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DE2227739A1 - Neue antibakteriell wirksame substanzen und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Neue antibakteriell wirksame substanzen und verfahren zu ihrer herstellung

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DE2227739A1
DE2227739A1 DE2227739A DE2227739A DE2227739A1 DE 2227739 A1 DE2227739 A1 DE 2227739A1 DE 2227739 A DE2227739 A DE 2227739A DE 2227739 A DE2227739 A DE 2227739A DE 2227739 A1 DE2227739 A1 DE 2227739A1
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acid
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ester
active
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Graham Mellows
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Beecham Group PLC
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
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Description

11 Heue antibakteriell wirksame Substanzen und Verfahren
zu ihrer Herstellung "
Priorität: 12.Juni 1971, Grossbritannien, Nr. 27 653/71
Es ist seit Jahren bekannt, dass Pseudomonas fluorescens inhibierende Stoffe liefert. Einen guten Überblick über die Arbeiten auf diesem Gebiet gibt das Buch "Antibiotics" von
H.W. Florey, E.B. Chain, IT.G. Heatley > M.A. Jennings,
A.G. Saunders, E.P. Abraham und M.E. Florey, Oxford University Press ,(1949)» Band I. Es ist nun gelungen, ein Gemisch inhibierender Substanzen zu isolieren und dieses Gemisch in drei
Komponenten aufzutrennen, von denen zwei in isomerer Form vorliegen.
Die Erfindung betrifft daher neue, aus Pseudomonas fluorescens gewinnbare antibakteriell wirksame Substanzen in praktisch neuer Form oder in Form eines Gemisches von drei Verbindungen.
209881/0730
Zwei dieser Verbindungen sind die Säure I (genannt "pseudcmornο acid") iind deren Isomeres, v/elche ciie Formel I
CILGH. CH. CH. CH.CH0 CH^pn J>
aufv/eist, während die dritte Verbindung die Säure II ist (genannt "pseudomonic acid I")» welche die Formel II
. CH. CH. CH. CH. CH2
GH.C02(CH2)8C0gH Il
A ^^ \pH.CHo.C.
(H)
aufweist.
Der Methylester eines Isomeren der IOrmel I kann leicht kristallisiert v/erden.
Die drei Verbindungen können einzeln isoliert werden. Die Erfindung "betrifft daher auch die Säuren I und II in praktisch
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reiner Form sowie deren Salze und Ester.
Säure I lässt sich in Form ihres kristallinen Methylesters identifizieren und charakterisieren, der ein IR-Spektrurn wie in Figur 1 und ein NMR-Protonenspektrum wie in Figur 2 auf v/eist.
Säure I basitzt antibakterielle Aktivität, die wahrscheinlich mit der Anwesenheit der freien Carboxylgruppe zusammenhängt. Die Salze von Säure I sind daher aktiv, während die Methyl- und p-Bromphenacylester weniger aktiv sind. Die Erfindung betrifft somit auch die Salze von Säure I und anderer Derivate der freien Carboxylgruppe, die leicht hydrolisiert v/erden können, wodurch man die Stammsäure I erhält.
Es wird angenommen, dass die Verbindung der Formel I in zwei isomeren Formen mit eis- und trans-Konfiguration an der Doppelbindung vorliegt,"und dass die in Form des kristallinen Methylesters in den Figuren 1 und 2 charakterisierte Säure I das trans-Isomer ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formeln 1 und II in praktisch reiner Form, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Pseudomonas fluorescein unter aeoroben Bedingungen auf oder in' einer Kulturbrühe züchtet, die anorganische Salze sowie assimilierbare Kohlenstoff· und Stickstoffquellen enthält, bis die Kulturbrühe mindestens nachweisbare antibakteriell wirksame Substanzen aufweist, die' Kulturbrühe anschliessend mit einer Bariumionen liefernden Verbindung versetzt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt,
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die Kulturbrühe mit einen organischen Lösungsmittel für die in der Kulturbrühe gelösten aktiven Substanzen extrahiert, den organischen Extrakt mit Wasser bei einem pH-Wert von 7 bis 9 extrahiert, das Wasser bis zur Bildung eines festen Rückstandes eindampft und den Rückstand in aktive und im wesentlichen inaktive Fraktionen auftrennt.
