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DE2360265A1 - Verfahren zur herstellung von cephalosporinen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von cephalosporinen

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Publication number
DE2360265A1
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Authority
DE
Germany
Prior art keywords
formula
ester
escherichia coli
ifo
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE2360265A
Other languages
English (en)
Inventor
Koichi Kato
Kenji Kawahara
Takeshi Takahashi
Toshiyuki Takahashi
Yoshio Yamazaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of DE2360265A1 publication Critical patent/DE2360265A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/04—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by acylation of the substituent in the 7 position
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Description

3. Dezember 1973 Kl/Br.
Takeda Chemical Industries, Ltd.,
27/ Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).
Verfahren zur Herstellung von Gephalosporinen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen. Insbesondere betrifft sie ein neues Verfahren zur Herstellung eines Cephalosporinesters der nachstehend angeführten, allgemeinen Formel (l), welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Derivat einer organischen Säure der nachstehend angeführten, allgemeinen Formel (II) mit einer 7-Aminocephemverbindung der nachstehend angeführten, allgemeinen Formel (III) in Gegenwart des Enzymes eines Mikroorganismus einer der Gattungen Escherichia, Bacillus, Proteus oder Pseudomonas,. welches fähig ist, einen Cephalosporinester der allgemeinen Formel (I) aus einem Derivat einer organischen Säure der allgemeinen Formel (ll) und einer 7-Aminocephem-4-carbonsäure der allgemeinen Formel (III) zu bilden, '
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RJ
r-ch-cünh
(I) COOR3
R-CH-COOH (II)
(IiI)
COOR3
worin R einen ungesättigten, sechsgliedrigen, carbocyclischen Ring oder einen fünfgliedrigen, heterocyclischen
Ring, welche gegebenenfalls unsubstituierte Substituenten aufweisen,
R Wasserstoff oder einen nicht substituierten Substi-
tuenten, wie Hydroxyl oder Halogen, 'Wasserstoff oder eine über Sauersto Stickstoff gebundene organische Gruppe, und
R 'Wasserstoff oder eine über Sauerstoff, Schwefel oder
COOR eine leicht in COOK umwandelbare Gruppe, welche im folgenden als Esterrest bezeichnet v/ird, bedeuten,
'umgesetzt vird.
Bisher wurde die Herstellung von halbsynthetischen Cephalosporinen durch Kondensationsreaktionen von reaktionsfähigen Derivaten organischer Säuren der Formel (II) mit 7-Aminocephem-4-carbonsäuren ausschließlich auf chemischem V/ege
durchgeführt. Diese chemischen Verfahren weisen jedoch alle Nachteile auf. So z.B. tritt bei der Acylierung von 7-Aminocephem-4-carbonsäure mit einem Acylhalogenid, welches ein
typisches Acylierungsmittel ist, und in wenigstens äquimolaren Mengen, bezogen auf die 7-Aminocepheir.-4-carbonsaure,
eingesetzt wird, bei Verwendung eines Überschusses an Acyl-
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halogenid, das an sich sehr reaktionsfähig ist, eine teilweise, unerwünschte Umsetzung der wenig· stabilen 7-Aminocephem-4*-c3rbonsäure ein, welche zu verminderten Ausbeuten führt. Es ist sehr schwierig, die Reaktionsbedingungen so zu steuern, daß diese Nebenreaktion auf ein Minimum reduziert wird. .
Es wurden umfangreiche Untersuchungen angestellt, um ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von halbsynthetischen Cephalosporinen zu entwickeln. Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde gefunden, daß die Herstellung von Cephalosporinen aus organischen Säuren der Formel (II) oder einem Derivat und 7-Aminocephem-4-carbonsäure auf dem V/e ge einer enzymä-tischen Kondensationsreaktion erfolgen kann*
Aus dem nachstehenden. Bezugsbeispiel 1 ist ersichtlich, daß unter den Bakterien die Gattungen Escherichiä, Bacillus, Proteus und Bseudomonas zur Herstellung von Cephalosporinen der Formel (I1K welche der allaemeinen Formel (I) entspre-
chen, worin R Wasserstoff bedeutet, aus einer organischen Säure der allgemeinen Formel (II) oder einem ihrer Derivate und einer 7-Aminocephem-4-e?rbonsäure der Formel (ill1), welche der allgemeinen Formel (III), worin R Wasserstoff ist, entspricht, geeignet sind. Weitere Untersuchungen ergaben, daß die bakteriellen Enzyme, welche die Reaktionen katalysieren, sehr stark wirksam' sind, die Cephalosporine der Formel (Ϊ1) in (II) und (III1) zu hydrolysieren, und daß diese Herstellungsreaktionen viel schneller vor sich gehen, wenn anstelle der organischen Säure der Formel (il) ein Derivat derselben als Acyli'erungsmittel !eingesetzt wird.
.Bei Einsatz von organischer Säure der Formel (II) als Acylquelle katalysieren diese bakteriellen Enzyme die'nächstehend angeführte, reversible Reaktion. Aus Bezucsbeispiel 2 wird deutlich," daß in dieser Reaktion die Gleichgewichtskonstante
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(K) viel kleiner ist als 1 (siehe Tabelle II). Daraus geht hervor, daß die Hydrolysierungsgeschv/indiq'rceit der Vorbindungen der Formel (i1) beträchtlich größer ist als deren Herstellungsgeschwindigkeit.
R-CH-COOH + H2N
(III1)
(R, R und R besitzen hierin die oben angeführte Bedeutung.)
Wird anstelle der organischen Säure der Formel (II) eines ihrer Derivate, z.B. ein Glycinderivat, eingesetzt, so wird dadurch die Herstellungsgeschwindigkeit der Verbindungen der Formel (I1) so erhöht, daS sie gleich der Hydrolysegeschv/indigkeit ist (siehe Bezugsbeispiel 3). Das Derivat der organischen Säure der Formel (II) wird durch diese Enzyme leicht zu (II) und Glycin hydrolysiert und außerdem in der oben angeführten Kondensationsreaktion eingesetzt. Selbst wenn man das Derivat der organischen Säure in großen Konzentrationen einsetzt, um die Verbindungen der Formel (I1) über das in der Reaktionsformel angegebene Gleichgewicht hinaus zu erhalten, wird die einmal entstandene Verbindung der Formel (I1) wieder hydrolysiert und ebenso auch die Menge an organischem Säurederivat der Formel (ill')· Es erwies sich daher als schwierig, die Verbindungen der Formel (I1) über die Gleichgewichtskonzentration hinaus zu erhalten (siehe Bezugsbeispiel 3).
4 098247113 &ς BAD ORIGiNAI.
Es wurde nun überraschenderweise gefu'nden, da3 die Bildungsgeschwindigkeit von Verbindungen der Formel (I) aus einem Derivat von (II) und (III) etwa gleich ist der Bildung von Verbindungen der Formel (I1) aus einem Derivat von (II) und (HI1)- und daß die einmal entstandene Verbindung der Formel, (i) selbst ungeachtet einer stark verlängerten Reaktionsdauer nicht hydrolysiert v/ird und daß daher die Verbindung der Formel (I) aus (II) und (ill) mit guter Ausbeute hergestellt werden kann.
Obwohl bekannt ist, daß mikrobielle Enzyme eine strenge Substratspezifität aufweisen, konnte die enzymatische Herstellung einer Verbindung der Formel (i) aus einem Derivat von (il) und (III) nicht einmal vom Fachmann aus der Tatsache abgeleitet werden, daß es möglich ist, eine Verbindung der Formel (I1) aus einem Derivat von (II) und (ill1) herzustellen. Darüber hinaus ist es überraschend, daß die Bildungsgeschwindigkeit einer Verbindung der Formel (I) aus einem Derivat von (II) und (III) ' gleich ist jener von (I1) aus einem Derivat von (H)-und (III1).
Außerdem ist es bekannt, daß die meisten Enzyme durch einen großen Überschuß an Substrat inhibiert werden, man nennt dies die sogenannte "Substratinhibierung". ßei den" bisher bekannten Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Penicillinen und Cephalosporinen wurde eine Substratkonzentration von etwa 0,1 bis I/o eingesetzt. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren tritt jedoch überhaupt keine Substratinhibierung auf, sogar wenn die Substratkonzentration mehr als 10% beträgt. Die enzymatische Reaktion verläuft reibungslos.
Yiie schon erwähnt, zeigen penicillinbildende Enzyme im allgemeinen eine starke Tendenz, die Penicilline zu hydrolysieren. Das hergestellte Penicillin wird daher bei verlängerter Reaktionsdauer hydrolysiert /Biochemical Journal 115,
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"■: - r ä*
759-761 (ΐ%9}7· Im Gegensatz dazu tritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren keine Hydrolyse der entstandenen Verbindung der Formel (I) auf, diese Verbindung wird daher mit Ausbeuten von 70 bis S0% erhalten.
Es wurde weiters überraschend gefunden, daß es möglich ist, die Verbindung der Formel (I) mit hoher Ausbeute unter Einsatz von (III) in Konzentrationen herzustellen, welche das Zehnfache der Konzentration an (III1) betragen, vorausgesetzt, daß die Verbindung der Formel (III) leicht wasserlöslich ist.
Die V/eiferentwicklung dieser Erkenntnisse führte zu dem erfindungsgeir.äßen Verfahren. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens v/erden aus einem Vergleich zwischen dem oben angeführten Verfahren unter Einsatz des gleichen Organismus bei der Herstellung einer Verbindung der Formel (I1) aus einem Derivat von (II) und (III') und dem erfir.dungsge.T.ä^en Verfahren ersichtlich, bei welchem
1) die Ausbeute an der gewünschten Verbindung außerordentlich hoch ist,
2) die Reaktion bei hohen Konzentrationen durchgeführt werden kann, ohne die Ausbeute zu verringern,
3) die Menge an eingesetztem Derivat der organischen Säure der Formel (II) v/eit geringer sein kann, als dies bei dem oben angeführten, bekannten Verfahren unter Einsatz der Verbindung der Formel (III1) der Fall ist,
4) die Reaktionsdauer nicht kritisch ist, da selbst bei stark verlängerter Reaktionsdauer die Ausbeute nicht wesentlich verringert wird.
