DE2037942C2

DE2037942C2 - Arzneimittel enthaltend ein "aktives" Chondroitinsulfat als Wirkstoff zur Verhinderung des Auftretens atherosklerotischer Läsionen und zur Verhinderung des Auftretens von Herzanfällen

Info

Publication number: DE2037942C2
Application number: DE19702037942
Authority: DE
Inventors: Lester M. Hollywood Calif. Morrison
Original assignee: Biomed Research Inc
Current assignee: Biomed Research Inc
Priority date: 1970-04-15
Filing date: 1970-07-30
Publication date: 1982-11-18
Also published as: DE2037942A1; FR2086068A1; FR2086068B1; GB1344727A; ES387885A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel enthaltend ein »aktives« Chondroitinsulfat als Wirkstoff zur Verhinderung des Auftretens atherosklerotischer Läsionen durch Förderung der Ausbildung des Kollateralkreislaufes in Herzregionen, die durch die Äste der Koronaarterien versorgt werden, und zur Verhinderung des Auftretens von Herzanfällen, einschließlich Myokardinfarkten, akuter Koronarinsuffizienz und akuter Myokardischämie bei Menschen mit ischämischer Herzschwäche.

Chondroitsulfate A und C sind in menschlichen und tierischen Geweben, insbesondere im Knorpel· und Bindegewebe weit verbreitet. Obwohl sie mit Protein OLier Peptidresten konjugiert sind, können die reinen, sauren Mucopolysaccharide ohne nennenswerte Zersetzung isoliert werden. Chrondroitinsulfate A und C entha'ien beide D-Glucuronsäure, 2-Amini-2-Desoxy-D-Galactose und Acetyl- und Sulfatreste in äquimolaren Mengen. Strukturuntersuchungen haben gezeigt, daß Chondroitinsulfate A und C sich nur in der Stellung der Sulfatesiergruppe im Hexosaminrest unterscheiden. Chondroitinsulfat A enthält die sich wiederholende Einheit (1 -<-4)-0-/}-D-Glucopyranosyluronsäu-

_re-(i— 3)-2-Acetamido-2-Desoxy-4-0-SuIpho-/?-D-Galactopyranose. Chondroitinsulfat C die sich wiederholende Einheit (1 -» 4)-0-j?-D-Glucopyranosyluronsäure-(1 — 3)-2-Acetamido-2-Desoxy-6-0-Sulpho-/?-D-Galactopyranose. Es hat sich jetzt gezeigt, daß gereinigte Präparate von Chondroitinsulfat A von offensichtlich ähnlicher, chemischer Zusammensetzung, beurteilt nach üblichen Verfahren der Analytik, sich signifikant in ihrer pharmakologischen und physiologischen Aktivität unterscheiden können. Ähnliche Befunde wurden bei gereinigten Präparaten von Chondroitinsulfat C erhalten.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Chondroitinsulfat A und Chondroitinsulfat C (im folgenden abgekürzt CSA und CSC) in einer Form erhalten werden können, die »aktiv« bei der Verhinderung der Atherosklerose und dem Wiederauftreten von kardiovaskulären Anfällen bei atherosklerotischen Säugetieren ist. wenn sie regelmäßig über eine längere Periode verabreicht werden. Dieses »aktive« Material muß von dem in der US-Patentsehnft 34 05 120 beschriebenen Material unterschieden werden, das sich als inaktiv erwiesen hat, die Plasma^Thrombüs-Bildüngszeit 6 bis 12 Stunden nach Verabreichung bei Kaninchen zu verlängern, entsprechend der Chandler-Ösen*Methode, und das inaktiv ist bei der Verhinderung der Afherosklerose bei Ratten, die mit atherogener Diät gefüttert wurden, wie es im folgenden beschrieben wird.

50

60 Bisher war aus den einschlägigen Veröffentlichungen wie der US-Patentschrift 19 50 100 ein Unterschied in der anti-atherosklerotischen Aktivität verschiedener Präparate von CSA und CSC mit offensichtlich ähnlicher, chemischer Zusammensetzung nicht bekannt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Arzneimittel enthaltend ein »aktives« Chondroitinsulfat als Wirkstoff zur Verhinderung des Auftretens atherosklerotischer Läsionen durch Förderung der Ausbildung des Kollateralkreislaufes in Herzregionen, die durch die Äste der Koronararterien versorgt werden, und zur Verhinderung des Auftretens von Herzanfällen, einschließlich Myokardinfarkten, akuter Koronarinsuffizienz und akuter Myokardischämie bei Menschen mit ischämischer Herzschwäche, wobei der Wirkstoff dadurch erhältlich ist, daß Rinder-Trachea oder Haifisch-Knorpel zerkleinert und entfettet, dann in einem 0.1-M-Calciumacetat-Puffer. der 1% Papain enthält und 0,005 M an Cystein und 0,005 M an Äthylendiaminotetraacetat ist, bei einer Temperatur zwischen 59 und 65° C inkubiert, der Überstand mit Aceton versetzt und der erhaltene Niederschlag in physiologischer Salzlösung gelöst und bis zur bleibenden Entfärbung mit Permanganat behandelt. MnC>2 abgetrennt und das gewünschte Produkt aus der Lösung mit Aceton gefällt wird.

Die Aktivität wird an der Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit 6 bis 12 Stunden nach Applikation bei Kaninchen nach der Chandler-Ösen-Methode festgestellt.

Die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel besteht aus der ora'en Applikation der Verbindung in Dosen zu 0,5 bis 10 g pru Tag. wobei normalerweise ein Drittel der Tagesdosis vor oder nach jeder Mahlzeit genommen wird. Die Behandlungszeit reicht von einer kurzen Zeit (etwa 3 Monate) bis zur lebenslangen Behandlung des Patienten. Gelegentliche Unterbrechungen in diesem Applikationsprogramm sind unerheblich, sofern es im ganzen gesehen regelmäßig durchgeführt wird. Der Fachmann wird sogleich den Unterschied erkennen zwischen einer im wesentlichen regelmäßigen Applikation über längere Zeit und der fehlerträclitigen, gelegentlichen oder kurzzeitigen Applikation.

