[go: up one dir, main page]

DE3009126A1 - Verfahren zur gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfaehigen leukozyten aus blut - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfaehigen leukozyten aus blut

Info

Publication number
DE3009126A1
DE3009126A1 DE19803009126 DE3009126A DE3009126A1 DE 3009126 A1 DE3009126 A1 DE 3009126A1 DE 19803009126 DE19803009126 DE 19803009126 DE 3009126 A DE3009126 A DE 3009126A DE 3009126 A1 DE3009126 A1 DE 3009126A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
leukocytes
blood
concentration
supernatant
aggregating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19803009126
Other languages
English (en)
Inventor
Josef H. Dipl.-Chem. Dr. 6350 Bad Nauheim Wissler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority to DE19803009126 priority Critical patent/DE3009126A1/de
Priority to US06/237,703 priority patent/US4343793A/en
Priority to EP81101729A priority patent/EP0036168B1/de
Priority to JP3370281A priority patent/JPS56140922A/ja
Priority to DE8181101729T priority patent/DE3168425D1/de
Priority to AT81101729T priority patent/ATE11376T1/de
Publication of DE3009126A1 publication Critical patent/DE3009126A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/126—Physiologically active agents, e.g. antioxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
    • B01D21/26—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force
    • B01D21/262—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force by using a centrifuge
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2202/00—Special media to be introduced, removed or treated
    • A61M2202/04—Liquids
    • A61M2202/0413—Blood
    • A61M2202/0429—Red blood cells; Erythrocytes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2221/00—Applications of separation devices
    • B01D2221/10—Separation devices for use in medical, pharmaceutical or laboratory applications, e.g. separating amalgam from dental treatment residues