Ein v/eiterer Vorteil besteht darin, daß die erfindungsgemäS erhältliche Verbindung der Formel (i), im Gegensatz zur Verbindung der Formel (I1), in Wasser wenig löslich ist, durch
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Extraktion mit organischen Lösungsmitteln gereinigt und daher in einem so hohen Reinheitsgrad erhalten werden kann, so daß sie für Injektionen verwendet werden kann.
Die in. dem erfindungsgemäSen Verfahren einzusetzenden Bakterien können unter den in verschiedenen Depots vorliegenden Stämmen.von Mikroorganismen ausgewählt oder aus der Natur, wie z.B. aus dem Erdreich, Abwässern, Meerwasser, menschlichen und tierischen Exkrementen, der Atmosphäre oder anderen Quellen gewonnen werden. Unter diesen Bakterien gibt es viele Stämme, die ß-Lactamasen erzeugen. Wenn eine bestimmte ß-Lactamase auf wenigstens einen 7-Aminocephern-4-carbonsäureester CIII) und Cephalosporinester der Formel (i) einwirkt, so wird vorzugsweise nach en·sich bekannter "eise eine Variante kultiviert und eingesetzt, welche keine ß-Lactamase erzeugt.
In dem erfindungsgemäSen Verfahren können auch alle nach bekannten Verfahren kultivierten Mutationsstamme eingesetzt werden, welche zur Erhöhung der Ausbeute an dem gewünschten Cephalosporin beitragen. Nachstehend wird ein Verfahren zur Auswahl von Stämmen angeführt, welche zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sindi
Ein Testbakterium wird ein bis zwei Tage lang bei einer Temperatur von 20 bis 400C in einer Schüttelkultur kultiviert. Ist das Wachstum genügend weit fortgeschritten, so werden die Zellen abgetrennt und in einem Volumen Zitratphosphatpuffer (0,05 M, pH 6,0) suspendiert, welches dem Volumen der Kultur entspricht. Dann werden 20 mM' 7-Aminocephalosporansäure (in der Folge 7-ACA genannt) und 60 mM 2-Thienylacetylglycin (in der Folge als TAG bezeichnet) zugegeben, die Reaktion wird bei 37°C 30 Minuten fortgesetzt. Ein Stamm, ·'■-'■ .welcher nicht weniger als 2mM T-Thienylacetamidbcephalo- " sporansäure (von jetzt an CET oder Cephalotin genannt)' er-' ·
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zeugt, ist zum Einsatz irn erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Die Ausbeute an CET wird durch Spektropolarimetrie ermittelt. Die Veränderung (ARr0 in der optischen Rotation bei 589 mu (10 cm, 27°C, pH 6,0), welche auftritt, wenn 20 mM 7-ACA zu 100% in CET umgewandelt werden, beträgt 0,540. Um diese Tatsache bei der Berechnung der Ausbeute an CET auszunützen, wird wie folgt vorgegangen: die Resktionsmischung wird zuerst auf O0C abgekühlt und dann zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Die optische Rotation (Rq ) der entstandenen überstehenden Flüssigkeitsschicht wird mit einem Digitalpolarimeter Modell Perkin-Elmer 141 bei 27°C gemessen, aus der Abveichung von der vor der Reaktion ermittelten Rotation (R0) wird nach der nachstehend angeführten Gleichung die Ausbeute an CET errechnet.
R30 -R0 Ausbeute an CET = —°—- — χ 20 (mM)
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wurden die in der Folge angeführten Stämme ausgewählt, welche in verschiedenen Kulturkollektionen deponiert sind: Escherichia coli IFO-3542, Escherichia coli ATCC-9637, Escherichia coli var. communior IFO-3547, Escherichia coli var. communior IFO-3548, Bacillus sp. ATCC-14552, Proteus rettgeri ATCC-9250, Escherichia coli IFO-13502 (ATCC-21985), Escherichia coli IFO-3470 (ATCC-21986), Escherichia coli IFO-3450 (ATCC-21987), Pseudomonas putida IFO-3537 (ATCC-21988) und Bacillus sp. IFO-12063 (ATCC-21989).
Die IFO- und ATCC-Nummern geben die Akzessionsnummern der Organismen im Institute for Fermentation, Osaka, Japan, und American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, an.
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Um den gewünschten Cephalosporinester der Formel (i) unter Verwendung eines, wie oben angeführt, ausgewählten, dazu geeigneten ßakteriums herzustellen, wird dieser Organismus zuerst kultiviert, die entstandene Kultur oder daraus verarbeitetes Material wird dann mit einem Derivat einer organischen Säure der Formel (II) und einem 7-Aminocephem-4-carbonsäureester (III) unter geeigneten Bedingungen -in Berührung gebracht.
Die Kultur kann eine aerobe Rührkultur, eine Schüttelkultur oder eine stationäre Kultur sein,obgleich der aeroben Kultur der Vorzug gegeben v/ird. Als Kulturmedium kann jedes beliebige verwendet werden oder eine Kombination von zwei oder mehr der herkömmlichen Nährmedien, die üblich verwendet werden, z.B. Fleischextrakt,- Hefeextrakt, Pepton, Caseinhydrolysat, Maisquellwasser u.dgl. Wenn nötig, können zusätzlich Phenylessigsäure, Kohlenstoffverbindungen, wie Zucker, organische Säuren, η-Paraffine u.dgl., verschiedene organische und anorganische, stickstoffhaltige Verbindungen einschließlich Stickstoff in Amino- oder Nitratform, Phosphate, Magnesiumsalze, Natriumchlorid und andere Metall-Ionen, verschiedene Vitamine u.dgl. eingesetzt werden. Vor der Verwendung v/ird der pH-V/ert des Mediums auf 6 bis 9 eingestellt. Die empfehlenswerte Inkubationstemperatur liegt im Bereich von 20 und 37°C. ..
Obgleich die Kultivierungszeit von dem betreffenden Bakterienstamm und den Kultivierungsbedingungen, vor allem der Beschaffenheit der Kultur, der Medienzusammensetzung, der Inkubationstemperatur u.dgl. abhängt, ist es ratsam, die Kultivierung dann abzubrechen, wenn die cephalosporinesterbildende Wirkung des Enzymsystems ihren Höhepunkt erreicht hat, d.h. zwischen der zweiten Hälfte der logarithmischen Wachstumsphase und der ersten Hälfte der stationären Phase. Im allgemeinen reicht eine Kultivierungszeit von 8 bis 48 Stunden aus.
409 82 4/ii3 5 .
Die so erhaltene Xultur oder das daraus verarbeitete Material wird in der Reaktion zur Herstellung von Cephalosporinester eingesetzt. Unter "verarbeitetem i-.iaterial" sind alle Stoffe zu verstehen, welche durch Verarbeitung der Kultur in Formen übergeführt wurden, welche eine erhöhte cephalosporineoterbildende Jirkung aufweisen und besser zur Herstellung von Cephalosporinester geeignet sind. Bei intrazellularer Herstellungswirkung umfaßt das verarbeitete Material z.B.
1) die aus der bakteriellen Kultur abgetrennten Zellen,
2) den zellenfreien Extrakt mit cephalosporinester-bildender, enzymatischer Wirkung, welcher durch Behandlung der bakteriellen Zellen nach einem bekannten Verfahren hergestellt wurde,
3) das teilweise oder ganz gereinigte, cephalosporinester-bildende Enzym, welches nach einem bekannten Verfahren aus dem zellenfreien Extrakt hergestellt
. wurde, und
4) wasserunlösliche Enzyme mit cephalosporinester-bilden- der V/irkung, welche durch chemische oder physikalische Bindung des teilweise oder ganz gereinigten Enzyms an ein wasserunlösliches Alaterial von hohem Molekulargewicht hergestellt wurden.
Tritt die synthetisierende V/irkung extrazellular auf, so ist unter· verarbeitetem Material
1) die nach Entfernen der Zellen aus der Kulturbrühe erhaltene überstehende Flüssigkeitsschicht,
2) der teilweise oder ganz gereinigte, cephalosporinesterbildende Wirkstoff, welcher durch Reinigung der überstehenden Schicht nach einem bekannten Enzymreinigungsverfahren erhalten wird,
3) der wasserunlösliche, cephalosporinester-bildende Wirkstoff zu verstehen, welcher v/ie oben beschrieben hergestellt und entweder physikalisch oder chemisch
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BAD ORIGINAL
- JLl -
an ein wasserunlösliches Trägermaterial von hohem Molekulargewicht gebunden wurde.
Bei der Herstellung von Cephalosporinester der Formel (i) aus dem Derivat einer organischen Säure der Formel (II) und 7-Aminocephem-4-carbonsäureester (III) unter Einsatz der Kultur oder des verarbeiteten Materials wird die Kondensationsreaktion gewöhnlich in einer wässerigen Lösung durchgeführt. ■ Der pH-«vert des Reaktionssystems wird auf vorzugsweise 4 bis 10, insbesondere 6 bis 9, eingestellt. Ist die Kultur oder das verarbeitete Material wasserlöslich, so wird die Kondensationsreaktion in Lösung vorgenommen, ist jedoch die Kultur oder das verarbeitete Material wasserunlöslich, wird die Kondensationsreaktion entweder in Suspension oder wie folgt durchgeführt: Das wasserunlösliche, cephalosporinester-bildende Enzym wird in eine Kolonne gepackt und eine wässerige Lösung, welche das Derivat der organischen Säure der Formel (il) und 7-Aminocephem-4-carbor.säureester (III) enthalt, wird über die Kolonne geleitet, so daß sich die Kondensatiönsreaktion innerhalb der Kolonne vollzieht. Bei Durchführung der Kondensationsreaktion nach einem dieser Verfahren empfiehlt es sich, dem Reaktionssystem ein mit Viasser- mischbares, organisches Lösungsmittel, wie z.B. Alkohole, Aceton oder Dimethylsulfoxid, zuzugeben. Die Reaktionszeit hangt von der Substratkonzentration, der Wirksamkeit- des csphslosporinester-bildenden Enzyms, der Reaktionsterriperatur und anderen Faktoren ab, sie liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von 1 Minute und 3Ö Stunden.