Es wurde gefunden, daß es erhebliche Unterschiede in der Pläsma-ThrombüS'Bildungszeit 6 bis 12 Stunden nach intravenöser Applikation verschiedener Chargen Chondroitinsulfat A gibt, trotz der Tatsache, daß sie auf der Grundlage folgender Standardteste nicht unterscheidbar sind.

Test

Methode

Bereich

Stickstoff

Schwefel

Optische Drehung

pH einer !"/»-Lösung

Verbrennungsrückstand

Hexosamin

Hexuronsäure

Spezifische Viskosität 1%

Farbe (20%ige Lösung)

Pyrogen

Sterilität

Schwei metalle

Kjeldahl

Schoninger

U. S. P. XVn, Seite

üblich

U.S.P.XVn, Seite

EIson-Morgan*)

Dische (Carbazole)*)

Oswald

eigenes Verfahren**)

U. S. P. XVn, Seite

U.S.P.XVn, Seite

U. S. R XVn, Seite 2,5 bis 3,5%

5 bis 6%

(a) $ =-23° bis -25°

pH 6 bis pH 7

weniger als 3 %

32 bis 35%

36 bis 39%

lOcps

weniger als 0,2 optische DichteeiDheit

pyrogenfrei

steril

weniger als 20 ppm

*) Methods of Enzymology, Band III, Herausgegeben von Sidney P. Colowicku. Nathan O. Kaplan, Academic Press, New York, 1957,

SeUe 93 bis 101. **) Die optische Dichte wird bei 420// im Beckmann-Jr.-Mod&H-B-Spektrophotometer bestimmt.

Keiner der beschriebenen Tests unterscheidet biologisch und physiologisch »aktives« CSA und biologisch und physiologisch »aktives« CSC von inaktivem Material. Die biologische und physiologische Aktivität von CSA und CSC können wie folgt bestimmt werden. Bei der Bestimmung der biologischen und physiologischen Aktivität durch die Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit nach der Chandler-Ösen-Methode in der Modifikation von Morrison et al (J. Atberoscler. Res„ 8:319, 1968), ergaben sich Präparate von gereinigtem Chondroitinsulfat A, die nach der oben angeführten Testreihe verg'eichba waren, folgende durchschnittliche Plasma-Thrombus-Bildungszeiten bei Kaninchen, 12 Stunden nach der injekt'on:

35

40

45

Getestete Probe	Durchschnittliche Plasma-
	Thrombus-Bildungszeit
	12 Stunden nach der
	Injektion
Physiologische Kochsalzlösung	12,2 Minuten
CSA, Charge A-6	49.6
CSA, Charge A-10	46,4
CSA, Charge B-3	14,1
CSA, Charge B-7	16,7
CSA, Charge B-9	31,6
CSA, Charge C-I	52,1
CSA, Charge C-2	13,6
CSA, Charge C-4	18,1
CSA, Charge W-2101	15,2
CSA, Charge W-164	22,8

Die Tests wurden durchgeführt mit weißen, männlichen Neu-Seeland-Kaninchen im Gewicht von 4'/2 bis 5V2 Pfund. Die Plasma-Thrombus-Bildungszeit wurde bei jedem Tier vor der Injektion und 12 Stunden nach der Injektion bestimmt. Das Chondroitinsulfat A wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und auf eine Konzentration von 80 mg/ml verdünnt. Die physiologi- βο sehen Kochsalzlösungskontrollen und die Chondroitin* sulfatlösungen wurden den Kaninchen in einer Dosis von 1 ml/kg Körpergewicht in die Öhr-Vene injiziert. Wenigstens 6 Kaninchen wurden für jede Gruppe verwendet. Injektionen von physiologischer Kochsalzlösung verursachten keine signifikante Änderung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit bei Blutprobenentnahme 12 Stunden nach der Injektion gegenüber dem Wert vor der injektion. Wie in der oben aufgeführten Tabelle gezeigt wurde, führten eine Reihe von Chondroitinsulfat-A-Präparaten zu einer deutlich signifikanten Erhöhung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit 12 Stunden nach der Injektion gegenüber den mit physiologischer Kochsalzlösung injizierten Kontrollen, während andere nur eine geringe oder gar keine Aktivität in dieser Hinsicht zeigten. Es ist von Interesse, daß Heparin, welches äußerst aktiv in der Verlängerung der Plasma-Thrombus Bilriungszeit bei Blutproben ist, die 15 Minuten nach intravenöser Injektion entnommen werden, zu keiner Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit in Blutproben führt, die 6 bis 12 Stunden nach Injektion entnommen werden. Dagegen zeigte sich, daß Proben von Chondroitinsulfat A, die zu einer merklichen Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit in Blutproben führten, die 12 Stunden nach Injektionen entnommen wurden, keinen signifikanten Effekt in der Verlängerung der Plasma Thrombus-Bildungszeit gegenüber Werten von vor der Injektion zeigten, wenn Blutproben 15 Minuten nach der Injektion entnommen werden.

Es hat sich auch gezeigt, daß im Falle des Chondroitinsulfats C gereinigte Präparate dieses Materials, die auf der Grundlage der oben genannten Tests ähnlich waren, sich deutlich in der Aktivität unterschieden, die zur Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit bei Kaninchen führt, wenn die Blutproben 12 Stunden nach der Injektion entnommen werden.

Allgemein sind Präparate von gereinigtem Chondroitinsulfat A. gereinigtem Chondroitinsulfat C oder Kombinationen der beiden »aktiv« bei der Hemmung oder Verhinderung des Auftretens von Atherosklerose, wenn sie zu einer Steigerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit bei Kaninchen 12 Stunden nach der Injektion unter den oben angegebenen Bedingungen um wenigstens 80% gegenüber Werten bei mit physiologischer Kochsalzlösung injizierten Kontrollen führen. Es wird nicht behauptet, daß die die Plasma-Thrombus-BiI-dungszeit verlängernde Aktivität solcher Präparate als Folge einer intravenösen Applikation mit der anti-atherögerien Aktivität als Folge der oralen Applikation korrelliert ist. Der Thrombus-verlängernde Test wird nur als Suchtest zum Nachteil von Präparaten mit anti-atherogener Aktivität eingesetzt. Es wurde auch beobachtet, daß jedes Präparat von gereinigtem Chondroitinsulfat A, C oder jede Kombination aus diesen die antUatherogene Aktivität unter den im

folgenden genannten Bedingungen zeigt, auch aktiv in der Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit bei Kaninchen 12 Stunden nach Injektion sind, und zwar mit Werten, die um wenigstens 80% über den mit physiologischer Kochsalzlösung injizierten Kontrollen liegen. Auch gibt es Befunde, daß Präparate, weiche besonders aktiv in der Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit bei Kaninchen unter den oben angeführten Bedingungen sind, ebenso aktiv in der anti-atherogenen Aktivität sind. Im Gegensatz hierzu waren Präparate von gereinigtem Chondroitinsulfat A und/oder C mit geringer oder gar keiner anti-atherogener Aktivität nie in der Lage, die Plasma-Thrombus-Bildungszeit bei Kaninchen im Vergleich mit Kontrollen, die mit physiologischer Kochsalzlösung injiziert waren, t5 unter den oben genannten Bedingungen signifikant zu verlängern.

