DE1803987A1

DE1803987A1 - Neues,physiologisch wirksames Peptidolipid und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1803987A1
Application number: DE19681803987
Authority: DE
Inventors: Kei Arima; Atsushi Kasinuma; Gakuzo Tamura
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1967-10-21
Filing date: 1968-10-19
Publication date: 1969-06-26
Also published as: US3687926A; GB1226589A; FR7981M; NL6815030A; NL155593B

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHONWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH i 000007

KÖLN h DEICHMANNHAUS

Köln, den 17.10.1968 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries. I>td.,

27, Doshomachi 2-ohome, Higashi-ku, Oaaka (Japan).

Neues, physiologisch wirksames Pepfcidolipid und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues, physiologisch wirksames Peptidolipid, das als "Surfactin" "bezeichnet wird, und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Der Erfindung liegen die folgenden Feststellungen zu Grunde:

1) Es gibt gewisse von der Anmelderin gefundene Mikroorganismen, die die neue physiologisch wirksame Substanz zu bilden vermögen.

2) Diese Mikroorganismen gehören zur Gattung Bacillus,

3) Die physiologiseh wirksame Substanz wird in einem Medium angereichert, in dem die Mikroorganismen kultiviert werden.

4) Die so angereicherte Substanz kann in gewünschter Reinheit aus der Kulturbrühe nach an sich bekannten Methoden isoliert werden.

5) Die Substanz hat ein ungewöhnlich große Zahl von physiologischen Wirkungen.

Wie bereits erwähnt, ist die neue Substan« als. "Surfactin" bezeichnet worden. Diese Bezeiehnung wird nachstehend in der Beschreibung verwendet*

»09826/1416

Surfaotin wird gemäß der Erfindung hergestellt, indem ein Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört und Surfactin zu bilden vermag, in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und verwertbare Stickstoffquellen und andere Hährstoffe enthält, kultiviert und das Surfactin aus der Kulturbrühe abgetrennt wird.

Die Mikroorganismen, die sich als besonders wirksam erwiesen, sind zur Gattung Bacillus subtilis gehörende Stämme. Kulturen dieser Stämme sind beim Institute For Fermentation Osaka, Japan, unter der Hinterlegungsmwmer IFO 5035 und beim Institute of Applied Microbiology of the University of Tokyo, Tokyo, Japan unter den Hinterlegungsnummern IAM 1069, IAM 1213, IAM 1260 und IAM 1259 hinterlegt worden.

Die mikrobiologischen Eigenschaften !liegen nicht allgemein fest. Natürlich gibt es zahlreiche Mutanten und Varianten von Mikroorganismen, die Surfactin bilden· Von den Mutanten und Varianten können ohne Rücksicht darauf, ob die Variation oder Mutation natürlich oder künstlich beispielsweise durch Behandlung mit Röntgenstrahlen, Ultraviolettlicht oder durch Einwirkung chemischer Reagentien, z.B. Stickstofflost, hervorgebracht wurde, alle für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, solange sie Surfactin bilden.

Die Zusammensetzung des Mediums ist nicht entscheidend wichtig, solange der das Surfactin bildende Mikroorganismus darauf wachsen kann. Es kann beispielsweise als Kohlenstoffquellen Glucose,-Glycerin, Stärke, Saccharose usw. und ' als Stickstoffquellen organische oder anorganische stickstoffhaltige Materialien, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenkuchen, Maisquellwasser, Harnstoff, Ammoniumsalze, nitrate u.dgl. enthalten. Anorganische Salze, z.B. die verschiedenen !Phosphate, Magnesiumsulfat und Natriumchlorid, können ebenfalls nach Belieben dem Medium zugesetzt werden. Ferner können zur Förderung des Waohstums des Mikroorganismus verschiedene Vitamine sowie Nucleinsäuren und ihre verwandten Verbindungen in das Medium eiribe-

909Ö26/U16

_ 3 —

zogen werden·

Je nach den Kultivierungsmethoden und -Bedingungen können Fälle auftreten, "bei denen der Zusatz von Schaumverhtttungs- ■ mitteln, z.B. eines Siliconharzes, Sojabohnenöl usw., für eine verstärkte Anreicherung von Surfactin günstig ist.