Die Reaktionstemperätur liegt im Bereich von 0 bis 500C. Die Substratkonzentrationen hangen hauptsächlich von der cephalosporinester-bildenden Wirkung ab, im allgemeinen beträgt die Konzentration an 7-Aminocephem-4-carbonsäureester (ΪΙΪ) 0,1 bis 20^. ' : ' ■ ; ' .-■:.-■-.
Um die Ausbeute an Cephalosporinester der Formel "('I)1' bezogen
409824/ 1135. ..·-.-
auf aen 7-Aminocephem-4-carbonsäureester (III), zu erhöhen, ist die Konzentration des Derivates der organischen Saure der Formel (II) vorzugsweise nicht weniger als äquimolar, bezogen auf den 7-Aminocephem-4-carbonsäureester (III).
In der allgemeinen Formel (II) bedeutet der unsubstituierte, ungesättigte, carbocyclische, sechsgliedrige Rest oder heterocyclische, fünfgliedrige RingyPhenyl, Cyclohexenyl, Cyclohexadienyl, Thienyl, Butyl od.dgl. Beispiele für Substituenten für diese cyclischen Gruppen sind -OH, -SH, -NO2, Halogen, z.B. -Cl, -Br, Alkyl, z.B. -CH3, -C2H5, Alkoxy, z.B. -OCH«, OC0Hp., -CN u.dgl. In der allgemeinen Formel (II) bedeutet W- nicht eine substituierte Gruppe, wie Amino oder Carboxyl, sondern einen unsubstituierten Rest, wie z.B. Wasserstoff, Hydroxyl oder Halogen, z*B. -Cl, -Br. Beispiele für die organische Säure der Formel (il) sind Phenylessigsäure, Mandelsäure, Cyclohexadienylessigsäure, a-Oxycyclohexadienylessigsäure, Cyclohexenylessigsäure, 2-Thienylessigsäure, 2-Furylessigsäure, p-Hydroxyphenylessigsäure, p-Mercaptophenylessigsäure, p-Nitrophenylessigsäure, p-Chlorphenylessigsäure, p-Bromphenylessigsäure, p-Methylphenylessigsäure, p~Äthylphenylessigsäure, p-Methoxyphenylessigsäure, p-Cyanophenylessigsäure u.dgl.
Obgleich die oben angeführten Beispiele für Phenylessigsäuren nur para-substituierte Säuren sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung auch solche Verbindungen eingesetzt werden, welche ähnliche Substituenten in der ortho- oder meta-Stellung aufweisen. Es sind auch solche organische Sauren der Formel (II) geeignet, welche zwei oder mehrere, gleiche oder verschiedene Substituenten am Ring besitzen.
Unter Derivaten der organischen Säure der Formel (il) sind solche Verbindungen zu verstehen, welche im wässerigen Medium mit dem Enzym des erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganis'-
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mus zu einer organischen Säure der Formel (II) hydrolysiert werden. Bevorzugte Beispiele hiefür sind wasserlösliche Derivate, wie Ar.unosäurederivate, insbesondere die entsprechenden Glycinderivate, wie z.B. N-Phenylacetylglycin, N-(2-Thienylacetyl)-glycin u.dgl., Glykolsäurerierivate, Thioglykolsäurederivate und die Amide der organischen Säure. In vielen Fällen ist es auch möglich, einen Alkylester, wie z.B. Methyl- oder Äthylester, der organischen Säure einzusetzen.
Die organische Gruppe, deren freie Valenz durch O, S oder N abgesättigt ist und in der allgemeinen Formel (III) mit R bezeichnet wird, kann Alkoxy, wie z.B. -OCH,,, 002H5? Alkylcarbonyloxy, wie z.B. -OCOCH3-OCOC2H5, -S-Q ; Pyridylthio, wie z.B. 2-PyridylthiO| O
Pyridinium, wie z.B. -N^, -N^-CONH2;
Alkylthiocarbonyloxy, wie z.B. -OCuSCH3, -OCOSC2H5; Dialkyläminothiocarbonylthio, wie z.B. -SCSN(CH3)2, -SCSN(C2H^)2* Trialkylammonium, wie z.B. -N(CH3)3, -N3? Aralkyloxycarbonylamino, wie z.B. -NHC00CH2-^\ ♦ Pyridazinylthio-K-oxid, wie z.B. 3-Methylpyridazinylthio-2-oxid,. 3-Methoxypyridazinylthio-1-oxid, od.-dgl. sein.
3 3
Der in der Formel -COOR mit R bezeichnete Esterrest kann eine Gruppe sein, welche durch Behandlung mit Alkali, Säure, Enzym oder durch Reduktion leicht in -COOH umgewandelt werden kann. Beispiele hiefür, sind Halogenalkyl, z.B» Trichloräthyl? Alkyl- oder Arylsulfonylalkyl, z.B. Methylsulfonyläthyl, Äthylsulfonyläthyl, Phenylsulfonyläthyl; Alkyl, z.B. Methyl, Äthyl; Alkoxyalkyl, z.B. Methoxymethyl; Alkylcarbonylalkyl, z.B. Acetonyl; Diarylalkyl, z.B. Diphenylmethyl; Alkylthioalkyl, z.B. Methylthiomethyl; Alkyl- oder Arylsulfinylalkyl, z.B. Methylsulfinyläthyl, Phenylsulfinylmethyl, u.dgl. Als Beispiele für das erwähnte Alkyl sind Alkyle mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl,
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Butyl, Isobutyl, sec.Butyl, tert.Eutyl ζυ nennen. Typisches Beispiel für Aryl ist Phenyl, welches durch Alkyl, Alkoxy, Halogen substituiert sein kann. Beispiele für den" 7-Aminocephem-4-carbonsäureester (III) sind 7-Aminocephalospor3nsäure-fTietl-iOxymethyl-ester, 7-Arr:ino-3-dei;acetoxycephalosporsnsäure-methylsulfonyläthyl-ester, 7-Amino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure-methoxymethyl-ester, 7-Amino-3-£2-(loxopyridyl)-thiomethy l7-3-cephem-4-carbonsäure-dipheny1-methyl-ester, 7-Amino-3(l-pyridylmethyl)-3-cephem-4-carbonsäure-methoxymethyl-ester, 7-Amino-3-^l-(4-carboxamidopyridyl)-rnethy];7-3-cephem-4-carbonsäure-methoxymethyl-ester, 7-Amino-3-rr.ethylthio-ccrboxy.T.ethyl-3-cephem-^-carbop.s3uremethoxymethyl-ester, 7-Amino-3-trimethylaminomethyl-3-cephem-4-carbonsäure-acetonyl-ester, 7-Amino-3-dimethyldithiocarbaraylmethy1-3-cephem-4-carbonsäure-diphenylmethyl-ester, 7-Amino-3-azidomethyl-3-cephem-4-carbonsäure-methoxymethylester, 7-Amino-3-benzyloxycarbonylarninomethy 1-3-cephem-4-carbonsäure-methoxymethyl-ester u.dgl. ^
Unter den 7-Aminocephem-4-carbonsäure-estern befinden sich auch neue Verbindungen, v/elche nach einem der nachstehend angeführten Verfahren hergestellt werden können.
(l) Der Alkohol der Formel (R OH), v/elcher dem gewünschten Esterrest oder einem reaktionsfähigen Derivat desselben entspricht, wird mit Penicillin G oder Penicillin V umgesetzt, um den entsprechenden Penicillin G-Ester oder Penicillin V-Ester zu erhalten, welcher dann einer Ringerweiterungsreaktion nach einem bekannten Verfahren unterworfen wird, worauf man die Stellung 7 des entstandenen entsprechenden 7-Acyl-3-desacetoxy-cephalosporansäure-esters deacyliert, um den gewünschten 7-Araino-3-desacetoxy-cephalosρoransäureester zu erhalten.
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(2) Die Aminogruppe des Cephalosporin C wird geschützt, dann wird die Verbindung mit dem dem gevünschtcn Esterrest oder seinem reaktionsfähigen Derivat entsprechenden Alkohol umgesetzt, um Cephalosporinester C zu erhalten, worauf die 7-Acylgruppe der Verbindung auf herkömmliche Weise entfernt wird, um den gewünschten T-Aminocephalosporansa'ure- ester
zu erhalten.
(3) Die 3-Position des Cephalosporin C wird nach Bedarf modifiziert, dann geht man wie unter (2) beschrieben vor, um den gewünschten 7-Aminocephem-4-carbonsä.ure-ester zu erhalten.
Der durch Umsetzen des Derivates einer organischen Säure der Formel-ClI) und eines 7-Aminocephem-4-carbonsäureesters (HI) in Gegenwart der Bakterien-Kultur oder eines daraus verarbeiteten Materials hergestellte Cephalosporinester der Formel (i) kann unter milden Bedingungen nach herkömmlichen
Verfahren, wie Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, welches in bezug auf V/asser, eine getrennte Phase bildet, durch Kristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, Chromatographie oder mit einer organischen Säure, die mit der Cephalosporinverbindung der Formel (I) ein unlösliches Salz bildet, isoliert und gereinigt werden.
Zu den auf diese Weise hergestellten Cephalosporinestern der Formel (I) gehören Verbindungen, welche Antibiotika an sich sind; viele davon sind Zwischenprodukte, aus welchen Verbindungen der Formel (i1) hergestellt werden können, die noch bessere Medikamente ergeben, ,
In der Beschreibung bedeuten - -wenn nichts anderes angeführt ist - mu, ml, 1, 0C, mM und N: Millimikron, Milliliter, Liter, Grad Celsius, millimolare Konzentration, und Formalität; die bei Konzentrationen angegebenen % sind Gev/.-^/Vol., d.h. Gramm pro Deziliter.
