DE2849666A1

DE2849666A1 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p 4

Info

Publication number: DE2849666A1
Application number: DE19782849666
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Asai; Kazunori Hatano; Eiji Higashide
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-11-18
Filing date: 1978-11-16
Publication date: 1979-05-23
Also published as: JPS5473193A; PL122365B1; JPS6010720B2; HU179599B; FR2409306A1; CH640269A5; DK144658B; GB2011384A; GB2011384B; FR2409306B1; SU882414A3; IT7829921A0; US4229533A; IT1160087B; DK514478A; ES475179A1; PL211027A1; NL7811324A; DK144658C

Description

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-*t

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums OI5003 P-4 in industriell vorteilhafter Weise.

Das Antibiotikum C-15003 P-4, nachstehend kurz als "P-Jj" bezeichnet, ist eine neue Verbindung, welche durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Nocardia, welcher aus natürlichen Quellen isoliert wird, erhalten "wird.

Die erfindungsgemäss verwendbaren'Mikroorganismen erzeugen beim Züchten unter Anwendung üblicher Kulturmedien im allgemeinen gleichzeitig mehrere Komponenten « des Antibiotikums C-15003. Zur Trennung einer jeden Komponente aus der Kulturbrühe bedarf man ausserordentlich komplizierter Verfahren, wodurch sich in unvermeidlicher Weise, eine niedrige Ausbeute an gewünschter Komponente ergibt.

Zur Behebung dieses Nachteils wurde nach einem Verfahren für die Gewinnung von P-4 ausgiebig geforscht, wobei nun festgestellt wurde, dass Ρ-Ί in einem beachtenswert hohen Ausmass, bezogen auf den Gesamtgehalt an Antibiotikum C-15003 dann erhalten werden kann, wenn das Kulturmedium eine spezifische Zusammensetzung aufweist.

Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-¹I, wobei dieses Verfahren darin besteht, dass man einen

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zur Gattung Nocardia gehörenden und das Antibiotikum C-15003 P-4 (nachstehend hin und wieder als "Antibiotikum C-I5OO3 P-4 erzeugender Stamm" bezeichnet) zu erzeugen vermögender Mikroorganismus in einem Kulturmedium züchtet, welches Leucin oder ein Derivat davon oder Salze davon enthält, um auf diese Weise in der Kulturbrühe insbesondere Antibiotikum C-15OO3 P-4 zu erzeugen, worauf man das so erhaltene Antibiotikum C-15003 P—4 gewinnt.

In der vorliegenden Beschreibung bedeuten die Ausdrücke "Antibiotikum C-15OO3^I! oder "C-15003" im allge meinen die vier Verbindungen der folgenden Formel I als eine Gruppe oder eine Mischung von zwei oder drei der besagten Verbindungen oder irgendeine der besagten Verbindungen.

worin R die Reste -

-CO-CH , -CO-CH₂-CH₂-CH₃ oder -CO-CH₂-CH

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bedeutet.-

Unter Bezugnahme auf die obige allgemeine Formel I wird jene Verbindung, in welcher das Symbol R den Rest -CO-CHp-CH-, . darstellt, in der vorliegenden Beschreibung als "Antibiotikum C<-15003 P-2" oder kurz als "Pr-2" bezeichnet, während die Verbindung, in welcher R den Rest

CH₃

darstellt, nachstehend als "Antibiotikum C-15003 P-3" oder

. ■ . wird
kurz "P-3" bezeichnet/. Die Verbindung, in welcher R den Rest -CO-CH₂-CH₂-CH, bedeutet, wird hier als "Antibiotikum C-15003 P-3"¹ oder kurz als "p-3"¹ bezeichnet. Schliesslich wird die Verbindung, in welcher R den Rest

.CH.

-CO-CH₂-CH

3
CH,

bedeutet, in der vorliegenden Beschreibung als ^t:Antibiotikum C-15003 P-V oder kurz als "P-V bezeichnet.

Als Beispiel des das Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stammes eines Mikroorganismus kann man einen Actinomycetenstamm Nr. C-15003, nachstehend hin und wieder auch "Stamm Nr. C-15003" genannt, bezeichnen, welcher aus dem Boden oder anderen Proben bei der Sichtung von ein Antibiotikum erzeugenden Mikroorganismen isoliert worden ist.

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Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 vmrden in analoger Weise, wie dies von Schirljng & Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 1J5, 313-3*10 (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht. Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28 ⁰C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt sich zu Verzweigungen und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium, Manche der Hyphen haben einen Durchmesser von 0,8 bis 1,2 μτη und können sich in gewissen Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der Stamm zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen taxonoinisehen Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche Körper (50-200 χ 200 - 1000 ^m), auf welchen weiteres Luftmycel wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Xonfigurationen auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung von älteren Kulturen zeigt, dass nur in wenigen Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen,

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während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale (0,8-1,2 um χ 4,8-6,3 μτη) und ellipsoidale (0,8-1,2 ^m χ 1,0-2,0 ^m) Körper, welche Arthrosporen ähneln, enthielten.

Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben, dass diese Körper glatte Oberflächen haben.