Das Medium kann fest oder flüssig sein, jedoch ist es im allgemeinen vorzuziehen, in einem flüssigen Medium unter Schütteln oder Belüftung zu arbeiten.

Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, Fermentationsdauer und p_H-Wert des Mediums, werden so gewählt, daß die Bildung von Surfactin maximal ist. In vielen Fällen ist es jedoch zweckmäßig, eine aerobe Kultivierung bei 20-40 0 wenigstens etwa 10 Stunden vorzunehmen, wobei das Medium während der gesamten Kultivierungsdauer bei p_H 6,0 bis 9,0 gehalten wird.

Surfactin wird in der Kultur eines diese Substanz bildenden Mikroorganismus angereichert. Das so gebildete Surfactin wird aus der Kulturbrühe dieses Mikroorganismus nach beliebigen Methoden, die für die Gewinnung von mikrobischen Metaboliten in gewünschter Reinheit üblich sind, abgetrennt.

Bei Verwendung eines flüssigen Mediums wird Surfaotin hauptsächlich in der Flüssigphase gefunden. Es ist daher zweckmäßig, die Zellen durch Filtration oder Zentrifugieren zu entfernen und dann das Surfactin vom Filtrat bzw. aus der oben stehenden Flüssigkeit zu isolieren. Es ist jedooh auch möglich, Surfactin direkt aus der Kulturbrühe ohne vorherige Entfernung der Zellen zu isolieren.

Die Abtrennung und fieinigung von Surfactin aus der Kultur kann leicht durch eine geeignete Kombination von verschiedenen verfügbaren Methoden, bei denen die physikalischchemischen Eigenschaften von Surfaotin ausgenutzt werden, vorgenommen werden. Geeignet zu diesem Zweck sind beispielsweise die Sedimentation des Endprodukts mit einer

909826/ U16

anorganischen Säure, z.B. Schwefelsäure oder Salzsäure, oder mit einer zweiwertigen Metallverbindung, z.B. Calcium, Sedimentation mit 5O#iger Sättigung mit Ammoniumsulfat, Extraktion des Endprodukts mit einem organischen lösungsmittel, das mit Wasser sohwer mischbar ist, z.B. Äther oder Äthylaoetat, Löslichmaohung des Endprodukts mit einem Lösungsmittel von hoher Polarität, z.B. Aceton oder Alkohol, Entfernung der Verunreinigungen mit einem Lösungsmittel von niedriger Polarität, z.B. Petroläther oder Hexan, Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Dextranperlen (erhältlich als "Sephadex", Hersteller Pharmacia Company, Schweden), lonenaustauschchromatographie an einem Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthyloellulose oder Diäthylaminoäthyl "Sephadex", AdsorptionsChromatographie beispielsweise mit Aktivkohle, Siliclumdioxyd usw. und Entfernung der Verunreinigungen durch Dialyse mit einer Zellophanmembran.

Durch Anwendung einer geeigneten Kombination der vorstehend genannten Methoden kann Surfaotin aus der Kulturbrühe in kristalliner Form isoliert werden. Das so erhaltene Surfactin hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften»

Physikalisch-chemische Eigenschaften

1) Farbe und Form der Kristalle» weiße Nadeln.

2) Schmelzpunkt der Kristalle» 137-14O⁰C.

3) Typisohe Elementaranalyse» 60,5 + 1»0# C, 9,0 + 0,5$ H, 9,3 + Ο,59έ Nj S und P nicht nachgewiesen.

4) Molekulargewicht» 1050 + 50 (gemessen nach der Dampfdruckmethode in Aoeton).