4098.24/1 135
Nachstehend sind die Zusammensetzungen der -f.'.edien angegeben, welche in den in der Folge angeführten Bezugs- und Ausführungsbeispielen eingesetzt wurden:
Medium A Fleischextrakt Natriumglutamat Medium C Fleischextrakt 10 g
Pepton Hefeextrakt Pepton 10 g
NaCl Phenylessigsäure NaCl " 5 g
• Leitungswasser NaGl Benzoesäure i 1, pH 7,0
Medium B KH2PO4 Leitungswasser
MgSO4.7H2O 20 g
Leitungswasser 10 g
2 g
2 g
1 3
0,2 g
1 1, pH 7,0
10 g
10 g
5 g
la
1 1, pH 7,0
Bezugsbeisoiel 1:
In einen konischen Kolben mit einem Fassungsraum von 200 ml wurden 20 ml Medium B (für Escherichia) oder Medium C (für andere Organismen) eingebracht und mit einer öse Escherichia coli IFO-3542, Pseudomonas putida IFO-3537, Bacillus sp. IFQ-386Ö oder Proteus rettgeri ATCC-9250 aus einer 2 Tage alten Schrägkuitur beimpft. Die Kultur wurde unter Schütteln bei 24° (für Escherichia) oder 28° 24 Stunden lang kultiviert. Die entstandenen Kulturbrühen (mit Ausnahme der
409824/1135
Bacillusbrühe) wurden zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, diese wurden in 5 ml 0,2M.Citratphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,0 suspendiert. I.'it der Bacilluslculturbrühe wurde unmittelbar der nachstehend beschriebene .Versuch angestellt: Jede der Zellensuspensionen wurde mit 5 rnl einer wässerigen Lösung (pH 6,0), die 10 mg/ml 7-ACA und 40 mg/ml TAG enthielt, versetzt. Die Reaktion wurde bei 4 Stunden lanq fortgesetzt. Die quantitative Bestimmung des erhaltenen CET wurde nach dem im Journal of the American Chemical Society, 94, 4035 (1972) beschriebenen spektrophotometrischen Verfahren durchgeführt,' welches die Cephalosporine selbst bei gleichzeitigem Vorliegen von 7-ACA aus der Abnahme der Absorption bei 260 mu nach Behandlung mit ß-Lactamase, hergestellt aus Aerobacter cloaseae IFO-12937, ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.
Tabelle I
- Mikroorganismus Ausbeute an Cephalotin
in %
Escherichia coli IFO-3542
Pseudomonas putida
IFO-3537
Bacillus sp. ATCC-14552
Proteus rettgeri ATCC-9250		 46 ·
41
37
20
Bezugsbeispiel 2t
Die gesamte Schrägkultur von Escherichia coli IFO-13502 (28°, 24 Stunden Kultivierung, Medium A) wurde in 10 ml sterilem V/asser suspendiert und die erhaltene Suspension wurde zum Beimpfen von 400 ml ,Medium B in einem Schüttelnkolben von 2 Liter Fassungsraum verwendet. Das beimpfte
409824/1 135
BAD ORIGINAL
Medium wurde unter Schütteln 24 Stunden lang bei 24° kultiviert. Die entstandene Kulturbrühe vur-ie zentrifugiert, ur die Zellen zu sammeln, diese wurden' in 20 ml destilliertem Wasser suspendiert. Inzwischen wurden wässerige Lösungen von je 5 ml hergestellt, die 40 m,Yi Cepholotin und 0, 40, 120 od&r 280 mM Thienylessigsaure (nachstehend mit TA bezeichnet) enthielten. Jede dieser Lösungen wurde'einem Anteil von 5 ml der oben angeführten Zellenaspension zugegeben, die Mischuny wurde auf einem pH-Wert von 6,0 und einer Temperatur von 37 gehalten, um das Cephalotin zu hydrolysieren. Der pH-Wert des Reaktionssystems wurde mittels pH-Stat auf 6,0 gehalten. Die Konzentrationen an Cephaiotin und 7-ACA bei Reaktionsgleichgev/icht v/urden spektrometrisch und polarimetrisch ermittelt.
Aus der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse und die Zeitabstände bis zum Erreichen des Gleichgewichts angegeben. In diesem Zusammenhang wurde das Gleichgewicht.auch ermittelt, wenn Cephalotin aus 7-ACA und TA hergestellt wurde} das Molverhältnis von Cephalotin zu 7-ACA bei Erreichen des Gleichgev/ichts entsprach in diesem Fall dem Molverhältnis zwischen eingesetztem 7-ACA und TA und deckte sich im wesentlichen mit dem in dem Cephalotinhydrolyseversuch ermittelten Molverhältnis von Cephalotin zu 7-ACA. Es ist zu beachten, daß in dem vorstehenden Vergleichsbeispiel der Wert für Cephalotin auf der Grundlage von äquimolaren Mengen an TA und 7-ACA ermittelt wurde.
Da bei der Herstellung aus TA und 7-ACA das Gleichgewicht erst nach langer Zeit erreicht wird, beziehen sich·die nachstehend angeführten Werte nur auf die in der Hydrolyse von Cephalotin erhaltenen Werte. Aus Tabelle II geht hervor, daß bei Herstellung von Cephalotin aus 20 mV. 7-ACA und 160 m.\: TA die Ausbeute an Cephalotin nur 30% beträgt.
409824/1 135
Bei Erhöhen der Substratkonzenträtion im Reaktionssystem wird die Ausbeute an Gephalotin beim Gleichgevichtszcitpunkt etwas erhöht, da jedoch die 7-ACA nur wenig löslich ist, kann selbst bei Erhöhen der Substratkonzentration auf 50 mM eine besondere Auswirkung erwartet werden»
Tabelle
II
Konzentration ;
an TA und CET
bei Reaktions
beginn (mM)		 GET Konzentration·
an TA und 7-
ACA
(mM) ;		 -£CA; Konzentration
an GET U.7-ACA
beim Gleichge
wicht (Rii4)		 1-ACAi Zeitraum bis
■zum Erreichen
des Gleichge
wichts Stunden}
TA 20 TA, 7 20 - CET 19,1
O 20 20 20 0,9 18,8 0,5
20 20 40 20 1,2 17,9 1
60 20 80 20 2,1 14,0 2
140 160 6,0 4
Bezugsbeispiel 3i
Die gemäß Bezugsbeispiel 2 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coil IFO-13502 wurden in destilliertem Wasser suspendiert,"um eine zehnfache Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe zu erhalten,, die Suspension wurde mittels pH-Stat auf einem pH-Wert von 6,0 gehalten, dann wurden bei 37 die Geschwindigkeiten der folgenden Reaktionen gemessen:
(l) HerStellungsgeschwindigkeit von Cephalotin aus 80 mM *TA und 20 mM 7-AGA, '
Herstellungsgeschwindigkeit von Cephalotin aus 80 mM TAG und 20 irfÄ 7-ACA, .
. Hydrolysegeschv/indigkeit von Gephalotin (20 mf.1) (Herstellung von TA und 7-ACA) und ■
(4) Hydrolysegeschwindigkeit von TAG (BO mM) (Herstellung von TA und Glycin),
(3)
409 8 24/1135
Die Geschwindigkeiten der Reaktionen (i), (2) und (3) wurden spektrophotometrisch ermittelt. Die Geschwindigkeit der Reaktion (4) wurde durch Titrieren des hergestellten GIycins mit Ninhydrin ermittelt /Analyst, 80, 209, (195^17.
Die Ergebnisse sind aus Tabelle III ersichtlich, aus welcher auch hervorgeht, daß die Bildungsgeschwindigkeit des Cephalotins aus TAG und 7-ACA etwa siebenmal größer ist, als die Bildungsgeschwindigkeit desselben unter Einsatz von TA und 7-ACA und annähernd der Hydrolysegeschwindigkeit entspricht, weiters, daß die Hydrolysegeschwindigkeit des Cephalotins unter Einsatz des erfindungsgemäß verwendbaren Bakteriums weit größer ist, als die Herstellungsgeschwindigkeit des Cephalotins. Aus diesen Zahlen ist ersichtlich, daß bei Herstellung von Cephalotin aus 160 mM TAG und 40 mM 7-ACA die Bildungsgeschwindigkeit des Cephalotins gleich der Hydrolysegeschwindigkeit ist, wenn etwa 20 mM Cephalotin hergestellt worden sind, d.h. daß die reine Bildungsgeschwindigkeit (Anhäufungsgeschv.'ihdigkeit) des Cephalotins zu diesem Zeitpunkt gleich Null wird.
■4 0982 4/1135 BAD ORIGIMAL
Tabelle III
ι».
Substrate
(cnM)		 bestimmte
Verbindung .,		 in verschiedenen Zeitabständen ermit
telte Werte (mM)
(Minuten nach'Reaktionsbeqinn)		 10 20 30 60 90 120 150 Reaktion s-
■.joschwindi>
keit
(^iMol/min)
TA(80)+7-ACA(20)
TAG(20)+7-ACA(20)
TAG(80)+7-ACA(20)
CET (18)
TAG (80).		 CET (hergestellt)
CET (hergestellt)
CET (hergestellt)
CET (verschwunden)
hergestelltes
Glycin .		 5 0,83
3,31
4,14
13,50
25,10		 1,23
3,23
6,42
10,58
45,82		 1,49
2,42
7,28
8,78
59,23		 2,01
1,25
5,53
74,93		 2,16
1,10
4,31		 1,01
3,55		 0,05
0,36
0,36
0,36
2,29
0,54
2,32
2,33
15,92
19,40
N)
GD O NJ CO OI
Bei Abfallen der TAG-Konzentration wird gleichzeitig die Anhäufungsgeschwindigkeit des Cephalotins negativ. Obgleich die Cephalotinanhäufung die maximale Anhäufung von Cephalotin (aus 160 mM TA und 40 mM 7-ACA) bei weitem übertrifft (d.h. die Cephalotinanhäufung bei Gleichgewicht), beträgt sie bestenfalls 20 mM (was einer Umwandlungsrate von tO% entspricht).