Unterschiede in der Aktivität verschiedener Präparate von gereinigtem Chondroitinsulfat A und C können aus Unterschieden im Herstellungsverfahren wie auch im Ausgangsrrsatena! resultieren. Es wurde beobachtet, daß Proben von gereinigtem Chondroitinsulfat A aus dem gleichen Ausgangsmaterial signifikant im Hinblick auf ihren Effekt bei der Plasma-Thrombus-Bildungszeit 12 Stunden nach Injektion differierten, in Abhängigkeit zum Herstellungsverfahren. Es wurde auch beobachtet, daß Herstellungsverfahren, weiche mit dem einen Ausgangsmaterial zu hoch aktivem Material, entsprechend dem oben aufgeführten Testverfahrer, geführt haben, mit einem anderen Ausgangsmaterial zu inaktivem Material führten, trotz der Tatsache, daß Unterschiede der verschiedenen Präparate mit den oben genannten chemischen Tests nicht nachgewiesen werden konnten.

6 bis 12 Stunden nach der Verabreichung an Kaninchen wurde folgende Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildung, bestimmt nach dem Chandler-Ioop-Verfahren, gefunden:

Chondroitin^olysulfat nach US-PS 34 05 120: kaum eine Verlängerung

Chondroitinsulfat nach US-PS 19 50 ICC: 33%ige Verlängerung

Erfindungsgemäße Substanzen nach den Beispielen 1 und 2: mehr als 80%ige Verlängerung.

Ein experimentelles Modell zur Induktion von Atherosklerose in der Aorta und in Koronararierien von Ratten wurde entwickelt. Es besteht darin, jungen Ratten 6 Wochen lang eine gereinigte, cholesterinhaltige Diät zu verabreichen, die mit 1.25 Millionen U.S.P.-Einheiten Vitamin D₂ (Visterol) pro kg/Körpergewicht ergänzt ist. Ratten, die mit einer entsprechenden Diät gefüttert wurden, bei welcher einmal Cholesterin, das andere Mal Vitamin D₂ weggelassen wurde, zeigten keine solchen Läsionen. Die Verteilung und das mikroskopische Bild solcher Läsionen in diesen Geweben beobachten sehr ähnlich. Es hat sich gezeigt, daß die orale Applikation gereinigter Präparate von Chondroitinsulfat A und C und ihrer Kombinationen, die aktiv in der Verlängerung der Plasma*Thrombus* Bildungszeit bei Kaninchen sind, wie oben angegeben, hoch aktiv in der Verminderung oder Verhinderung des Auftretens atherosklerotischer Läsionen als Folge der ütherogenen Diät, die oben genannt wurde, sind.

Im folgenden wird eine Beschreibung der experimentellen Bedingungen zur Erzeugung einer Atherosklerö-Se gegeben und die Resultate nach Applikation eines biologisch und physiologisch »aktiven« Präparates von gereinigtem Chondroitinsulfat A genannt.

Die Grunddiät war eine hochgereinigte Mischung aus Saccharose (61%), vitaminfreiem Test-Casein (24%), Baumwollsamenöl (10%), Hubbell-, Mendel- und Wakeman-Salzmisehung (5%), der folgende Vitamine zugesetzt wurden (Mengen je kg/Diät): Thiaminhydrochlorid (10 mg), Riboflavin (10 mg), Pyridoxinhydrochlorid (10 mg), Calciumpanthothenat (60 mg), Nikotinsäure (100 mg), Ascorbinsäure (200 mg), Biotin (1 mg), Folsäure (10 mg), p-Aminobenzoesäure (200 mg), Inosit (400 mg), Vitamin B₁₂ (150 Mikrogr.), 2-Methyl-l,4-Naphtochinon (5 mg), Cholinchlorid (2 g), Vitamin A (5000 U.S.P.-Einheiten), Vitamin D₃ (500 U.S.P.-Einheiten) und a-Tocopherolacetat (100 mg). Die Vitamine wurden anstelle einer gleichen Menge Saccharose zugesetzt 54 männliche Ratten des Long-Evans-Stammes, mit durchschnittlich 145 g Körpergewicht — Bereich von 136 bis 155 g — und 54 weibliche Ratten des Long-Evans-Stammes, mit durchsc' sittlich 146 g Körpergewicht — Bereich von 138 bis 1 Zo f — wurden für das folgende Experiment ausgewählt:

Die Tiere wurden in 5 Gruppen mit vergleichbarem Gewicht eingeteilt Die Gruppen I₁II und III bestanden aus 6 T:°ren beiderlei Geschlechts; die Gruppen IV und V bestanden aus 18 Tieren beiderlei Geschlechts. Gruppe I wurde mit der oben genannten Grunddiät gefüttert. Gruppe II wurde mit der Grunddiät, der 1% gereinigtes Chondroitinsulfat A (Cha. ge 9008) zugesetzt war. gefüttert Diese Chondroitinsulfat-Präparate führten bei Kaninchen zu einer Plasma-Thrombus-Bildungszeit von 48.8 Minuten, 12 Stunden nach der Injektion, gegenüber einer durchschnittlichen Thrombus-Bildungszeit von 13,2 Minuten bei Kontrollen, die mit physiologischer Kochsalzlösung injiziert waren (Testbedingungen wie oben beschrieben). Gruppe III wurde mit der Grunddiät, welcher 1,5% Cholesterin und 0,5% Cholsäure zugesetzt war, gefüttert. Gruppe IV wurde mit der Grunddiät gefüttert, der 1,5% Cholesterin. 0.5% Cholsäure und Vitamin D₂ (1.25 Millionen U.S.P.-Einheiten kg/Diät) zugesetzt waren. Gruppe V wurde mit der gleichen Diät wie Gruppe IV gefüttert, der jedoch noch 1% gereinigtes Chondroitinsulfat A (Charge 9008) zugesetzt war. Die Ergänzungskomponenten wurden der Grunddiät anstelle einer entsprechenden Menge Saccharose zugefügt. Die Tiere wurden in Metallkäfigen mit erhöhtem Siebboden gehalten (3 Ratten in einem Käfig) und erhielten die verschiedenen Diäten ad libitum. Die Tiere wurden täglich gefüttert; die nach 24 Stunden nicht verbrauchte Nahrung wurde weggeworfen. Die Ratten wurden während des Experiments wöchentlich gewogen.