Die aktiven Fraktionen können kombiniert werden, wodurch man ein Gemisch der drei verschiedenen Säuren erhält.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird Pseudomonas fluorescens nach herkömmlichen Methoden gezüchtet. Alle Stämme des Mikroorganismus liefern in geringerem oder höherem Masse die Säure Ein besonders geeigneter, öffentlich zugänglicher Stamm ist jedoch Pseudomonas fluorescens NCIB 10 586 (NGIB = National Collection of Industrial Bacteria .).
Die nächste Verfahrensstufe, nämlich der Zusatz einer Bariumionen liefernden Verbindung zur Kulturbrühe, wird als die entscheidende Massnahme betrachtet, die die erfolgreiche Abtrennung der aktiven Komponenten ermöglicht. Der grösste Teil der aktiven Kulturflüssigkeit wird in dieser Verfahrensstufe in lösliche Bariumsalze überführt (was an sich überraschend ist, da die meisten Bariumsalze nicht in Wasser löslich sind), während die inaktiven Komponenten als unlöslicher Niederschlag verbleiben.
Nach Entfernung des Niederschlags werden die aktiven Substanzen aus der wässrigen Lösung mit einem geeigneten Lösungsmittel
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extrahiert. Als Lösungsmittel eignet sich vor allem Isobutylmethylketon (IBMK). Ebenfalls geeignet ist Äther mit einem 5prozentigen Gehalt an Äthanol sowie Chloroform, beide Lösungsmittel sind aber nicht so wirksam wie IBMK.
Der organische Extrakt wird dann mit V/asser bei einem alkalischen pH-Wert extrahiert, und die Salze der aktiven Substanzen werden durch Eindampfen des Wassers gewonnen. Falls erwünscht, kann die Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel und anschliessend mit Wasser bei alkalischem pH-Wert mehrmals wiederholt werden, um so ein erfolgreiches Extrahieren der aktiven Substanzen zu gewährleisten.
Die inaktiven Verunreinigungen werden aus dem Salzgemisch entweder dadurch abgetrennt, dass man das .rohe Salzgemisch der Ionenaustauscher-Chromatographie unterwirft oder dadurch, dass man das Salzgemisch verestert und das veresterte Gemisch der Kieselgel-Chromatographie unterwirft. Mr die Ionenaustauscher-Chromatographie eignet sich eine Säule aus Polystyrolharz mit einem linearen Gradienten, wie er durch Eluieren mit 0,01 η methylalkoholischem Ammoniak und mit 0,01 η wässrigem Ammoniak erhalten wird. Nach dieser Methode wird zunächst eine Reihe von inaktiven Säuren mit niedrigem Molekulargewicht eluiert, anschliessend die aktiven Fraktionen (30- bis 60prozentige EIuierung).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Säure I in praktisch reiner Form, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine aktive Fraktion gemäss dem
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vorstehend beschriebenen Verfahren herstellt, diese Fraktion verestert und aus dem Gemisch von Estern der drei verschiedenen Säuren den Ester der Säure I abtrennt und verseift.
Die Erfindung betrifft gleichermassen ein Verfahren zur Herstellung der Säure II in praktisch reiner Form, das dadurch gekennzeichnet' ist, dass man eine aktive Fraktion verestert und aus dem G-emisch von Estern der drei verschiedenen Säuren den Ester der Säure II abtrennt und verseift.
Zur Durchführung der Verfahren der zuletzt genannten Ausführungsformen der Erfindung wird die aktive Fraktion z.B. in die Methylester umgewandelt, und das Estergemisch wird dann in seine drei Komponenten aufgetrennt. Dies erfolgt durch Dünnschicht-Chromatographie nach der herkömmlichen Methode, z.B. auf Kieselgel mit einem Gemisch von. Chloroform und Isopropanol im Verhältnis 9 · 1 als laufmittel. Dadurch wird der Ester der Säure II, der in geringer Menge vorliegt, abgetrennt. Der Methylester der Säure I kann aus dem verbleibenden Gemisch umkristallisiert werden.