Beispiel It
Die Zellen von Escherichia coli IFO-13502 aus vier verschiedenen Schrägkulturen (Medium A mit 2% Agar), die bei 28 24 Stunden lang gezüchtet wurden, wurden in 40 ml physiologischer Salzlösung suspendiert, damit wurden je 500 ml Medium B in 2-Liter-Schüttelkolben mit je 10 ml dieser Suspension beimpft. Dann wurde in den Kolben bei 24 innerhalb von 24 Stunden eine Samenkultur hergestellt. Zwei Liter dieser Samenkultur v/urden dann zum Beimpfen von 100 1 Medium B (welchem 0.005& Antischaummittel beigegeben war), die sich in einem Tank von 200 1 Fassungsraum befanden, verwendet, die Inkubation erfolgte bei Zerstäuben, Rühren und 50$ Belüftung innerhalb von 24 Stunden bei 150 UpM und 24 . Nach Kultivierung wurden die nassen Zellen in einem Zentrifugalabscheider gesammelt und in 5 1 reinem Wasser suspendiert. Nach gründlichem Waschen der Zellen wurde die Suspension nochmals zentrifugiert, wobei etwa 1100 g nasse Zellen erhalten wurden. Die Zellen wurden wieder in 5 1 reinem Wasser suspendiert und bis zur Verwendung in lyophilem Zustand gehalten.
Die so gewaschenen Zellen wurden in 10 ml 0,5f.i Citratphosphatpuffer suspendiert, wobei eine zehnmal stärkere Konzentration als die der ursprünglichen Kulturbrühe erhalten wurde.
40982W 1 1 35 BAD ORIGINAL
Dieser Suspension wurden 10 ml einer Pufferlösung zugegeben, welche 160 rmM Mandel glycin und 80 miM 7-Ämino-3-desacetoxycephalosporansäure(in der Folge mit 7-ADCA bezeichnet) -methylsulfonyläthylester enthielt. Die Mischung wurde unter ständigem Rühren bei 37° 4 Stunden lang reagieren . gelassen, v/orauf sich im Reaktionssystem 27,5 mM 7-/^x~Phenyl-a-hydroxyacetamidoZ-S-desacetoxycephalosporansäuremethylsulfonylathylester ansammelten. Die quantitative"Bestimmung erfolgte durch Polarimetrie.
Beispiel 2: .
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coil IFO-13502 wurden in einem 0,2M Citratphosphatpuffer (pH 6,0) suspendiert, wobei eine zehnmal stärkere Konzentration als die der ursprünglichen Kulturbrühe erhalten wurde. Inzwischen wurden Phenylacetylglycin (in der Folge mit PAG bezeichnet) und 7-ADCA öder 7-ADCA-Methylsulfonylathylester in der gleichen Pufferlösung gelöst, diese Lösung wurde mit den oben angeführten Zellensuspensionen zusammengemischt, das Gemisch wurde bei 37° unter Rühren reagieren gelassen. Aus Tabelle IV sind die Zellenkonzentrationen, PAG, 7-ADCA und 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester im Reaktionsgemisch ersichtlich. Die FuS-note *") In der Tabelle bedeutet, daß die Zellenkonzentration der Kulturbrühe als Standard angenommen wurde.
Tabelle IV
Ver
such
Nr.		 Zellen
konzen
tration		 Konzentra
tion an PAG
(in fliM)		 Konzentration
an 7-ADCA
(in mM)		 Konzentration
an 7-ADCA-E st ei
(in mM)
1 X5*' 80- 40 0
2 X 2 80 0 40
3 X 5 160 80 0
4 X 2. 160 0 80
5 X 5 240 120 0
6 X 2 240 0 120j .
Die Menge an 7-Phenylacetamido-3-desacetoxycephalosporansäure, hergestellt aus PAG und 7-ADCA wurde durch Spektrophotometrie wie bei Anwendung von ß-Lactamase ermittelt. Um die aus PAG und 7-ADCA hergestellte Menge an 7-Phenylacetamidocephalosporansäure-methylsulfonyläthylester zu ermitteln, wurde dem Reaktionsgemisch Tetrahydrofuran zugegeben, und nach Abzentrifugieren der Zellen v/urde die überstehende Schicht polarimetrisch gemessen. Die Ergebnisse sind aus Tabelle V ersichtlich.
A0 9824/1135 .
Tabelle V
Test
Nr.		 Ausbeute an Cephalosporin nach ver
schiedenen Intervallen
(Minuten nach Reaktionsbeginn) in mM		 60 90. 120 180 240 20x60 maximale
Umwandlung
(%) ■ 		Umwandlung
bei
Reaktionsende·
. ■(%) ■
1
2
3
4
5
6		 15 9,7
24,4
15,1
51,3
25,0
49,0		 10,1
25,0
22,3
56,0
30,6
59,0		 9,2
25,3
22,1
56,2
34,2
67,7		 10,0
26,2
23,1
56,4
37,0
78,0		 8,7
26,5
22,5
57,4
32,4
85,2		 8,0
27,4
20,2
58,0
31,3
91,2		 25
68 .
29
73
' 31 ,
76		 20
68 .
25
73-
. 26
76
7,4
16,6
11,0
19,4
10,5.
,18,1
O KJ CJ) CTI
Die Umwandlungsgeschwindigkeit von 7-ADCA in Cephalosporin betrug 25 bis 31%, jene von Cephalosporinester 68 bis 16%. Das Produkt wurde auf folgende V/eise identifiziert: Dem 20 Stunden-Reaktionsgemisch aus Versuch 6 (Gehalt von 91 m«M Cephalosporinester) wurde das Fünffache seines Volumens an Tetrahydrofuran zugegeben, um das Produkt gründlich zu lösen, dann wurden die Zellen und unlöslich en Proteine abzentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeitsschicht wurde unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 35 eingeengt. Nach Abdestillieren des Tetrahydrofurans setzten sich Kristalle ab. Diese wurden filtriert, mit .Vasser gut gewaschen und aus Methanol umkristallisiert. Man erhielt 7-Phenylacetamido-3-desacetoxycephalosporansäure-methylsulfonyläthyl-ester in Form von Kristallen; Fp: 145-146° /pj^ + 78° (c = 1,0, CH2Cl2), E*£m (260 mjj) = 159. Ausbeute: 72$6. Das Produkt wurde mit einer authentischen Probe durch NMR-und IR-Spektrometrie identifiziert.
Beispiel 3:
Es wurde eine wässerige Lösung (pH 6,0), welche PAG und 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester enthielt, hergestellt. Dann wurde, nach Beispiel 1 eine bestimmte Menge gewaschener Zellen von Escherichia coli IFO-13502 in einem gleichen Volumen destillierten V/assers suspendiert. Die Suspension wurde der oben angeführten wässerigen Lösung zugegeben und das Gemisch wurde bei 37° umsetzen gelassen. Während der Reaktion wurde der pH-Wert durch Zugabe von 2N HCl mittels pH-Stat auf 6,0 gehalten. Aus Tabelle VI sind die Zellen- und Substratkonzentrationen im Reaktionsgemisch ersichtlich. Der Verlauf der Reaktion ist wie der in Tabelle VII gezeigte. Die quantitative Analyse des Reaktionsproduktes (7-Phenylacetamido-S-desacetoxycephalosporansäure-methylsulfonyläthylester) wurde wie in Seispiel 2 beschrieben durchgeführt.
409824/1 135 .
BAD ORIGINAL
Tabelle VI
Ver
such
Nr*.		 Zellkonzentra-
tion		 Konzentration
an PAG		 Konzentration
an
7-ADCÄ-Ester
1.
2		 5 χ
8,5 χ		 480 mM
660 mM		 240 mM
330 mM
Tabelle VII
Ver
such
Nr.		 Ausbeute an Cephalosporinester
zu verschiedenen Zeitpunkten
der Reaktion
(Minuten) * CmM)		 60 90 120 180 240 7x60 Reaktions
ausbeute
in %
1
2		 15 38.
60		 49
88		 • 62
119		 93
152		 124
210		 172
260		 72
79
18
18
Beispiel 4; ' ' ■
In einen Schüttelkolben mit 200 ml Fassungsraum wurden 20 ml Medium B eingebracht, welche mit einer Öse Escherichia coli IFÖ-3450, Escherichia coil IFO-3470 oder Escherichia.coli var. communior IFO-3547 aus einer 2 Tage alten Schrägkultur beimpft und unter Schütteln bei 24° 24" Stunden lang kultiviert wurde. Die so kultivierten Zellen würden zentrifugiert und "in 2,5 ml 0,2 M. Citratphosphatpuffer (pH 6,0) susperi-' * diert. Dieser Suspension wurden 2,5 ml einer ahnlichen '' Pufferlösung, Vielehe 480 mM PAG und 24Ö mM 7-ADCA-Methyl- :"
4 09824/1135· : . ;
l ;..; .if Λΐ«;-( fi g £|
sulfonyläthylester enthielt, zugegeben und die Mischung wurde unter Schütteln bei 37° 16 Stunden lang reagieren gelassen.
Um die Produkte vollständig zu lösen, wurden dem Reaktionsgemisch 25 ml Tetrahydrofuran zugegeben, die bakteriellen Zellen und unlöslichen Proteine wurden abzentrifugiert. Die entstandene überstehende Flüssigkeitsschicht wurde polarimetrisch untersucht, wobei die Ausbeute an 7-Phenylacetamido-S-desacetoxycephalosporansäure-methylsulfonyläthylester ermittelt wurde. Die Ergebnisse sind aus Tabelle VIII ersichtlich.
Tabelle VIII
Mikroorganismus Ausbeute in mM an
erwünschtem Produkt
(Cephalosporinester)
Escherichia coli IFO-3450
Escherichia coli IFO-3470
Escherichia coli var.
communior IFO-3547		 94,8 mM
{19% theoretisch)
99,6 mM
(83# theoretisch)
82,8 mM
(69£ theoretisch)
Beispiel 5t
In einen Schüttelkolben mit einem Fassungsraum von 200 ml wurden' 20 ml Medium C eingebracht, die mit einer Öse Bacillus sp. ATCC-14552 oder Bacillus sp. IFO-12063 aus einer 2 Tage alten Schrägkultur beimpft und unter Schütteln bei 28° 24 Stunden lang kultiviert wurde. Jeder der entstandenen Kulturen wurde eine Lösung aus 160 mg TAG in 2,5 ml 0,5 M Citratphosphatpuffer (pH 6,0) und dann in 2,5 ml Methanol gelöster 7-ADCA-Methylester (ll4mg) zugegeben.
