DE1295565B

DE1295565B - Verfahren zur Herstellung von einen Histidinrest enthaltenden Peptiden

Info

Publication number: DE1295565B
Application number: DES78076A
Authority: DE
Inventors: Otsuka Hideo; Inouye Ken
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1961-02-18
Filing date: 1962-02-16
Publication date: 1969-05-22
Also published as: US3280098A; CH439313A; GB970952A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Histidin-Peptiden bzw. von Peptiden, die am Carboxylende oder in der Mitte des Moleküls einen Histidinrest aufweisen.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt folgendes generelle Herstellungsschema zugrunde:

HC=

¹N

=C—CH₂-CHCO-P
N—Cbz NH-Cbz

(D

CH

HX
HC==C—CH₂-CHCO-P

HX-N Ν—Cbz NH,-HX

CH

(H)

HC=C- CH₂-CHCO- P

N N—Cbz NH,

% /
CH

(III)

HC=

=C—CH,-CHCO—P

(IV)

— I

HX N

HX HC

=C—CH,- CHCO-P (ΙΓ)

N—Cbz NHOC-Q-NH₂ ■ HX

CH

N—Cbz NHOC —Q—NH-R

CH

HC==C—CH₂-CHCO- P (V)

N N —H NHOC —Q —NH-R

^ /
CH

=C—CH₂-CHCO-P
N—Cbz NHOC—Q-NH,

(III)

CH

HOOC—Q'—NH-R'
HC=C- CH₂-CHCO-P (IV)

N N-Cbz NHOC —Q-NHOC

CH Q' -NH-R'

HC—C—CH,—CHCO—P (V)

I I " I

N N-H NHOC Q-NHOC

CH Q-NH R'

In diesem Reaktionsschema bedeutet Cbz eine Carbobenzoxygruppe (— CO — O — CHa — CnH.-,), X Halogen (z. B. Cl, Br oder J), P eine niedere Alkoxygruppe (z. B. — OCH_:!, — OCjHr,, — OG₁H₇), eine substituierte oder nichtsubstituierte Phenyl-(niederes)-alkoxygruppe (z. B. — O — CHa — GiH.-,,

— O — CHaGsH iNOji-p) oder einen Rest der Formel

NH- Q" — CO — P'

wobei P' eine niedere Alkoxygruppe (/.. B. —OCHn,

— OCjH.-,, —- OGiH₇) oder eine substituierte oder nichtsubstituierte Phenyl-(niedere)-alkoxygruppe (z.B.

— C -CHa -ChH.-,, O CH₂- GjHiNOa-p) bedeutet, Q, Q' und Q" einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest und R und R' eine die Aminogruppe schützende Gruppe (z. B.—CO — O- CH- — C_nHr,, to

— C(GiH₅Ja. SOa - C₀Hi - CHa-p, -CHO, -CO O C(CHa)₃) bedeutet.

Die Abkürzungen N(u) und N(Im), weiche im folgenden verwendet werden, bedeuten das Stickstoffatom im «-Aminorcst bzw. das aktive Stickstoff- f>.s atom im Imidazolkern des Histidins.

N(u),N(Im)-Diearbobenzoxy-[.-histidin ist ein hervorragender Ausgangsstoff für die Synthese von Histidinpeptiden (A k a b ο r i und Mitarbeiter, Nature, 181, 772 [1958]; Sakiyama und Mitarbeiter, Bull. Chem. Soc, Japan, 31. 926 [1958]). Danach wurde ohne Schwierigkeit das Peptid erhalten, welches einen Histidinrest an der endständigen Aminogruppe enthält. Hingegen ist es schwerer, ein Peptid durch Einführung eines Histidinrestes in die endständige Carboxylgruppe oder in die Mitte des Moleküls zu erhallen. Die Ursache dafür lag darin, daß es bisher an einer befriedigenden Methode, das N(Im)-Atom selektiv zu schützen, ermangelte.

In dieser Beziehung sind N(Im)-Benzyl-i.-histidin und dessen Derivate wertvolle Zwischenprodukte (du V i g η e a 11 d und Mitarbeiter, J. Biol. Chem., 117, 27 [1937]; Cock und Mitarbeiter, J. Chem. Soc, 1061 [1949]; O ν e r e 1 I und Mitarbeiter, J. Chem. Soc, 232 [1955]; T h e ο d ο rpoulos, J. Org. Chem., 21, 1550 [1956]), aber sie sind Tür die praktische Verwendung nicht genügend leicht zugänglich. In letzter Zeit erhielt man N(Im)-Trityli.-histidin-methylester-hydrochlorid durch Erhitzen einer methanolischen Lösung von N(«),N(Im)-Ditrityl-i.-histidin-methylester-hydrochlorid (S t e 1 akatos und Mitarbeiter, J. Am. Chem. Soc. 81,

2884 [1959]). Diese Verbindung ist jedoch wegen ihrer unstabilen Natur nur begrenzt verwendbar.

Es wurde nun gefunden, daß die am N(Im)-AtOm gebundene Carbobenzoxygruppe einer Behandlung mit HalogenwasserstofTsäure in einem geeigneten organischen Lösungsmittel unter normalen Decarbobenzoxylierungsbedingungen unerwartet widersteht. Dementsprechend entsteht durch Behandeln der N(a).N(Im)-Dicarbobenzoxyverbindung der Formel(I) mit HalogenwasserstofTsäure das entsprechende N(Im) - Carbobenzoxydihydrohalogenid der Forme! (II). Letztere Verbindung kann in die entsprechende N(Im)-Carbobenzoxyverbindung der Formel (III) umgewandelt werden und zur Einführung des Histidinrestes bei der Synthese von Histidinpeptiden dienen, insbesondere von Peptiden, die den Histidinrest an der endständigen Carboxylgruppe oder in der Mitte des Moleküls aufweisen.

