DE2449167C2

DE2449167C2 - N-Acyl-L-histidyl-L-prolinamide, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2449167C2
Application number: DE2449167A
Authority: DE
Inventors: Siegfried Dipl.-Chem. Dr.Rer.Nat. 5190 Stolberg Herrling; Eberhard Dipl.-Chem. Dr. 5100 Aachen Schwertner
Original assignee: Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 1974-10-16
Filing date: 1974-10-16
Publication date: 1984-05-24
Also published as: ATA604475A; ZA755956B; AT348694B; BE834590A; DE2449167A1

Description

/"^Z"N R₁
i /

NH

O = C C

v_n₂

CO —NH- CH-COOH

(IH)

10

20

25

in Gegenwart eines wasserbindenden Mittels, oder mit einem funklionellen Derivat einer Verbindung der Formel III oder
c) ein N-Acyl-L-histidyl-L-prolinderivat der Formel so

R.

. NH

CH₂

O = C C

N CO — NH- CH- CO — N

COW

(IV)

40

in der W den Rest des N-Hydroxysuccinimids bedeutet, mit Ammoniak

und gegebenenfalls die erhaltenen Verbindungen der allgemeinen Formel I in an sich bekannter Weise 4ϊ in pharmazeutisch anwendbare Salze mit Säuren überführt.
8. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1.

50

Die Erfindung betrifft pharmakologisch aktive N-Acyl-L-histidyl-L-prolinamide der allgemeinen Formel 1

NH

CH₂

ι
CO —NH-CH-CO —N

CONH,

(D

W)

und deren pharmazeutisch anwendbare Salze mit Säuren.

Darin bedeutet Z eine Gruppe der Formeln

R₀ R₃

I I

(a) — NH- CO- C— oder (b) -C-S-CH₂-R₂ R₄

worin R₁ zusammen mit R₀ für eine zusätzliche Bindung oder, wenn Z die Gruppe (b) darstellt, für ein Wasserstoffatom steht, R₂ und R₃ für Wasserstoffatome oder für Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen stehen und R₄ Wasserstoff oder Methyl bedeutet. Besonders bevorzugt werden die Verbindungen der Formel I, in denen R₂ und R₄ für Wasserstoff stehen. In diesen bevorzugten Fällen handelt es sich dann bei den mit dem L-Histidyl-L-prolinamid verknüpften Carbonsäuren der Formel II

R,

>o O = C C

um Orotsäure, Thiomorpholin-(5)-on-(3)-L-carbonsäure und 6-Methylthiomorpholin-(5)-on-(3)-carbonsäure. Weitere geeignete Säuren der Formel II sind aber auch z. B. 5-Methyl-, 5-Äthyl- und 5-Propyl-orotsäure sowie 6,6-Dimethyl-thiomorpho!in-(5)-on-(3)-L-carbonsäure.

jo Wenn Z die Gruppe (b) bedeutet, liegen auch die Reste der Säuren der Formel II am die Carboxylgruppe tragenden Kohlenstoffatom (3) in der L-Form in den Verbindungen der Formel I vor. Sind darin R₃ und R₄ voneinander verschieden, so tritt ein weiteres Asvmmetrie-Ze.ntrum (am Kohlenstoffatom 6) auf, wobei an dieser Stelle in den Verbindungen der Formel I D bzw. L oder auch DL-Konfiguration vorliegen kann. Aufgrund der Basizität des L-Histidin-Restes sind die Verbindungen der Formel I befähigt, mit Säuren Salze zu bilden. Zum Gegenstand der Erfindung gehören daher auch Salze dieser Verbindungen mit pharmazeutisch (in Salzform) anwendbaren anorganischen oder organischen Säuren wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Phenylessigsäure, Benzolsulfonsäure.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen überraschenderweise biologische Eigenschaften, die denen des L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid, das gewöhnlich als »Thyrotropin-Releasing-Hormone« oder »TRH« bezeichnet wird, hinsichtlich Wirkungsqualität und Wirkungsstärke weitgehend gleichenjedoch erheblich langer als diejenigen des bekannten Produktes anhalten. Die Verbindungen sind bei parenteraler und oraler Verabreichung wirksam, wobei der Wirkungseintritt rasch erfolgt, z. B. bei parenteraler Gabe nach etwa 10 Minuten. TRH wird im Körper rasch enzymatisch abgebaut und damit wirkungslos, wobei dieser Abbau maßgeblich durch Pyroglutamat-aminopeptidasen bewirkt wird, die die Pyroglutamyl-Histidin-Bindung spalten. Überraschenderweise zeigte s'ch, daß Pyroglutamat-aminopeptidasen die Verbindungen der Formel I [geprüft wurden Orotyl-L-histidyl-L-prolinamid, nachstehend als Substanz »A« bezeichnet, S-Oxo-thiomorpholin^- (L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid (»B«) und S-Oxo-o-methyl-thiomorpholir.^-iU-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid mit [a] y -33,5°, c = 1 in Methanol (»C«)] nicht zu spalten vermögen.