Die Art der Verseifung der einzelnen Komponenten hängt von dem betreffenden Eoter ab. Beim p-Bromphenacylester kann die Methode von Sheehan et al., J. Org. Chem. 1964, Band 29, Seite 2006 angewandt werden (Behandlung mit Natriumthiophenoxid).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung :
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Beispiel 1
Isolierung von antibakteriell wirksamen Fraktionen Pseudomonas fluorescens Stamm KGIB 10 586 wird submers "bei 3O0G in einem Kulturmedium gezüchtet, das 1 Prozent Maisquellwasser und 0,5 Prozent Glukose in einem Lösungsgemisch "basischer Salze enthält. Die Maximalausbeute an Antibiotikum wird nach 24 Stunden erhalten", wobei alle nachweisbaren aktiven Substanzen in der Kulturflüssigkeit vorliegen. Nach Zusatz von 0,5 Prozent Bariumchlorid werden die Zellen und die ausgefällten inaktiven Substanzen abzentrifugiert. Die aktiven Substanzen · werden stufenweise durch Verteilung in 0,2 Volumenteile IBMK vom pH 4,5 in 0,8 Volumenteile Wasser vom pH 8,5 und in 0,25 Volumenteile IBMK vom pH 4,5 aufkonzentriert. Anschliessend wird die Lösung unter vermindertem Druck eingeengt. Nach weiterer Verteilung in Wasser vom pH 8,5 und Einstellung des pH-Werts auf 7 bis 8-wird die wässrige Lösung gefriergetrocknet . Man erhält ein Gemisch von Natriumsalzen, das bei O0G mehrere Monate ohne Aktivitätsverlust gelagert werden kann.
In einem pH-Bereich von 4 bis 9 ist der Antibiotikumextrakt bei 37°0 24 Stunden stabil, ausserhalb dieses Bereichs tritt ein rascher Aktivitätssenwund ein. Das Gemisch von Natriumsalzen zeigt ein breites antibakterielles Spektrum gegen grampooitive und gram-negative Bakterien, es weist eine geringe Toxizität auf und ist bakterlöstatisch gegenüber Stphylococcus
UC TC
aureus Stamm /6571 und Escherichia coli Stamm MRE 600'· . '
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Das rohe Säuregemisch wird chromatographisch an einem Polystyrolharz (Handelsprodukt) mit linearem Gradienten durch EIuieren mit 0,01 η methylalkoholischem Ammoniak und mit 0,01 η wässirgem Ammoniak -gereinigt.
Zunächst wird eine Reihe von Säuren mit niedrigem Molekulargewicht eluiert und anschliessend die Fraktionen, die die stärkste anti"bakterielle (biologische) Aktivität aufweisen (30- "bis 60prozentige Eluierung).
Beispiel 2 Reinigung der Säuren I und II
Werden die in Beispiel 1 erhaltenen "biologisch aktiven Fraktionen mit Diazomethan in Äther methyliert, so zeigen sich bei der Dünnschicht-Chromatographie zwei Flecken. Es handelt sich dabei um den Methylester der Säure I und deren Isomeres sowie, als in geringerer Menge vorliegende Komponente, um den Methylester der Säure II in einem Gewichtsverhältnis von etwa 9 ί 1·
Der Methylester der Säure I und deren Isomeies(etwa 9 Gewicht 3-teile) wird mit Hilfe von Schicht-Chromatographie an Kieselrgel mit einem Gemisch von Chloroform und Isopropanol im Verhältnis 9 - 1 als Laufmittel vom Methylester der Säure II (etwa 1 Gewichtsteil) abgetrennt. 50 Gewichtsprozent'des Methylesters der Säure I und deren Isomeies werden aus dem Gemisch durch Umkristallisieren aus Benzol/Petroläther gewonnen. Man erhält farblose Nadeln vom Fp. 76,5 bis 780C. Die Elementaranalyse ergibt' die Formel Cp7H-^Oq.