Man kann die N(«KN(Im)-Dicarbobenzoxyverbindung (I) mit hervorragender Ausbeute nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in das entsprechende N(Im)-Carboberizoxydihydrohalogenid (II) und weiter in die entsprechende N(Im)-Carbobenzoxyverbindung der Formel (III) überführen. Auch setzt die Verwendung der N(Im)-Carbobenzoxyverbindung (III) zur Einführung der Histidingruppe eine Verunreinigung des resultierenden N(Im)-Carbobenzoxyhistidinpeptides der Formel (IV) durch Nebenprodukte auf ein Minimum herab. Das resultierende N(Im)-Carbobenzoxyhistidinpeptid der Formel (IV) weist im allgemeinen eine hohe Löslichkeit auf und kann deshalb leicht aus organischen Lösungsmitteln umkristallisiert werden. Die N(Iin (-Carbobenzoxygruppe im resultierenden N(Im)-Carbobenzoxyhistidinpeptid (IV) kann leicht durch Behandeln mit Alkali oder durch katalytisch^ Reduktion abgespalten werden, wobei das Histidinpeptid gemäß Formel (V) erhalten wird.

Als Ausgangsverbindung für das erfindungsgemäße Verfahren wird die N(«),N(Im)-Dicarbobenzoxy verbindung der Formel (I) verwendet, welche ihrerseits nach einem bekannten Verfahren gewonnen werden kann (S a k i y a η a und Mitarbeiter, Bull. Chem. Soc, Japan, 31, 926 [1958]). Die Carboxylgruppe wie auch andere reaktive funktioneile Gruppen im Ausgangsstoff können in bekannter Art und Weise, bevor das erfindungsgemäße Verfahren zur Anwendung kommt, geschützt werden. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von einen Histidinrest enthaltenden Peptiden der allgemeinen Formel

rest bedeutet, in dem die funktioneilen Gruppen teilweise oder vollkommen geschützt oder ungeschützt sein können, Q ein Aminosäurerest oder ein Peptidrest ist, in dem die funktioneilen Gruppen teilweise oder vollständig geschützt oder ungeschützt sein können, und R eine Aminoschutzgruppe ist, dadurch gekennzeichnet, daß man
1. eine N(a),N(Im)-Dicarbobenzoxyhistidin-Verbindung der allgemeinen Formel

HC=C	— CH₂	— CHCO	-P	NH	(IV)
N N	Cbz	NHOC	Q		— R
\ / CH

in der Cbz einen Carbobenzoxy-, P einen niederen Alkoxy-, einen substituierten oder unsubstituierten Phenylniederalkoxyrest bedeutet oder einen Rest der allgemeinen Formel

— NH-Q" —CO —P'

in der P' einen niederen Alkoxy- oder einen substituierten oder unsubstituierten Phenylniederalkoxyrest und Q" einen Aminosäurerest oder einen Peptid-HC=

^C-CH₇-CHCO-P

N N —Cbz

\ /
CH

NH ~Cbz (I)

in der Cbz und P die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, mit einem Halogenwasserstoff in einem inerten organischen Lösungsmittel unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von O bis 40⁰C behandelt;
2. die erhaltene N(Im)-Carbobenzoxyhistidin-dihydrohalogenid-Verbindung der Formel

HC=

=C —CH₇-CHCO-P

HX N

N —Cbz NH₂-HX (II)

CH

in der X ein Halogen ist und Cbz und P die obigen Bedeutungen besitzen, entweder durch Schütteln der wäßrigen Lösung in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels mit Ammoniumhydroxyd oder Natriumbicarbonat oder durch Behandeln der Lösung oder Suspension in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einer äquivalenten Menge eines tertiären Amins neutralisiert und 3. die gebildete N(Im)-Carbobenzoxyhistidin-Verbindung der Formel

HC=C — CH₂ — CHCO — P

N N —Cbz NH₂ (III)

CH

in der Cbz und P die obigen Bedeutungen besitzen, in an sich bekannter Weise in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise in Gegenwart eines Kondensationsmittels mit einer Aminosäure oder einem Peptid umsetzt, in denen die endständige Aminogruppe geschützt ist, und gewünschtenfalls die N(Im)-Carbobenzoxygruppe des Histidinrests in an sich bekannter Weise durch Alkalibehandlung oder katalytische Hydrierung entfernt wird.

Bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens behandelt man z. B. die N(<«),N(Im)-Dicarboxybenzoxyverbindung (I) mit einem Halogenwasserstoff, beispielsweise mit HCl, HBr oder HJ (vorzugsweise mit HBr) in einem inerten organischen Lösungsmittel wie Dioxan, Eisessig, Diäthylphosphit, Methanol oder Äthanol (vorzugsweise Dioxan oder Eisessig) bei einer Temperatur zwischen O und

5 6

40°C (vorzugsweise zwischen 15 und 30"C) und Gruppen, welche der alkalischen Hydrolyse oder

erhält das entsprechende N(Im)-Dicarbobenzoxy- der Hydrierung unterliegen, kann gleichzeitig statt-

dihydrohalogenid (II). Erfolgt die Behandlung bei finden, indem ein das Carboxylende schützender

Eiskühlung oder in der Hitze, so ist eine Abnahme Methyl-, Äthyl- oder Benzylester durch alkalische der Ausbeute zu erwarten. Die Reaktion muß in 5 Behandlung und ein das Aminoende schützender

einem wesentlich wasserfreien Medium durchge- Carbobenzoxy- oder Tritylrest durch katalytische

führt werden, andernfalls, d. h. in Gegenwart von Reduktion abgespalten werden.