Ein nach Gabe von TRH und analog wirkenden Substanzen auftretendes charakteristisches Bild ist das sogenannte »wet-dog-shaking« der Ratte. Dabei schütteln sich die Tiere unter dem TRH-Einfluß ähnlich wie ein nasser Hund, der das Wasser aus seinem Fell entfernen will. Dieser Versuch wurde z. B. wie folgt durchgeführt:
Männliche Ratten erhielten die jeweilige Testsubstanz intraperitoneal appliziert, und dann wurde in Abständen von 5 Minuten jedes Tier eine Minute lang beobachtet, wobei die Anzahl der Schüttelaktionen gezählt wird. Als Maß für die Wirkung der Prüfsubstanz wird dann die durchschnittliche Anzahl der Schüüelaktionen pro Minute gewertet. In der folgenden Tabelle sind die Werte nach intraperitonealer Verabreichung von jeweils 25 mg TRH bzw. Substanz A/kg Körpergewicht und 1 mg Substanz C/kg zusammengestellt:

75 90 105 120

2,1 1,55 1,05 0,6

1.1 0,9 0,9 0,5

Substanz	Minuten	nach Applikation	45	60
	!5	30	_	_
TRH	2.9	1.0	3,2	2,15
A	5,25	3.8	3.0	1.6
C	4.8	3.0

Daraus ist nicht nur zu ersehen, daß die erfindungsgemaßcn Substanzen diesen Effekt stärker als TRH auslösen, sondern daß sie auch erheblich langer wirken als TRH, was im Einklang mil der zuvor beschriebenen Abbau-Resistenz steht. Als minimale Wirkdosis für das Auslösen des »wet-dog-shaking« der Ratte wurden folgende Werte für diese und weitere Testsubstanzen ermittelt:

TRH 5-10 mg/kg

Substanz A 2 mg/kg

Substanz C 0,25 mg/kg

Isomeres der Substanz C mit [a] 'J -108,5° 1,8 mg/kg id

S-Oxo-o.o-dimethyl-thiomorpholin-S-iD-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid 1 mg/kg

5-Oxo-6-(DL)-äthyl-thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinarnid 2 mg/kg

5-Oxo-6-(DL)-n-propyl-thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid 3,5 mg/kg

Die Verabreichung von antidepressiv wirkenden Substanzen mit zentralerregenden Eigenschaften bewirkt eine Steigerung der spontanen motorischen Aktivität der Tiere. Gruppen von 10 Tieren wurden unmittelbar nach intraperitonealer Verabreichung der Testsubstanzen in Meßboxen gesetzt und die Bewegungsaktivität der Tiere mit infrarotmeBschranken für jeweils iO Minuien gemessen, in der folgenden Tabeiie sind diejenigen Dosen der Prüfsubstanzen angegeben, die eine deutliche Steigerung der Bewegungsaktivität der Tiere bewirkten:

R,

— 7.--C I)i»i» Bemerkungen 2Ί

-NH-CO-CH = C 2-5 Substanz A

— CHj — S — CHj — CH 5 Substanz B

— CH—S — CH₂ — CH 0,3 Substanz C \a] t' -33,5°

CH₃

— CH — S —CHj—CH 1 Ia]V -108,5° _4I) CH,

— CH — S —CHjCH 1
C₂H₅

— C(CH,),- S — CHj— CH 0,5

— CH—S —CHj—CH 1

C₃H^n)
-CH-S-CH₂-CH 3

I \

C₃H₇(ISO)

TRH 20-50 als Vergleichssubstanz

Gute Hinweise auf psychostimulierende bzw. aniidepressive Wirkungen von Prüfsubstanzen lassen sich im &5 pharmakoäogischen Test z. B. durch Prüfung der Beeinflussung der durch Reserpinverabreichung bei Versuchstieren ausgelösten Effekte erhalten. Dazu werden 8 mg Reserpin pro kg Körpergewicht, gelöst in 5%iger Ascorbinsäurelösung, Mäusen intraperitoneal injiziert. Nach 18 Stunden wird die stark gesenkte Körpertemperatur

tzr i KJ ι

der Versuchstiere gemessen und danach werden die Testsubstanzen verabreicht. In 30minüligen Abstanden wird die rektale Temperatur gemessen und so als ED₅₀-Wert diejenige Dosis ermittelt, die eine 50%ige Verminderung der Reserpin-Hypothermie bewirkt. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

I / üDmi Bemerkungen

~-f- -■(' (mg/kg i. p.)