209881 /0730
C, Prozent H, Prozent
C27H46°9
gefunden : berechnet:
62,8
63,0
8,9 9,0
Der Ester ist optisch aktiv (
= 9° (C 1,5 in Ghloroforr/J) .
Die Analyse des öligen p-Bromphenacylesters ergibt die Formel
C, Prozent H, Prozent
C54H49BrO10
gefunden : "berechnet:
58,1
.58,5
6,9 7,0
Die Stamm-Monocarbonsäure, d.h. die Säure I, hat somit die Formel Cp/-H,»Oq. Diese Annahme wird bewiesen durch das Massenspektrum des Methylesters, in dem das Molekularion erwartungsgemäss bei m/e 514 liegt. Das IR-Spektrum des Methylesters (Figur 1) zeigt : ^ ira-χ. (CCl4) 3440 (Hydroxyl), 1740 (Ester), 1715-und 1650 cm" ( 0(,ß-ungesättigter Ester). Das UV-Spektrum (X max.(ÄtOH) 221,5 myu (L 13400) bestätigt die Anwesenheit der ex1,ß-ungesättigten Esterbindung. Das NMR-Spektrum (Figur 2) zeigt die Anwesenheit von zwei sekundären Methylgruppen (Υ 9,09; 8,81), einer olefinischen Methylgruppe (Y 6,40) sowie eines olefinischen Protons (γ 4,32).
Durch Acetylieren des Methylesters mit einem Gemisch von Pyridin und Essigsäureanhydrid erhält man ein Triacetat, (/33^520I2 , das bei katalytischer Hydrierung durch Absorption von 1 Mol Wasserstoff ein Dihydro-Derivat, C55H54O12 ergibt. -
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Die Reduktion des Methylesters mit Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran ergibt 1,9~Dihydroxynonanoat vom Pp. 460C (Bis-phenylcarbamatderivat vom Fp. 168 bis 169°C). Durch Behandeln des p-Bromphenacylesters mit einem Gemisch von Kaliumpermanganat und Natriumperjodat erhält man p-Bromphenacyl-9-hydroxynonanoat, C17H23BrO., vom Fp. 77,5 bis 780C.
C, Prozent H, Prozent
gefunden: 55,1 6,4
berechnet: 55,0 6,2
Durch schwach basische Hydrolyse des Methylesters erhält man 9-Hydroxynonanoatmethylester, Ο^ΗρΟΟ^, in Form eines Öls. Die Anwesenheit der 9-Hydroxynonanoat-Einheit in der Säure I wird auch durch das Massenspektrum des Methylesters bestätigt. Die Massenmessung des Fragments bei m/e 127 ergibt 327,18059 (327,18059 ber. für C17H27Og), was einer Abspaltung der Seitenkette -0(CHp )οΟΟρΟΗ·2 aus dem Molekularion entspricht.
Beispiel 3
Nachfolgend wird ein Überblick über weitere Beobachtungen gegeben, die zur Aufstellung der Strukturformeln für die Säuren I und II führen.
a) Die Anwesenheit der Cg-Einheit in der Säure I wird durch die in Beispiel 2 beschriebenen Reaktionen bestätigt.
Bindung 'der C^-Einheit an den Molekülrest
Die folgenden Beobachtungen haben bewiesen, dass die
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g an den Molekülrest durch eine <x,ß-ungesättigte Esterbindung gebunden ist, an die ausserdem eine -CEU-G-ruppe (chemische Verschiebung im ITMR-Spektrum des Methylesters der Säure 1 und "bestimmter Derivate) gebunden ist:
!Durch Behandeln eines durch eine Hydroxylgruppe geschützten Derivats des Methylesters der Säure I mit a) Osmiumtetroxid in Pyridin, b) wässrigem Hatriummetabisulfat und c) Natriumperjodat in wässrigem Äthanol erhält man eine Verbindung der IOrmel
OHC.CO2GH2(CH2)6GH2C02CH5
(gekennzeichnet durch Elementaranalyse, NMR- und IR-Spektren; Semicarbazonderivat vom Fp. 164 bis 165,50C) sowie ein Methylketonderivat des heterocyclischen Rings. Hiermit ist ebenfalls bewiesen, dass die -CH^-Gruppe am - ß-Kohlenst off atom des c\', ß-unge satt igten Esters gebunden ist.