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Leukozyten (weiße Blutkörperchan) sind ein Spurenzellbestandteil des Blutes. Sie dienen im Körper verschiedenen Funktionen, "beispielsweise der Abwehr von Infektionen, dem Abbau zerstörten Zellmaterials (Phagozytose), der Produktion von regulierenden Stoffen des Zellwachstums, von Hormonen und von immunologischen Mediatoren, wie Immunoglobulinen, Prostaglandinen und Histamin. Unerwünschte Punktionen der Leukozyten werden sichtbar bei Leukämien in Form eines ungehinderten Zellteilungsverhaltens von bestimmten Leukozytenarten und deren Vorstufen. Leukozyten verhalten sich als amöboide Zellen und können sowohl statistisch (Chemokinesis) als auch gerichtet (Chemotaxis) durch chemische Agentien in ihrer Umgebung zur Wanderung stimuliert werden. Diese beiden Arten des Wanderungsverhaltens gehören zu den empfindlichsten Kriterien bei der Überprüfung der Lebensfähigkeit und der Lebenskapazität der Leukozyten.
Es gibt verschiedene Arten von Leukozyten: neutrophile, eosinophile und basophile Phagozyten, mononukleäre Phagozyten (Monozyten) und kleine mononukleäre Leukozyten (Lymphozyten) sowie die verschiedenartigsten Vorstufen davon. Die Lymphozyten wiederum bestehen aus verschiedenen unterscheidbaren Populationen mit verschiedenen biologischen Punktionen (ÜJ-Zellen, B-Zellen usw.). Alle Leukozytenarten werden als multipotente differenzierungsfähige Stammzellen im Knochenmark gebildet, welche auch gemeinsame'für Erythrozyten und Thrombozyten sind. Nach ihrer Reifung und ihrem Übertritt in den Blut strom behalten nur die Monozyten und Lymphozyten ihre !Peilungsfähigkeit bei. Der Übertritt der verschiedenen Leukozytenarten in das Gewebe infolge chemischer Anlockung ist in der Regel wiederum mit einer weiteren Differenzierung der Zellen verbunden. So werden beispiels-
' INSPECTED
weise Monozyten in Makrophagen, basophile Leukozyten in Mastzellen umgewandelt.
Leukozyten sind sehr empfindliche Zellen mit beschränkter* von der Zellart abhängiger Lebensdauer. Äußere Krafteinwirkung und der Einfluß verschiedenster chemischer Stoffe oder unphysiologische Bedingungen führen sehr leicht zu einer Schädigung in funktioneller und/oder morphologischer Hinsicht .
Bisher konnten Leukozyten wirtschaftlich nur in kleinen Men-
10
gen (maximal etwa 10 Zellen pro Ansatz) gewonnen werden. Hierfür wurde beispielsweise die gesamte Leukozytenpopula-
sotfenannten
tion mit Hilfe von /Prennmitteln durch Zentrifugieren oder im Schwerefeld direkt aus dem Gesamtblut abgetrennt. Es ist ferner bekannt, nur bestimmte Leukozytenarten zu gewinnen, z.B. nur nukleophile Granulozyten oder Lymphozyten, und zwar durch gemeinsame Abtrennung aller übrigen Bestandteile des Blutes. Diese bekannten "Verfahren der direkten Abtrennung sind für die Gewinnung größerer Mengen von Leukozyten schon deshalb nicht geeignet, da sie die Handhabung, insbe-
daa
sondere Zentrifugieren sehr großer Blutvolumina erfordern wurden. Zur Lösung diese Problems wurde die Anwendung der Durchflußzentrifugißramyi vorgeschlagen. Ferner wurde versucht, bestimmte Leukozytenarten, wie neutrophile Granulozyten, nach Phagozytose von zugesetzten Eisenfeilspänen magnetisch abzutrennen. Auch die Abtrennung der Leukozyten aus Blut mit Hilfe von Adsorptions- und Filtertechniken
(Leukophorese) wurde erprobt.
30
Alle diese Verfahren ermöglichen aus verschiedenen Gründen nur die Aufarbeitung von Leukozyten aus kleineren Mengen Blut (maximal 6 bis 10 Liter). Neben den bereits erwähnten Handhabungsschwierigkeiten und dem unverhältnismäßig hohen Kostenanfall infolge der benötigten großen Mengen sehr teurer Trenn- und Aggregationsmittel (Metrizoate, Dextran u.dgl.)
1/0036
ist bei den bekannten Verfahren insbesondere die funktioneile und morphologische Unversehrtheit und Lebensfähigkeit der Leukozyten nicht gewährleistet. Dies gilt vor allem für die Durchflußzentrifugierung,bei der eine sehr ungleichmäßige Krafteinwirkung auftritt, und natürlich auch für die Isolierung mit Hilfe von Eisenfeilspänen.
"Funktionelle Unversehrtheit" bedeutet dabei das unvermin-
sowie die derte statistische und gerichtete Wanderungsvermögen,/unverminderte Phagozytose von Fremdpartikeln und zellspezifische Sekretion von Leukozytenprodukten. Die "morphologische Unversehrtheit" ist bestimmt durch die Integrität der Zellform und der subzellulären Strukturen, sowie die Nichtanfärbbarkeit im Farbstoffausschluß-Test (Vitalfärbung).
Für die Erforschung der biologischen Funktionen der Leukozyten, zur Gewinnung von Leukozytenhormonen und für die medizinisch-diagnostische sowie medizinisch-technische An-
Mengen von wendung von Leukozyten ist die Verfügbarkeit größerer/funktionell und morphologisch intaktem und lebensfähige! Leukozyten Voraussetzung. Es besteht deshalb ein Bedürfnis nach einem Verfahren, das die rasche, schonende, wirkungsvolle und wirtschaftliche Gewinnung von Leukozyten in technischem Maßstab ermöglicht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfähigen Leukozyten aus Blut zur Verfügung zu stellen., 4as in wirtschaftlich vertretbarer Weise die rasche und schonende Gewinnung großer Mengen von Leukozyten in hoher Ausbeute ermöglicht. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfähigen Leukozyten aus Blut, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) Blut mit einer ausreichenden Menge einer erythrozyten-
aggregierenden Substanz versetzt und den Überstand von L den aggregierten Erythrozyten abtrennt,
130041/0036
b) den erhaltenen Überstand bei höchstens durchschnittlich etwa 400 χ g und einer Temperatur von etwa O bis 370C etwa 5 bis 15 Minuten zentrifugiert und den thrombozytenhaltigen Überstand von den sedimentierten Leukozyten abtrennt,