Wasser, wird eine schützende Estergruppe am Auch das erhaltene N(Im)-Carbobenzoxyhistidin-

Carboxylende und, wenn vorhanden, gleichzeitig peptid (IV) kann zur Einführung der Histidingruppe auch am Peptidmoiekül abgespalten. Deshalb muß 10 verwendet werden. Sofern die schützende Gruppe

nicht nur ein wesentlich wasserfreies organisches am Aminorest säureempfindlich ist, wie z. B. die

Lösungsmittel verwendet werden, sondern auch Carbobenzoxy-, Trityl- oder tert.-Butyloxycarbonyl-

das saure Reagenz muß im wesentlichen wasserfrei gruppe, behandelt man das N(Im)-Carbobenzoxy-

sein, z. B. durch Einleiten von gasförmigem Halogen- histidinpeptid (IV) mit Halogenwasserstoff (vorwasserstoff in ein organisches Lösungsmittel unter 15 zugsweise mit Bromwasserstoff) in einem inerten

Ausschluß von atmosphärischer Feuchtigkeit her- organischen Lösungsmittel (vorzugsweise Dioxan

gestellt werden. oder Eisessig), um die schützende Gruppe am Amino-

In trockenem Zustand ist das so erhaltene rest selektiv zu entfernen, worauf man das erhaltene

N(Im)-Carbobenzoxydihydrohalogenid (II) stabil N(Im)-Carbobenzoxyhistidinpeptid-dihydrohalogenid und kann gelagert werden. Bevor das Dihydro- 20 der Formel (ΙΓ) mit Alkali in Gegenwart eines mit

halogenid (II) als Histidinrest eingeführt wird, muß Wasser nicht mischbaren organischen Lösungs-

zuvor der Halogenwasserstoff durch Behandlung mittels (vorzugsweise Dichlormethan) schüttelt, so

mit einer alkalischen Substanz entfernt werden. Um daß eine Lösung von N(Im)-Carbobenzoxyhistidin-

hierbei aber auch zugleich eine Abspaltung der peptid der Formel (III') im genannten Lösungsmittel N(Im)-Carbobenzoxygruppe zu vermeiden, nimmt 25 entsteht. Nun unterwirft man die so erhaltene Ver-

man die Neutralisation durch Schütteln des bindung (ΙΙΓ) der weiteren Einführung einer Peptid-

N(Im)-Carbobenzoxydihydrohalogenids (II) mit gruppe durch eine Aminosäure oder ein Peptid und

Alkali in Gegenwart eines mit Wasser nicht misch- hierauf der Eliminierung der N(Im)-Carbobenzoxy-

baren organischen Lösungsmittels vor, wobei die gruppe in der gleichen Weise, wie oben beschrieben

entstehende N(Im)-Carbobenzoxyverbindung (IN) 30 wurde.

sofort nach der Abspaltung des Halogenwasserstoffs Es ist nicht erforderlich, die Zwischenprodukte

von diesem Lösungsmittel aufgenommen wird, nach jeder Stufe zu isolieren, jedoch können im

ohne daß eine unerwünschte Zersetzung eintritt. Verlaufe der stufenweisen Synthese geeignete Reini-

Hierbei verwendbare Lösungsmittel sind z. B. Di- gungsmethoden eingeschaltet werden,

chlormethan, Chloroform, Äthylacetat. Das Dichlor- 35 Die erhaltenen neuen Verbindungen sind wert-

methan wird wegen seines relativ niedrigen Siede- volle Zwischenprodukte für die Synthese von

punktes und seines Lösungsvermögens bevorzugt. proteinähnlichen Verbindungen und können auch

Als Alkali verwendet man wäßriges Ammoniak als solche oder nach Abspaltung der N(Im)-Carbo-

oder Natriumbicarbonat. An Stelle dieser Alkalien benzoxygruppe für Ernährungszwecke, z. B. an

kann man auch ein tertiäres Amin, wie Triäthyl- 40 Stelle von Proteinhydrolysaten verwendet werden,

amin, Tri-n-butylamin oder Pyridin, verwenden. In Sie können als spezifisch wirkende Peptide zur

diesem Falle wird die Lösung oder Suspension des Überwindung von gewissen Aminosäurenmankos

N(Im)-Carbobenzoxydihydrohalogenids (II) in einem verordnet werden, und zwar wegen deren geeigneten

inerten organischen Lösungsmittel, wie Dichlor- und genauen Dosierung in einem bedeutend vorteil-

methan, Chloroform, Äthylacetat, Dioxan, Tetra- 45 hafteren Maße, als es mit Proteinhydrolysaten

hydrofuran oder Dimethylformamid, mit einer äqui- möglich ist. Diese Peptide können auch für technische

valenten Menge des tertiären Amins behandelt. Zwecke an Stelle von Proteinhydrolysaten u. dgl.

Die derart erhaltene Lösung der N(Im)-Carbo- verwendet werden.

benzoxyverbindung (III) in einem organischen Lö- In den Beispielen bedeuten die Prozentangaben

sungsmittel kann als solche zur Einführung des 50 Gewichtsprozente pro Volumen, sofern nichts an-

Histidinmoleküls in der Synthese von Histidin- deres vermerkt ist. peptiden verwendet werden, insbesondere von solchen

Peptiden, die den Histidinrest am Carboxylende Beispiel 1 oder in der Mitte des Moleküls aufweisen.