Na'ii 6 Wochen Fütterung wurden die Ratten mit Natriumpentobarbital betäubt. Blut wurde aus dem Herzen in eine h.-parinisierte Spritze gezogen. Die Lebern wurden entnommen, zur Entfernung überschüssigen Blutes abgetupft, gewogen und im Kühlschrank bis zur Analyse gelagert. Fett wurde aus den Lebern nach der Methode von Thompson et al (Brit. J. Nutrition, 3;50, 1949) extrahiert, Gesamtdiolesterin und freies Cholesterin wurden in der Leber und im Plasn.a nach der Methode von Schöenheirner und Sperry in der Modifikation von Nieft und Deuel (J. Biol. Chem., 177:143, 1949) bestimmt. Zur Nekropsie wurden Herzen und Aorta mit 10%igem, gepuffertem Formalin fixiert. Die Herzen wurden in 3 Teile, den apikalen, mittleren und basalen, zerlegt. Die Aorten wurden in Höhe des Bogens und des mittleren Thorax transversal

durchschnitten. Gefrierschnitte der oben genannten Präparate wurden hergestellt, mit einer Dicke von 16 bis 20 Mikrometer und zur Demonstration von Lipiden mit Ölrot^O gefärbt und mit Hämatoxylin gegengefärbt. 10 Schnitte von jedem Teil des Herzens und des Bogen- und Thorax-Teiles der Aorta wurden hergestellt. Die Schnitte wurden unter dem Mikroskop untersucht und nach Vorkommen und Schwere der athcrosklerolischen Läsionen eingeteilt.

Vorkommen und Verteilun_t alherosklerotischer Läsionen in den Koronararterien und der Aorta von Ratten der verschiedenen Gruppen sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle 1

Wirkungen eines „aktiven" Chondroitinsulfat-A-Präparates auf das Vorkommen und die Verteilung atherosklerotischer Läsionen in den Koronararterien und der Aorta von Ratten, die mit einer durch ein Überangebot von vitamin-D-antherogenen Diät gefüttert wurden

nichtatherogene Diät

Gruppe I Gruppe II Gruppe III

atherogene Diät Gruppe Iv" Gruppe V

Männliche Ratten
Zahl der Tiere je Gruppe
Ursprüngliches Körpergewicht (g)
Letztes Körpergewicht (g)*)

Histologische Befunde

Koronaratherosklerose-Vorkommen (%) Durchschnittliche Zahl von Arterien je Ratte, die in folgenden Teilen des Herzens verletzt sind:

basaler Teil

mittlerer Teil

apikaler Teil

Aortenatherosklerose-Vorkommen (%) Prozentualer Anteil von Tieren je Gruppe, die in folgenden Teilen der Aorta Verletzungen zeigen (Zahl je verletzter Ratte):

intrakardial

Bogen
Mittlerer Thorax

Weibliche Ratten
Zahl der Tiere je Gruppe
Ursprüngliches Körpergewicht (g)
Letztes Körpergewicht (g)*)

Histologische Befunde

basaler Teil

mittlerer Teil

apikaler Teil

Aortenatherosklerose-Vorkomnien (%) Prozentualer Anteil von Tieren je Gruppe, die in folgenden Teilen der Aorta Verletzungen zeigen (Zahl je verletzter Ratte):

intrakardial

Bogen
Mittlerer Thorax

6	6	6	18	18
145,3	145,3	145,3	145,6	145,6
362,0	365,7	371,5	131,1	158,9

0,0

100,0

16.7

0,0	0,0	0,0	4,2	0,5
0,0	0,0	0,0	3,5	0,1
0,0	0,0	0,0	2,4	0,2
0,0	0,0	0,0	94,4	0,0
0,0	0,0	0,0	44,4	0,0
			(2,0)**)
0,0	0.0	0,0	88,9	0,0
			(2,1)**)
0,0	0,0	0,0	66,7	0.0
			(1,3)**)
6	6	6	18	18
146,5	146,5	146,5	146,5	146,5
240,8	229^	259,6	110,3	138,2
			(16)***)
0,0	0,0	0,0	100,0***)	16,7
0,0	0,0	0,0	2,7	0,2
0,0	0,0	0,0	2,8	0,1
0,0	0,0	0,0	2,7	0,0
0,0	0,0	0,0	100,0***)	27,8
0,0	0,0	0,0	874	27,8
			(2,0)**)	(U))**
0,0	0,0	0,0	100,0	27,8"
			(2,7)**)	(U))**
0,0	0,0	0,0	93,8	IU
			(1,6)**)	(1,5)**)

") uas experiment wurde nach 6 Wochen Fütterung beendet

**) Die Schwere der Verletzungen wurde nach einer Skala, die von 0 bis A reicht, beurteilt.

***) Zwei Ratten in dieser Gruppe starben im Verlauf des Experiments. Die Angaben in dieser Gruppe beruhen auf Beobachtungen bei den überlebenden 16 Ratten.