c) die erhaltenen sedimentierten Leukozyten zur Lyse der restlichen begleitenden Erythrozyten und Thrombofcyten bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 und einer !Temperatur von höchstens etwa +80C etwa 20 bis 60 Sekunden mit Wasser oder einer Kochsalzlösung behandelt, so daß die KaCl-Konzentration in der Suspension höchstens etwa 0,4·% beträgt, danach die Suspension wieder auf physiologische Konzentration einstellt und die Leukozyten aus der Suspension abtrennt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden also zunächst die gesamten Leukozytenpopulationen ohne Rücksicht auf die verschiedenen Leukozytenarten von Erythrozyten, Thrombozyten, Plasma oder Serumkomponenten abgetrennt. Dabei entfällt die Notwendigkeit, dem Blut große Mengen Trennmittel in hoher Konzentration zusetzen zu müssen, um eine Abtrennung bestimmter Zellarten aus einem großen Blutvolumen zu erreichen. Dadurch, daß keine Trennmittel zur Auftrennung des gesamten Blutvolumens eingesetzt werden, wird das Verfahren nicht nur erheblich wirtschaftlicher, sondern es verläuft auch zeilschonend und ermöglicht deshalb die Gewinnung der Leukozyten in hoher Ausbeute unter Beibehaltung ihrer funktioneilen und morphologischen Integrität. Einzelne Lukozytenarten können dann nach der Gewinnung der gesamten gemischten Populationen unter Anwendung der üblichen Trennmittel und -verfahren, allerdings in wesentlich geringerer und deshalb wirtschaftlich vertretbarer Menge, aus diesen isoliert werden , da das hierfür zu behandelnde Volumen durch das erfin- . dungsgemäße Verfahren auf einen Bruchteil des ursprünglichen Blutvolumens vermindert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Gewinnung der Leukozyten aus dem Blut der verschiedensten Lebewesen. Wegen
130041/0038
der leichten Verfügbarkeit ist die Verwendung von Gäugerblut, insbesondere Blut vom Menschen, Schwein, Rind, Schaf, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen oder Ratte, bevorzugt. Das Blut kann in nativem Zustand anticoaguliert oder coaguliert als zellreiches Plasma eingesetzt werden. Bevorzugt wird natives anticoaguliertes Blut verwendet, da die Abtrennung des zellreichen Plasmas vom Blutkuchen einen zusätzlichen Arbeitsgang erforderlich macht und mit. einem weitgehenden Verlust der Thrombozyten und einem teilweisen Verlust an Phagozyten infolge Anhaftung an und Einschluß in den Blutkuchen verbunden ist. Zur Verhinderung der Coagulierung können dem nativen Blut übliche Anticoagulantien, wie Citrate, Oxalate, EDTA oder Heparin, in üblicher Menge zugesetzt werden. Aus wirtschaftlichen Gründen wird als Anticoagulant vorzugsweise eine Citratlösung verwendet.
In der ersten Stufe des Verfahrens wird das Blut mit einer ausreichenden Menge einer e'rythrozytenaggregierenden Substanz versetzt, um den Großteil der Erythrozyten von der
2C Gesamtheit der Leukozytenpopulationen und den Thrombozyten ohne Einsatz von Trennmittel und/oder Zentrifugen abzutrennen. Als erythrozytenaggregierende Substanzen eignen sich alle üblicherweise für diesen Zweck verwendeten, Leukozyten nicht schädigenden und nicht aggregierenden Stoffe. Spezielle Beispiele für derartige Stoffe sind Methylcullulose, Dextran und andere natürliche und synthetische Polysaccaride.
Vorzugsweise wird als erythrozytenaggregierende Substanz Methylcellulose verwendet, da sie einerseits das wirtschaftlichste Mittel darstellt und zum anderen physiologisch unbedenklich ist und bei den erforderlichen Konzentrationen und übrigen Verfahrensbedingungen das Komplementsystem des Blutes nicht aktiviert und dadurch keine leukozytenaktivierenden Faktoren freigesetzt werden. Um die Handhabung der
Suspension und die Abtrennung der Erythrozyten zu erleichtern, wird Wtethylcellulose mit möglichst niedriger Viskosität verwendet.. Geeignet ist Methylcellulose mit einer Viskosität > 10""2 Pa. s, vorzugsweise 2 ΊΟ""2 bis 3·10~2 Pa.s (gemessen an einer 2prozentigen Lösung in Waaser bei 200C).
INSPECTED
"I Solche vorzugsweise verwendete Methylcellulose besitzt ein Molekulargewicht von
etwa 20 000 bis 25 000. Die Konzentration der Methylcellulose im Blut beträgt mindestens/O,01%. Bei geringeren Kohzentrationen ist die aggregierende Wirkung unbefriedigend, das Absetzen der Erythrozyten erfordert zu lange Zeit und die Leukozyten setzen sich ebenfalls in aggregierter Form als sogenannter "buffy-coat" ab. Die Obergrenze der Methylcellulosekonzentration ist nicht kritisch; sie wird von Viskositäts- und WirtschaftlichkeitsgeSichtspunkten bestimmt. Konzentrationen über etwa 0,3% sind aus diesen Gründen unzweckmäßig. Bevorzugt ist ein Konzentrationsbereich von etwa 0,05 bis 0,3%, insbesondere etwa 0,1%.Methylcellulose in
der Gesamtblutsuspension.
15
Die Behandlung mit der erythrocytenaggregierenden Substanz, wie Methylcellulose, erfolgt bei Temperaturen von 0 bis 37"C und bei einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,0, vorzugsweise von 6,8 bis 7,5.
20
Nach der Zugabe der Methylcellulose setzen sich die aggregierten Erythrozyten im Verlauf von etwa 20 bis 35 Minuten ab. Der aus Plasma, Leukozyten, Thrombozyten und geringen Mengen restlicher Erythrozyten bestehende Überstand wird danach in üblicher Weise, beispielsweise durch Dekantieren, Abheben oder Abpumpen, von den aggregierten Erythrozyten abgetrennt. Damit wird eine Volumenreduzierung von etwa 50% erzielt.
Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet die gmeinsame Abtrennung aller Leukozytenpopulationen von Thrombozyten und Plasmakomponenten aus dem leukozyten- und thrombozytenreichen Überstand der ersten Stufe. Dazu wird dieser Überstand bei niedrigen Schwerefeldern kurz zentrifugiert, wobei alle Leukozytenarten geaeinsam sedimentieren, während Plasmakomponenten und Thrombozyten im Überstand verbleiben.
1 3 CD ;Q 41 / 0 © 3 β
Das Zentrifugieren erfolgt bei höchstens durchschnittlich etwa 400 χ g, da hei höherer Kraft auch die Thronibozyten mitsedimentiert werden. Die Untergrenze der Zentrifugationskraft ist nicht kritisch; eine zu starke Erniedrigung erfordert Jedoch eine längere Zentrifugierzeit, was zu Aus-"beuteverlusten und einer Einschränkung der funktionellen Integrität der Leukozyten führen kann. Vorzugsweise wird das Zentrifugieren bei durchschnittlich etwa 400 χ g durchgeführt.