Die Weiterverarbeitung der Verbindung (III) um- 55 A. Herstellung von N(Im)-Carbobenzox.y-

faßt im wesentlichen zwei Stufen, nämlich die L-histidin-methylester-dihydrobromid Verknüpfung des Peptidrestes und die Abspaltung

der H(Im)-Carbobenzoxygruppe. Zu 1,14 g N(«),N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidin-Die Einführung der Peptidgruppe kann hierbei methylester-hydrochlorid werden 6 cm³ einer 40,4gein an sich bekannter Weise erfolgen. 60 wichtsprozentigen Bromwasserstofflösung in Dioxan Die Abspaltung der N(Im)-Carbobenzoxygruppe beigemischt, wonach man die Mischung bei Raumaus dem entstandenen N(Im)-Carbobenzoxyhistidin- temperatur (15 bis 30⁰C) stehenläßt. Nach der peptid (IV) kann durch Behandeln mit Alkali, 15 Minuten dauernden Kohlensäureentwicklung werz. B. mit Alkalihydroxyd oder mit Alkalicarbonat, den 30 cm³ wasserfreier Äther zugesetzt, wobei sich oder auch durch katalytische Reduktion in Gegen- 65 das ausscheidende öl bald verfestigt. Man wäscht wart eines Palladiumkatalysators erfolgen. Die Reak- mit Äther und dann mit Dichlormethan und trocknet, tionstemperatur beträgt hierbei 0 bis 40 C, Vorzugs- Ausbeute: 1,05 g. Schmp. 167 bis 167,5 C (Zerweise 15 bis 30' C. Die Entfernung schützender Setzung), λ ^^han"' = 234 ma (; = 3,140). Löslich

in Methanol und Wasser; unlöslich in Dichlormethan, Äthylacetat und Äther.

Analyse für Ci₅HH₁HiO₄Br₂:

Berechnet: C 38,75%, H 4,12%, N 9,04%, Br 34,4%;

gefunden:
C 37,23%, H 4,44%, N 9,43%, Br 35,03%.

B. Herstellung von Carbobenzoxyglycyl-N(Im)-carbobenzoxy-L-histidin-methylester

Einer Lösung von 1,03 g N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidin-methylester-dihydrobromid in 20 cm³ Dichlormethan und 10 cm³ Wasser wird lcm³ einer 28%igen wäßrigen Ammoniaklösung unter starkem Schütteln bei O¹C zugesetzt. Dann sättigt man die wäßrige Phase mit Kochsalz und extrahiert mit Dichlormethan. Die vereinigten organischen Lösungen werden über Natriumsulfat bei 0⁰C getrocknet und im Vakuum zu einem kleinen Volumen konzentriert. Dem Rückstand werden 0,42 g Carbobenzoxyglycin und 0,41 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und das Volumen mit Dichlormethan auf 20 cm³ gebracht. Diese Mischung läßt man nun über Nacht bei Raumtemperatur (15 bis 30⁰C) stehen und stellt sie dann in den Kühlschrank. Nach Abfiltrieren vom Dicyclohexylharnstoff wird das Filtrat im Vakuum konzentriert und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die erhaltene Lösung kühlt man im Eisbad ab, schüttelt mit eiskalter η-Salzsäure, dann mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit Wasser; hierauf trocknet man über Natriumsulfat und verdampft zu einem Sirup, welcher aus Äthylacetat—Petroläther zum Kristallisieren gebracht wird. Ausbeute: 0,84 g; Schmp. 74 bis 75,5°C. Umkristallisation aus Äthylacetat—Äther ergibt feine Nadeln mit gleichem Schmelzpunkt, (u)f +3,0 ±0,5° (c = 3,102 in Methanol), («)S⁹ + 24,5±0,7' (c = 2,827 in Äthylacetat), λ

'.= 236 ηΐμ

(ι·· = 3,755). Löslich in Äthylacetat, Chloroform und Methanol; schwach löslich in Äther; unlöslich in Petroläther und Wasser.

Analyse für C₂₅H₂«1

Berechnet ... C 60,7%, H 5,31%, N 11,3%; gefunden ... C 60,61%, H 5,45%, N 11,43%.

Beispiel 2

A. Herstellung von N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylester-dihydrobrornid

Eine Mischung von 0,55 g N(a),N(Im)-Dicarbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylester in 3 cm³ einer 37,5gewichtsprozentigen Bromwasserstofflösung in Dioxan wird während 30 Minuten bei Raumtemperatur (15 bis 30 C) stehengelassen. Nach Zusatz von 20 cm³ wasserfreiem Äther scheidet ein öl aus, welches sich rasch verfestigt. Dieser Niederschlag wird hierauf mit Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 0,55 g. Schmp. 95"C (Zersetzung). Löslieh in Methanol, Dichlormethan und Wasser; unlöslich in Äthylacetat und Äther.

65

Analyse für C

Berechnet:

C 43,7%, H 5,23%, N 9,70%, Br 27,7%;
gefunden:
C 40,94%, H 5,60%, N 10,62%, Br 27,91%.

B. Herstellung von Carbobenzoxyglycyl-NOrrO-carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylester

Einer Lösung von 0,477 g N(Im)-Carbobenzoxy-L - histidyl - L - leucin - methylester- dihydrobromid in 20 cm³ Dichlormethan werden 5 cm³ einer eiskalten 5%igen Natriumbicarbonatlösung bei 0°C unter starkem Schütteln beigemischt. Hierauf sättigt man die wäßrige Phase mit Kochsalz und extrahiert mit lO-crn³- Portionen Dichlormethan. Die vereinigten organischen Lösungen werden nach Trocknung über Natriumsulfat im Vakuum eingedampft. Dem Rückstand fügt man eine Lösung von 0,157 g Carbobenzoxyglycin und 0,155 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in 5 cm³ Dichlormethan zu. Die erhaltene Lösung wird hierauf während 4 Stunden bei Raumtemperatur (15 bis 3O⁰C) gerührt und dann im Vakuum bis auf etwa 10 cm³ konzentriert. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Nach Kühlung mit Eis wird der entstandene Niederschlag aus Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und mit Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten organischen Lösungen verdampft man unter Vakuum zu einem Sirup. Durch Zusatz von 5 cm³ Äthylacetat wird der Sirup fest. Man fügt hierauf 10 cm³ Äther zu und bringt die Mischung in den Kühlschrank. Hierauf filtriert man die abgeschiedenen Kristalle ab. Ausbeute: 0,371 g; Schmp. 147,5 bis 149°C. Nach Umkristallisation aus Äthylacetat ergaben sich Schmp. 152 bis 152,5°C (α)? -9,2± l°(c = 2,062 in Methanol), λ *£""■ = 236 ηΐμ (_f = 3,610). Löslich in Chloroform und Methanol; schwach löslich in Äthylacetat; unlöslich in Äther, Petroläther und Wasser.