1,0 »Substanz A«

0,3 »Substanz B«

0,04 »Substanz C« \a\» -33,5°

0,2 la];¹-108.5°

3,3 als Vergleichssubstanz

Unter dem Einfluß antidepressiv wirkender Substanzen, insbesondere auch solcher mit zentralerregenden Eigenschaften, wird im Tierexperiment eine Steigerung der Amphetamingruppentoxizität beobachtet, die u. a. zu einer höheren Absterberate der Tiere fuhrt. In entsprechenden Testen wurden Mäusen die Testsubstanzen inlraperitoneal injiziert und 15 Minuten später erhielten die Tiere eine subkutane Amphetamin-lnjektion in einer Dosis von 5 mg/kg. Die Tiere wurden in Glasbehälter von 20 cm Durchmesser gesetzt und die Zahl der während vier Stunden verstorbenen Tiere ermittelt. Um die Größe der Tiergruppen während des Experimentes konstant zu hallen, wurden die toten Tiere jeweils djrch unbehandelte Kontrolltiere ersetzt. Als ED₅₀, d. h. als diejenige Dosis, die den Tod von 50 % der damit (nach Amphetamin-Vorbehandlung) behandelten Tiere bewirkt, wurden folgende Werte ermittelt:

— NH-

-CH₂-

-CH-

CH,

— CH-
I

CH,

-C(CH

I

C₂H,

-CH-
I

-CO-CH = C

ClMn)

I κ
-CO-C = C
\

-S-CH₂-CH
\

/
-S-CH₂-CH
\

-S-CH₂-CH
\

,J₂-S-CH₂-CH
\

-S-CH₂-CH
\

CH₇Oi)

TRH

I —z— c	-CO	-CH = C \	ED₅₀ (mg/kg i. p.)	Bemerkungen
-NH		I	0,7	»Substanz A«
	-CO	I / \
-NH		ca. 5

Fortsetzung

κ,

--/ — c

Bcmerktii^en

(ms/kg i. p.)

NH-CO-C =

-CH₂-S-CH₂-CH

/ -CH-S-CH₂-CH

CH₃

/ H

-CH-S-CH₅-CH

CH₃

-CH-S-CH₁-CH

ι \

C₂H₅

-C(CHj)₂-S-CH₂-CH

ca. 5

1.6
0,18

1,3
0,75

»Substanz B«

»Substanz C« [a] -j -33,5°

\a\ ■;.' -108,5°

-CH-S-CH₂-CH

CjH/n)

/ .r w ς γη CH

C₃H₇(ISO)

3,5

TRH

ca. 5

4,1

als Vergleichssubstanz

Die Toxizität der Verbindungen ist sehr gering. Beispielsweise wurden nach intraperitonealer sowie nach oraler Verabreichung der Substanzen A, B und C an Mäuse bzw. an Ratten auch bei Dosen von 4000 mg/kg noch keine Todesfälle beobachtet. Die Substanzen können daher therapeutisch als Psychostimulantien bzw. als Antidepressiva eingesetzt werden und zwar sowohl bei Menschen als auch bei Tieren.

Eine der Hauptwirkungen des TRH ist die Freisetzung von Thyrotropin (»TSH«), das auf die Schilddrüse im Sinne einer generellen Stimulation wirkt. Diese Wirkung stellt für als Psychostimulantien bzw. Antidepressiva einzusetzende Substanzen eine wenig erwünschte Nebenwirkung dar. Für die Verbindungen der Formel I konnte nun überraschenderweise gezeigt werden, daß das Verhältnis der zur Auslösung der Effekte auf das ZNS erforderlichen Dosen zu den die Thyrothropin-Ausschüttung bewirkenden Dosen wesentlich günstiger ist als für TRH. Beispielweise seien dazu folgende Werte genannt:

Substanz

A B C TRH

!: II:

Relative	3,3	Wirkung	Verhältnis I : Il
I	11,0	II	41,25
82,5	0,08	157,14
1,0	0,07	33,0
2,5	1,0
1,0

Relative Wirkung bezüglich der Aufhebung der Reserpin-Hypothermie ;TRH = 1).