2) Zellenzusammensetzung

Der Stamm v/urde in einem modifizierten ISP No. 1- * Medium während 66 bis 90 Stunden bei 28 ^CC unter Schütteln gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, 421 (1964)] und der Methode nach M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934 (I968)] wurden die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Die Säure lag in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose deuteten.

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3) Eigenschaften auf taxonomischen Medien

Der Stamm zeigte ein verhältnismässig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blassgelb und in den letzteren Phasen hellgelblich-lohfarben bis gelblichlchfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche Pigmente, welche in verschiedenen taxonomisehen Medien gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftmycel war pulvrig und zeigte im, allgemeinen ein massiges V/achstum bei weisser bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung. Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxcnomischen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.

Tabelle I

Züchtungseigenschaften des Stammes No. C-15003 auf taxonomisehen Medien
(A) Saccharosenitrat-Agar:

V/achstum (G): massig, leuchtendmelonengelb (3 ia)*

bis bernsteinlohfarben (3 Ic)*, Bildung - von coremiaähnlichen Gebilden Luftmycel (AM): spärlich, weiss Lösliches Pigment (SP): keines oder blass gelblich-

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lohfarben '

(B) · Glycerinnitrat-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von

coremiaähnlichen Gebilden
AM: massig, weiss
SP: kein

(C) Glucose-Asparagin-Agar: . G : massig, hellringelblumenfarbig (3 Pq-) bis leuchtendgelb (2 pa) .
AM: spärlich, weiss·

SP: leuchtendgelb (2 pa)·

(D) Glyeerin-Asparagin-Agär:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiss

SP: kein ■

(E) Stärkeagar:

G :: massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellweizenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen

· Körpern .·

je

AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein

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(F) Nähragar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) · bis khakigelb

(2 ga.)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, v/eiss SP: kein

(G) Calciummaleat-Agar:

G" : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellweizenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)

.SP: kein (H) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:

G : massig, bernsteinfarbig (3 Ic) bis leuchtend gelb (3 la) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: massig, v/eiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)

SP: kein (I) Hafermehl-Agar:

G' : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*" bis khakigelb (2 ga) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, v/eiss bis hellgelb

SP: kein (J) Pepton<-Hefeextrakt-p:isen~Agar: ·

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G : massig, khakigelb (2 ga)
AM; kein
' SP: khakigelb (2 ga)*

(K) Tyrosin-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellmelonengelb (3 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern

AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)
SP: kamelfarben (3 ie)

^: Parbcode nach "Color Harmony Manual", k. Auflage (Container Corporation of America, 1958)

*0 Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich für das Wachstum lag bei 12 bis 38 ⁰C. Der Temperaturbereich, in welchem ein gutes Wachstum des Luftmycel auf Agar (ISP
No. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35 ⁰C.

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Tabelle II

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-I5OO3 waren die folgenden:

Temperaturbereich für das Wachstumϊ 12 bis 38 "C 5 Temperaturbereich für das Wachstum des Luft-

mycels:

Verflüssigung von Gelatine:

Hydrolyse von Stärke:

Reduktion, von Nitraten:

Peptonisierung von Milch:

Coagulierung von Milch: ^v

Zersetzung von Casein:

Herstellung von Melanoid-Pigmenten:

Zersetzung von Tyrosin: Zersetzung von Xanthin: · Zersetzung von Hypoxanthin: Toleranz in bezug auf Lysozym: Toleranz in bezug auf Natriumchlorid:

20 bis 35 ⁰C

positiv

negativ

positiv

negativ (Pepton-

Hefeextrakt-

Eisen-Agar),

positiv (Tyrosin-Agar) positiv negativ negativ positiv 2 %

5) Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen

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Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham und Gottlieb [Journal of Bacteriology 56, 107 (19*18)] beschrieben ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1 % Hefeextrakt untersucht. Dabei liessen sich die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Werte
eruieren.

Tabelle III
Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm N0.C-I5OO3

10 Kohlenstoffauelle	Wachstum	Kohlenstoffquellen	Wachstumi
D-Xylose		Raffinose
L-Arabinooe	+ l·	Melibiose	+ +
D-Glucose	+-t ++	i-Inositol
D-Galactose	+ -1-	D-Sorbitol	- -
15 D-Fructose	-t-b-t ++	D-Manna toi	++ ++
L-Rhamnose	+ -t	Glycerin	- +
B-Mann.ose	-fc-t-fc -t+	lösliche Stärke	+ +
Saccharose	+-fc -L-b	Blindversuch	- -
Lactose
20 Maltose	± ⁺'
Trehalose	-fc 4Hr

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·' Grundmedium bei Zusatz von 0,1 % Hefeextrakt Anmerkung; -fc-fc-fc; üppiges Wachstum
^-t; gutss Wachstum

+ : V/achstum

+: schlechtes V/achstum

~i kein V/achstum

6) Andere Eigenschaften

Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecular Biology, 3, 2O8, 196I] hergestellt. Der G-C(Guanin-Cytosin)-Gehalt des DNA betrug ungefähr 71 MoI-Ji.

Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses Stammes war positiv.

Die obigen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's "The Actinomycetes" Bd.. 2 [The Williams and Wilkins Co., I961]; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative .Bac-: teriology, 8. Ausgabe, 197^"; und anderen Literaturstellen verglichen.