4098-24/1136 ·
Die Reaktion wurde .unter ständigem Rühren bei 37 16 Stunden lang fortgesetzt. Die im Reaktionssystem angesammelte Menge an 7-(2'-Thienylacetamido)-3-desacetoxycephalosporansäuremethylester betrug bei Einsatz von Bacillus sp. ATCC-14552 16,2 mM und bei Einsatz von Bacillus sp» IFQ-12063 15*8 mM. Die Bestimmung erfolgte durch Spektrophotometrie wie bei Anwendung von ß-Lactamase.
Beispiel 6? . .
In einen Schüttelkolben von 200 ml Fassungsraum wurden 40 ml Medium C eingebracht, die mit einer Öse Pseudomonas putida IFO-3537 oder Proteus rettgeri ATCC-9250 aus einer 2 Tage alten Schrägkultur beimpft und unter Schütteln bei 28° 24 Stunden lang kultiviert wurde. Die so kultivierten Zellen wurden abzentrifugiert und in 2 ml 0,2 M Citratphosphatpuffer (pH 6,0) suspendiert. Dieser Suspension wurden 2 ml einer ähnlichen Pufferlösung, welche 320 mM PAG und 160 mM 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester enthielt, zugegeben und die Mischung wurde unter Rühren bei 37° 16 Stunden lang umsetzen gelassene Dann wurden 12 ml Tetrahydrofuran zugegeben und die Zellen und unlöslichen Proteine abzentrifugiert. Schließlich wurde die Konzentration an ^-Phenylacetamido-S-desacetoxycephalosporansäure-methylsulfonyläthyl-ester in der entstandenen 75&Lgen wässerigen Tetrahydrofuranlösung durch Polarimetrie ermittelt. Die Ausbeute betrug bei Verwendung von Pseudomonas putida IFO-3537 44 mM, bei Verwendung von Proteus rettgeri ATCC-9250 36 mM.
Beispiel T.
10 ml einer 20&igen wässerigen Methanollösung mit einem Gehalt von 160 mM TAG und 80 mM 7-ADCA-Methylestex wurden mit 10 ml einer Suspension der gewaschenen Zellen von Escherichia cöli IFO-13502 in'0,5 M Citratphosphatpuffer (pH 6,0), her-
409824/1135-
gestellt nach Beispiel i, vereint, die Mischung wurde unter Rühren 3 Stunden lang bei 30° umgesetzt. Die durch Polarimetrie ermittelte Konzentration an 7-(2*-Thienylacetamido)-ß-desacetoxycephalosporansäure-methylester im Reaktionsqe- . misch betrug 28 mM. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 ml eines Gemisches aus Dichlormethanäthyläther (l : 3) beendet und das Reaktionsgemisch gut geschüttelt, um den gewünschten Cephalosporinester zu extrahieren. Der Extraktionsvorgang wurde unter Einsatz von 50 ml eines ähnlichen Lösungsmittels zwei weitere Male wiederholt, die Extrakte wurden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Dann wurde das Lösungsmittel bei einer Temperatur von nicht mehr als 35° abdestilliert. Der entstandene Rückstand wurde aus einer kleinen Menge Methanol-Wasser umkristallisiert, man erhielt 155 mg Nadelkristalle mit einem Schmelzpunkt von 196-198°, /W^ + 147° Cc = 0,5, in Methanol). NiZA(CDCl3) fe(ppm): 2,07(3H, s), 3,25(2H, q) , 3,75(3H, s), 3,77(2H, s), 4,87(1H, d), 5,67(lH, q), 6,72(lH, d), 6,90 (2H, d), 7,17(1H, t) (s:Singlett, d:Doublett, t: Triplett, q: Quartett).
Das Produkt wurde mit einer authentischen Probe mittels IR-urid NMR-Spektrometrie bestimmt,
Beispiel 8;
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 wurden in 10 ml 0,5M Citratphosphatpuffer auf das Vierfache der Konzentration der Kulturbrühe suspendiert.
Dieser Suspension wurden 10 ml einer 20/&igen wässerigen Methanol lösung mit einem Gehalt von'PAG (80 irW) und 7-ADCA-Kethylester (67,4 mM) zugegeben und die .Vdschung wurde bei 30° unter ständigem Rühren umgesetzt. Das nach 4 Stunden
409824/1135
erhaltene Reaktionsprodukt (V-Phenylacetamido-S-desacetoxy-, cephalosporansäure-ir.ethylester) wurde in einer Menge von 26,5 mM erhalten, was 79^ der Theorie entspricht. Die quantitative Analyse des Produktes wurde durch Spektrophotometrie wie bei Verwendung von ß-Lactamase durchgeführt.
Die Reaktion wurde nach 4 Stunden Inkubationszeit beendet und das Reaktionssystem gründlich mit 40 ml Tetrahydrofuran geschüttelt= Dann wurden die.Zellen und anderen unlöslichen Stoffe abzentrifugiert und die überstehende Schicht unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 35° eingeengte Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Methanol umkristallisierto Man erhielt Nadelkristalle von T-Phenylacetamido-S-desacetoxycephalosporansäuremethylester mit einem Schmelzpunkt von 191-193° [s7<£ + 23° ic = 0,5, in CH2Cl2), E J^n (260 imi) = 185O Das Produkt wurde mit einer identischen Probe durch IR-= und NMR-Spektrometrie .bestimmte
Beispiel 9s . .
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zeilen von Eschexichia coli IFO-13502 wurden in 20 ml destilliertem Wa'sser auf das Zehnfache der ursprünglichen Kulturbrühe konzentrierto' Dieser Suspension wurden 20 ml einer 20^igen wässerigen Methanollösung mit einem Gehalt von 320 mM TAG und 160.mM 7-ACA-ltflethoxymethylester zugegeben, das System wurde bei 28° umgesetzt und der pH-Wert mittels pH-Stat auf 6,0 gehalten» Nach 4 Stunden betrug die Anhäufung von gewünschtem Cephalosporinester im Reaktionsgemisch 61 mMe Die quantitative Analyse wurde mitteis Spektrophotometrie wie bei Anwendung von ß-Lactamase durchgeführte Dann wurden dem Reaktionsgemisch 120 ml Tetrahydrofuran zugegeben, um das· Produkt vollständig zu lösen, und die Zellen und anderen unlöslichen Materialien abfiltriert* Die entstandene überstehende Schicht wurde unter vermindertem Druck bei e'iner
409824/1135.
Temperatur von nicht mehr als 30° eingeengt und der entstandene kristalline Rückstand wurde abfiltriert, mit V/a sr, er gewaschen und aus Methylenchlorid und Äther umkristallisiert. Man erzielte auf diese Weise eine Ausbeute von 203 inq 7-(2'-ThienylacetamidoJ-cephalosporansäure-methoxymethylester mit einem Schmelzpunkt von 158-159° /ä/S5 + 28° (c = 0,5, in CH2Cl2), ET* (260 πω) * 162. Das Produkt wurde mit einer authentischen Probe durch IR- und NMR-Spektromctrie bestimmt.
Beispiel 10:
In vier Schüttelkolben von 200 ml Fassungsraum wurden je 25 ml Medium B eingebracht, mit einer Öse Escherichia coli IFO-3450 aus einer 2 Tage alten Schrägkultur beimpft und unter Schütteln bei 24° 24 Stunden lang kultiviert. Dann wurden die Zellen aus den vier Kulturbrühen abzentrifugiert und in 10 ml 0,2 M Citratphosphatpuffer (pH 6,0) suspendiert. Dieser Suspension wurden 10 ml 0s2 M Citratphosphatpuffer mit einem Gehalt von 160 mM Phenylacetamid und 80 mM 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester zugegeben. Das System wurde unter Rühren bei 37° 16 Stunden lang umgesetzt. Die Ausbeute betrug 24,2 mM 7-Phenylacetamido-3-desacetoxycephalospoxansä'ure-methylsulfonyläthylester.
Beispiel 11t
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 wurden in 10 ml 0,5 M Citratphosphatpuf fer (pH 6,0) auf eine zehnfache Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe suspendiert. Der entstandenen Suspension wurden 10 ml einer 20^igen, wässerigen Methanollösung mit einem Gehalt von TAG (160 mM) und 7-ACA-Acetonylester (80 mM) zugegeben und die Mischung wurde unter Rühren bei 30° umgesetzt. Nach 4 Stunden hatten sich 20,5 mM Cephalosporinester im Reaktionsgemisch angesammelt. Dann wurden 40 ml Tetrahydrofuran zugegeben und nach gründlichem
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Schütteln wurden die Zellen und anderen unlöslichen Stoffe abzentrifugiert. Die überstehende Schicht wurde unter vermindertem Druck und niedriger Temperatur eingeengt. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Methanol-Äther umkristallisiert« Die Ausbeute betrug 128 mg 7-(2'-Thienylacetamidoj-cephalosporansäureacetonylester. Dieses Produkt wurde mit einer authentischen Probe durch IW.R- und\ IR-Spektrometrie bestimmt.
Beispiel 12; -
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 wurden in 10 ml 0,5 M Citratphosphatpuffer (pH 6,0) in einer zehnfachen Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe suspendiert, dann wurden 10 ml einer 20^igen wässerigen Methanollösung mit' einem Gehalt von TAG (120 mM) und 7-ACA-Diphenylmethylester (60 mM) zugegeben. Die Mischung wurde unter Rühren bei 30° reagieren gelassene Mach 4 Stunden betrug die im Reaktionssysteni angesammelte Menge an Cephalosporinester 18,5 mM. Diesem Reaktionsgemisch wurden 40 ml Tetrahydrofuran zugegeben . und die Zellen und anderen unlöslichen Stoffe wurden nach gründlichem Schütteln abzentrifugiert. Die überstehende Schicht wurde bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck eingeengt. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert. Man erhielt 105 mg 7-(2!-Thienylacetamido)-cephalosporansäure-diphenylmethylester mit einem Schmelzpunkt von 61-63°, Jj^Ji? 0° (c=0,5, CH2Cl2), E^m (260 mjj) = 136. Dieses Produkt wurde mit einer authentischen Probe durch NMR- und IR-Spektrometrie bestimmt.