Analyse für C₃IH₃₇N₅O₈:

Berechnet ... C 61,3%, H 6,14%, N 11,5%;
gefunden ... C 61,39%, H 6,31%, N 11,44%.

Beispiel 3

Herstellung von Carbobenzoxy-O-benzyl-L-seryl-NUmJ-carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylester

Einer Mischung von 0,576 g Carbobenzoxy-O-benzyl-L-serin (O k a w a , Bull. Chem. Soc, Japan, 29, 488 [1956]) und N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylester (hergestellt aus 1,118 g N(Im)-Carbobenzoxy - L - histidyl - L - leucin - methylester - dihydrobromid durch Behandeln mit Natriumbicarbonat in Gegenwart von Dichlormethan) in Dichlormethan werden 0,362 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Die Lösung wird während 3 Stunden gerührt und hierauf über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Abfiltrieren des ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoffs wird das Filtrat unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in Äthylacetat wieder aufgelöst, nacheinander mit n-Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und wieder Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einem Sirup eingedampft, aus welchem nach Fällung aus Äthylacetat—Äther 118 g Produkt mit einem Schmp. von 102 bis 105⁰C erhalten werden. Umkristallisation aus Äthylacetat ergibt eine Analysenprobe vom Schmp. 105 bis 106⁰C, (σ)J" + 7,8±l°(r = 1,990 in Äthylacetat).

909 521/585

Analyse für Gu)Ha₅NaOi): Analyse für

Berechnet ... C 64,3%, H 6,23%, N 9.62%; Berechnet

gefunden ... C 64,04%, H 6.29%, N 9,51»/». gefunden

C 65,1%, H 6.35%. N 10,6%: C 64,42%, H 6,47%, N 10.71%.

Beispiel 4

Herstellung von Formylglycyl-O-benzyl-L-seryl-NilmJ-carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylester

O-Benzyl-L-serin-methylester (hergestellt aus 1,81 g des Hydrochlorids durch Behandeln mit Kaliumcarbonat in Äther) und 0,68 g Forrnylglycin (vgl. I η ο u y e und Mitarbeiter, Bull. Chem. Soc, Japan, 34, 4 [1961]) werden mit !^,N'-Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensationsmittel in Dichlormethan kondensiert, wobei man 1,714 g Formylglycyl-O-benzyl-L-serin-methylester erhält, das leicht in Formylglycyl-O-benzyl-L-serin in 80%iger Ausbeute verseift wird.

Hierauf verkoppelt man N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylester (hergestellt aus 1,118 g NilirO-Carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylesterdihydrobromid durch Behandeln mit Natriumbicarbonat in Gegenwart von Dichlormethan) mit 0,491 g des oben hergestellten Formylglycyl-O-benzyl-L-serins gemäß Beispiel 3. Ausbeute: 0,815 g. Umkristallisation aus Methanol ergibt Nadeln mit einem Schtnp. von 131 bis 132 C. («); +1,6±1 (c = 2,046 in Äthylacetat).

Analyse für Gi

Berechnet
gefunden

C 60,1%, H 6,24»/». N 12,35"/«; C 59,85%,, H 6,24»/», N 12,32%.

Beispiel 5

Herstellung von Carbobenzoxy-L-prolyl-L-phenylalanyUN(Im)-carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-

methylester

Man kuppelt 2,49 g Carbobenzoxy - L - prolin (I η ο u y e und Mitarbeiter, Bull. Chem. Soc. Japan, 34, 4 [1961]) mit L-Phenylalanin-methylester (hergestellt aus 2,59 g des Hydrochlorids durch Behandeln mit Kaliumcarbonat in Äther) unter Verwendung von Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan und erhält 4,362 g Carbobenzoxy-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester als sirupöse Substanz. Die methanolische Lösung dieses Rohproduktes schüttelt man mit 5 cm³'2 n-Natriumhydroxyd während einer Stunde und erhält 2,54 g Carbobenzoxy-L-prolyl-i.-phenylalanin (64,2"/» Ausbeute in bezug auf Carbobenzoxy-L-prolin) mit einem Schmp. von 131 bis 132 C.

NUnrO-Carbobenzoxy-i.-histidyl-L-leucin-methylester (hergestellt aus 1,39 g N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidyl-L-leucin-methylester-dihydrobromid durch Behandeln mit Natriumbicarbonat in Dichlormethan) werden mit 0,793 g Carbobenzoxy-i.-prolyl-i.-phenylalanin (wie oben hergestellt) nach Beispiel 3 gekoppelt, wobei Carbobenzoxy-i.-prolyl-i.-phenylaianyl-NflmJ-carbobenzoxy-i.-histidyl-i.-leucin-methylester in einer Ausbeute von 1,267 g gebildet wird.

Umkristallisation aus Aceton Äther ergibt eine Analysenprobe mit einem Schmp. von 144,5 bis 145 C (Zersetzung), («)? -56,4+1 (c = 2,544 in Methanol).