Die Dauer des Zentrif ugierens beträgt 5 bis 15 Minuten. Bei kürzerer Zeit ist der Sedimentationseffekt zu gering, während bei längeren Zeiten die funktioneile Integrität der Leukozyten beeinträchtigt ist. Vorzugsweise wird das Zentrifugieren etwa 8 bis 12, insbesondere etwa 10 Minuten durchgeführt. Die Temperatur beim Zentrifugieren kann 0 bis 57°C betragen. Vorzugsweise beträgt sie höchstens etwa 15°C» insbesondere 5 bis 100G.
Zum Zentrifugieren eignet sich jede manuell oder automatisch geschwindigkeitskonstant haltbare und temperaturregelbare Schleudermaschine.
Nach der Beendigung des Zentrifugieren wird der thrombozyten-und plasmakomponentenreiche Überstand in üblicher Weise, beispielsweise durch Dekantieren, Abheben oder Abpumpen, von den sedimentierten Leukozyten abgetrennt. Das Volumen des Leukozytensediments beträgt {jetzt noch etwa 0,5% des Ausgangsblutvolumens.
Die Thrombozyten können erfindungsgemäß von den Plasmakomponenten aus dem thrctrbozytenrelchen tiberstand durch kurzes Zentrifugieren in der vorstehend angegebenen Weise,jedoch bei höherer Beschleunigung als 400 χ g, vorzugsweise bei 800 χ g und einer Dauer von 20 min, als Sedirasnt gewonnen, in einer Throribozyten nicht schädigenden oder aggregierenden Salzlösung suspendiert und einer Verwendung zugeführt werden. Diese Gewinnung der Thraribozyten ist ebenfalls Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der plasmahaltige überstand kann separat anderweitig oder im Zusammenhang mit der Buxxribozytenverwertung benutzt werden.
130041/0036
Das in der vorstehend beschriebenen Verfahrensstufe erhaltene Leukozytensediment enthält eine geringe Menge restlicher begleitender Erythrozyten und Thrombozyten. Diese Verunreinigungen werden in der dritten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Suspendieren in einer hypotonischen Salzlösung lysiert und anschließend entfernt.
Dazu wird das Leukozytensediment zunächst durch sorgfältiges Schütteln im Gefäß verteilt und unter weiterem sorgfältigen rotierenden Schütteln durch Zugabe von Wasser oder verdünnter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 und einer Temperatur von höchstens etwa +80C etwa 20 bis 60 Sekunden auf eine NaCl-Konzentration von höchstens etwa 0,4% eingestellt. Unter diesen Bedingungen werden die Erythrozyten und Thrombozyten durch Lyse zerstört und ihre Bestandteile in Lösung gebracht, während die Leukozyten funktionell und morphologisch intakt bleiben.
Eine Kochsalzkonzentration über etwa 0,4% und/oder eine Behandlungsdauer unter etwa 20 Sekunden ist zur vollständigen Lyse der Fremdzellen ungenügend- Andererseits führen eine Behandlungsdauer über 60 Sekunden und/oder eine Temperatur über +80C auch zur Schädigung der verschiedenen Leukozytenarten.
25
Vorzugsweise beträgt der pH-Wert bei der Lyse etwa 6,8 bis 7,5, insbesondere etwa 7,1. Die Temperatur beträgt vorzugsweise höchstens etwa 4°C, insbesondere etwa 0 bis 1°C. Die Dauer der Lyse ist vorzugsweise etwa 25 bis 35» insbesondere etwa 30 Sekunden. Bevorzugt ist außerdem eine NaCl-Konzentration während der Lyse von höchstens etwa 0,2%. Zweckmäßigerweise wird das Volumen der Suspension für die Lysereaktion auf etwa 1/20 des ursprünglichen Blutvolumens eingestellt.
Die Lysereaktion wird
dadurch beendet, daß die physiologischen Salzbedingungen,
313) ÜKI./0036
vorzugsweise 0,9% Kochsalzgehalt, wieder hergestellt werden. Dazu fügt man "beispielsweise zu einer Zellsuspension mit einem NaCl-Gehalt von 0,2% unter sorgfältigem zirkulärem Schütteln das gleiche Volumen 1,6prozentige Kochsalzlösung mit gleicher Temperatur und gleichem pH-Wert hinzu. Anschließend werden die funktionell und morphologisch intakten Leukozyten aus der Suspension abgetrennt. Dies erfolgt beispielsweise durch Zentrifugieren unter den Bedingungen der zweiten Verfahrensstufe (vorzugsweise durchschnittlich etwa 400 χ g, etwa 8 "bis 12 Minuten, bei höchstens etwa 15°C). Danach wird der Überstand, beispielsweise durch Dekantieren, Abheben oder Abpumpen,von den sedimentierten Leukozyten abgetrennt .
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das in der dritten Stufe erhaltene Leukozytensediment nach Verteilung der Zellen im Gefäß durch zirkuläres Schütteln mindestens einmal mit einem Leukozyten nicht schädigenden und nicht aggregierenden flüssigen Medium aufgeschlämmt und und anschließend von dem flüssigen Medium wieder abgetrennt, tun an den Zellen und am Gefäß anhaftende geringe Mengen an löslichen Verunreinigungen zu entfernen. Als flüssiges Medium eignet sich hierfür jede die Ze]len nicht schädigende oder aggregierende Flüssigkeit, vorzugsweise physiologische Salz- oder Proteinlösung (Zellmedien) oder kryopräservative Medien. Spezielle Beispiele für geeignete Lösungen sind physiologische Kochsalzlösung, Hank's, Gey's oder Earfe's-Salzlösungen oder kompliziertere Zellmedien, wie Medium TC 199. Um den Waschvorgang wirkungsvoll zu gestalten, wird das Volumen der Suspension auf etwa 1/10 des ursprünglichen Gesamtblutvolumens gebracht.
Die Waschlösung kann anschließend auf übliche Weise, beispielsweise durch Dekantieren, Abheben oder Abpumpen des ÜberStandes vom Sediment nach einem Zentrifugierschritt, abgetrennt werden.
130041/0038
In einer anderen Aus führungsform können die in der Waschflüssigkeit suspendierten Leukozyten als solche oder als Sediment ihrer Verwendung zugeführt werden. Sie können auch
nach üblichen Verfahren kryopräserviert werden. 5
