starkes oder zu langes Zentrifugieren vermeiden,
das zur Hämolyse der roten Blutkörper führen und den Anteil an Milchdehydrogenase, Kalium oder Hämoglobin im Serum nach
oben verfälschen kann.
Die maximale Größe der Partikel wird günstigerweise so gewählt, daß sie die ersten 2-5 Min. der Koagulation ohne
Rühren in Suspension bleiben.
Besonders günstig ist ein feines Pulver, das suspendiert bleibt und in den von den Gefäßwänden entfernteren Teilen seine aktivierende
Wirkung entfaltet, bzw. für die Aktivierung eine größere Gesamtoberfläche zur Verfügung stellt, gleichzeitig
aber wegen der geringen Partikelmasse beim Zentrifugieren weniger stark oder häufig mit den roten Blutkörpern zusammenstößt,
und die Gefahr der Hämolyse nicht so groß ist.
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Zur Bereitung der gerinnungsaktivierenden Partikel wird z.B. das Borsilikatglas Corning 7740 mit einer Dichte von ca.
2,23 g/ccm in der Kugelmühle gemahlen und zur Entfernung größerer Partikel durch ein -325 mesh Sieb geleitet. Das
feinteilige Glas wird dann mit Wasser gemischt, und 5 Min.
stehen gelassen, bis sich die schwereren Partikel abgesetzt haben, der überstehende Teil abgegossen und 7 Min. mit bis
zu 1100 G- zentrifugiert, und das Zentrifugat im Vakuum bei 1000C getrocknet. Die erhaltene Partikelgröße ist 0,4 - 20/um,
4/um im Durchschnitt. Hierdurch erhält man gleichmäßige, nicht auf die Randteile beschränkte und ohne Rühren bleibende Suspensionen
mit der Möglichkeit der beschädigungsfreien Trennung durch Zentrifugieren. Die Größenverteilung der Partikel hängt
von ihrer Dichte ab. Da die Partikeloberflächen unregelmäßig und ungleichmäßig sind, sind die von der Flüssigkeit ausgeübten
Reibungskräfte nicht genau bestimmbar. Ein zahlenmäßiger Größenbereich der geeigneten Partikel läßt sich daher
nicht angeben, da die Ausfällung bzw. Sedimentation von der Zentrifugalkraft und den Reibungskräften abhängt. Der Bereich
wird daher funktional definiert (vgl. die vorstehenden Ausführungen und den Hauptanspruch).
Die Figur 2 zeigt, wie beim Einfüllen der Blutprobe in das Gefäß gleichzeitig die kontaktaktivierenden Partikel gleichmäßig
im gesamten Blut suspendiert werden. Ist ein dichter Verschluß 13 des ausgepumpten Gefäßes vorgesehen, so kann
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nach. Vornahme einer Venenpunktur mit der Nadel 40 das Blut
unmittelbar in das Gefäß gesaugt werden.
Infolge der gleichmäßigen Suspension "bestehen überall kontaktaktivierende
Stellen; das Blut koaguliert daher sehr rasch, die Koagulation ist nach 2-15 Min. abgeschlossen.
Sodann wird die Probe zentrifugiert. Hierbei wird entsprechend Figur 3 das Blut in die leichtere Serumphase 16 und die
schwerere, Zellen und Fasermaterial enthaltende Phase 18
getrennt. Die kontaktaktivierenden Partikel liegen jetzt ebenfalls getrennt vor und sind mit 20 bezeichnet.
Nach einer in der Figur 4 dargestellten bevorzugten Ausbildung wird eine bestimmte Trenngelmenge 30 aus thixotropem,
inaktivem Material mit einem spezifischen Gewicht zwischen dem der zu trennenden Phasen in das Gefäß gegeben und ein
dieses zu Beginn des Zentrifugierens nach oben drückendes Aktivatorelement 32 in einer zunächst etwas in das Gel eingedrückten
Lage vorgesehen. Me kontakt aktivier enden Partikel werden hierbei zweckmäßig in eine Vertiefung 33 des Elementes
gefüllt, und gehen bei Einführung der Blutprobe von selbst und ohne Rühren oder Schütteln in Suspension. Beim Zentrifugieren
werden die Partikel 20 ausgefällt, und das emporsteigende Gel hält die schwerere und leichtere Blutphase voneinander getrennt
.
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Das erfindungsgemäße Verfahren macht es überflüssig, zur Einleitung
der Blutkoagulierung den Gefäßinhalt zu rühren oder das Gefäß zu schütteln oder in eine horizontale Lage zu bringen,
vielmehr gehen die Partikel von selbst in Suspension und bewirken eine so rasche Koagulierung und Umwandlung des gesamten
Fibrinogengehalts in Fibrin, daß diese bei Beginn des Zentrifugierens
abgeschlossen ist und in der getrennten Serumphase keine Fibrinbildung stattfindet.
Bei direkter Blutentnahme durch Venenpunktur kann das Gefäß während der Koagulation und Zentrifugierung geschlossen bleiben,
was aus hygienischen Gründen günstig ist, z.B. Ansteckungsgefahr durch krankes Blut herabsetzt.
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Claims (5)
1.) Verfahren zur Koagulierung und Trennung von Blut in
leichtere und schwerere Phasen, bei dem in ein Gefäß Partikel eines koagulationsfordernden, kontaktaktivierenden
Materials wie Glas, Kaolin, Bentonit, hydratiertes Aluminiumsilikat, Kieselgur, Diatomeenerde, oder dergleichen
gegeben werden, sodann Blut eingefüllt, koagulieren gelassen und zentrifugiert wird, dadurch gekennzeichnet,
daß Größe und Dichte der Partikel im Hinblick auf eine ohne Rühren oder Schütteln nahezu gleichzeitig
mit der Bluteingabe erfolgende und bis zur vollständigen Koagulierung verbleibende gleichmäßige Suspension in der
gesamten Blutmenge gewählt werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel ein feinteiliges Pulver mit einer die rasche
Ausfällung aus der Serumphase bei normaler Zentrifugierung
bewirkenden Mindestgröße und einer Dichte größer als die Serumphase sind.
3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel aus Glas einer Dichte von 2,23 g/ccm,
einer Mindestgröße von 0,4/um, einer Höchstgröße von 20 /um,
und einer Durchschnittsgröße von 4/um bestehen.
- 10 609820/0686
4. Verfahren zum Herstellen der in dem Verfahren nach den Ansprüchen 1-3 verwendeten Partikel, dadurch gekennzeichnet,
daß Glaspulver einer Dichte größer als die Serumphase mit einer Flüssigkeit einer Dichte nicht
größer als die des zu trennenden Blutes gemischt werden, die Mischung bis zur Ausfällung der schwereren Partikel
stehen gelassen wird, das Sediment abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit länger und stärker als bei der
normalen Blutzentrifugierung zentrifugiert wird, und die
hierbei ausgefällten Partikel entfernt und getrocknet werden.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Glas einer Dichte von 2,23 g/ccm in der Kugelmühle gemahlen
und auf nicht über -325 mesh klassiert wird, mit Wasser gemischt, 5 Min. stehen gelassen, nach Abtrennung
des Sedimentes bis zu 7 Min. mit 1100 G- zentrifugiert wird, und die hierbei ausgefällten Partikel im Vakuum bei
1000C getrocknet werden.
609820/0685
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