Beispiel 6

A. Herstellung von N(Im)-Carbobenzoxy-i.-histidyl-L-phenylalanin-methylester-dihydrobromid

Eine Mischung von 0,585 g N(<i),N(Im)-Dicarbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylalanin-methylester mit 3 cm^;i einer 37,5gewichtsprozentigen Bromwasserstofflösung in Dioxan wird bei Zimmertemperatur (15 bis 30 C) stehengelassen. Sobald Kristalle entstehen, verfestigt sich die Mischung. Nach 30 Minuten werden 15cm^:i Äther zugesetzt, und man filtriert ab, wäscht mit Dichlormethan, dann mit Äther und trocknet. Ausbeute: 0.60 g farblose Nadeln mit einem Schmp. von 133 bis 134 C (Zersetzung). / S^ham" = 234 ma (ι = 3.300). Löslich in Methanol und Wasser; schwach löslich in Dichlormethan; unlöslich in Äthylacetat und Äther.

Analyse für G₂IH₂KNiO₅Br..:

Berechnet:

C 47,15%. H 4.61%, N 9,15»/», Br 26.15»/»; C 46,87%. H 4,75%, N 9.05»/». Br 26.26»/».

Wird die Behandlung mit einer 29,3gewichtsprozentigen Bromwasserstofflösung in Eisessig durchgeführt, so erhält man das Produkt in feinen Nadeln mit einer Ausbeute von 99,3"/».

35

40

B. Herstellung von Carbobenzoxyglycyl-

N(Im)-carbobenzoxy-L-histidyl-i.-phenylalanin-

methylester

Eine Suspension von 0,522 g N(Im)-Carbobenzoxy- L- histidyl - L- phenylalanin - methylester-dihydrobromid in 20 cm³ Dichlormethan und 7,5 cm^:! Wasser werden in einem Eisbad auf 0 C abgekühlt. Hierauf fügt man 1 cm³ einer 28%igen wäßrigen Ammoniaklösung unter starkem Schütteln zu. Dann sättigt man die wäßrige Phase mit Natriumchlorid und schüttelt mit 10 cm³ Dichlormethan. Die vereinigten Dichlormethanlösungen werden mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und hierauf über wasserfreiem Natriumsulfat bei 0 C getrocknet. In der so zubereiteten Lösung von N(Im) - Carbobenzoxy -L- histidyll.-phenylalanin-methylester in Dichlormethan löst man nun 0,162 g Carbobenzoxyglycin und versetzt hierauf die Mischung mit einer Lösung von 0,160 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in 5 cm³ Dichlormethan, wobei sich Dicyclohexylharnstoff ausscheidet. Nun läßt man die Lösung über Nacht stehen und erwärmt dann vorsichtig auf 40"C. Man filtriert sodann vom Dicyclohexylharnstoff ab und stellt die Lösung in den Kühlschrank, wo das Produkt nadelförmig auskristallisiert. Ausbeute: 0,445 g. Schmp. 151 bis 152 C. Durch Umkristallisieren aus Dichlormethan erhält man feine Nadeln mit einem Schmp. von 154 bis 154,5 C («)L⁸ -8,6 ±2 (r = 2,336 in Methanol), λ S^h;'""' = 236 πψ (ι- = 3,655). Löslich in warmem Dichlormethan; wenig löslich in kaltem Dichlormethan, Äthylacetat und Methanol; unlöslich in Äther, Petroläther und Wasser.

Analyse für

Berechnet
gefunden

C 63,7%, H 5,51%, N 10,9%; C 63,69»/.), H 5,63%, N 10,84%.

Herstellung von Carbobenzoxyglycyl-L-histidyl-L-phenylalanin

Einer Suspension von 0,642 g Carbobenzoxyglycyl - N(Im) - carbobenzoxy - L - histidyl - l - phenylalanin-methylester in 15 cm³ Methanol werden 2,2 cm³ n-Natriumhydroxyd zugesetzt, worauf die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur (15 bis 30 C) geschüttelt wird. Nach weiteren 30 Minuten Stehenlassen der erhaltenen klaren Lösung, kühlt man im Eisbad, neutralisiert mit 2,2 cm³ η-Salzsäure und konzentriert im Vakuum zur Trockene. Den kristallinen Rückstand wäscht man mit eiskaltem Wasser und trocknet wieder. Ausbeute: 0,360g; Schmp.: 200 C (Zersetzung); («)■"' +15,4 ±1,4" (c· = 1,424 in Methanol).

Analyse für C₂SH₂TNsOiJ:

Berechnet ... C 60,85%, H 5,52»/,,, N 14,2»/,,;
gefunden ... C 60,51%, H 5,65»/,,, N 14,11»/,,.

Herstellung von Glycyl-N(Im)-carbobenzoxy-L-histidyl-i.-phenylalanin-methylester-dihydrobromid

35

40

45

Durch Behandeln von 0,642 g Carbobenzoxyglycyl - N(Im) - carbobenzoxy - L - histidyl - L - phenylalanin-methylester mit 3 cm³ einer 37,5gewichtsprozentigen Bromwasserstofflösung in Dioxan gemäß Beispiel 2 erhält man 0,421 g des Produktes; IJST= 234ηΐμ(,· = 3,640).

Analyse für C₂(iH:tiNr,O(;Br₂:

Berechnet:

C 46,7»/,,, H 4,68»/,,, N 10,0%, Br 23,9»/,,;
gefunden:
C 45,73»/,,, H 4,99»/,,, N 10,40%, Br 22,59»/,,.

Beispiel 7

A. Herstellung von Carbobenzoxy-y-tert.-butyli.-glutamyl-N(Im)-carbobenzoxy-L-histidyl-

L-phenylalanin-methylester

Man mischt eine Lösung von Carbobenzoxyy-tert.-butyl-L-glutaminsäure (hergestellt aus 2,50 g des Dicyclohexylammoniumsalzes durch Behandeln mit »Dowex-50« (Handelsmarke) (H ± Form)) in Dichlormethan mit einer Lösung von N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylalanin-methylester (hergestellt aus 3,25 g des Dihydrobromides gemäß Beispiel 1) in Dichlormethan. Hierauf fügt man 1,00 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid zu und füllt mit Dichloräther auf etwa 30 cm³. Man läßt bei Raumtemperatur über Nacht stehen, kühlt im Kühlschrank ab, filtriert vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff und konzentriert im Vakuum zur Trockne und wäscht den festen Rückstand mit Äthylacetat und trocknet. Ausbeute: 3,37g, Schmp.: 133 bis 135"C. Durch Umkristallisieren aus Acetonitril erhält man 3,17 g reine Kristalle. Schmp. 161 bis 162 C; («)? -11,6 ± 1 (<■ = 1,557 in Dimethylformamid).