Sämtliche Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wenn die beabsichtigte Verwendung und die Erhaltung der funktioneilen und morphologischen Integrität der Leukozyten innerhalb ihrer normalen Lebenszeit dies erfordert. Die verwendeten Gefäße weisen eine hydrophobisierte, z.B. silikonisierte Oberfläche auf, um Verluste an adhärierenden Leukozytenarten und damit Veränderungen der natürlichen Populationszusammensetzung zu vermeiden. Lifolge der begrenzten natürlichen Lebenszeit der Leukozyten muß das Gewinnungsverfahren in möglichst kurzer Zeit durchgeführt werden. Ein wesentlicher Vor teil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es die Gewinnung der Leukozyten ohne Unterbrechungen in einer im Verhältnis zu ihrer Lebenszeit kurzen Zeit ermöglicht.
Fach dem erfindungsgemäßen Verfahren können funktionell und morphologisch intakte und lebensfähige Leukozyten in großer Menge auf wirtschaftliche Weise gewonnen werden. Beispiels-
12 weise können in einem Ansatz pro Arbeitskraft etwa 5*10 Zellen isoliert werden. Die erhaltenen Leukozyten können als Gesamtpopulation verschiedenen Verwendungszwecken zugeführt werden. Beispielsweise kann die gemischte Population kultiviert und zur Produktion von Leukozytenhormonen für die Gewebereparatur verwendet werden. Sie kann auch zur Isolierung von in vitalen Leukozyten enthaltenen Zellkomponenten oder subzellulären Strukturen verwendet werden.
Aus den erhaltenen gemischten Populationen von Leukozytenarten können nunmehr auch unter Anwendung der bisher bei Vollblut praktizierten Verfahren einzelne Leukozytenarten in homogener Zellpopulation isoliert werden. Da aber das zu
130041/0036
behandelnde Volumen nunmehr erheblich geringer ist als das ursprüngliche Gesamtblutvolumen (beispielsweise beträgt es bei Suspension der erhaltenen Leukozyten im dreifachen Flüssigkeitsvolumen nur etwa 2% des ursprünglichen Volumens), wird die Abtrennung und Gewinnung einzelner Leukozytenarten in großem Maßstab unter Verwendung der üblichen Trennmittel und Trennmethoden Überhaupt erst ermöglicht und gleichzeitig wirtschaftlich sinnvoll. Darin liegt ein weiterer erheblicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Beispielsweise können die Granulozyten (d.h. die neutrophilen, eosinophilen und basophilen Leukozyten)von den mononukleären Leukozyten XLymphozyten und Monozyten) dadurch abgetrennt werden, daß man die Gesamtpopulationen mit Glaswolle behandelt.
Die Granulozyten haften dabei an der Glaswolle an, die mononukleären Leukozyten dagegen nicht. Durch Auswaschen mit einem Leukozyten nicht schädigenden und nicht aggregierenden flüssigen Medium können die funktionell und morphologisch voll intakten Granulozyten von der Glaswolle wieder abgelöst werden.
Sowohl die Granulozyten als auch die mononukleären Leukozyten können dann getrennt kultiviert oder einer anderen Verwendung zugeführt werden.
Das Beispiel erläutert die Erfindung.
Ausführungsbeispiel
a) 100 Liter steriles frisches Schweineblut oder Humanblut werden durch Zusatz von Heparin bis zu einer Konzentration von 10 U/ml oder Natriumeitrat bis zu einer Konzentration von 0,01 molar und pH-Wert 7,10 in antikoaguliertes Blut überführt. Dieses Blut wird in einen 120 Liter fassenden, sterilen silikonisierten zylindrischen Behalter aus Polypropylen gegeben. Sodann wird das Blut mit 2prozentiger wäßriger Methylcelluloselosung (MC 25» Molekulargewicht 25 000) bis zu einer Konzentration von
13Q041/0036
" ORDINAL INSPECTED
0,1 Gewichtsprozent versetzt. Nach 20 bis Stehen bei 100C wird der Leukozyten und Thrombozyten enthaltende überstand (50 % des gesamten Blutvolumens) von den aggregierten Erythrozyten abgetrennt.
b) Der erhaltene Überstand wird sofort 10 Minuten bei 5°C und 4-00 χ g zentrifugiert. Der thrombozytenhaltige Überstand wird von den sedimentierten Leukozyten dekantiert,
und sofort 20 Minuten bei 800 χ g zentrifugiert. Dabei werden die Thrombozyten als Sediment gewonnen.
c) Hierauf werden die sedimentierten Leukozyten zur Lysis
■ von restlichen begleitenden Erythrozyten und Thrombozyten 30 Sekunden bei 00C vorsichtig in einer 1 mmolaren Natrium-Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7» 10
dispergiert, die Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,2 Gewichtsprozent enthält. Danach wird die Lysis durch Zusatz eines gleichen Volumens einer 00C kalten 1,6 gewichtsproζentigen Natriumchloridlösung vom pH-Wert 7,10 abgebrochen. Auf diese Weise wird wieder die physiologische Konzentration von 0,9 Gewichtsprozent Natriumchlorid eingestellt. Die erhaltene Dispersion der funktionell intakten und lebensfähigen Leukozyten wird 10 Minuten bei O0C und 4-00 χ g zentrifugiert.
Die erhaltene Mischpopulation der sedimentierten Leukozyten ist für verschiedene Zwecke, z.B. für bestimmte Kulturzwecke, für biologische Versuche oder zur Weiterverarbeitung auf reine Leukozytenpopulationen, bereits genttgend rein. Als Ausgangsmaterial für spezielle Kulturzwecke, z.B. die Mediatorproduktion unter Ausschluß von Verunreinigungen von Erythrozytenrestbestandteilen, werden die sedimentierten Leukozyten noch mindestens einmal weiter gewaschen.
1 30Q)4H /(0)036
d) Die in Stufe c) erhaltenen sedimentierten Leukozyten werden bei O0C in 1/10 des anfänglichen Blutvolumens (10 Liter) einer O,9gewichtsprozentigen Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,10 durch vorsichtiges zirkuläres Schütteln etwa 10 Minuten dispergiert. Hierauf wird die Dispersion 10 Minuten bei O0G und 400 χ g zentrifugiert. Dieser Vorgang wird noch ein weiteres Mal wiederholt.
Es wird in 50prozentiger Gesamtausbeute eine Mischpopulation von Leukozyten erhalten. Aus 200 Liter Schweineblut können durchschnittlich 2x 10 Zellen Leukozytenmischpopulation, entsprechend etwa 1 kg Lebendgewicht isoliert werden.
pie erhaltene Mischpopulation der Leukozyten kann nach Stands-rdmethoden entweder kryokonserviert oder in homogene Zellpopulationen von neutrophilfcn Leukozyten(etwa 58% der Gesamtmasse der Leukozyten), Lymphozyten (etwa 32%), Monozyten (etwa 7 %), eosinophilen (etwa 2,5%) und basophilen
Leukozyten (etwa 0,5%) aufgetrennt werden.
/CB038 ORIGINAL iN