Es wurde angenommen, dass dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber un-

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ter den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, v/eiche die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu schliessen, dass dieser Stamm eine neue Art von Mikroorganismen darstellt.

Der besagte Stamm Na, C-15003 ist beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (PERM)" unter der Nummer FERM -P 3992, beim "Institute for-Fermentation, Osaka, (IFO)" unter der Nummer IFO 13726 und bei "The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, U.S.A." unter der Mummer ATCC-3128I registriert worden.

Ein Mikroorganismus der Gattung Nocardia kann, wie dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder künstlich. So sollten beispielsweise die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, ultraviolettem Licht usw., durch Monozellen-Isolierung, durch Züchtung auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch eine beliebige andere mutagene Behandlung erhältlich sind, sowie die Mutanten, die sich spontan aus dem Stamm ableiten, im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten Art betrachtet werden·. Irgendwelche die Antibiotika C*-15OO3 P-2, P-3, P-3' und/oder P-4 zu bilden

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vermögende Varianten und Mutanten lassen sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwenden. So liefert beispielsweise der Stamm No, C-15003 durch verschiedene mutegene Behandlungen Mutanten, welche sozusagen keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Substratmycelien, welche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben- oder orangerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht in bazillenartige Elemente oder verzweigte» kurze Hyphen aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weissen Luftmyeelien oder im wesentlichen ohne Luftmyeelien»

Das im Sinne der vorliegenden Erfindung als Zusatzsubstanz verwendete Leucin kann in Form eines Derivates Verwendung finden. Beispiele von Derivaten sind Alkylester mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, z.B. die Methylester oder Aethylester von Leucin, Amide, wie z.B. das Amid, Alkyl— amide mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, wie z.B. N-Methylamid

oder N-Aethylamid von Leucin,, dessen Ketosäuren, z.B. die α-Ketoxsocapronsäure, .oder Salze der oben erwähnten Verbindungen, wie z.B. die Chlorhydrate. Me L-Form von Leuein ist wünschenswert« Man kann auch Mischungen der freien Form des Leucins und dessen Derivaten oder Mischungen von Derivaten verwenden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Ver-

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fahrens werden die vorgenannten Substanzen im allgemeinen in Mengen von ungefähr O₃Ol bis 1,0 % (Gew./Vol.) und vorzugsweise von ungefähr' O₃I bis 0,5 % (Gew./Vol.) dem Medium in.einem beliebigen Zeitpunkte der Züchtung von Nocardia sp.Nr. C-15003 hinzugegeben. Die Zugabe erfolgt vorzugsweise im Anfangsstadium der Züchtung.

Das Medium, welches für die Züchtung eines derartigen ein Antibiotikum C<-15003 P-¹J erzeugenden Stammes verwendet wird, kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, dass es durch den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält'. Vorzugsweise wird man aber

zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden.

Das Medium kann die erfindungsgemäss verwendete Zusatzsubstanz, ferner Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen, welche durch den das Antibiotikum No. C-15003 P-4 erzeugenden Stamm assimiliert und verdaut werden können,_ anorganische Stoffe, Spurennährmittel usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette und OeIe, z.B. Soja bohnenöl, Specköl, Hühneröl usw., und dergl. nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise Fleisch-

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extrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Baumwollsamenmehl, Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumsulfat, Ammonium-•chlorid, Ammoniumnitrat, und Nitratsalze, z.B. Natriumnitrat oder Kaliumnitrat, und dergl, genannt. Das Medium kann ferner Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze usw., Eisen-, Mangan-, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze usw., Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. enthalten. Ferner kann das Medium zusätzlich Vitamine, z.B. die Vitamine B,, Bp, Nicotinsäure, B,^, C, E etc., Nucleinsäuren, z.B. purin, Pyrimidin und Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann man auch eine Mineralsäure und/oder ein Alkalimetall oder Ammoniak sowie die entsprechenden Basen als den pH-Wert einstellende Mittel verwenden. OeIe, Fette, oberflächenaktive Mittel und schaumverhindernde Mittel können gleichfalls zugesetzt werden.

Die Züchtung kann unter beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submersen aeroben Bedingungen oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen. Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen hängen selbstverständlich vom Zustande und von der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züch-

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tungsmethode und anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie bei 20 bis 35 ⁰C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr 5,5 bis 8,5. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine solche von 23 bis 30 °C bei einem anfänglichen pH*-Wert von 6,5 bis 7,5 anwenden. Auch die Züeht.ungsdauer schwankt je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Züchtung: so lange fortsetzt, bis die Produktivität von P-Jf einen Maximalwert erreicht hat. Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche Zeitdauer bei ungefähr 48 bis 240 Stunden.

Nachstehend findet sich ein konkretea Beispiel für die Herstellung, von P-4„

Der Stamm Nr. Ö-15QO3 wurde in einem Kulturmedium I, welches sieh aus 3 % löslicher Stärke,, 0,2 % Ammoniumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat_> 1,09 % Kaliumdihy- ' drogenphosphat, 2,09% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,001 % Ferrosulfat und der Zusatzsubstanz zusammensetzte, oder in einem Kulturmedium II, welches sich aus 5 % Dextrin, 3 %

20- MaisQuellflüssigkeifc, 0,1 % Pepton, 0,5 % Calciumcarbonat und der Zusatzsubstanz zusammensetzte, inokuliert und wan*· rend Ih^ Stündeii^in einem rotierenden Schüttelbehälter (200 Umdrehungen pro Minute) oder einer Fermentiervorrich-

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tung bei 28 °ü gezüchtet.