bll) Bestätigung der Doppelbindung
Der Methylester der Säure I und deren Triacetatderivat absorbieren bei katalytischer Hydrierung 1 Mol Wasserstoff, wodurch man die entsprechenden Dihydro-Derivate erhält, die lediglich Endabsorption'im UV-Spektrum zeigen.
"bill) Stereochemie an der Doppelbindung Dass die Doppelbindung als trans-Bindung vorliegt wird auö den in .der Literatur für chemische Verschiebungen
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(NMR-Spektrum)bei eis- und trans-CH^-G-ruppen, die an Doppelbindungen dieser Art gebunden sind, angegebenen Werten abgeleitet.
c) Art der Funktionen im Molekülrest
a) Nachweis von Glykolgruppierunge'n
i) Der Methylester der Säure I bildet ein Acetonidderivat, das durch Elementaranalyse, NMR- sov/ie IR- und UV-Spektren gekennzeichnet ist.
ii) Durch Behandeln des Methylesters der Säure I mit Natriurnperjodat in wässrigem Äthanol erhält man als einziges Produkt einen Dialdehyd. Damit liegt eine Grlykolgruppierung vor, und zwar in einem Ring.
iii) Diese Beobachtung wird bestätigt durch NMR-Doppelresonanzversuche mit Triacetat- und [Pribenzoatderivaten.
b) Nachweis der Epoxidgruppe
I) Die Anwesenheit der Epoxidgruppe wird von chemischen Verschiebungen in den NMR-Spektren der beiden gebundenen Protonen des Methylesters der Säure I und deren Derivaten abgeleitet. Dies wird bestätigt durch NMH-Doppelresonanzversuche und Versuche, welche die Spinnentkopplung und damit die Auflösung dicht beieinanderliegender Maxiina in den NMR-Spektren ermöglichen.
OH
i
c) Die Teilstruktur CII3ClLCH-
CII3
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wird abgeleitet von chemischen Verschiebungen in den entsprechenden Protonen (MCR) des Acetonidderivats des
Methylesters der Säure I so\</ie des Oxidationsprodukts, dem Acetoxidketonderivat des Methylesters der Saure I,
. O
das die Teilstruktur CH J#CH_ aufweist..
ä) Die Struktur des Methylketons des heterocyclischen Rings und damit die Struktur der Säure I, wie in der Formel I aufgezeigt, wird mit Hilfe von Spinnentkopplungs- und Doppelresonanzversuchen in den NMR-Spektren der entsprechenden Methylketontriacetat- und -tribenzoatderivate abgeleitet.
Säure II
Aus den Spektren des Methylesters der Säure II und deren Triaeetatderivat (Massenspektrum, UV-, NMR- und IR-Spektren) lässt sich dessen enge Beziehung zum Methylester der Säure I ableiten, der eine zusätzliche Hydroxylgruppe aufweist.
Die in -der Formel II aufgezeigte Struktur wird mit Hilfe von NMR-Doppelresonanzversuchen am Triacetatderivat des Methylketons des heterocyclischen Ringes abgeleitet.
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Claims (14)

Patentansprüche
1. Neue, aus Pseudomonas fluorescent gewinnbare antibakteriell wirksame Substanzen in praktisch reiner Form oder in Porin eines Gemisches der nachstehenden Formel I
OH
OH H° 1 f. CO2 (CH2)8C02H
CH Np. CH2C
CH,CH.CH.CH.CH.CHO CH ~„ Ο
CH5
CD
auch als Isomeres, sowie der nachstehenden Formel II
HO I CH.C02(CH2)8C02H
Il
CH,. CH.CH. CH.Cft. CH2—
• CHp β C«GH-;
P OH
(II)
alle Verbindungen gegebenenfalls als Salze oder in Form ihrer Ester.