Claims (4)

VOSSIUS VOSSIUS .TAaJpKMER.. HE-UhIEMANN RAUH SIEBERTSTRASSE * ■ 8QOO MÜNCHEN BO · PHONEi (O8Ö) 47+O 76 CABLEi BENZOtPATENT MDNCHEN ■ TELEX 8.88 4BSVOPAT D u.Z.: P575(V0/Ra/H) IU. MAJC-PLAjrCK-GESELLSCHAJO? zur Förderung der Wissenschaftea e.Y. Göttingen, Bunsenstraße 10 "Verfahren zur Gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfähigen Leukozyten aus Blut" Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfähigen Leukozyten aus Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) Blut mit einer ausreichenden Menge einer erythrozytenaggregierenden Substanz versetzt und den Überstand von den aggregierten Erythrozyten abtrennt,
b) den erhaltenen Überstand bei höchstens durchschnittlieh etwa 400 χ g und einer Temperatur von etwa O bis 37°C etwa 5 bis 15 Minuten zentrifugiert und den thrombozytenhaltigen Überstand von den sedimentierten Leukozyten abtrennt,
c) die erhaltenen sedimentierten Leukozyten zur Lyse der restlichen begleitenden Erythrozyten und Thrombozyten bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 und einer Temperatur von höchstens etwa +80C etwa 20 bis 60 Sekunden mit Wasser oder einer Kochsalzlösung behandelt, so daß die MaCl-Konzemtration in der Suspension höchstens etwa 0,4% beträgt, danach die Suspension wieder auf physiologische Konzentration einstellt und die Leukozyten aus der Suspension abtrennt.
L 130041/0036
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe c) erhaltenen Leukozyten d) mindestens einmal in einem Leukozyten nicht schädigenden und nicht aggregierenden flüssigen Medium aufschlämmt und anschließend von dem flüssigen Medium wieder abtrennt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als e-rythrozytenaggregierende Substanz Methylcellulose niedriger Viskosität verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Methylcellulose mit einer Viskosität von 2 bis 3 · 10~? Pa.s (Viskosität einer 2prozentigen Lösung in Wasser bei 200C) verwendet.
5· Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Methylcellulose in einer Konzentration von 0,05
bis 0,3% verwendet.
20
6- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zentrifugieren in Stufe b) bei durchschnittlich 400 χ g und einer Temperatur von höchstens etwa 15°C
etwa 8 bis 12 Minuten durchführt.
25
7· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lyse in Stufe c) bei einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 7,5» einer Temperatur von höchstens etwa 4-0C und einer NaCl-Konzentration von etwa 0,2% etwa 25 bis 35 Sekunden durchführt.
8· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Leukozyten nicht schädigendes und nicht aggregierendes flüssiges Medium eine physiologische Salzlösung, vorzugsweise physiologische Kochsalzlösung verwendet.
130041/0036
DE19803009126 1980-03-10 1980-03-10 Verfahren zur gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfaehigen leukozyten aus blut Withdrawn DE3009126A1 (de)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19803009126 DE3009126A1 (de) 1980-03-10 1980-03-10 Verfahren zur gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfaehigen leukozyten aus blut
US06/237,703 US4343793A (en) 1980-03-10 1981-02-24 Process for obtaining intact and viable leucocytes and thrombocytes from blood
EP81101729A EP0036168B1 (de) 1980-03-10 1981-03-09 Verfahren zur Gewinnung intakter und lebensfähiger Leukozyten und Thrombozyten aus Blut
JP3370281A JPS56140922A (en) 1980-03-10 1981-03-09 Recovery of leucocyte and blood platelet from blood
DE8181101729T DE3168425D1 (en) 1980-03-10 1981-03-09 A process for obtaining intact and viable leucocytes and thrombocytes from blood
AT81101729T ATE11376T1 (de) 1980-03-10 1981-03-09 Verfahren zur gewinnung intakter und lebensfaehiger leukozyten und thrombozyten aus blut.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19803009126 DE3009126A1 (de) 1980-03-10 1980-03-10 Verfahren zur gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfaehigen leukozyten aus blut