Relative TSH-ausschütlende Wirkung (TRH = 1).

Die Verbindungen der Formel 1 zeigen also vorwiegend Effekte im pharmakologischen Bereich, im Vergleich zu denen die Effekte auf die Schilddrüse zurücktreten.

Geeignete pharmazeutisch anwendbare Zubereitungsformen der Verbindungen der Formel I sind Tabletten, Dragees, Granulate, Kapseln, Säfte bzw. Sirupe und Sprays zur intranasalen Applikation oder zur Verabreichung der Substanzen über die Bronchien.

Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel !. Diese erfolgt /.weckmäßig so, daß man das L-Histidyl-L-prolinamid mit einer Säure der Formel II in Gegenwart eines wasserbintlenden Mittels, insbesondere eines Carbodiirnids (vorzugsweise Dicyclohexylcarbüdiimid) oder mit einem funktionellen Derivat einer Säure der Formel II, wie z. B. einem Säurehalogenid, umsetzt.

Zur Hersteilung der Verbindungen der Formel I kann man auch so vorgehen, daß man ein N-Acyl-L-histiüin der Formel

! /
O = C C CH,

vi CO NH CH C^naH (III)

ι " ~ ~

in der Z und R, die angegebenen Bedeutungen haben nach in der Peptidchemie üblichen Methoden in G.;genwart eines wasserbindenden Mittels, insbesondere eines Carbodiimide, vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid, oder ein funktionelles Derivat einer Verbindung der Formel Ul, wie z. B. ein Säurehalogenid. gemischtes Anhydrid, oder einen aktivierten Ester, mit L-Prolinamid umsetzt.

Schließlich ist es auch möglich, die Verbindungen der Formel I dadurch zu erhalten, daß man ein N-Acyl-L-histidyl-L-prolinderivat der Formel

O = C C CH, ^{C0W (IV)}

N cn — NH — CH-CO — N

in der Z und R, die angegebenen Bedeutungen haben und W den Rest des N-Hydroxysuccinimids bedeutet, mit Ammoniak oder einer unter den Reaktionsbedingungen Ammoniak liefernden Substanz, wie z. B. Ammoniumcarbonat, umsetzt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch eine beträchtliche Stabilität aus, sie können daher z. B. durch Umfallen, Umkristallisation, aber auch durch Säulenchromatographie, Gegenstromverteilung gereinigt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher. Alle Temperaturangaben sind darin unkorrigiert. Bei der Ausarbeitung dieser Beispiele wurde auf die Erzielung optimaler Ausbeuten kein Wert gelegt.

Beispiel I

a) 10,5 gL-HistidinhydrochloridtMonohydrat) werden in 50 ml 2 η Natronlauge gelöst. Unter Rühren im Eisbad wird die Lösung des aus 7,8 g Orotsäure durch Behandeln mit Thionylchlorid in Gegenwart von Dimethylformamid hergestellten Orotylchlorids in 100 ml Dimethylformamid zugetropft. Durch gleichzeitiges Zutropfen von 2 η Natronlauge wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 9 und 10 gehalten.

Nach beendetem Zutropfen läßt man noch 5 Minuten weiterrühren. Anschließend wird durch Zugabe von Salzsäure ein pH-Wert von 7-8 eingestellt. Nach einiger Zeit bildet sich eine Fällung, die abfiltriert wird.

Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wird mit etwa 30 ml Wasser versetzt. Durch Zugabe von Salzsäure wird ein pH-Wert von 5-5,5 eingestellt. Nach einigem Stehen im Eisbad wird die Fällung abgesaugt. Durch Umkristallisation aus siedendem Wasser erhält man das reine Orotyl-L-histidin.

Ausbeute nach dem Trocknen: 4,5 g (30% der Theorie). Die Substanz verfärbt sich allmählich ab 230°C und zersetzt sich unter Verkohlung bei 263-266°C.
[a]% -36,9° (c = 0,5; 1 η Salzsäure).

b) 587 mg Orotyl-L-histidin werden in etwas Wasser durch Zugabe von 2 ml 1 η Salzsäure gelöst und anschließend gefriergetrocknet. Dieses gefriergetrocknete Orotyl-L-histidinhydrochlorid, 288 mg I-Hydroxybenzotriazol und 301 mg L-Prolinamidhydrochlorid werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Unter