ίο

Die Befunde zeigen, daß die orale Applikation eines biologisch »aktiven« Präparates von Chondroitinsulfat A im Gehalt von 1% in der Diät eine signifikante Reduktion des Vorkommens und der Schwere atherosklerotischer Läsionen in den Koronararterien und der Aorta von Ratten bewirkte, die mit einer durch ein C»rarangebot von vitamin-D-atherogenen Diät gefüttert wurden. Weitere Untersuchungen mit einem biologisch »aktiven« Präparat von Chondroitinsulfat C ergaben, daß dieses Material in dieser Hinsicht ähnlich aktiv war. Im Gegensatz dazu hatten Präparate von gereinigtem Chondroitinsulfat A und C, die den oben Verwendeten Präparaten in der chemischen Zusammensetzung, gemäß den früher beschriebenen Tests, glichen, aber in Hinblick auf die Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit von Kaninchen (bestimmt nach der Chandler-Ösen-Methode in Blutproben, die 12 Stunden nach injektion entno^^nen wurden) »inaktiv« waren, geringe oder keine Aktivität bei der Reduzierung des Vorkommens und der Schwere atherogener Läsionen unter den oben angegebenen Teslbedingungen.

Ein zusätzlicher Befund, einzigartig in der Medikation von anti-atherogenen Aktivitäten, besteht darin, daß die anti-atherogene Aktivität »aktiver« Präparate von Chondroitinsulfat A und C nicht in nachweisbarer Stärke Plasma- und Leber-Cholesterin, sowie den Leber-Gesamtlipid-Spiegel erniedrigt. Die Zunahme des Plasma- und Leber-Cholesterins, sowie der Leber-'Jesamtlipide in Ratten, die mit einer durch ein Überangebot von vitamin-D-atherogenen Diät, weiche mit 1% eines »aktiven« Präparates von Chondroitinsulfat A oder C ergänzt war, gefüttert wurden, war gleich groß bei Ratten, die mit der nicht-atherogenen Grunddiät gefüttert wurden, ebenso wie Ratten, die mit der atherogeneh Diät unter Foftlassung des Chondroitinsulfats A oder C gefüttert wurden.

Die Wirksamkeil biologisch »aktiver« Präparate von Chondroitinsulfat A und C in der Förderung der Ausbildung des Kollateralkreislaufes in Herzregionen, welche von Ästen der Koronaarterien versorgt werden, wird durch folgende Ergebnisse gezeigt.

Ratten wurden mit alherogener Diät (Gruppe IV) wie oben angegeben, gefüttert, d. h. die Grunddiät war mit 1,5% Cholesterin, 0,5% Cholsäure und Vitamin D2 (1,25 Millionen US.P.-Einheiten kg/Diät) ergänzt. Diese Ratten zeigten eine signifikante Abnahme in der Zahl der Koronararlerienäste, bestimmt durch die tatsächliche Zahl der Koronararterienäste in Querschnitten aller drei Teile des Herzens, d. h. dem basalen, dem mittleren und dem apikalen Teil, im Vergleich zu Ratten, die mit nichtatherogener Diät gefüttert worden waren (Gruppe I. Il und III). Dieser Effekt betraf nur die Koronararlerienäste, nicht die Hauptkoronararterien. Wurden Ratten mit atherogener Diät, wie oben angegeben, gefüttert, welche zusätzlich ein »aktives« Präparat von Chondroitinsulfat A mit einem Gehalt von 1% in der Diät enthielt (Gruppe V), so war die Zahl der Koronararterienäste nahezu gleich groß wie bei Ratten, die mit der nichtatherogenen Diät (Gruppe I, II und III) gefüttert worden waren. Gleichartige Befunde wurden sowohl bei männlichen wie bei weiblichen Ratten erhalten. Die Resultate sind in der Tabelle II zusammengefaßt.

Diätgruppe

Zahl von Durchschnittliche Zahl von Koronararterien pro Querschnitte folgender Tieren Herzteile:

je Gruppe Basaler Schnitt Mittlerer Schnitt Apikaler Schnitt

Haupt.-A. Äste Haupt.-A. Äste Haupt.-A. Äste

Männliche Ratten
Nicht-atherogene Diät:
Gruppe I
Gruppe Π
Gruppe ΓΠ
Atherogene Diät:
Gruppe IV
Gruppe V

Weibliche Ratten
Nicht-atherogene Diät:
Gruppe I
Gruppe Π
Gruppe ΠΙ

Atherogene Diät:
Gruppe IV
Gruppe V

6 6 6

18 18

6 6 6

18 18

4,7 5,3 3,5

3,7 4,8

5,2 4,0 4,3

3,2 4,0

25,3 28,2 23,0

14,3 20,9

20,0 25,3 27,7

11,7 21,4 6,0
6,5
5,0

5,5
5,7

5,2
5,7
5,0

4,8
5,6

31,6
33,0
27,5

20,0
27,3

28,3
32,5
30,0

18,0
29,1

3,8
4,5
3,8

3,3
3,6

26,0
28,0
23,0

15,6
22,8

4,2	25,3
3,3	26,2
4,0	25,5

3,2
4,1

14,5
22,1

Tabelle II

Wirkungen eines „aktiven" Chondroitinsulfat-A-Präparates auf die Zahl der Koronararterienäste bei Ratten, die mit einer

durch ein Überangebot von vitamin-D-atherogenen Diät gefuttert wurden*)

*) Das Experiment wurde 6 Wochen nach Fütterung beendet

Man erkennt, daß unter den Bedingungen des oben 65 konkurrierende Applikation eines »aktiven« Präparates j|

genannten Experimentes, in dem eine Verminderung von Chondroitinsulfat A in einem Gehalt von 1% der j

der Zahl der Koronararterienäste bei Ratten eintraf, die Diät zu einer hoch signifikanten Zunahme der S

mit einer atherogenen Diät gefüttert wurden, die Koronararterienzahl führte. In dem Maße, in welchem g|

eine Zunahme der Koronararterienäste in einer bestimmten Herzregion mit einer Zunahme des Kreislaufes in dieser Region verbunden ist, sind »aktive« Präparate von Chondroitinsulfat A aktiv in der Förderung der Ausbildung des Kollateralkreislaufes in den Herzregionen, die von den Koronararterienästen versorgt werden. Zusätzliche Untersuchungen zeigen, daß »aktive« Präparate von Chondroitinsulfat C gleichermaßen aktiv in dieser Hinsicht sind. Demgegenüber waren Präparate von gereinigtem Chondroitinsulfat A und C, die »inaktiv« in der Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit bei Kaninchen unter den früher angegebenen Testbedingungen waren, ohne Aktivität in Hinblick auf die Verhinderung der Abnahme der Koronararterienzahl bei Ratten, die mit einer durch ein Überangebot von vitamin-D-atherogenen Diät gefüttert wurden.