5) Spezifische Drehung» ß.J^ «* +40° + 4° (Chloroform,^)

-39° + 4°(Methanol, I96)

6) Ultraviolettabsqoriition» Zwischen 230 und 400 mx ist kein bedeutsames Absorptionsmaximum vorhanden·

909826/U16

7) Infrarotabaorption von Kristallen aus Aoeton-Wasser: In 3?ig.1 dargestellt. Die hauptsächlichen Absorptionsbanden mit einer KBr-Scheibe liegen wie folgt (Wellenlänge in ft 2,97, 3,34, 3,37, 5,74, 6,04, 6,51, 6,80 und 7,20.

8) Komponenten: Bei der Hydrolyse in 6n-Salzsäure bei 110⁰O für 20 Stunden werden L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, L-Valin, L-Leuoin und D-Leucin im Verhältnis von 1:1:1:2:2 nachgewiesen. Gleichzeitig werden 24 bis 259έ der ursprünglichen Kristalle als gelbbraune ölige Substanz frei, die in Salzsäure unlöslich und in A'ther oder Petroläther löslich ist. Die ölige Substanz stammt aus 1 Mol eines Fettsäureanteils des Surfaotins.

9) Farbreaktionen: Negativ in der Ninhydrinreaktion und positiv in Biuret-Reaktionen.

10) Löslichkeit: in Wasser und Mineralsäuren unlöslich, in alkalischem Wasser, Aceton, Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol·, Isobutanol, tert.-Butanol, Äthylaoetat, Chloroform, Methylenc.hlorid, Dioxan, Benzol, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und Eisessig löslioh. Unlöslich oder sohwer löslich in Tetraohlorkohlenetoff, Petroläther, Ligroin, Brdölbenzin, Hexan und Oyolohexan. In Äther löslioh, fällt jtdoch allmählioh aus und wird zuweilen ein G-el. Ausgefällt aus einer wässrigen alkalischen Lösung von Ammoniumsulfat mit 50#iger Sättigung oder naoh Zusatz .einer Verbindung eines zweiwertigen Metalls, wie Cadmium, Kupfer, Zink, Eisen, Kobalt, Nickel, Mangan, OaIoium, Magnesium oder Quecksilber·

11) Stabilität: Bleibt im wesentlichen unverändert, wenn es 30 Minuten bei Pg 7 biß 9 und 120⁰C stehen gelassen wird.

12) Das mit der Ultrazentrifuge ermittelte Sedimentationsge sohwindigkeits-Dlagraum zeigte für eine Lösung von Surfaotin in einem Oarbonatpuffer (0,1-molar, Pg 9,0) bei Verwendung einer eynth'e tischen Grenafläohenielle einen

909826/1416

einzelnen Peak für Surfactin. Die Sedimentationskonstante, "berechnet aus der Sedimentationsgeschwindigkeit des Peaks "beträgt etwa 1 S.

, 13) Gelfiltration an einer Sephadex-Säule: Bei Auflösung in einem Carbonatpuffer (0,1-molar, p_H 9,0) und Aufbringung auf eine Sephadex G-50-Säule läuft es duroh und ist in der vorderen Fraktion enthalten.

14) Dialyse: Dialysiert nicht durch eine Gellophanmembran,

W Die physiologischen Wirksamkeiten von Surfactin werden nachstehend ausführlich "beschrieben.

1) Inhibierung der Fibrinogen-Thrombin-Reaktion?

Fibrinogen, ein Plasmaprotein, das eine wichtige Rolle bei der Koagulierung des Bluts spielt, wird unter der . enzymatisohen Wirkung von Thrombin in gelatinöses Fibrin umgewandelt. Während die Anwensenheit dieses Reaktionssystems von lebenswichtiger Bedeutung für einen lebenden Organismus ist, führt eine Überaktivität dieses Reaktionssystems zu ernsten Symptomen, z.B. Thrombose oder Embolie. Surfactin verhindert die durch Thrombin katalysierte Bildung von Fibringelen und macht die schon gebildeten Fibringele löslich.