Beispiel 13: . " " * -
Es wurden 20 ml einer wässerigen Lösung (eingestellt auf einen pH-Wert von 6,0) mit einem Gehalt von 480 mM TAG und 240 mM 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester hergestellt. Inzwi-
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sehen wurden die nach Beispiel 1 hergestellten, gewä schmen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 in 20 ml destilliertem Wasser in'der zehnfachen Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe suspendiert. Die Suspension wurde der oben angeführten Lösung zugegeben und das Gemisch wurde bei 37 reagieren gelassen, der pH-Wert wurde während der Reaktion mittels pH-Stat durch Zugabe von 2N HCl auf 6,0 gehalten. Nach 5 Stunden hatten sich im Reaktionssystem 86,4 rri.l Cephalosporinester angesammelt. Diese Menge wurde polarimetrisch ermittelt.
Die Reaktion wurde nun beendet und das Reaktionsgem.isch mit 200 ml Tetrahydrofuran versetzt, um das Produkt zu lösen. Dann wurden die Zellen und anderen unlöslichen Stoffe abfiltriert. Das entstandene Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 35 eingeengt und die ausgefällten Kristalle wurden abfiltriert. Die Kristalle v/urden dann aus iMethanol-Äther umkristallisiert, man erhielt 1,26 g 7-(2l-Thienylacetamido)-3-desacetoxycephalosporansäure-methylsulfonyläthyl-esterj Fp: 137-139°, 5
(c = 0,5, in 75/0 v/ässer. Tetrahydrofuran),
Elcm *260 T^ = 175» Nm(CDCl3) &(ppm): 2,13(3H, s), 2,94 (3H, s), 3,33(2H, d), 3,38(2H, t) , -3,83(2H, s) , 4,65(2H, q), 4,95(1H, d), 5,73(1H, q), 6,67(lH, d), 6,98(2H, d), 7,25 (IH, t).
Beispiel 14;
In 7 1 O,1M Tris-Salzsäurepuffer mit einem pH-Wert von 8,0 wurden 2700 g (Naßgewicht) nach Beispiel 1 hergestellter, gewaschener Zellen von Escherichia coli IFO-13502 suspendiert. Dann wurden die Zellen mittels Ribi Cell Fractionator, Sorval, Modell RF-I unter 15.000 pounds per square inch · fraktioniert. Dem entstandenen Rohextrakt wurden 17,3 g MgSO4.7H2O (Endkonzentration 10 πύί) und 3,5 mg D-Nase-I (Sigma, Endkonzentration 0,5 jug/tnl) zugegeben, das System
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■■j ;■;*-'
wurde bei 5 3 Stunden lang gerührt« Dann wurden 282 g Ca(CH3COO)2OhUO in Pulverform zugegeben und gelöst«, Anschließend wurde eine Lösung aus. 279 g K2HPO4'5,n 800 ml reinem Wasser allmählich zugetropft, um die Bildung von Calciumphosphatgel im Rohextrakt zu bewirken, das System wurde sofort zentrifugiert« Die entstandene überstehende -· Schicht von 799 Γ wurde mit !Obiger Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellt und der entstandene Niederschlag abzentrifugiert, der pH-Wert .wurde darauf mit wässerigem Ammoniak auf 7,5 eingestellt0 Dann wurde der Lösung Ammoniumsulfatpulver bis zur 60/bigen Sättigung zugegeben, der Niederschlag wurde abfiltriert, in einer kleinen Menge reinen Wassers gelöst und gegen reines Wasser dialysiert» Das entstandene Dialysat von I9I 1 wurde über Diäthylaminoäthyl-Zellulose geleitet (pH 8S5, O5I M Tris-Puffer) und das adsorbierte, cephalosporin-bildende Enzym wurde mit O5OI M Tris-HCl-Puffer (pH 8S5) mit einem Gehalt von O0OSM NaCl eluierta Die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt-«, gegen reines V/asser dialysiert und dann lyophilisiert, man erhielt 730 mg Enzympräparato
Nachstehend wird ein Beispiel für die Heistellung des Cephalosporinesters unter Einsatz des oben beschriebenen Enzympräparates gegebene
20" mg des oben angeführten Enzympräparates wurden einer wässerigen Lösung von 20 ml (pH 6,0) mit einem Gehalt von 160 mM TAG und "80 mM 7-ADCA-Methylsulfonyäthylester zugegeben, das Gemisch wurdet Stunden lang bei 37° umgesetzt, während der Reaktio η wurde der pH-Wert mittels pH-Stat durch Zugabe von 2N HCl auf 6s0 gehalten« Es wurde gefunden, daß .sich während dieser Reaktionszeit 58,2 mM 7°(2s->Thienylaeetamidoi-S-desacetoxycephalosporansäure-methylsulfonyläthyleste'r angesammelt hatten«, Die quantitative Bestimmung erfolgte mittels Polarimetrie„
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Beispiel ISi
Das nach Beispiel 14 hergestellte cephalosporir.ester-bildende Enzym wurde chemisch an ein wasserunlösliches Harz gebunden, um ein wasserunlösliches Enzympräparat herzustellen, mit welchem Cephalosporinester erzeugt wurde. Zur Bindung von cephalosporinester-bildenden Enzymen an wasserunlösliche Harze sind verschiedene Verfahren bekannt. Nachstehend wird das unter Einsatz von Azid durchgeführte Insolubilisierungsverfahren beschrieben»
In 400 ml Methanol wurden 50 g Carboxymethylcellulose (Whatman CM-II) suspendiert, während des Abkühlens der Suspension auf -IO bis -20° wurden 100 ml Thionylchlorid zugetropft. Die Reaktion wurde über Macht unter Eiskühlung und dann 3 Tage bei Raumtemperatur fortgesetzt» Der entstandene Methylester wurde abfiltriert,.mit Methanoi, Aceton und Äther gewaschen und getrocknet (Ausbeuteι 41 g). Dann wurde dieser Methylester in 500 ml Methanol suspendiert und mit 100 ml Hydrazinhydrat versetzt. Die Mischung wurde bei 65° 3 Stunden lang am Rückfluß gekocht und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen® Das entstandene CMC-Hydraζid wurde mit Methanol und Äther gewaschen und getrocknet (Ausbeute ί 39,3 g), 3 g des CMC-Hydraζids wurden einem Gemisch von 150 ml 2%iger Salzsäure und .30 ml Seigern Netriumnitrit zugegeben und das Gemisch wurde bei 4° 30 Minuten umgesetzt. Das Produkt wurde abfiltriert und zweimal mit 200 ml kaltem Dioxan gev/aschen. Dann wurde, durch Zugabe von 200 ml kaltem Wasser CMC-Azid erhalten« 1 g des CMC-Azids wurde in 5 ml 0,05M Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert und eine Lösung von 100 mg des cephalosporinester-bildenden, nach Beispiel 14 hergestellten Enzyms in 10 ml einer ähnlichen Pufferlösung zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 5° umgesetzt. Das entstandene Produkt wurde abfiltriert, gut mit 0t2M.wässerigem Glycin und mit O1SM wässeriger Natriumchloridlösung gewaschen. Dann wurde sein Gehalt an
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= 37-
2360265 cephalosporinf-bildendem Wirkstoff bestimmt. Es wurde gefunden, daß 12Jo des Wirkstoffs der Enzymprobe an die CMC gebunden worden waren. Die gesamte Menge des so erhaltenen wasserunlöslichen Enzyms wurde in 20 ml 0,2Ni Citratphosphat-Puffer (pH 6,0) und einer Lösung von 160 mM TAG und 80 mM 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester in 20 ml einer ähnlichen Pufferlösung suspendiert. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei 37° unter ständigem Rühren umgesetzt, man. erhielt 28,2 mM 7-(2'-Thienylacetamido)-3=desacetoxycephalosporansäuremethylsulfonyläthylestero Diese Menge wurde mittels Polarimetrie bestimmt,,
Beispiel 16s
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia eoli IFO-13502 wurden in 10 ml O9SM Citratphosphatpuffer in einer zehnfachen Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe suspendiert, dann wurden 10 ml eines ähnlichen Puffers mit einem Gehalt von 160 mM TAG und 80 mM 7-Amino=3-(2M-pyridylthiomethyl)~3~cephem-4»carbonsaur^methoxymethylester zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37 4 Stunden lang unter ständigem Rühren umgesetzt, man erhielt 24 mM 7-(2l-Thienylacetamido)-3-=(2I!-pyridylthiomethyl)~3-cephem-4-carbonsäuremethoxymethylestere Diese Menge wurde durch Polarimetrie ermittelt.
Beispiel 17s . .
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 wurden in 10 mi O8S M Citratphosphatpuffer in der zehnfachen Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe suspendiert, dann wurden 10 ml eines ähnlichen Puffers mit einem Gehalt von 160 mM TAG und 80 mM 7-Amino-3-/68 e~(3l!~methylpyridazinyl)-thiomethyj7-4-methoxymethoxycarbonyl-3-cephem-2!'-oxid zugegeben« Die Mischung wurde unter Rühren bei 37° 4 Stunden lang umgesetzt. Während dieser Zeit scmmelten sich im Reaktions-
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system 22 mM 7-(2l-Thienylacetamido)'-3-/ö"-(3M-methylpyridazinyl)-thiomethyl7-4-rr.ethoxymethoxycarbony l-3-cephem- 2"-öxid an. Die quantitative Bestimmung erfolgte mittels Polarimetrie.
Beispiel 18:
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 wurden in 10 ml 0t5M Citratphosphatpuffer in einer zehnfachen Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe suspendiert, dann wurden 10 ml einer ähnlichen Pufferlösung mit einem Gehalt von 160 mW TAG und 80 mM 7-Amino-3-/6"-(3"-methoxypyridazinyl)-thiomethyl.7-4-methoxymethoxycarbonyl-3-cephem-l"-oxid zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren bei 37 4 Stunden lang umgesetzt, man erhielt 27 mM 7-(2!-Thienylacetamido)-3-/S"-(3"-rnethoxypyridazinylJ-thiomethyiy-^-methoxymethoxycarbonyl-S-cephemlM-oxid. Die quantitative Bestimmung erfolgte mittels Polarimetrie.