Die Wirksamkeit »aktiver« Präparate von Chondroitinsulfat A und C bei der Verhinderung des Auftretens von Herzanfällen (einschließlich Myokardinfarkten, akuter Koronarinsuffizienz und akuter Myokardischämie) bei Menschen mit ischämischer oder koronarer Herzschwäche wird ciiKch folgende Ergebnisse belegt. Der hier verwendete Ausdruck »ischämische Herzschwäche« beschreibt eine insuffiziente Blutversorgung des Myokard. Gemeint ist nicht nur das Vorliegen einer Koronararterienverkalkung (»stille« Atherosklerose ist in der Koronararterien der Mehrzahl der nordamerikanischen Erwachsenen gegeben), sondern das Fortschreiten des atherosklerotischen Prozesses zum Stadium

ίο einer klinisch und/oder elektrokardiographisch nachweisbaren Abnormalität. 120 Patienten mit ischämischer Herzschwäche, bestimmt durch Elektrokardiogramme und Krankengeschichte, einschließlich Angina pectoris und/oder Zustand nach Myokardinfarkt, die über Zeiträume zwischen 6 Monaten und 20 Jahren behandelt worden waren, wurden in 2 Gruppen zu je 60 Patienten geteilt, die nach Alter, Geschlecht, klinischen- und Laboratoriumsbefunden so vergleichbar wie möglich waren. Ein Vergleich beider Gruppen wird in Tabelle III gegeben.

Tabelle III

Befinden von 60 mit CSA behandelten Patienten mit ischämischer Herzschwäche und 60 Kontroll-Patienten vor der Studie

	Durchschnittsalter (Jahre)	Angina (Fälle)	Früherer Myokardinfarkt (Fälle)	Hochdruck (Fälle)	Unter Anti- Koagulans-Therapie (Fälle)	Gesamtzahl von Patienten
Männer: CSA Kontrollen	66 66	15 19	7 12	6 8	6 7	16 25
Frauen: CSA Kontrollen	64 67	25 20	6 3	20 19	3 3	44 35
Zusammen: CSA Kontrollen	65 66	40 39	13 15	26 27	9 10	60 60

Beide Patientengruppen wurden willkürlich ausgewählt, wie sie in der klinischen Praxis vorkamen. Alle umfassenden, therapeutischen Maßnahmen, die vor dem Test durchgeführt worden waren, wurden fortgesetzt oder ausgedehnt Dazu gehörten Diäten mit niedrigem Natriumgehalt, niedrigem Cholesteringehalt, begrenzte Zuckeraufnahme, wo es angezeigt war, Applikationen von Vasodilatoren für Koronararterien, Cerebralarterien oder periphere Arterien, Sedativa, oralen Antikoagulantien, Vitaminen und/oder Ergänzungsnährstoffen (einschließlich stark ungesättigter öle und Fette), Schilddrüsenextrakten und weiblichen Geschlechtshormonen. Die zwei Gruppen unterschieden sich nur in einer Hinsicht Personen der Gruppe II wurden täglich mit einem »aktiven« Präparat von Chondroitinsulfat A behandelt, jene der Gruppe I nicht Während des ersten Jahres der Untersuchung wurden die Personen der Gruppe II täglich mit 1,5 bis 10 g eines »aktiven« Chondroitinsulfat-A-Präparates behandelt, go anfänglich in Pulverform, später in Form von Tabletten, mit je 0,5 g gereinigtem Chondroitinsulfat je Tablette. Während des zweiten und dritten Jahres der Untersuchung betrug die Dosis des täglich applizierten »aktiven« Chondroitinsulfates A entweder 1,5 oder 3 g &.

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Das Chondroitinsulfat A wurde aus Rinder-Trachta-Knorpeln hergestellt Jede Charge des Chondroitinsulfats A wurde auf ihre Aktivität bei der Verlängerung der Plasma-Thrombus-Bildungszeit getestet, wie oben angegeben. Nur jene Präparate wurden zum Test eingesetzt, die nach dem »Bio-Test« für »aktiv« befunden wurden.

Laboratoriumsteste des hämopoetischen, hepatischen, renalen und anderer Systeme wurden in beiden Patientengruppen durchgeführt. Bei Gruppe II wurden diese Tests gewöhnlich alle ein bis zwei Monate während der ersten Zwei-Jahres-Periode durchgeführt, dann während des dritten Jahres der Behandlungsstudie alle vier Monate. Die Tests waren: vollständige Blutzählung, Senkungsgeschwindigkeit, Urinanalyse, proteingebundenes Jod, Test mit J^l3I-markiertem Trijodthyronin, Natrium, Kalium, Thymoltrübungstest, Serum-Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Serum-GIutamat-Pyruvat-Transaminase, Serum-Bilirubin (direktes und indirektes), Calcium, Phosphor, Creatinin, Glucose, Gesamtprotein, Albumin, Globulin, Harnstoff-Stickstoff, Harnsäure, alkalische Phosphatase, Cephalinflokkulation, Cholesterin und ß-Lipoprotein.

Zusätzlich wurden bei jedem Patienten Thorax-Röntgenaufnahmen und Ruhe-Elektrokardiogramme gemacht Belastungs-Elektrokardiogramme nach Master wurden bei den meisten Patienten angefertigt, ophthaimologische Untersuchungen durch qualifizierte Ophthalmologen wurden in allen Fällen durchgefüi""t;

Photographien der MikroZirkulation in den Konjunktivolgefäßen wurden be 27 Patiettten gemacht.

Korenare Risikofaktoren wie Fettleibigkeit, iiypercholeslerinämie, Hyperlipämie, Hyperbetalipoproteinämie. Hochdruck, Rauchen, Zuckerkrankheit waren bei beiden Gruppen mit etwa gleicher Häufigkeit gegeben.

Schädliche Wirkungen in Verbindung mit der

Chondroilinsulfat-A-Applikation — klinisch oder auf der Basis von Laboraloriumsbefunden — wurden bei keiner Person während der dreijährigen Beobachtungszeit festgestellt.

Tabelle IV gibt Details der Mortalität und Morbidilät bei den 120 Patienten während de. dreijährigen Versuchszeit wieder.