Tabelle 1
Surfaotingehalt, ng/ml Koagulierungszei-fe, Sekunden

O 20

10 ' 26

25 37

50 54

.75 72

100 95

150 * 130-135

200 170-190

_ßAD ORIGINAL

000026/1416

Surfaotin wird in unterschiedlichen Konzentrationen zu einem 0,02-molaren Üjris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer, p_H 7»4) gegeben, der 0,145 Mol Natriumchlorid und 0,5$ Fibrinogen enthält. Hierzu werden 5 Einheiten (Einheiten gemäß dem japanischen Arzneibuch)/ml (Endkonzentration) Thrombin gegeben. Die Koagulierungszeit wird bei 57⁰O gemessen·

2)Surfaotin inhibiert speziell das stationäre Wachstum von Mikroorganismen, die zur Gattung Myoobaoterium gehören, in Bouillon. Die hemmenden Mindestkonzentrationen von Surfactin gegen verschiedene Bakterienstämme bei den oben genannten Waohstumsbedingungen sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Stamm Hemmende Mindestkon-. ; zentration» jag/ml

Bacillus subtilis IAM-1026 >500

Staphylococcus aureus IAM-1011 > 500

Esoheriohia coli B >500

Escheriohia ooli K-12 >500

Proteus vulgaris IFO-3045 >500

Pseudomonas aeruginosa IAM-1215 >500

Serratia maroesoens IAM-1023 >500

Mycobacterium avium IIPO-3082 10

Mycobacterium phlei IFO-3158 5

Myoobacterium sjmegmatis IFO-3083 10

Myoobaoterium 607 SM-F 5

Gemessen nach der Flüssigkeitsverdünnungsmethode in Bouillon.

3) Surfaotin inhibiert nioht das Waohstum von Triohophyton mentagrophytes, eines pathogenen Fungus, der für dit Dermatophytose oder den Sportlerfuß verantwortlich ist. Wenn es jedoch zusammen mit antifungalen Mitteln, wie Pyrrolnitrin, verwendet wird, steigert es deren antifungale Wirksamkeit gegen Triohophyton mentagrophytes und verhindert

909826/U16

gleichzeitig eine Verminderung ihrer antifungalen Wirksamkeit in Gegenwart von Serum, Die kombinierte Wirkung von Surfactin mit Pyrrolnitrin ergü sich aus Tabelle 3«

In der Praxis genügt jedoch der Zusatz von etwa 0,5 bis 5 mg Surfactin zu einer Pilzbekämpfungssalbe, um die Wirksamkeit der Salbe, die beispielsweise 5 mg Pyrrolnitrin, 5 mg Benzalconiumohlorid, 20 mg Salicylsäure und 200. mg Diäthylsebacat usw. enthält, zu steigern«

[Tabelle 3

Einfluß von Surfactin auf die antifungale Wirkung von Pyrrolnitrin

Zusatz Hemmende Mindestkonzentration, Mg/ml

unne Zusatz 1,pb

Pyrrolnitrin 500 ug Surfactin/ml 0,39

10°/ό Serum 12.5

10/0 Serum, 500 ng Surfactin/ml '

1,56

Testmikroorganismasί Trichophyton mentagrophytes, gemessen nach der Agar-Verdünnungsmethode auf Sabouraud's-Medium«, Bei alleiniger Verwendung hat Surfactin selbst bei 500 /Ug/ ml keine Wirkung»

Es ist ferner bekannt, daß die Wirksamkeit verschiedener Enzyme, Antibiotika und anderer physiologisch wirksamer Substanzen in Gegenwart von Serum abnimmt,, Die Verhinderung dieser Deaktivierung durch die gleichzeitige Verwendung von Surfactin läßt auf vielseitige Anwendbarkeit der Substanz in der Medizin schließen.

4) Surfactin hat eine starke Oberflächenaktivität„ Tabelle 4 zeigt die Fähigkeit von Surfactin zur Senkung .der Oberflächenspannung durch Messung der Größe von Tropfen mit einem Stalagmometer. Die Werte in Tabelle 4

909826/U1 6

zeigen, daß Surfactin eine viel größere Oberflächenaktivität hat als Natriumlaurylsulfat, das als starkes oberflächenaktives Mittel bekannt ist. Ein oberflächenaktives Mittel, das so wirksam ist wie Surfactin und seinen Ursprung in der Welt der Mikroben hat, ist bisher nie beschrieben worden.