Rühren bei Raumtemperatur werden nacheinander 0,56 ml Triäthylamin und eine Lösung von 412 mg !^,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 7,4 r.;l Dimethylformamid zugegeben. Anschließend wird weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wird mit wenig Wasser versetzt und filtriert Das Filtrat wird mit ca. 15 g eines Kationenaustauschers in der freien Säureform, wie z. B. Dowex* 50 WX Λ (effektive Korngröße 0,07-0,16 mm) gerührt und dann wird filtriert. Der mit dem Produkt beladene Kationenaustauscher wird mit Wasser gewaschen, dann mit überschüssigem In Ammoniak gerührt und filtriert Das ammoniakalische Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft Der Eindampfrückstand wird der Gegenstromverteilung im System n-Butanol-Wasser unterworfen. Die vereinigten Fraktionen, die das Hauptprodukt enthalten, werden unter vermindertem Druck eingedampft. Der Ein- ^ll) dampfrückstand wird in Wasser gelöst und gefriergetrocknet Man erhält 482 mg (59% der Theorie) Orotyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrat
[a]% -45,8° (c=l; Methanol).

B eis ρ iel 2 a

15,6 g Orotsäure, 14,4 g 1-Hydroxybenzotriazol und aus 38,5 g N-Benzyloxycarbonyl-L-hisddyl-L-prolinamid (K. Inouye et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 44,1689-91 (1971)) durch Abspalten der Benzyloxycarbonylgmppe mittels einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig hergestelltes L-Histidyl-L-prolinamiddihydrobromid werden in 200 ml Dimethylformamid gegeben. Man kühlt auf -5°C ab und gibt unter Rühren 27,8 ml Triäthylamin und kurz darauf bei der gleichen Temperatur die Lösung von 20,6 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Dimethylformamid zu. Man rührt 24 Stunden und läßt dabei die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen. Dt gebildete Niederschlag wird nach dieser Zeit abgesaugt und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft Der Rückstand wird in 200 ml Wasser gegeben und 12 Stunden bei 0⁰C aufbewahrt. Nach Filtrieren wird das Filtrat bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit 170 g eines Kationenaustauschers in der freien Säureform, z. B. Dowex* 50 WX 4 (effektive Korngröße 0,07-0,16 mm) gerührt und dann wird filtriert. Der mit dem Produkt beladene Kationenaustauscher wird 6mal mit je 700 ml Wasser, 3mal mit je 200 ml Methanol und 3mal mit je 700 ml Wasser gewaschen. Anschließend wird 5 Minuten mit 170 ml In Ammoniak gerührt und filtriert und das Harz noch 4mal mit je 90 ml 1 η Ammoniak gewaschen. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bei Temperaturen bis 35°C auf » ein Volumen von ca. 100 ml eingedampft. Die dabei erhaltene konzentrierte Lösung wird mit Aktivkohle behandelt und dann gefriergetrocknet. Durch 2maliges Aufkochen mit je 250 ml absolutem Äthanol erfolgt bereits weitgehende Behandlung. Zur endgültigen Reinigung kann man beispielsweise eine Säulenchromatographie heranziehen. Dazu werden beispielsweise je 2-3 g des Materials in 5 ml Wasser gelöst, mit 10 ml Methanol versetzt und über eine Säule von 200 g basischem Aluminiumoxyd geschickt. Die Elution erfolgt mit Methanol/Wasser (2:1) und wird durch Ultraviolettabsorption bei 254 nm verfolgt. Die Verunreinigungen werden zusammen mit etwas Hauptprodukt zuerst eluieit, danach erfolgt Elution des reinen Produktes. Die vereinigten, das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Man erhält so 11,25 g (28% der Theorie) Orotyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrat Schmelzpunkt 250⁰C; [a]% -45,8° (c = 1; Methanol).

C₁₆H₁₉N₇O₅ ■ H₂O (407,4).

Berechnet:	C	47,20	H	5.19	N	24,	12%
Gefunden:	C	47.95	H	5,27	N	24,	10%

H) Das gleiche Produkt wurde auch durch Umsetzung von L-Histidyl-L-prolinamid mit Orotylchlorid (J. med. Chem. 6,334-335 (1963)) erhalten. Dabei wurde durch Lösen in absolutem Tetrahydrofuran von nicht ins Säurechlorid überführter Orotsäure befreites Orotsäurechlorid eingesetzt. 5(