Die Tabellen IV und V zeigen die Resultate bei Verwendung des Mediums I bzw. II«

Die Gesamtproduktivität an C^-15003 wurde mit Talaromyces avellaneus IFO 7721 als TestOrganismus mittels der Papierseheibenmethode getestet. Das Testmedium bestand aus }j5 g Dlnatrlumhydrogenphosphat, 0,5 % Kaliumdihydrogenphosphat, 5 g Hefeextrakt (Difeo, USA), 10 g Glucose, 15 g Agar und 1000 ml destilliertem Massen CpH 7,0).

Die Bestimmung von in der Kulturbrühe vorhandenem P-2, P-3 und P^ erfolgte in folgender Weiser

Die Kulturbrühe wurde mit dem gleichen Volumen Aethylaeetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde eingeengt und getrocknet. Das getrocknete Material wurde dermassen in Aethylacet-at gelöst, dass man 1/100 Volumen der Ausgangsbrühe erhielt. Die Produkte wurden durch Dünnschi eht ehr omatograp hie mittels Kieselgel (Kieselgelplatten 6OP₂C-H, Merck, BRD) mit Hilfe von mit Wasser gesättigtem Aethylaeetat entwickelt. Die Menge an Antibiotikum und das Verhältnis der Komponenten wurden mit einem Shimazu TLC-Scanner Model CS-910 mit 2 Messwellenlängen (Shimazu, Ltd._s Japan) auf der Basis der integrierten Dichten jedes einzelnen Fleckens auf dem Chromatogramm bei 25^ nm bestimmt. Das Verhältnis der Komponenten wurde in Gew:,^, bezogen auf sämtliche Produkte, nämlich P-2, p-3 und Ρ^ή, wiedergegeben.

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Wie sich aus den Tabellen IV und V ergibt, erzeugte der Stamm Nr. C-15003 das Antibiotikum P-4 in einem Verhältnis von 65 bis 84 %, bezogen auf die Gesamtmenge, sofern man die erfxndungsgemäss anvisierten Zusatzstoffe verwendete, wogegen die Vierte bei 25 % oder "weniger in Abwesenheit solcher Zusatzstoffe lagen. Daraus ergibt sich, dass die Gewinnung von P-4 aus der Kulturbrühe im ersteren Falle wirksamer ist als im letzteren Falle.

Tabelle IV

Verhältnis der Komponenten (Gew.-5

Zusatz- substanz	zugesetzte Menge {%)	Dauer der Zugabe (Std.) *"	Verhältnis der Komponenten (%)	P-3	p_i\|	Totale Produk tivität (jAg/ml)
keine	-	-	P-2	65	.25	10
L-Leucin	0,1	0	10	.28	67	13,5
L-Leucin	0,3	0	5	13	79	11,5
L-Leucin	0,1	72	8	30	65	10
5

Die mit der Zahl 0 angegebene Dauer der Zugabe bedeutet, dass die Zusatzsubstanz im Medium zusammen mit den übrigen Bestandteilen zugegeben wurde.

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τ« 22 ~

Tabelle V Verhältnis der Komponenten (Gew.-%)

Zusatz substanz	zugesetzte Menge {%)	Dauer der Zugabe (Std.)^v	Verhältnis der Komponenten (%)	P-3	25	Totale Produk tivität (jig/ml)
keine		~	P-2	60	72	18
L-Leucin	0,3	0	15	21	84	20
L-Leucin	0,5	0	7	11	15
5

if⁴ Die mit der Zahl 0 angegebene Dauer der Zugabe hat die gleiche Bedeutung wie bei der Tabelle IV.

Da P-4, welches in dieser Weise in der Fermentierbrühe erzeugt worden ist, eine lipophile, neutrale , Substanz darstellt, lässt sie sich leicht aus der Kulturbrühe nach an sich für die Gewinnung solcher Metabolite bekannten Trennungs- und Reinigungsmethoden gewinnen. P-4 liess sich leicht aus dem Züchtungsfiltrat in mit Wasser nicht mischbaren j organischen Lösungsmitteln, wie z.B." Fettsäureestern, wie Aethylacetat oder Amylacetat, Alkoholen, wie Butanol, halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie z.B. Chloroform, und Ketenen, wie z.B. Methylisobutylketon, extrahieren. Die Extrahierung von P-¹I aus dem Filtrat erfolgte bei einem möglichst neutralen pH^-Wert und vorzugsweise mittels Aethylacetat bei einem pH-Wert von 7· Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf wurde ein nichtpolares Lösungsmittel, z,B. Petroläther oder Hexan, dem Konzentrat hinzugegeben und das rohe, die Wirksubstanz enthaltende Produkt als Niederschlag gewonnen. Das rohe Produkt wurde hierauf