Tabelle 4

Probe Oberflächenspannung Dyn/om

Destilliertes Wasser 71,98

0,1-molare NatriumbAcarbonatlösung 71,57

ITatriumlaurylsulfat, 0,005$* 56,56

0,0556* 31,25

Surfactin 0,005$* 27,90

0,05$* 27,00

* Jede Probe in 0,1-molarer Natriumbicarbonatlösung, ermittelt bei 25°C durch Messen des Tropfengewichts.

5) Akute Toxizität von Surfactin bei der Maus:

(intramuskulär): 420mg/kg

(intravenös): 105 mg/kg

q (intraperitoneal): 200 mg/kg

LD₅₀ (per os)i >4 g/kg

Pie vorstehenden Ausführungen zeigen, daß Surfactin allein oder in Kombination mit anderen Verbindungen sehr wertvoll ist, beispielsweise als oberflächenaktives Mittel, Stabilisierungsmittel für Medikamente, Medikament gegen Thrombose·, 2::ijolie, Entzündung usw. Es ist somit zu erwarten, daß Surfactin auf den verschiedensten Gebieten, z.B. in der Medizin, der pharmazeutischen Wissenschaft, in der Biologie and Chemie sowie auf verwandten Gebieten Anwendung finden wird.

909826/U16

«ιοBesonders "bemerkenswert ist, daß die Verabfolgung von Surfactin an Ratten₉ bei denen eine Minstliche Hypercholesterinäroie erzeugt worden ist, bei einer Tagesdosis von 50 bis 100 mg/kg Körpergewicht den G-esamtcholesterinspiegel im Plasma (P<.1$) und in der leber (P < 0,1$) erheblich senkt und das Verhältnis von G-esamtcholesterin/Phospholipide im Plasma erniedrigt (P < 1$) sowie das Leberlipidbild verbessert (P = Wahrscheinlichkeit der Signifikanz)»

Durch die starke anticholesterinämische Wirkung und die niedrige Toxizität wird Surfactin auch zur Behandlung oder Verhütung der Hypercholesterinämie verwendet. Für diesen Zweck beträgt die orale Tagesdosis gewöhnlich etwa 0,5 bis 3 g, vorzugsweise etwa 1 bis 1,5 g für den Erwachsenen,,

Surfactin kann allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger verabfolgt oder zusammen mit anderen Arzneimitteln oder Verbindungen mit oder ohne ,/eiteren pharmazeutisch unbedenklichen. Träger verabfolgt Serien« Als Arzneimittelzubereitungen kommen beispielsweise Pulver ι Tabletten, Kapseln, Sirupe, Lösungen usv;_o zur oralen Einnahme in Präge, Die Wahl des Trägers hängt τοη der bevorzugten Darreichunsform und von der örtlichen pharmazeutischen Praxis a.b.

Ti"'θ Prozensätzse in den folgendes Beispiel ?^ra "br^-ie^en auf

liic ill as suMilis (IfO 3035) * der 24 Stunden bei 30⁰C in einem Schrägröhrcnen mit BoailiQiLu«-<-±Ui_.r d.s > . ipton_c

, ' το j¹ -' ^ *"/ "^ ü ⁱ^ 'iicT

': Ίρ Pleisiohextrakt und 0,17 T^ „ _ΰ __

l·.. ail einss Bouillonnieaiuii.. " ^ c jit.t *:i·:- 12 Standen unter S_chtjti > ι Le^·⁵ " "^r 1 ι 1 U-* L- - Oio

izi '; 1 eiiiss Buü-i- .it*ß'λ.;v.„,afiit. „ί"(. fixnsis. ί!'ΐ?'-': :.uid auf ei/Λ - ' "^?^ΐ-" ' ϊΦ':: " ^mttel'r«

^909826/1416 BADORIQINAL

vereinigten Kultur aus 20 solcher KoHden werden mit Salzsäure auf Ptt 2 eingestellt. Die erhaltene Fällung wird π >

abfiltriert und in etwa 1 1 Wasser suspendiert.-Die Suspension wird unter Rühren und Erhitzen auf P_H 9 eingestellt.