2) Methylester der Säure der Formel I .
3) p-Bromphenacylester der Säure der Formel I .
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4. Verfahren zur Herstellung'von antibakteriell wirksamen
Substanzen gemäss Anspruch 1, Formeln I und II ,
dadurch gekennzeichnet, dass man Pseudomonas fluorescens unter aeroben Bedingungen auf oder in einer Kulturbrühe
züchtet, die anorganische Salze sowie assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bis die Kulturbrühe mindestens nachweisbare bakteriell wirksame Substanzen aufweist, die Kulturbrühe ans chi ie s send mit einer
Bariumionen liefernden Verbindung versetzt und den sich
bildenden Medersenlag abtrennt, die Kulturbrühe mit einem organischen lösungsmittel für die in der Kulturbrühe gelösten aktiven Substanzen extrahiert, den organischen Extrakt mit V/asser bei einem pH-Wert von 7 bis 9 extrahiert, das Wasser bis zur Bildung eines festen Rückstands eindampft und den Rückstand in aktive und im wesentlichen inaktive Fraktionen auftrennt.
5. Verfahren nach Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Pseudomonas fluorescens IiCIB 10 586 verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kulturbrühe mit Isobutylmethylketon extrahiert.
7. Verfahren nach Anspruch 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die aktiven Substanzen aus dem Gemisch von aktiven ■ und inaktiven Salzen durch Ionenaustauscher-Chromatographie abtrennt.
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8. Verfahren nach Anspruch 4 Ms 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die aktiven Substanzen aus dem Gemisch von aktiven und inaktiven Salzen abtrennt, indem man das Salzgemisch verestert und das veresterte Gemisch der Kieselgel-Chromatographie unterwirft.
9." Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Polystyrolharz verwendet und':mit 0,005 η "bis 0,05 η methylalkoholischem Ammoniak sowie mit 0,005 η "bis 0,05 η wässrigem Ammoniak eluiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass man mit 0,01 η methylalkoholischem bzw. 0,01 η wässrigem Ammoniak eluiert.
11. Verfahren nach Anspruch 4 bis 10 zur Herstellung der Säure der Formel I in praktisch reiner Form, dadurch gekennzeichnet, dass man eine aktive Fraktion herstellt und verestert, aus dem Gemisch·von Estern der drei verschiedenen Säuren (2 Isomere der Formel I, eine Verbindung der Formel II) den Ester der Säure der Formel I abtrennt und verseift.
12. Verfahren nach Anspruch 4 bis 10 zur Herstellung der Säure der Formel II in praktisch reiner Form, dadurch gekennzeichnet, dass man eine aktive Fraktion herstellt und verestert, aus dem Gemisch von Estern der drei verschiedenen Sauren den Ester der Säure der Formel II abtrennt und verseift.
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13. Verfahren nach. Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man den Ester der Säure der Formel I von dem Estergemisch abtrennt, indem man a) die Ester der Säure der Formel I und deren Isomeres vom Ester der Säure der Formel II mit ' Hilfe von Schicht-Chromatographie an Kieselgel abtrennt und "b) den Ester der Säure der Formel I aus dem erhaltenen
ι Gemisch durch Umkristallisieren isoliert.
14. "Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass
man den Ester der Säure der Formel II von dem Estergemisch ■ mit Hilfe von Kieselgel-Ghromatographie abtrennt.
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Leerseite
DE2227739A 1971-06-12 1972-06-07 Pseudomonsäuren, deren Natriumsalze und Methylester und Verfahren zu ihrer Herstellung Expired DE2227739C2 (de)

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DE2227739C2 DE2227739C2 (de) 1982-07-29

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JP (2) JPS548753B1 (de)
BE (1) BE893376Q (de)
CH (1) CH584755A5 (de)
DE (1) DE2227739C2 (de)
GB (1) GB1395907A (de)

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