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nötigenfalls einer üblichen Reinigungsmet hade unterzogen. Als routinemässige Reinigungsmethode kann man die Adsorptianschromatagraphie nennen. Zu diesem Zwecke kann man übliche Adsorptionsmittel, wie z.B. Kieselgel, aktives Älumin-iumoxyd,. ein makroporöses, nicht ionogenes Adsorp- -tionsharz usw._} verwenden. Das im Rohprodukt enthaltende P-4. liess sich z.B. durch Kieselgelchromatographie mit beispielsweise einer Mischung von Petroläther und Hexan entwickeln und durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie z.B. Aethylacetat, Aceton, Aethanol oder Methanol, oder einem hälogenierten Kohlenwasserstoff _y wie z.B. Bichlormethan oder Chloroform, welches ein polares Lösungsmittel, wie z.B. einen Alkohol, wie Methanol oder Aethanol, ein Keton,, wie z.B. Aceton oder Methylethylketon, oder dergl. enthielt, eluieren. Auf diese V/eise liess sieh F«-4- eluieren,, abtrennen und gewinnen.

Verwendete man für die Reinigung von P-M ein makroparöses Adsorptionsharz, so wurde die Eluierung von P-4 aus der Säule mit einer Mischung von Wasser und einem niederen Alkohol, einem niederen Keton oder einem Ester durchgeführt. Als niederer Alkohol kommt beispielsweise Methanol,. Aethanol, Propanol oder Butanol usw. und als niederes Keton beispielsweise Aceton oder Methyläthylketon usw.,. in= Frage. Der Ester kann beispielsweise Aethylacetat^ Butylacetat usw. sein. Gemäss einem besonderen Verfahren wurde das Rohprodukt II in einer 6Q ^-igen Methanol-Wasser-Mischung gelöst und in einer Säule von Diaion Hp-IO (Mitsubishi Chemical Industries Ltd,, Japan) adsorbiert. Die Säule wurde mit einer 70 %-igen Methanol-Wasser-Mischung gewaschen. un& das P-4 mit einer 90 £-igem Methan&I-Wasser-M-ischung eluiert.

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ORIGINAL INSPECTED

Beim oben beschriebenen Verfahren wurden die ?-H enthaltenden Fraktionen gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das getrocknete Produkt wurde dann mit 5 bis 8 Volumina Aethylacetat versetzt und das Gemisch stehengelassen, wobei sich Kristalle vom P-4 ausschieden.

Beim erfindungsgemässen Verfahren erreichte man ein Produktionsverhältnis von P-4 in den C-15003 Produkten von ungefähr 65 % oder mehr, wobei man P-4 leicht aus der Kulturbrühe gewinnen konnte. Daher ist das erfindungsgemässe Verfahren für die industrielle Herstellung von P*-4 besonders interessant.

Die physikochemisehen Eigenschaften des nach Beispiel k erhaltenen P-¹I finden sich in der Tabelle VI,

Tabelle VI

Antibiotikum C-15003 P-4
C₅₃H₄₅ClN₂O₉

= 649,196

Schmelzpunkt (⁰C)	177 - 180°
Spezifische Drehung (a>_D	-112° + 10° (c=0,522 CHCl₃)
Elementaranalyse Gef. (Ji)	C = 60,65 H = 7,05 N = 4,25 Cl = 5,23

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Tabelle Vl Port Setzung

Elementaranalyse Ber, {%)	C = 61,05 H= 6,99 N = 4,32 Cl = 5,46
Ultraviolett*- absorptionsspektren nm U) (in Methanol)	233(29900) 24O(sh 28240) 252(27590) 280(5712) 288(5680)
Infrarotabsorptions- spektren (cm"¹) KBr	1740, 1730, 1670, 158O, 1445, 1385,- 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038
magnetisi"··he Kern resonanzspektren (ppm) 100 MHz in CDCl₃	l,03(d) (6h)
Massenspektren (m/e)	587, 485, 470, 450
Löslichkeit	unlöslich in Petroläther, Hexan und V/asser, spär lich löslich in Benzol und Aether, löslich in Chloroform, Aethylacetat, Aceton, Aethanol, Metha nol, Pyridin, Tetrahydro furan und Dimethylsulf- oxyd
Farbreaktionen	Dragendorff; positiv Beilstein; positiy

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Es darf angenommen werden, dass die Verbindungen P"3., P-3' und Pr-4 neue Verbindungen darstellen, dass aber P-2 die gleiche Verbindung wie Maytansinolpropionat ist, welches sich in "Kupchan et al's report" [The Journal of American Chemical Society 9J_, 529*1 (1975)] findet. Dies geht aus der Elementaranalyse, aus der spezifischen Drehung, aus der Ultraviolettstrahlenabsorption, der Infrarotstrahlenabsorption, dem Massenspektrum usw. hervor.

Die biologische Wirkung von P-4 ist die folgende:

A) Antimikrobiell Wirksamkeit :

Mit Trypticase-Soja-Agar (BBL) als Versuchsmedium wurden die Hemmkonzentrationen gegenüber den weiter unten erwähnten Mikroorganismen mit Hilfe der Papierscheibenmethode festgestellt. Die Pilterpapierscheiben (Toyo Seisakusho, dünne Qualität, mit einem Durchmesser von 8 mm) wurden jeweils mit 0,02 ml einer 300 ug/ml Lösung von P-4 imprägniert, worauf man diese Scheiben auf Agar-Platten anordnete, welche mit den weiter unten genannten Mikroorganismen beimpft waren. P-4 hatte keine Wirkung in bezug auf die folgenden Bakterien, nämlich Escherdchia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens und Mycobacterium avium.