Beispiel 19t
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 wurden in 10 ml 0,5M Citratphosphatpuffer in der zehnfachen Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe suspendiert. Dann wurden 10 ml einer ähnlichen Pufferlösung mit einem Gehalt von 160 mM TAG und 80 mM U-/j-Amino-4-methoxymethoxycarbonyl-3-cephem-3-ylmethyl7-pyridin zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37° unter ständigem Rühren 4 Stunden lang reagieren gelassen, nach Ablauf dieses Zeitraums hatten sich im Reaktionsgemisch 21 mM N-/7-(2'-Thienylacetamido)-4-methoxymethoxycarbonyl-3-cephem-3-ylmethyl7-pyridin angesammelt. Die quantitative Bestimmung erfolgte mittels Polarimetrie.
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Beispiel 20s
Die wie in Beispiel 1 hercrstellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 wurden in 2 ml O,2M Phosphatpuffer in einer zwanzigfachen Konzentration der ursprünglichen .Kulturbrühe suspendiert, dann wurden 2 ml einer 0,2M Phosphatpufferlösung mit einem Gehali von 160 mM 7-ADCA-MethyIsulfο-nyläthylester und 320 ml\'« 0-(p-Hydroxyphenylacetyl)-glykolsäure zugegeben. Das Gemisch wurde unter ständigem Rührenbei 37° 16 Stunden lang umgesetzte Der so entstandene Cephalosporinester und der nicht umgesetzte 7-ADCA-Ester wurden mit 180 rnM NaOH bei 25° und einem pH-Wert von 10,0 in die entsprechenden Säuren umgewandelte Das Gemisch wurde mit ß-Lactamase5hergestellt aus Aerobacter cloaceae XFO-12937, wie in. Bezugsbeispiel 1 beschrieben behandelt, dann wurde die Cephalosporinkonzentration mittels Spektrophotometxie festgestellt» Es hatte sich eine Menge von 118 mM 7-(p-Hydroxyphenylacetamido)-3-desacetoxycephalosporansäüre-methylsulfonyläthylester im Reaktionssystem angesammelte
Beispiel 21s "
Es wurde ähnlich,, wie in Beispiel 20 beschrieben vorgegangen, unter Einsatz der Zellen von Proteus- rettgeri ATCC-9250 statt Escherichia coli IF0=13502o Man erhielt auf diese Weise 9 mM 7= (p-Hydroxyphenylacetamido) = 3'=-desacetoxycephalospor ansäur emethylsulfonyläthylestero ·
Beispiel 22s
Zu 20 ml einer nach Beispiel 5 hergestellten Kultur von Bacillus sp« ATCC-14552 wurden 164 mg Phenylessigsäureäthylester, gelöst in 2„5 ml Methanol, und 178 mg 7~Amiho-3-desacetoxycephalosporansäure=methylsulfonylathylester-hydrochlorid, gelöst in 2,5 ml O9SM Phosphatpuffer (pH 8,0) gegeberu Der pH-Wert der Mischung wurde mit 5N NaOH auf 8,0 eingestellt, sie wurde unter ständigem Rühren bei 37° 24. Stunden
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lang umgesetzt. Man erhielt 12,3 mM 7-Phenylacetamido-3-desacetoxycephclnsporansäure-methylsulfonyläthylester. Die quantitative Bestimmung wurde mittels Spektropnotometrie wie bei Verwendung von ß-Lactarr.ase durchgeführt.
Beispiel 23;
Die nach Beispiel 1 hergestellten, gewaschenen Zellen von Escherichia coli IFO-13502 wurden in 0,5M Phosphatpuffer in einer zwanzigfachen Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe suspendiert. Zu 5 ml dieser Suspension wurden 5 ml 0,5M Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0) mit einem Gehalt von 160 mM Phenylacetamid und 80 mM 7-Afnino-3-desacetoxycephalosporansäure-methylsulfonylMthylester gegeben und die Mischung wurde bei 37° 24 Stunden lang umgesetzt. Man erhielt 22,5 mM 7-Phenylacetamido-3-desacetoxycephalosporansäure~methylsulfonyläthylester. Die Menge wurde durch Polarimetrie ermittelt.
Beispiel 24t
Die ähnlich wie in Beispiel 6 beschriebenen hergestellten Zellen von Proteus rettgeri ATCC-9250 wurden aus 40 ml ihrer Kuiturbrühe abzentrifugiert und in 2 ml 0,2M Citratpuffer (pH 6,0) suspendiert. Der Suspension wurden 2 ml einer ähnlichen Pufferlösung mit einem Gehalt von 320 mM S-Phenylacetylthioglykolsäure und 160 mM 7-Amino-3-des3cetoxycephalosporansäure-methylsulfonyläthylester zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37° unter Rühren 24 Stunden lang umgesetzt. Man erhielt eine polarimetrisch ermittelte Menge von 57 mM 7-Phenylacetamido-3-desacetoxycephalosporansäuremethylsulfonyläthyiester,
Beispiel 25;
Zu 20 ml einer nach Beispiel 5 hergestellten Kultur von Bacillus sp. IFO-12063 wurden 5 ml 0,2M Glycin-NaOH-Puffer
. , 409824/1 135 ·
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(pH 9,0) mit einem Gehalt von 400 αύΛ Phenylacetylene in und 2CC ITjVi. 7- Amino- 3-ce sa ce toxycepha los por a nsäure-methyle s te r
gegeben."Der pH-Wert der Mischung wurde auf 9,3 eingestellt und sie wurde unter Rühren bei 37° 24 Stunden lang umgesetzt. Man erhielt eine polarimetrisch ermittelte Menge von 16 mM 7-Phenylacetamido-3-desacetoxycephalosporansäure-methylester.
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Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    Verfahren zur Herstellung eines Cephalosporins der allgemeinen Formel
    , (D
    COOR3
    worin R ein ungesättigter, sechsgliedriger, carbocyclischer Ring oder ein fünfgliedriger, heterocyclischer Ring ist, wobei die Ringe gegebenenfalls nicht weiter substituierte Substituenten aufweisen, R Wasserstoff oder einen unsubstituierten Substituen
    ten, Wa ssi
    Schwefel oder Stickstoff gebundene Gruppe, und
    R Wasserstoff oder eine organische, über Sauerstoff,
    3
    COOR eine leicht in COOH umwandelbare Gruppe bedeuten,
    dadurch gekennzeichnet, daß ein Derivat einer organischen Säure der allgemeinen Formel
    R1
    R-CH-COOH , (II)
    worin R und R die oben angeführte Bedeutung haben, mit 7-Aminocephem-4-carbonsäureester der allgemeinen Formel
    CH2R2 , (III) . COOR3
    2 3
    worin R und R die oben angeführte Bedeutung haben, in Gegenwart einer Kultur oder eines aus dieser Kultur aufgearbeiteten materials eines Mikroorganismus einer der Gat-
    409824/1135 ·
    tungen Escherichia, Bacillus, Proteus und Pseudomonas, wel-, eher fähig ist, ein Cephalosporin der Formel (I) aus eir.err. Derivat der organischen Säure der Formel (II) und 7-Aminocephem-4-carbonsäureester der Formel (III) zu bilden, umgesetzt wird« .
    2o Verfahren nath Anspruch I9. dadurch gekennzeichnet, daß als Derivat der organischen Säure der Formel (II) ein solches verwendet wird, welches in einem wässerigen Medium in Gegenwart einer Kultur oder eines aus dieser' Kultur verarbeiteten Materials des eingesetzten Mikroorganismus hydrolysiert werden kann, um die organische Säure der Formel (II) zu erhalteno
    3o .Verfahren nach Anspruch I9 dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)' einsetzt, -in der Rx für Wasserstoff, Hydroxyl oder Haloqene R für Wasserstoffs Alkoxy, Alkylcarbonyloxy,, Pyridylthio, Pyridinium, Alkylthiocarbonyloxy, Dialkylaminothiocarbonylthio, Alkylammonium, -N39 Aralkyloxycarbonylamlno oder Pyridazlnylthio-N-oxid und R^ für Halogenalkyl, Alkyl=(oder Aryl)-. sulfonylalkyl, Alkyl, Alkoxyalkyl, Alkylcarbonylalkyl, Diarylthioalkyl oder Alkyl=(oder Aryl)-sulfinylalkyl stehen.
    4o Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
    daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (ll) einsetzt,
    1 ■ "2 ·■
    In der R für Wasserstoff, Hydroxyl oder Halogen, R für Wasserstoff, Alkoxy, Alkylcarbonyloxy, Pyridylthio, nium, Alkylthiocarbonyloxy, Dialkylaminothiocarbonylthio, Alkylammonium, -N3, Aralkyloxycarbonylamlno oder Pyridazlnylthlo-N-oxid und R3 für Haiogenalkyl, Alkyl- (oder. Aryl)-sulfonylalkyl, Alkyl, Alkoxyalkyl, Alkylcarbonylalkyl, Diarylthioalkyl oder Aikyi-(oder Aryl)-.. . sulf inylalkyl stehen.
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    5. Verfahren n=!ch Anspruch ^1, fadurch gekennzeichnet, riaS als Derivat der organischen Säure -Acr Forrr.el (II) ein Aminosäureester, ein Glykolsäureester, ein Thioglykolsäureester, ein Amid oder ein Alkylester derselben eingesetzt wird.
    6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da<3 als !Mikroorganismus Escherichia coli verwendet wird*
    7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, däS als Mikroorganismus Escherichia coli IFO-35^2, Escherichia coli ATCC-9637, Escherichia coli var. comrnunior IFO-3547, Escherichia coli var. communior IFO-3548, Escherichia coli IFO-13502, Escherichia coli IFO-3470, Escherichia coli IFO-3450, Bacillus sp. IFÖ-12063, Proteus rettgeri ATCC-9250 oder Pseudomonas putida IFO-3537 verwendet wird.
    8. Verbindunq, dadurch qekenn^ichnet, daS sie 7-(2'-Thienyl3cetamido)-3-/6ll-(3"-methoxypyridazinyl)-thioinethyl/-4-methoxymethoxyc3rbonyl-3-cepnefr-l"-oxid und 7-(2f-Thienylacetamido)-3-/6"-{3H-methylpyrid3zinyl)-
    thiomethyl/-4-niethoxymethoxycarbonyl-3-cephern-2u-öxid ist. . ■
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