Beispiel 3

1) 9,7 g 5-Oxo-thiomorpholin-3-(L)-carbonsäure (Tetrahedron, 28 4503-13 (1972)) und L-Histidyl-L-prolinamiddihydrobromid, hergestellt aus 23,2 g N-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolinamid durch Abspal- 5: tung der Benzyloxycarbonylgruppe mittels einer 40%igen Lösung vom Bromwasserstoff in Eisessig, werden in 150 ml Dimethylformamid gegeben. Man kühlt auf-10⁰C, gibt unter Rühren 16,7 ml Triäthylamin und kurz darauf bei der gleichen Temperatur eine Lösung von 12,3 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Dimethylformamid zu. Man rührt zunächst 2 Stunden bei -5°C und dann weitere 22 Stunden, wobei man die Temperatur langsam auf Raumtemperatur ansteigen läßt. Danach wird der Niederschlag abgesaugt, das bi Filtrat bei vermindertem Druck eingedampft und der so erhaltene Rückstand in 200 ml Wasser gegeben. Nach 2stündigem Aufbewahren bei Raumtemperatur wird abgesaugt und das Filtrat 10 Minuten mit 100 g eines Kationenaustauschers, wie z. B. des stark sauren Handelsproduktes Dowex* 50 WX 4 gerührt. Das Austauscherharz wird abgesaugt und 4mal mit je 300 ml Wasser, 3mal mit 200 ml Methanol und 2mal mit je 300 ml Wasser gewaschen. Anschließend wird es mit 100 ml In Ammoniak bei Raumtemperatur gerührt. t>' Man saugt ab und wäscht mit je 50 ml In Ammoniak 4mal nach. Die vereinigten ammoniakalischen Filtrate werden unter vermindertem Druck bei Temperaturen unter 35°C eingedampft. Der Rückstand wird in 200 ml Unterphasc des Systems n-Butanol/Wasser gelöst und je die Hälfte dieser Lösung im System

n-Butanol/Wasser der Gegenstromverteiiung über 740 Stufen unterworfen. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Wasser gelöst, mit Aktivkohle behandelt und gefriergetrocknet. Man erhält 6,9 g (30% der Theorie) 5-OxothiomorphoIin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrat.
Schmelzpunkt 155-157°C;

[a] » -48,5° (c = 0,52; Methanol).

II) Das gleiche Produkt wurde auch wie folgt erhalten:

a) 53,0 g Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolinmethylester [hergestellt nach HeIv. Chem. Acta 44,721 (1961)] wurden in 200 ml Dioxan und 50 ml Wasser gelöst und unter Rühren bei Raumtemperatur

durch portionsweise Zugabe der erforderlichen Menge 1 η Natronlauge unter Verwendung des Indikators Thymolphthalein verseift. Nach beendeter Verseifung wurde der pH-Wert der Lösung auf 8 eingestellt und anschließend das Verseifungsgemisch unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Eindampfungsrückstand wurde in Wasser gelöst und dreimal mit Essigsäureäthylester/ sek.-ButanoI (4 : 1) extrahiert. Anschließend wurde die wäßrige Phase mit Salzsäure bis pH 3 angesäuert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit etwa 200 ml absolutem Äthanol versetzt und nach längerem Stehen im Eisbad filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Nach dem Trocknen erhielt man 39,6 g (77% der Theorie) Benzylov-carbonyl-L-histidy!-L-prolin als schaumig erstarrte Masse.
,₀ iatt³ -56,3° (C=I; Methanol).

b) 39,4 g Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-prolin wurden in 200 ml Eisessig gelöst und unter Rühren im Eisbad mit 170 mi einer 4ö%igen Lösung Bromwasserstoff in Eisessig versetzt. Nach ca. 5 Minuten wurde das Eisbad entfernt und der Ansatz 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Dipeptiddihydrobromid wurde durch Versetzen mit etwa 500 ml trockenem Äther ausgefällt, abfiltriert, in 150 ml absolutem Methanol gelöst und durch Zugabe von etwa 700 ml trockenem Äther erneut ausgefällt. Die überstehende Lösung wurde von dem ausgefallenen Niederschlag abdekantiert. Nach dem Entfernen der Lösungsmittelreste unter vermindertem Druck erhielt man 35,7 g (84% der Theorie) L-Histidyl-L-proIindihydrobromid als hygroskopische, schaumig erstarrte Masse.