Andererseits wurde mit Agar-Platten, welche aus 3,5 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g Monokaliumdihydrogenphosphat, 5 g Hefeextrakt (Difco), 10 g Glucose, 15 g Agar und 1.000 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 bestanden, die Wachstumsverhinderung gegenüber

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Talaromyces avellaneus getestet. Bei diesem Testversueh lagen die miniipalen Hemmkonzentrationen bei 1,0 bis 1,5 ug/ml für P-4 . Ferner wurde Tetrahymena pyriformis W auf einem Testmedium, bestehend aus 20 g Proteose-Pepton (DIfCo)₅ 1 g Hefeextrakt, 2 g Glucose, 1.000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0 bei 28 ⁰C während 44 bis 48 Stunden gezüchtet und hierauf die Hemmwirkung auf das Wachstum von Pt-4 in bezug auf Protozoen durch die Serienverdünnungsmethode bestimmt- Die Wachstumsinhibition trat bei 0,5 ug/ml für C-I5003 P-4 ein.

P-4 zeigte Wirkungen gegenüber den folgenden Mikroorganismen :

Fusicladium levieri» Helminthosporium sigmoidium var. irreguläre, Pyricularia oryzae, Cochlioborus miyabeanus, Sclerotinia screrotiorum, Pellicularia sasakii, Trichophyton rubrum, Rhodotorula rubra und Cryptococcus neoformans«

B) Gytostatische Wirkung :

Die therapeutische Wirkungen von P-4 nach einer 9-tägigen, intraperitonealen Dosierung in bezug auf P 388-Lettkämie bei Mäusen (1 χ 10 Zellen/Tiere) wurden bestimmt. ?-k wies bezüglich des lebensverlängernden Verlaufes eine cytostatische Wirkung auf, welche, verglichen mit einer Dosismenge von 0,00625 mg/kg/ Tag, einem Wert von I80 % entsprach.

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C) Toxizjtät :

Bei einem akuten Toxizitätstest mit Mäusen als Testtiere, denen man intraperitoneal p-4 injizierte, ergab sich mit diesem Antibiotikum ein LD -Wert von mehr als 0,313 mg/kg.

. Wie bereits erwähnt, zeichnet sich

P-¹J durch eine starke Hemmwirkung gegenüber Fungi und Protozoen aus und ist daher als fungizides Mittel oder als Antiprotozoenmitt.el sehr wertvoll. Da darüberhinaup P-4 bei mit Tumoren befallenen Säugetieren, z.B. Mäusen, eine lebensverlängernde Wirkung ausübt, darf man auch annehmen, dass diese Verbindung als Cytostatikum wertvoll sein wird.

p-4 kann als fungizides Mittel und als Antiprotozoenmittel mit Vorteil auch im Zusammenhang mit der bakteriellen Oekologie im Boden, in Belebtschlämmen, in der tierischen Körperflüssigkeit oder dergl. verwendet werden. Wünscht man daher wertvolle Bakterien aus einer Bodenprobe zu isolieren oder will man die Wirkungen von Bakterien unabhängig von jenen von Pilzen und Protozoen bei der Bearbeitung und Analyse von Belebtschlämmen, _Wie sie bei der Behandlung von Abwässern Verwendung finden, einschätzen, so kann man das neue Antibiotikum dazu einsetzen, um ein selektives Wachsen der bak-

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teriellen Flora zu fördern, ohne ein gleichzeitiges Wachsen der Pilze und Protozoen zu begünstigen. Gemäss einem besonderen Beispiel kann man eine Probe einem flüssigen oder festen Medium und überdies 0,1 ml einer 10 bis 100 ^ig/ml-Lösung von P-4 in einer 1 #-igen wässrigen Methanollösung pro ml des Mediums zusetzen, worauf man eine Inkubation einleitet.

P-4 kann auch als antimikrobielles Mittel für die Behandlung von durch die oben erwähnten Mikroorganismen verursachten Pflanzenkrankheiten eingesetzt werden. Gemäss . einer typischen Anwendung wird P-4 in Form einer 1 %-igen methanolischen wässrigen Lösung, welche 0,5 ^g/ml bis 5 ^g/ml des Antibiotikums enthält, verwendet. So kann man.P-JJ beispielsweise zum Bekämpfen von Mehltau, der durch Helminthosporium verursachten Blattfleckenkrankheit und des Blattscheidenbrandes von Reispflanzen verwenden.

Die folgenden Beispiele erläutern die ,vorliegende Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Teile sind jeweils Gew.-Teile, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen Teilen und Vol.-Teilen entspricht

jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck "%" bezieht sich ■ auf "Gew./VoI", sofern nichts anderes ausgesagt wird.

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Beispiel 1

*10 Vol.^Teile eines Impfkulturmediums mit einem pH-Wert von 7,0, welches 1,0 % Glucose, 2,0 % Bacto-Trypton und 1,2 % Bacto-Hefeextrakt enthielt, wurde in einem Erlenmeyerkolben mit 200 Vol.-Teilen· Passungsvermögen gebracht .