Analyse für CiiHi?NsOi„:

Berechnet ... C 64,0»/,,, H 6,15»/,,, N 9,10»/,,;
gefunden ... C 63,94»/,,, H 6,21»/,,, N 9,18%.

B. Herstellung von Carbobenzoxy-y-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanin

Einer Suspension von 0,77 g Carbobenzoxy- γ - tert. - butyl - l - glutamyl - N(Im) - carbobenzoxy-L - histidyl - L - phenylalanin - methylester in 10 cm³ Methanol werden 2,2 cm³ η-Natronlauge bei 0°C zugesetzt und die Mischung hierauf während 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt, sodann in einem Eisbad abgekühlt. Nach Zusatz von etwa 20 cm³ Wasser neutralisiert man die Lösung mit 2,2 cm³ η-Salzsäure, wobei das Produkt, teilweise kristallisiert, sich in fester Form abscheidet. Man filtriert, wäscht mit kaltem Wasser und trocknet. Ausbeute: 0,585 g. Nun kocht man die Suspension des Rohproduktes in 20 cm³ Acetonitril während einiger Minuten, wobei völlige Kristallisation eintritt. Nach Kühlung im Kühlschrank filtriert man die Kristalle ab, wäscht mit Acetonitril und dann mit Äther und trocknet. Ausbeute: 0,445 g; Schmp. 172 bis 173"C.

Beispiel 8

A. Herstellung von N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylalanin-benzylester-dihydrobromid und NUmi-Carbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylalaninbenzylester-monohydrochlorid-monohydrat

55 Eine Mischung von 2,98 g N(a),N(Im)-Dicarbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylanlanin-benzylester mit 15 cm³ einer 35gewichtsprozentigen Bromwasserstofflösung in Dioxan wird während 30 Minuten bei Raumtemperatur (15 bis 30"C) stehengelassen. Die entstehenden Kristalle werden abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet; Ausbeute: 3,08 g; Schmp. 127 bis 127,5"C (Zersetzung).

Analyse für

Berechnet:

C 52,3%, H 4,69»/,,, N 8,15»/,,, Br 23,25%;
gefunden:

C 53,75%, H 5,09%, N 8,59%, Br 23,61%.

Eine Suspension von 10,02 g des oben erhaltenen N(Im) - Carbobenzoxy - L - histidyl -L- phenylalaninbenzylester-dihydrobromids in 100 ml Dichlormethan wird in einem Eisbad gekühlt und mit 30 ml 3 N-Ammoniak bei 0°C geschüttelt. Die wäßrige Phase wird zweimal mit Dichlormethan extrahiert und die Extrakte mit der organischen Lösungsmittelphase vereinigt. Die Dichlormethanlösung wird bei 20"C im Vakuum eingeengt und der Rückstand in KX) ml Äthylacetat wieder aufgelöst. Nach Zugabe von 30 ml eisgekühlter N-Chlorwasserstoffsäure zur erhaltenen Lösung scheidet sich das N(Im)-Carbobenzoxy-i.-histidyl-L-phenylalanin-bcnzylester-monohydrochlorid-monohydrat in Nadeln und mit einem Ertrag von 7,13 g aus. F. 136,5 bis 137 C (Zersetzung). /Cif""'¹ = 236 ΐημ (f = 3,390). Löslich in Methanol, kaltem Dichlormethan; schwach löslich in Äthylacetat, Wasser; unlöslich in Äther.

Analyse für C», Hi₀NiOr,'· HCl ■ H₂O:

Berechnet-:

C 62,1 %, H 5,38%, N 9,66»/,,, Cl 6,11 »Abgefunden :

C 61,90»/,,, H 5,65%, N 9,90%, Cl 5,84»/,,.

B. Herstellung von Formyl-y-methyl-L-glutamyl-N(Im)-carbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylalanin-

benzylester

Einer Suspension von 1,162 g N(Im)-Carbobenzoxy - L - histidyl -l- phenylalanin - benzylester - monohydrochlorid-monohydrat in 10 cm³ Wasser und 20 cm³ Dichlormethan wird 1 cm³ 28%iges Ammoniakwasser unter starkem Rühren und Eiskühlung zugesetzt. Dann wird die wäßrige Phase zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Lösungen wäscht man mit Wasser, trocknet sie über wasserfreiem Natriumsulfat und engt sie unterhalb 20⁰C im Vakuum ein. Man setzt wieder Dichlormethan zu und dampft nochmals ab. Nun löst man den sirupösen Rückstand in 5 cm³ Acetonitril und 10 cm³ Dichlormethan. Dieser Lösung setzt man eine Lösung von 0,417 g Formyl-y-methyl-L-glutaminsäure in 20 cm³ Acetonitril zu. Nach Beifügen einer Lösung von 0,455 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 5 cm³ Acetonitril scheidet sich ein kristalliner Niederschlag von Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff aus. Das Filtrat wird nun bei Raumtemperatur gerührt, wobei das Produkt nach einer Stunde auszukristallisieren beginnt. Man rührt während weiterer 3 Stunden. Nach Eiskühlung filtriert man den Niederschlag ab und löst ihn wieder in 20 cm³ heißem Acetonitril. Nun entfernt man sorgfältig den unlöslichen Rest von N,N'-Dicyclohexylharnstoff und läßt d.as Filtrat bei Raumtemperatur (15 bis 30"C) stehen und stellt es hierauf, zur vollständigen Ausscheidung des Produktes, in den Kühlschrank. Ausbeute: 1,215 g; Schmp. 165 bis 165,5 C (Zersetzung); (α)% -12,1 ±3" (c = 2,032 in Dimethylformamid); λ £?_a"^hano1 = 236 ma (f = 3,415).