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE3009126A1 true DE3009126A1 (de) 1981-10-08

Family

ID=6096746

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19803009126 Withdrawn DE3009126A1 (de) 1980-03-10 1980-03-10 Verfahren zur gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfaehigen leukozyten aus blut
DE8181101729T Expired DE3168425D1 (en) 1980-03-10 1981-03-09 A process for obtaining intact and viable leucocytes and thrombocytes from blood

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE8181101729T Expired DE3168425D1 (en) 1980-03-10 1981-03-09 A process for obtaining intact and viable leucocytes and thrombocytes from blood

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4343793A (de)
EP (1) EP0036168B1 (de)
JP (1) JPS56140922A (de)
AT (1) ATE11376T1 (de)
DE (2) DE3009126A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0061141A2 (de) 1981-03-18 1982-09-29 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Chemokinesine und Chemotaxine aus Leukozyten und entzündeten Geweben: natürliche Mediationsproteine für umkehrbare Förderung von willkürlichen und gerichteten Bewegungen (Chemokinesis und Chemotaxis) und für Akkumulation von spezifischen Leukozytarten; Verfahren zu ihrer biotechnischen Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4487700A (en) * 1983-02-18 1984-12-11 Technicon Instruments Corporation Method and apparatus for separating lymphocytes from anticoagulated blood
CA1243957A (en) * 1983-06-03 1988-11-01 Laszlo Bogdany Compositions for cosmetic, health- and body- preserving use
US4572834A (en) * 1984-04-10 1986-02-25 Clinical Reference Laboratory, Inc. Biologic and method of preparing same
US4818418A (en) * 1984-09-24 1989-04-04 Becton Dickinson And Company Blood partitioning method
US4917801A (en) * 1984-12-04 1990-04-17 Becton Dickinson And Company Lymphocyte collection tube
US5053134A (en) * 1984-12-04 1991-10-01 Becton Dickinson And Company Lymphocyte collection tube
US4640785A (en) * 1984-12-24 1987-02-03 Becton Dickinson And Company Separation of lymphocytes and monocytes from blood samples
US4940668A (en) * 1985-11-01 1990-07-10 Becton Dickinson And Company Method for increasing agglutination of groups of cells to produce improved cell layer interface in centrifuged blood sample
US4695553A (en) * 1985-11-01 1987-09-22 Becton Dickinson And Co., Inc. Method for increasing agglutination of groups of cells to produce improved cell layer interface in centrifuged blood sample using antibodies
US4744907A (en) * 1987-01-16 1988-05-17 Interferon Sciences, Inc. Blood cell separation
US4844818A (en) * 1987-10-23 1989-07-04 Becton Dickinson & Company Method for separating the cellular components of blood samples
US4957638A (en) * 1987-10-23 1990-09-18 Becton Dickinson And Company Method for separating the cellular components of blood samples
US4867887A (en) * 1988-07-12 1989-09-19 Becton Dickinson And Company Method and apparatus for separating mononuclear cells from blood
US4954264A (en) * 1989-02-02 1990-09-04 Becton-Dickinson And Company Apparatus for separating mononuclear cells from blood and method of manufacturing and using the same
CA2148483A1 (en) * 1992-11-03 1994-05-11 Alexander Saunders Methods and procedures for preparing red blood fractions
US5789147A (en) * 1994-12-05 1998-08-04 New York Blood Center, Inc. Method for concentrating white cells from whole blood by adding a red cell sedimentation reagent to whole anticoagulated blood
US7169547B2 (en) 1994-12-05 2007-01-30 New York Blood Center, Inc. High concentration white blood cells as a therapeutic product
US5733545A (en) * 1995-03-03 1998-03-31 Quantic Biomedical Partners Platelet glue wound sealant
AU712934B2 (en) 1995-06-06 1999-11-18 Interpore International Inc. Device and method for concentrating plasma
DE19700651C1 (de) * 1997-01-10 1998-09-03 Siemens Ag Verdichtung zu entsorgender Steuer- und Absorberelemente aus Leichtwasser-Reaktoren
RU2129883C1 (ru) * 1998-07-08 1999-05-10 Закрытое акционерное общество "Международная компания Дельта SP" Получение концентрата тромбоцитов из плазмы, обогащенной тромбоцитами, по технологии "дельрус"
EP3244901A4 (de) * 2014-12-31 2018-06-20 Anthrogenesis Corporation Verfahren zur isolierung von thrombozyten
CN110804589A (zh) * 2018-08-06 2020-02-18 上海医药临床研究中心 一种白细胞的分离纯化方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2390727A (en) * 1942-08-15 1945-12-11 Baxter Laboratories Inc Treatment of blood
GB978743A (en) * 1960-05-25 1964-12-23 Nat Res Dev Process for the preparation of an eosinophil-containing material and extracts thereof from blood
US3709791A (en) * 1971-04-13 1973-01-09 Technicon Instr Method and apparatus for lymphocyte separation from blood
DE2546166A1 (de) * 1975-10-15 1977-04-28 Behringwerke Ag Gegerbte thrombozyten
AT364085B (de) * 1977-03-29 1981-09-25 Hoffmann La Roche Verfahren zur stabilisierung von leukozyten