Tabelle IV

Auftreten akuter Herzanfälle bei 60 mit CSA behandelten Patienten und 60 Kontroll-Patienten mit ischämischer Herzschwäche während einer dreijährigen Versuchszeit

Gesamlfalle	2 14	Myokardinfarkte tödlich/nicht tödlich	0 6
Männer: CSA Kontrollen	2 15	2 4	0 4
Frauen: CSA Kontrollen	4 29	1 2	0 10
Zusammen: CSA Kontrollen	) stationär ) stationär oder ambulant **) tödlich	3 6

Akute Koronarinsuffizienz*)

Myokard ischämie**)

Bei den 60 Patienten der Gruppe I, die kein CSA erhielten traten folgende akute Herzanfälle auf:

1. Myokardinfarkte (tödlich) 6 Fälle

2. Myokardinfarkte (nicht tödlich) 10 Fälle

3. Akute Koronarinsuffizienz oder akute Myokardischämie (nicht tödlich) 8 Fälle

4. Myokardischämie (nicht tödlich) 5 Fälle

35

40

Alle oben aufgeführten Patienten wurden stationär behandelt, mit Ausnahme von zwei tödlichen Fällen von Myokardinfarkten, die von einem fremden, behandelnden Arzt auf dem Totenschein als solche diagnostiziert wurden. Patienten, die im Krankenhaus als »akute Koronarinsuffizienz« oder »drohender Myokardinfarkt« diagnostiziert wurden, wurden zunächst in einer Intensivstation für akute Herzerkrankungen eines Krankenhauses behandelt. Unter den 6 tödlichen Fällen mit Myokardinfarkt waren 4 Männer im Alter von 76, 71, 65 und 56 Jahren und 2 Frauen im Alter von 65 und 79 Jahren. Drei Patienten starben während des ersten Jahres, die anderen während der folgenden 2 Jahre der Untersuchung, während die oben beschriebenen, therapeutischen Allgemeinmaßnahmen liefen. Von den 6 Fällen mit Myokardinfarkt (tödlich) hatten 4 Patienten eine Krankengeschichte mit chronischer Angina pectoris.

8 Patienten überlebten die Myokardinfarkte, 2 von ihnen hatten je 2 Anfälle, so daß insgesamt 10 Anfälle von nicht tödlichem Myokardinfarkt vorlagen. Unter diesen 8 Patienten waren 5 Männer und 3 Frauen. Ihr Alter lag zwischen 49 und 83 Jahren, mit einem Durchschnittsalter von 68 Jahren. Keiner von ihnen hatte vor dem Anfall eine Anti-Koagulantientherapie erhalten. 5 Patienten hatten früher schon Myokardinfarkte gehabt

Es gab 8 Fälle (7 Patienten, 1 P. zweimal) von akuter Koronarinsuffizienz. Alle waren in die Intensivstation für akute Herzkrankheiten des Krankenhauses eingewiesen worden, einige mit der Diagnose eines »drohenden« oder »bevorstehenden« Myokardinfarktes, einer »protrahierten Angina pectoris« oder »Status anginosus«. Alle 7 Patienten erholten sich von der akuten Koronarinsuffizienz, aber bei 2 Patienten traten plötzlich massive Myokardinfarkte auf, der eine 12 Monate später (nich,. tödlich), der andere 21 Monate später (tödlich). Der erste der beiden Patienten war zweimal wegen akuter Koronarinsuffizienz in stationärer Behandlung gewesen.

5 Patienten mit Myokardischämie wg-^n wegen Beklemmungszuständen in stationärer Behandlung, die auf ihr kardiovaskuläres System zurückzuführen waren. Die Fälle waren jedoch nicht so schwer, und das EKG und die Blutenzym-Änderungen waren nicht so kritisch, daß eine Einweisung in die Intensivstation für akute Herzkrankheiten erforderlich gewesen wäre; diese Patienten unterlagen folglich der allgemeinen Pflege des Krankenhauses. Alle 5 Patienten waren Frauen; ihr Alter lag zwischen 55 und 75 Jahren, mit einem Durchschnittsalter von 65 Jahren.

Bei den 60 Patienten, die aktives CSA erhielten, traten folgende akute Herzanfälle auf:

1.	Myokarinfarkt (tödlich)	3 Fälle
2.	Myokardinfarkt (nicht tödlich)	0 Fälle
3.	Akute Koronarinsuffizienz
	(terminal)	1 FaU
4.	Myokardischämie	0 Fälle

2 der tödlichen Myokardinfarkte traten bei Männern (68 und 77 Jahre alt) auf, der dritte bei einer Frau (65 Jahre alt).

Beim ersten Patienten mit tödlichem Myokardininfarkt, bei dem eine Autopsie vorgenommen wurde, war

das CSA zwei Monate vor dem Tod abgesetzt worden. Der zweite Patient in dieser Kategorie hatte CSA ein Jahr lang mit Unterbrechungen genommen, dann war es ein Jahr vor dem Tod abgesetzt worden. Die dritte Patientin mit tödlichem Myokardinfarkt litt an persistierendem Hochdruck, der häufig nur schwer oder gar nicht kontrolliert werden konnte. Die Patientin, die an terminaler Koronarinsuffizienz und dekompensierter Herzinsuffizienz starb, hatte diese lerminalen Komplikationen ats Folge einer massiven cerebrovaskulären Blutung bei chronischem Herzflimmern und Herzflattem. Die 3 Patienten hatten eine Krankengeschichte mit Angina pectoris.

Einije Patienten in der mit CSiA behandelten Gruppe mußten häufige, kurze Unterbrechungen in der CSA-Medikation in Kauf nehmen, sie es wegen Lieferschwierigkeiten des Viedikamentes. wegen gelegentlicher »Influenza«-Infektionen im Atmungs- und Verdauungstrakt, oder durch Verdauungsstörungen, hervorgerufen durch Nahrung. Die Unterbrechungen waren von kurzer Dauer, zwischen einigen Tagen bis höchstens einige Wochen.

Bis jetzt sind bei den 60 mit CSA behandelten Patienten, außer den oben genannten 4 Patienten keine neuen Herzanfälle mehr aufgetreten. Genau genommen repräsentieren 2 dieser 4 Patienten keine Fälle des Versagens von CSA in der Verhinderung eines akuten Herzanfalles, da bei dem einen Anfall (tödlicher Myokardinfarkt beim 77jährigen Mann) der Patient des CSA ein Jahr vor seinem Tod abgesetzt hatte, bei dem zweiten Fall der Patient tatsächlich an einer massiven cerebrovaskulären Blutung starb, bei welcher das Herzversagen als terminale Komplikation auftrat.