Die Suspension wird dann etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen und zur Entfernung der Zellen zentrifugiert.

Zur oben stehenden Flüssigkeit wird Salzsäure gegeben, wobei sich eine Fällung bildet. Die Fällung wird mit Äther extrahiert und der Extrakt zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in etwa 1 1 Wasser bei Pg 9 gelöst. Nachdem unlösliche Bestandteile abfiltriert worden sind, wird das Filtrat in einer Cellophanmembran 2 Tage gegen fließendes Wasser dialysiert. Hierauf folgt eine weitere, über Nacht durchgeführte Dialyse gegen eine 0,05-molare Acetatpufferlösung (pjj 4). Das erhaltene Sediment wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Ein Zyklus, der aus Auflösung in Alkali, Säuresedimentation und Extraktion mit Äther besteht, wird zweimal durchgeführt. Die Ätherlösung wird zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Aceton gelöst, und die unlöslichen Bestandteile werden abfiltriert. Zur Acetonlösung wird ein gleiches Wasservolumen gegeben, wobei sich eine Fällung bildet, die durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einem Gemisch von Aceton und Wasser (75:50) gewaschen wird. Dann folgt ein weiterer Zyklus aus Auflösung in Alkali, Säuresedimentation und Extraktion mit Äther.

Der Extrakt wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand in einer Carbonatpufferlösung (0,1-molar, Pi₁ 9) gelöst. Die Lösung wird an einer Sephadex G-50-Säule behandelt. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen.

Die aktiven Fraktionen werden der Sedimentation mit Säure, Extraktion mit Äther und Einengung unterworfen. Das erhaltene Konzentrat wird mehrmals mit Petroläther gewaschen.

909826/ U16

180398?

Es wird dann in Äther gelöst. Die Lösung wird in einen verschlossenen Behälter gefüllt, der bei Raumtemperatur stehen gelassen wird, wobei sich ein Sediment bildet. Nach 2 (Tagen wird das Sediment abfiltriert und mit Äther gewaschen, wobei 870 mg weißes pulverförmiges Surfactin vom Schmelzpunkt 136 bis HO⁰O erhalten werden.

Beispiel 2

Bacillus subtilis (IAM-1213) wird auf die in Beispiel. 1 beschriebene Weise kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren von der Kulturlösung entfernt. 2 1 des erhaltenen Filtrats (p_H 8,8) werden mit Äthylacetat behandelt. Die Äthylacetatschicht wird verworfen. Die .wässrige Schicht wird mit Salzsäure auf ρ«- 2 eingestellt und das erhaltene Sediment in Äther gelöst. Nach einem Zyklus aus Konzentrierung, Auflösung in Alkali, Ausfällung mit Säure, Zentrifugalabscheidung und Auflösung in Alkali wird eine Oalciumchloridlösung zur Lösung gegeben, bis keine Sedimentation mehr stattfindet. Die Sedimente werden abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Sie werden dann in 0,01n-Salzsäure suspendiert. Die Suspension wird einige Zeit stehen gelassen.

Die Suspension wird dann mit Äther geschüttelt und die Ätherschicht eingeengt. Das Konzentrat wird einem weiteren Zyklus aus Auflösung in Alkali, Zusatz von Calciumchlorid, Filtration, Extraktion mit Äther und Einengung unterworfen. Das Konzentrat wird dann in einer Carbonatpufferlösung (0,1-molar, p_H 9) gelöst. Die Lösung wird über eine Sephadex G-50-Säule gegeben. Die aktive Fraktion wird aufgefangen und mit Salzsäure versetzt. Das gebildete SeäLment wird mit Äther extrahiert und der Extrakt in alkalischem Wasser (p_H 10) gelöst. Nach einer weiteren Sedimentation mit Salzsäure wird das erhaltene Sediment abfiltriert, mit Ο,ΌΙη-Salzsäure gut gewaschen und dann in Äther gelöst. Die unlöslichen Bestandteile werden abfiltriert und die Ätherfraktion eingeengt. Zum Rückstand wird Aceton gegeben.