Nach dem Sterilisieren wurde das Medium mit Nocardia sp. No. C-15003 (IFO 13726; ATCC 31281: FERM-P No. 3992) geimpft. Das geimpfte Material wurde dann bei 200 Umdrehungen pro Minute in einem rotierenden Schüttelbecher inkubiert, wobei man die Impfkultur erhielt. Die in der Kultur vorhandenen Zellen wurden dreimal mit sterilisiertem, destilliertem Wasser gewaschen und die gewa-

in
schenen Zellen hierauf erneut7"3er ursprünglichen Brühe von"

sterilisiertem, destilliertem Wasser angeschlämmt.

1 Vol.-Teil des so erhaltenen Materials wurde in 40 Vol.-Teilen eines als Hauptbestandteil dienenden Kulturmediums, welches aus 3 % lösliche Stärke, 0,2 % Ammoniumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat, 1,09 % Kaliumdihydrogenphosphat, 2,09 % Dikaliumhydrogenphosphat, O₃OOl % Ferrosulfat und 0,3 % L-Leucin bestand, inokuliert und diese Hauptkultur bei 28 ⁰C während 8 Tagen in einem rotierenden Schüttelbehälter, welcher mit 200 Umdrehungen pro Minute drehte, behandelt,

Die Gesamtproduktion an C-15003 betrug 12 ^ug/ml und das Verhältnis von P-¹*, bezogen auf das gesamte Material, lag bei 80 Gew.-%.

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Beispiel 2

500 VoI,-Teile der gemäss Beispiel 1 erhaltenen Impfkultur wurden in einem Sakaguchikolben mit einem Passungsvermögen von 2.000 Vol.-Teilen inokuliert und während 48 Stunden bei 28 ⁰C in einer sich hin- und herbewegenden Schilttelvorrichtung (110 Hübe/Minute) gezüchtet, um zu einem Inokulum zu gelangen. Das Inokulum wurde dann zu 100 χ 10 Vol.-Teilen eines Medium hinzugegeben, welches aus 2,0 % Glucose, 3,0 % lösliche Stärke, 1,0 % Maisquellflüssigkeit, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,5 % Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japan), 0,3 % Natriumchloridtnd

pH 7,O. 0,5 % Calciumcarbonat (Gew. /Vol.) bestand^vbehandelt, wobei das ganze Material sich in einem rostfreien Stahlfermentierhehälter m
Teilen befand.

tierhehälter mit einem Fassungsvermögen von 200 χ 10 VoI-

Dic Züchtung erfolgte während 48 Stunden bei 28 ⁰C bei einer Belüftung von lOOLiter/Minute und durch Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. Die Kulturbrühe (10 χ 10 Vol.-Teile) wurde in einen rostfreien Stahlfermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 200 χ ΙΟ'' Vol.-Teilen eingebracht, welcher 100χ 10 Vol.-Teile eines Fermentierungsmediums enthielt, das aus 5 % Dextrin, 3 % Maisquellflüssigkeit, 0,1 % Pepton, 0,5 % L-Leucin und 0,5 % Calciumcarbonat (Gew./Vol.) bestand, wobei der pH-Wert bei 7,0 lag.

Die Fermentierung erfolgte während K Tagen bei 28 ⁰C und einer Belüftung von 100 χ 10 Vol.-Teilen/Minute bei Rühren mit 150 Umdrehungen pro Minute.

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Die Gesamtproduktion an C-15OO3 betrug 12 ug/mL Das P-'f in CV15OQ3 wurde in einer Gewichtsmenge von ungefähr &5 % erhalten.

Beispiel 3

Zu 95 χ ICr Vol.-Teilen der Kulturbrühe, wie sie gemäss Beispiel 2 erhalten worden war, wurden 50 χ ICr Vol.-Teile Aceton hinzugegeben. Das Gemisch wurde während 30 Minuten gerührt. Das so erhaltene Gemisch wurde mit. 2 χ 10·⁵ VoI,-Teilen Hyflo Super-Cel (Johnes and Manville Products, Ltd,) versetzt und das Gemisch gründlich gerührt.

Das Gemisch wurde unter Druck durch einen Filter filtriert, wobei man 135 x 10^ Vol.-Teile eines FiI- ₍ trats erhielt« Dieses Filtrat wurde mit 50 χ 10 Vol.-Teilen Wasser und 90 χ 10 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch gerührt und zweimal extrahiert.

Die erhaltenen Aethylacetatschichten wurden vereinigt und zweimal mit jeweils 30 χ 10 Vol.-Teilen Wasser gewaschen. Dann wurde die so erhaltene Aethylacetatschicht mit 1 χ 10^ Vol.-Teilen wasserfreiem Natriumsulfat versetzt, getrocknet und auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther versetzt und der gebildete Niederschlag durch Filtrieren gewonnen. Auf diese Weise erhielt man 35 Teile des rohen Produktes.