Analyse für CsTH₃₉NoOi):

Berechnet ... C 63,7%, H '5,63%, N 10,0%;

gefunden ... C 63,79%, H 5,90%, N 10,36%.

Herstellung von Formyl-y-methyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanin

Man hydriert eine Suspension von 0,349 g Formyly-methyl-L-glutamyl-NtlmJ-carbobenzoxy-L-histidyl-L-phenylalanin-benzylester in 20 cm³ Methanol in Gegenwart von Palladiumschwarzkatalysator bei Raumtemperatur (15 bis 30⁰C). Nach vollständiger Auflösung der Kristalle, hydriert man während weiterer 8 Stunden. Dann filtriert man den Katalysator ab und konzentriert das Filtrat im Vakuum. Der sirupöse Rückstand wird in Wasser aufgenommen, vom Niederschlag abfiltriert und die wäßrige Lösung im Vakuum eingedampft. Eine Auskristallisierung erhält man nach wiederholter Eindampfung mit Dichlormethan, worauf abfiltriert, mit Dichlormethan gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute: 0,212g; Schmp. 185 bis 189°C (Zersetzung); («)?? -12,2 ±2 (c· = 2,210 in Methanol).
Analyse Tür C₂₂Ho₇N₅O₇ · 2 H₂O:

Berechnet ... C 51.9%, H 6,13%, N 13,7%;
gefunden ... C 51,28%, H 5,77%, N 13,48%.

Beispiel 9

Herstellung von N(u),N(Im)-Dicarbobenzoxy-

L-histidyl-N(Im)-carbobenzoxy-L-histidyl-

L-phenylalanin-benzylester

Eine Mischung von 0,423 g N(«),N(Im)-Dicarbobenzoxy-L-histidin, N(Im)-Carbobenzoxy-L-histidyl-

40

60

L-phenylalanin-benzylester (hergestellt aus 0,70 g N(Im) - Carbobenzoxy - l - histidyl - l - phenylalaninbenzylester - monohydrochlorid - monohydrat durch Behandeln mit Ammoniakwasser in Gegenwart von Dichlormethan) und 0,206 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan wird bei Raumtemperatur während 2V2 Stunden gerührt, über Nacht stehengelassen und dann im Vakuum konzentriert. Man erhält einen Sirup, der in etwa 5 bis 6 cm³ Acetonitril gelöst wird, und nach Abfiltrieren des unlöslichen DicyclohexylharnstofFs fällt man das Produkt durch Ätherzusatz. Ausbeute: 0,754 g; Schmp. 132 bis 133 ⁰C. Schmelzpunkt der feinen Kristalle nach Umkristallisation aus Äthylacetat: 138 bis 140ⁿC; (a)l^! -17,9 ±2" {c = 3,047 in Methanol); λ JS¹""¹⁰'= 236 ταμ (e = 7,830). Gut löslich in Dichlormethan und heißem Äthylacetat; löslich in Acetonitril und Methanol; schwach löslich in Äther; unlöslich in Petroläther und Wasser.

Analyse für C52H49N7O10:

Berechnet ... C 67,1%, H 5,79%, N 10,5%; gefunden ... C 67,05%, H 5,41%, N 10,69%.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von einen Histidinrest enthaltenden Peptiden der allgemeinen Formel

HC=

=C — CH, — CHCO — P

(IV)

N —Cbz NHOC-Q —NH-R

CH

— NH-Q"— CO —P'

in der P' einen niederen Alkoxy- oder einen substituierten oder unsubstituierten Phenylniederalkoxyrest und Q" einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest bedeutet, in dem die funktioneilen Gruppen teilweise oder vollkommen geschützt oder ungeschützt sein können, Q ein Aminosäurerest oder ein Peptidrest ist, in dem die funktionellen Gruppen teilweise oder vollständig geschützt oder ungeschützt sein können, und R eine Aminoschutzgruppe ist, dadurch gekennzeichnet, daß man 1. eine N(«), N(Im)-Dicarbobenzoxyhistidin-Verbindung der allgemeinen Formel.

HC=

=C — CH₂- CHCO — P

N N —Cbz NH-Cbz (I) CH

in der Cbz und P die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, mit einem Halogenwasserstoff in einem inerten organischen Lösungsmittel unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 4OX behandelt;

15 16

2. die erhaltene NUirO-Carbobenzoxyhistidindihydrohalogenid-Verbindung der Formel

-C — CH₂ — CHCO — P

N — Cbz NH₂ · HX

in der X ein Halogen ist und Cbz und P die obigen Bedeutungen besitzen, entweder durch Schütteln der wäßrigen Lösung in Gegenwart eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels mit Ammoniumhydroxyd oder Natriumbicarbonat oder durch Behandeln der Lösung oder Suspension in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einer äquivalenten Menge eines tertiären Amins neutralisiert und
die gebildete N(Im)-Carbobenzoxyhistidin-Verbindung der Formel

HC=

=C — CH₂ — CHCO — P

N — Cbz NH₂

(IN)

CH

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Halogenwasserstoff in der ersten Stufe Bromwasserstoff verwendet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der dritten Stufe als Kondensationsmittel Dicyclohexylcarbodiimid, Carbonyldiimidazol oder Tetraäthylpyrophosphit verwendet.

909 521/585