Eine weitere Patientin in dieser Gruppe starb. Die Autopsie bei der 62jährigen offenbarte ein bösartiges. cerebraleb Astrozytom. Die Patientin zeigte bereits cerebrale Symptome, als die Therapie mit CSA begann, zuvor waren 2 Einweisungen in das Krankenhaus zum Zwecke cerebraler und allgemeiner neurologischer Untersuchungen erfolgt Diese deckten das Vorliegen cerebraler Läsionen nicht auf. sie wurden plötzlich bei einer Operation vor dem Tod und bei der Autopsie nachgewiesen.

Unter den 60 Kontroll-Patienten traten insgesamt 29 Herzanfälle während der 3jährigen Beobachtungsperiode auf. im Gegensatz zu nur 4 Herzanfällen bei der Vergleichs-Patientengruppe, die täglich orale Dosen eines »aktiven« Präparates von Chondroitinsulfat A erhielt.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel wird Vorzugs- so weise zur oralen Verabreichung konfektioniert, wobei dem Wirkstoff die üblichen pharmazeutischen Exzipienten und Träger zugesetzt sind.

Herstellung von »aktivem« CSA

Ein Ausgangsmaterial zur Herstellung von »aktivem« Chondroitinsulfat A ist Rinder Trachea. Das Material wird aus dem Schlachthaus erhalten, möglichst bald nach dem Schlachten der Tiere. Es wird bis zur

55 Verarbeitung gefroren. Bei der Verarbeitung wird es vom Gewebe befreit und fein gemahlen. Das gemahlene Material wird mit 5 Teilen Aceton entfettet In 2 Extraktionen wird der Fettgehalt auf etwa 1% oder weniger gesenkt Das entfettete Material wird getrocknet und erneut gemahlen. In einem Gehalt von 5% wird das Material in einem 0,1-M-Calciumacetat-Puffer suspendiert der 1 % Papain enthält und 0,005 M an Cysteinhydrochlorid und 0,005 M an Dinatrijm-Äthy-Iendiaminotetraacetat (Versen) ist Die letztgenannten Komponenten dienen als Enzymaktivatoren. Die Mischung wird unter leichtem Rühren 24 bis 30 Stunden bei 62° C + 3° C inkubiert Die Trachea wird zu etwa 85 bis 95% gelöst Der Oberstand wird dekantiert und mit dem doppelten Volumen Aceton versetzt Der Acetonübsrstand wird abgetrennt, der verbleibende Niederschlag wird in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 3 bis 5% gelöst Diese Lösung wird unter ständigem Rühren in Portionen zu 2 bis 5 ml mit gesättigter Kaliumpermanganatlösung versetzt, wobei

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abgewartet wird. In Abhängigkeit von der Beschaffenheit des Ausgangsmaterials können zwischen 50 und 200 ml Kaliumpermanganatlösung pro 6 Pfund Ausgangsmaterial erforderlich sein. Sobald die Entfärbungszeit länger als 5 Minuten dauert, wird kein weiteres Permanganat mehr zugegeben. Man läßt die Lösung hierauf über Nacht stehen, damit die Flokkulation des Mangandioxyds erfolgen kann und Reaktionen bis zur Vollständigkeit ablaufen können. Das Mangandioxyd wird durch Zentrifugation oder Filtration durch grobes Filterpapier abgetrennt Der Mangandioxyd-Kuchen wird mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. In einigen Fällen wird die Zugabe einer geringen Menge Formaldehyd oder Methanol zu einer Flokkulation von Mangandioxyd führen. Die vereinigten Überstände werden mit einem Volumenteil Aceton versetzt es bildet sich ein öliger Niederschlag, der nach Dekantieren abgetrennt wird. Der Niederschlag wird vom Lösungsmittel befreit oder in möglichst wenig Wasser gelöst und das Endprodukt durch Lyophilisation der Lösung erhalten. Die Papierchromatographie zeigt, daß das Produkt im wesentlichen aus reinem Chondroitinsulfat A besteht. Die Infrarot-Spektrophotometrie des Produktes zeigt die für Chondroitinsulfat A typische Absorptionskurve. Die Bestimmung der optischen Drehung ergibt Werte von (a)'/ = -24'. der Stickstoffgehalt liegt bei 3_r3%.

Die Herstellung von »aktivem« CSC

Ein Ausgangsmaterial zur Herstellung von »aktivem« Chondroitinsulfat C sind Haifischknorpel. Dieses Material wird in trockener Form gemahlen und mit 3 bis 5 Teilen Aceton entfettet. Eine Extraktion ist im allgemeinen ausreichend. Die extrahierten Haifischknorpel werden weiterbehandelt, wie es oben für getrocknete Rinder-Trachea im Anschluß an die Entfettungsstufe beschrieben wurde.

230 246/26

Claims

Patentanspruch:

Arzneimittel enthaltend ein »aktives« Chondroitinsulfat als Wirkstoff zur Verhinderung des Auftretens atherosklerotischer Läsionen durch Förderung der Ausbildung des Kollateralkreislaufes in Herzregionen, die durch die Äste der Koronaarterien versorgt werden, und zur Verhinderung des Auftretens von Herzanfällen, einschließlich Myokardinfarkten, akuter Koronarinsuffizienz und akuter Myokardischämie bei Menschen mit ischämischer Herzschwäche, wobei der Wirkstoff dadurch erhältlich ist, daß Rinder-Trachea oder Haifisch-Knorpel zerkleinert und entfettet, dann in einem O.l-M-Calciumacetat-Puffer, der 1% Papain enthält und 0,005 M an Cystein und 0,005 M an Äthylendiaminotetraacetat ist, bei einer Temperatur zwischen 59 und 65" C inkubiert, der Überstand mit Aceton versetzt und der erhaltene Niederschlag in physiologischer Salzlösung gelöst und bis zur bleibenden Entfärbung mit Permanganat behandelt, MnCh abgetrennt und das gewünschte Produkt aus der Lösung mit Aceton gefällt wird.