Das so erhaltene rohe Produkt wurde mit 50 VoI,-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch gerührt,

Die unlöslichen Bestandteile wurden dann durch 909821/0601

Filtrieren entfernt und das Filtrat mit 10 Teilen Kieselgel (Merck, BRD₃ 0,05 bis 0,2 mm) versetzt. Nach dem Rühren des Gemisches wurde das Aethylacetat durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wur-

• 5 -de oben einer Kieselgelsäule .(500 Vol.-Teile) zugegeben. Die Antibiotika wurden stufenweise mit 500 Vol.-Teilen n-Hexan, 500 VoI,-Teilen einer Mischung von η-Hexan und Aethylacetat in Mischungsverhältnis von 3:1, 2.000 VoI,-Teilcn einer Mischung von η-Hexan und Aethylacetat im Mischungsverhältnis von 1:1 und 2.000 Vol.-Teilen mit Wasser gesättigtem Aethylacetat eluiert. Das Eluat wurde jeweils in Fraktionen von 50 Vol.-Teilen gesammelt.

Ein Anteil von 1 Vol.-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann mit 0,1 Vol.-Teil Aethylacetat versetzt, wobei man zu einem Gemisch gelangte. Dieses Gemisch wurde bei 2,5 cm von der Bodenkante einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, BRD, 60 F₂₅IjJ °j25 mm, 20 χ 20) aufgetragen und bei einer Laufstrecke von ungefähr 17 cm mit mit Wasser gesättigtem Aethylacetat entwickelt. Nach der Entwicklung wurde der Nachweis mit ultraviolettem Licht (2.357 S) vorgenommen. Die aktiven Fraktionen von Rf 0,49 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf ungefähr 2 Vol.-Teile eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann mit 20 Vol.-Teilen Petroläther versetzt, wobei man 1,08 Teile rohe Kristalle erhielt. Diese rohen Kristalle wurden in 20 Vol.-Teilen warmem Aethylacetat gelöst. Nach dem Kühlen gewann man 0,92 Teile P-²I. Auf diese Weise erhielt man P-4-Kristalle in reinem Zustand in einer Menge von 9*J Gew.-%. Der Schmelzpunkt der Kristalle lag bei 178 bis l80 ⁰C.

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Beispiel 4

In iJOO Vol.-Teilen 50 #-igem Methanol wurden 20 Teile des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Produktes gelöst. Dann wurde eine Säule (2,5 cm Durchmesser) mit 1.000 Vol.-Teilen Diaion HP-IO (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan) beschickt und mit 3.000 Vol.-Teilen 50 #~igem methanolischem Wasser behandelt. Die nach den obigen Angaben erhaltene Probenlösung wurde dann durch die Säule hindurchgeleitet und mit 1.000 Vol.-Teilen 60 #-igem Methanol gewaschen und durch kontinuierliches Hinunterfliessenlassen unter Verwendung von 7.500 VoI.-Teilen 60 #-igem Methanol in Wasser und 7.500 Vol.-Teilen 95 #-igem Methanol in V/asser eluiert.

Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 75 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion nach den Angaben von Beispiel 3 der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unterworfen.

Die aktiven Fraktionen Nr. 182 bis 190 wurden gesammelt und eingeengt. Das Konzentrat wurde dann mit 500 Vol.-Teilen V/asser und 1.000 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt.

Das so erhaltene Gemisch wurde in einem Scheidetrichter geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt. Nach zweimaligem Waschen mit jeweils 300 Vol.-Teilen Wasser wurde die Aethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und stehengelassen.

Die auf diese Weise erhaltenen Kristalle von P-4 90982 1 /060 1

wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet (0,950 Teil P-M}.

Die auf diese fyfeise erhaltenen reinen P-^-Kristalle betrugen 9'P Gew. -% und wiesen einen Schmelzpunkt von 177 bis 173 ⁰C auf.

Beispiel 5

Anstelle von L-Leucin, wie dies in Beispiel 1 der Fall war, wurde der Methylester von Leucinj das N-Methylamid von Leucin, die α-Ketoisocapronsäure oder das Chlorhydrat von Leucin verwendet. Auf diese Weise gelangte man zu ähnlichen Resultaten, d.h. man erhielt das gewünschte P-ft in ähnlichen Ausbeuten.

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Claims

Patentanwälte Dr.-lng. Stfiönwoid Dr.-ing Th.Mevc-r Dr.-Ing. Hshold Dr. fücs ■ DN.-ihom. Alsk'-.-on Kreisler DipUhem. Carola feuer - O^L-lng. Seifing Case 52 878 5 Köln 1, Dejchmannhaus Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka (Japan) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-4 Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-4 durch Züchtung eines zur Gattung Nocardia gehörenden, das Antibiotikum C-15003 P-^ zu erzeugen vermögenden Mikroorganismus in einem assimilierbare Kohlenstoffquellen und verdaubare Stickstoffquellen enthaltenden Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Kulturmedium Leucin und/oder mindestens ein Derivat davon als Zusatzsubstanzen hinzugibt.

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ORJGiNAL !MSPEGTED

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Nocardia sp.No. C-15003 (ATCC-31281; IPO 13726; PERM-P No. 3992) verwendet wird.

33 Verfahren nach Anspruch I₃ dadurch gekennzeichnet ^ dass man als Zusatzsubstanz Leucin verwendet.

Als neue Verbindung das Antibiotikum C-15003 P-¹J.

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