909826/1416

!lach der Entfernung der unlöslichen Bestandteile durch Filtration wird die Lösung-eingeengt. Der Rückstand wird über eine mit Aceton "behandelte Sephadex LH-20-Säule gegeben. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen.

Durch Zusatz von Wasser in der doppelten Acetonmenge entsteht eine leichte Trübung. Das Gemisch wird in einem Kühlschrank bei 5⁰C stehen gelassen. In 2 Monaten kristallisiert Surfaotin aus. Die Kristalle werden mit Aceton-Wasser (1:2) gewaschen, wobei 40 mg Surfactin in Form von Nadeln erhalten wird.

200 mg des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Pulvers werden in 12 ml Aceton gelöst. Zur Lösung werden 8 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wird einige Zeit in einem Kühlschrank bei 5⁰C stehen gelassen. Wenn eine leichte Trübung im Gemisch festgestellt wird, werden die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Nadeln als Impfkristalle zugesetzt, worauf über lacht stehen gelassen wird. Hierbei scheiden sich weiße Nadeln ab· Durch Umkristallisation aus Aceton-Wasser werden 14-0 mg Surfactin vom Schmelzpunkt 137-14O⁰C erhalten.

Elementaranalyse: 59,5596 C, 9,00# H, 9,12# N.

Beispiel 3

Bacillus subtilis (IAM-1213) wird in steigendem Maßstab zur Herstellung von 5 1 eines Kultur präparats kultiviert.

1) Schrägkultur

Medium: 1$ Pepton, 1# Fleischextrakt, 0,5$ Natriumchlorid, 1,55» Agar
Temperatur: 3O⁰C
Zeit: 24 Stunden

2) Kolbenkultur (eine Reihe von konischen Kolben) Mediums \i» Pepton, 1?έ Fleischextrakt, 0,5$ Natriumchlorid

Größe der Kolben: 2 1x2

90 9 8 2.6/U1 6

18039;

Plüssigkeitsmenges 500 ml χ Kulturmethode: Schüttelkultur Temperatur: 30⁰G Zeit: 24 Stunden

3) Impfkultür Medium; \°jo Pepton, V/o Fleischextrakt, O₈5$ Natriumchlorid

Passungsvermögen des Behälters ε 50 Plüssigkeitsmenges 30 Sohaumverhütungsmittel: Siliconharz (Toshiba Silicone TSA 750, Hersteller Toshiba Electric Company_} Ltd.) 0,033°/*
Belüftung? 15 l/Minute Ruhrgeschwindigke.lt: 280 UpM Temperaturs 3O⁰C Zeit! 24 Stunden

4) Hauptkultur Medium! Yß> Peptoiij 1$ Fleischextrakt, 0_£5$ Ea";riumchlorid, 1'/o Glucose Fassungsvermögen des Tankss 1000 Plüsi,igkeitsmenge; 500 Schaumverhütungsmittels öilicoiJaarz (wie \>ei ier Impf·= kultur) O_sO25^ Belüftung.: 500 l/Minute B.ührgeschwindigkeit: 160 UpM temperaturί 30⁰C Zeiti 24 Stunden

^r der ^T'u] bivxcrui £ τ ^cH ι ' ρ -» ι ""ε==

C ¹¹On en^{1 p}ernt, wo·)"*! /./) 1 o^r - e* * "^ " "'"L^t

*, 7,6) erhalten w rn η. Ϊ- j »> .j^^e^j v„„l ij„t 100

• ¹AOeLr¹" Lchan'"¹*.¹ J. t ¹Ja t ^- '. ~ r A äx-s

909826/14 16 BAD oriqinal

Äthylacetat extrahiert wird.