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0061141A2 (de) 1981-03-18 1982-09-29 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Chemokinesine und Chemotaxine aus Leukozyten und entzündeten Geweben: natürliche Mediationsproteine für umkehrbare Förderung von willkürlichen und gerichteten Bewegungen (Chemokinesis und Chemotaxis) und für Akkumulation von spezifischen Leukozytarten; Verfahren zu ihrer biotechnischen Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen

Also Published As

Publication number Publication date
JPS56140922A (en) 1981-11-04
US4343793A (en) 1982-08-10
EP0036168B1 (de) 1985-01-23
EP0036168A2 (de) 1981-09-23
DE3168425D1 (en) 1985-03-07
EP0036168A3 (en) 1982-05-12
ATE11376T1 (de) 1985-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3009126A1 (de) Verfahren zur gewinnung von funktionell und morphologisch intakten und lebensfaehigen leukozyten aus blut
DE69320342T2 (de) Verfahren zur erhaltung einer ueberstandsfraktion von aktivierten thrombozyten
EP0071888B1 (de) Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, sterilen, pyrogenfreien und stromafreien Hämoglobinlösungen
DE69732662T2 (de) Verwendung von antikörpern gegen embryonales hämoglobin zur identifizierung von fötalen zellen
EP0931554B1 (de) Vorrichtung zur Aufbereitung von intra- oder postoperativen Blutverlusten für die Autotransfusion
DE69523566T2 (de) Dichte-gradientmedien zur trennung von zellen
DE69033787T2 (de) Filtration von Blutplättchen vor der Lagerung
DE3872588T2 (de) Vereinfachtes verfahren zur herstellung von menschlichen lymphokinaktivierten killerzellen.
DE69432859T2 (de) Verfahren zur reinigung von kollagenase
DE2908722A1 (de) Verfahren zum abtrennen von leukozyten aus einer leukozytenhaltigen loesung durch filtrierung und vorrichtung
EP3335744B1 (de) Verfahren zum herstellen einer leukozytenpräparation und leukozytenpräparation
EP0156961A2 (de) Verfahren zur Herstellung hochgereinigter, stromafreier, hepatitissicherer Human- und Tierhämoglobinlösungen
DE69826531T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur herstellung von gereinigten plasmaproteinen
DE102009022605B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Auftrennen von Vollblut
DE2560565C2 (de) Verfahren zum Herstellen gerinnungsaktivierender Partikel
DE69302426T2 (de) Filter zur Entfernung von Leukozyten
Day et al. Methods for separating platelets from blood and plasma
EP0276931B1 (de) Blutzellentrennung
CA1250808A (en) Semen sexing
DE69329340T2 (de) Aufbewahren von stammzellen
DE19817328C2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Thrombozytenpräparates
EP3662080A1 (de) Verfahren und zusammensetzung zur stabilisierung zellfreier nukleinsäuren und zellen
DE2323981A1 (de) Antikoagulansisolierung
DE60006505T2 (de) Verfahren zu trennung fötaler zellen aus maternalem blut
EP0146107A3 (de) Verfahren zur nacheinanderfolgenden Herstellung von humanem Leukozyteninterferon und humanem Gamma-Interferon

Legal Events

Date Code Title Description
8141 Disposal/no request for examination