[a]i> -40,5° (c= 1; Methanol).

c) 4,1g 5-Oxo-thiomorpholin-3-(L)-carbonsäure und 3,6 g 1-Hydroxybenzotriazol wurden in 55 ml

Dimethylformamid gelöst und unter Rühren im Eisbad mit einer Lösung von 5,2 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Dimethylformamid versetzt. Es wurde 10 Minuten im Eisbad und anschließend 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die so erhaltene Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters wurde zu einer mit 8,4 ml Triethylamin unter Rühren im Eisbad versetzten Lösung von 8,3 g L-Histi-_J5 din-L-prolindihydrobromid in 90 ml Dimethylformamid gegeben und noch 20 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Der ausgefallene Niederschlag wurde abfiltriert, das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit 100 ml Wasser versetzt und mehrere Stunden im Eisbad aufbewahrt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Die Reinigung erfolgte durch Säulenchromatographie über Kieselgel 60 (0,2-0,5 mm) in Methanol. Die gesammelten Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit Methanol versetzt, filtriert, und dann wurde das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der schmierige Rückstand wurde in Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Man erhielt 3,8 g (48% der Theorie) 5-Oxo-thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolin.

[a] 'i -45,3° (c = 0,5: Methanol). jg

d) 198 mg 5-Oxo-thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolin wurden in Wasser gelöst, mit 0,5 ml Cp

1 η Salzsäure versetzt und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt und 63 mg N-Hydroxy- Pi

succinimid wurden in 6 ml Dimethylformamid gelöst und unter Rühren bei Raumtemperatur mit der p!

Lösung von 103 mg N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 1,7 ml Tetrahydrofuran versetzt. Nachdem ('·.-]

2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde, gab man 1 ml einer konzentriert.->i wäßrigen Ammo- ?·!

niaklösung zu. Danach wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und anschließend unter ver- j|j mindertem Druck eingedampft. Der Rückstü.id wurde mii Wasser versetzt und filtriert. Das Filtrat |j

wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit einem Kationenaustauscherharz (ca. 10 g) und anschließend |] mit In Ammoniak behandelt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rück- :·| stand wurde im System r.-Butanol/Wasser der Gegenstromverteilung unterworfen. Die vereinigten j^::'|

Fraktionen, die das Hauptprodukt enthalten, wurden unter vermindertem Druck eingedampft, in Was- 'f>t sergelöst und gefriergetrocknet. Man erhielt 61 mg (30% der Theorie) 5-Oxo-thiomorpholin-3-(L)-car- r;i

bonyl-L-histidyl-L-prolinamidhydrat. i

Ie)? -48,6° (c = 0,5; Methanol). d

Nach den vorstehend beschriebenen, insbesondere den aus den Beispielen ersichtlichen Vorgehenswciscn ■:% wurden auch folgende Verbindungen der allgemeinen Formel I erhalten: ' j

a) (5-Methyl-orotyD-L-histidyl-L-prolinamid-trihydrat '.;'!

Schmelzpunkt: 222 227° (Zersetzung): '

Mv' -46,8° (<■ - I; Methanol). · :

C₁₇Hj₁N₇O, 3 IU) (457. 459) .;j

Berechnet: C 44,63 115,95 N 21,43%

Gefunden: C 44.67 115.58 N 21,79% :;

IO :^;

b) (5-ÄthyI-orotyI)-L-histidy!-L-prolinamidhydrat Schmelzpunkt: 186°C;

M £ -46,0° (c = 0,5; Methanol). ■ C₁₈H₂₃N₇O₅ · H₂O (435, 427)

Berechnet: C 49,64 H 5,79 N 22,52% Gefunden: C 49,50 H 5,87 N 22,59%

c) (5-n-Propyl-orotyl)-L-histidyl-L-prolinamidhydrat Schmelzpunkt: 187°C;

[al? -48,6° (c = 0,5; Methanol). ¹⁰

C₁₉H₂₅N₇O₅ · H₂O (449, 493)

Berechnet: C 50,77 H 6,06 N 21,82% Gefunden: C 50,86 H 6,12 N 22,19%

d) 5-Oxo-6-(DL)-methyl-thiomoφholin-3-(L)-carbonyl-L-hist·dyl-L-proΓinamidtrihydrat. 15 (Zur optischen Konfiguration vgl. bei i)

Schmelzpunkt: 140-142⁰C; [β] J^s -33,5° (c=l; Methanol). C₁₇H₂₄N₆O₄S ■ 3 H₂O (462,5)

Berechnet: C 44,15 H 6,55 N 18,17 S 6,93% ²⁰

Gefunden: C 44,69 H 6,47 N 18,52 S 6,54%

e) S-Oxo-o-^LJ-athyl-thiomorpholin-S-iLJ-carbonyl-L-histidyl-L-prolinarnid. Schmelzpunkt: 138-140⁰C;

[a] % -87,4° (c = 0,34; Methanol). 25

C₁₈H₂₆N₆O₄S (422,52)