Die vereinigte Äthylacetatlösung von etwa 500 1 wird auf 2 1 eingeengt. Der Rückstand'wird mit 50 g Aktivkohle behandelt, um farbige Verunreinigungen zu entfernen. Die Kohle wird unter Verwendung eines Filterhilfsstoffs abfiltriert. Das hierbei erhaltene klare Filtrat wird auf etwa 1 1 eingeengt. Das Konzentrat wird mehrmals mit etwa 2 1 alkalischem Wasser (p_H 10) behandelt, um die aktive Substanz in die wässrige Schicht zu überführen. Durch Zusatz von Calciumchlorid zur alkalischen Lösung wird die aktive Substanz als Oaloiumsalz vollständig ausgefällt·

Nach der Abtrennung durch Zentrifugieren wird die Fällung in etwa 500 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit Salzsäure auf ρ_Η 2 eingestellt und dann einige Zeit gerührt, wobei sich eine calciumfreie Fällung bildet.

Die Fällung wird mit Äther extrahiert und die Ätherlösung eingeengt. Der hierbei erhaltene Rückstand wird in etwa 1 1 Aceton gelöst und durch eine Säule gegeben, die mit 100 ml Aktivkohle, die mit Aceton vorbehandelt worden ist, gefüllt ist. Die Säule wird mit 1 1 Aceton gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Eluat wird zur Trockene eingeengt. Hierbei werden 30 g Surfaotin als weißes Pulver erhalten.

Das Pulver wird in etwa 600 ml Aceton gelöst, dem etwa 400 ml Wasser zugesetzt werden, wobei die Lösung etwas trübe wird. Zu dieser Lösung wird eine geringe Menge von Impfkristallen von Surfactin gegeben, worauf die Lösung 12 Stunden in einem Kühlschrank stehen gelassen wird. Hierbei werden 24 g kristallines Surfactin vom Schmelzpunkt 137 bis 140⁰C in Form von weißen Nadeln erhalten.

909826/U16

Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung eines neuen, physiologisch wirksamen Peptidolipids, bezeichnet als "Surfactin", dadurch gekennzeichnet, daß man einen Surfactin erzeugenden, zur Gattung Bacillus gehörenden Stamm eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff und verwertbaren Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet und das angesammelte "Surfactin" aus der Kulturbrühe abtrennt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Surfactin erzeugenden Stamm Bacillus subtilis einsetzt.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem pH-Wert zwischen etwa 6 und 9 vornimmt.

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur zwischen etwa 20 und etwa 40°C liegt.

5) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus subtilis IPO 5035 einsetzt.

6) Verfahren nach Anspruch -2, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus subtilis IAM I2I3 einsetzt.

7) Neues, physiologisch wirksames Peptidolipid mit der Bezeichnung "Surfactin" als Stoffwechselprodukt eines Mikroorganismus, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

1. es bildet weiße Nadeln vom Schmelzpunkt 1J>J bis 14o°C,

909826/U16

2. sein Molekulargewicht beträgt I050 - 100j

3. die Elementaranalysenwerte sind

60,5 - 1,0 % C, 9,0 ± 0,5 % H, 9,3 ± 0,5 * N;

4. es ist löslich in Wasser, Aceton, Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, tert.-Butanol, Äthylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Dioxan, Benzol, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und Eisessig, unlöslich oder schwer löslich in Wasser, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Tetrachlorkohlenstoff, Petroläther, Ligroin, Petroleumbenzin, Hexan und Cyclohexane

5. seine Ninhydrinreaktion ist negativ, die Biurit-Reaktion positiv;

6. seine aus Aceton-Wasser umkristallisierten Kristalle zeigen signifikante Infrarotabsorptionsbanden (in KBr) bei folgenden Wellenlängen: (in Ai) 2,97 5,74 6,80 3,34 6,04 7,20 3,37 6,51

7. es zeigt kein Ultraviolettabsorptionsmaximum zwischen 230 und 400 mu;

8. es hat eine spezifische Drehung
CJ^ +40° ± 4° (in Chloroform, 1 %)

-39° + 4° (in Methanol, 1 <£)%

9. es enthält L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, L-Valin, L-Leucin, D-Leucin und eine Fettsäure im Verhältnis von 1:1:1:2:2:1.

909826/U16

L e/r s e 11 e