Berechnet: C 51,17 H 6,22r N 19,90% Gefunden: C 50,97 H 6,41 N 20,28%

0 S-Oxo-ö.o-dimethyl-thiomorpholinO-tU-carbonyl-L-histidyl-L-proiinamid. 30

Schmelzpunkt: 140-142⁰C;
[a] ? -67,5° (c - 0,5; Methanol). C₁₈H₂₆O₄N₆S (422,5)

J5

g) S-Oxo-o-iDLi-n-propyl-thiomorpholinO^LJ-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid. [a]'i -87,1° (c= 1; Methanol).
C₁₉H₂₈O₄N₆S (436,5) 40

Berechnet: C 52,35 H 6,48 N 19,27 S 7,35% Gefunden: C 51,90 H 6,79 N 19,16 S 7,29%

h) S-Oxo-o-iDLJ-isopropyl-thiomorpholin-S-iLj-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid. ίϊ

[al'i -102,5° (c=l; Methanol). C₁₉H₂₈O₄N₆S (436,5)

Berechnet: C 52,35 H 6,48 N 19,27 S 7,35%

Gefunden: C 51,98 H 6,86 N 19,10 S 7,21% 50

i) Ausgehend von L- bzw. D-a-Brompropionsäureäthylester und L-Cystein-di-natrium-salz wurden zwei Isomere der 5-Oxo-6-methyllhiomorpholin-3-(L)-carbons;iure erhalten, deren optische Zuordnung nicht völlig geklärt werden konnte. Diese zeigten

[<*]? +41,8° (c = 1 in Methanol) bzw.
[a]i^J -112,8° (c= 1 in Methanol)

und wurden deshalb als »6-(d)-Form« bzw. als »6-(l)«-Form bezeichnet. Durch Umsetzung mit L-Histidyl- t>o L-prolinamid entsprechend den oben beschriebenen Verfahrensweisen wurden erhalten: S-Oxo-o^dJ-methyl-thiomorpholin-S-iLJ-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid-trihydrat [a\ Ό¹ = -33,5° (c = 1 in Methanol; dieses Produkt erwies sich als identisch mit dem aus der 5-Oxo-6-(DL)-methyl-thiomorpholin-3-(L)-carbonsäure erhaltenen, vorstehend unter d) aufgeführten Produkt, d. h. daß wahrscheinlich von letzterem bei der Aufarbeitung nur die »6-(d)-Form« isoliert wurde). 65

S-Oxo-o-lO-methyl-thiomorpholinO-iLj-ciirbonyl-L-histidyl-L-prolinamid. [a] 2 -108,5° (c = I in Methanol).

Berechnet:	C	51,20	H	0,21	N	19,89	S	7,58%
Gefunden:	C	50,17	H	6,32	N	18,40	S	8,19%

Claims

Patentansprüche: 1. N-Acyl-L-histidyl-L-proIinamide der allgemeinen Formel

(a) —NH — CO — C— oder (b) —C — S—CH₂—

bedeutet, R, zusammen mit R₀ für eine zusätzliche Bindung oder, wenn Z die Gruppe (b) darstellt, Tür ein Wasserstoffatom steht und in der R₂ und Rj für Wasserstoffatome oder für Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen stehen und R₄ Wasserstoff oder Methyl bedeutet
und deren pharmazeutisch anwendbare Salze mit Säuren.
2. N-Acyl-L-histidyl-L-prolinamide der allgemeinen Formel

CO —NH-CH-CO —N

CONH₂

in der R₂ die im Anspruch 1 ungegebene Bedeutung hat.

3. Orotyl-L-histidyl-L-prolinamid.

4. N-Acyl-L-histidyl-L-prolinamide der allgemeinen Formel

CO —NH-CH-CO —N

CONH₂

in der Rj die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen hat, wobei in diesen Vorbindungen an dem mit * gekennzeichneten Kohlenstoffatom L-Konfiguration vorliegt.

5. 5-Oxo-thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid.

6. 5-Oxo-6-methyl-thiomorpholin-3-(L)-carbonyl-L-histidyl-L-prolinamid mit [a]" -33,5° (c - I in Methanol).

7. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der der allgemeinen Formel II, III oder IV, in denen Z und R, die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt, und /war:

a) L-Histidyl-L-prolinamid mit einer Carbonsäure der allgemeinen Formel

i \/

O=C C

N COOH

(H)

in Gegenwart eines wasserbindenden Mittels oder mit einem funktionellen Derivat einer Säure der Formel II oder
b) L-Prolinamid mit einem N-Acyl-L-histidin der allgmeinen Formel