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DE2047952A1 - Verfahren zur photometrischen Aus wertung von lichtstreuenden Objekten - Google Patents

Verfahren zur photometrischen Aus wertung von lichtstreuenden Objekten

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DE2047952A1 DE19702047952 DE2047952A DE2047952A1 DE 2047952 A1 DE2047952 A1 DE 2047952A1 DE 19702047952 DE19702047952 DE 19702047952 DE 2047952 A DE2047952 A DE 2047952A DE 2047952 A1 DE2047952 A1 DE 2047952A1
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Carl Zeiss SMT GmbH
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Description

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FIRMA CARL ZEISS, 7920 HEIDENHEIM (BRENZ)
Verfahren zur photometrischen Auswertung von lichtstreuenden Objekten
Die vorliegende Erfinduno betrifft ein Verfahren zur photometrisehen Auswertung von lichtstreuenden Objekten. Diese Aufgabe stellt sich beispielsweise bei der Auswertung von Pherogrammen oder Chromatogrammen. .
Das Verfahren nach der Erfindung und seine Wirkungsweise wird im folgenden am Beispiel der Auswertung von Dünnschicht-Chromatogrammen beschrieben, ohne daß dadurch der Anwendungsbereich dieses Verfahrens eingeschränkt werden soll.
Die Dünnschicht-Chromatographie· ist ein modernes analytisches Trennverfahren für organische und anorganische Substanzgemische.-
Auf einer meist aus Glas bestehenden Trägerplatte ist eine dünne, aus feinkörnigem lichtstreuendem Material bestehende Schicht des Sorptionsmittels, z.B. Kieselgel aufgetragen, die als Trennschicht bezeichnet wird. Das zu trennende und in Lösung befindliche Substanzgemisoh wird an einer bestimmten Stelle punkt-oder bandförmig auf die Trennschicht aufgetragen. Danach wird die Platte in eine Kammer gestellt, die ein geeignetes Fließmittel enthält. Bei der jetzt einsetzenden Entwicklung wandert das Fließmittel durch Kapillarkräfte über die Trennschicht, wobei das Substanzgemisch aufgetrennt wird. Nach beendeter Entwicklung befinden sich die verschiedenen Substanzen des Gemisches an verschiedenen Stellen der Trennschicht.
Die eigentliche Aufgabe besteht nun darin, das entwickelte Dünnsohicht-Chromatogramm qualitativ und quantitativ auszuwerten.
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Zur Auswertung von Dünnschicht-Chroinatogrammen ist es bekannt, die Substanzflecken zunächst nachzuweisen, danach die Trennschicht im Bereich der einzelnen Substanzflecken abzukratzen, die Substanzen aus dem Sorptionsmittel zu eluieren und dann qualitativ oder quantitativ zu bestimmen. Dieses Auswerteverfahren ist recht umständlich und nicht immer zu verwenden, da ein Rückgewinnungsverlust nicht zu vermeiden ist.
Es ist auch bekannt, Dünnschicht-Chromatogramme direkt auszuwerten. Dazu mißt man die bei Abtastung des Chromatogramms mit einem Lichtbündel konstanter Intensität auftretende unterschiedliche Absorption des Lichtes oder bei fluoreszierenden Substanzen die Emission der Substanzzone.
Die Messung der Absorption geschieht bei Objekten, die keine oder nur eine geringe Lichtstreuung hervorrufen durch Messung der Transmission. Bei lichtstreuenden Objekten, z.B. bei Dünnschicht-Chromatogrammen, ist es vor einer Transmissionsmessung erforderlich, das Objekt mit Hilfe einer Flüssigkeit mit geeignetem Brechungsindex transparent zu machen. Wegen dabei auftretender Elutionseffekte ist ein solches Verfahren zur Auswertung von Dünnschicht-Chrornatogrammen kaum zu empfehlen.
In den letzten Jahren ist man dazu übergegangen, d3e Auswertung von Dünnschicht-Chromatogrammen in Remission vorzunehmen. Dazu wird das Chromatogramm von einem monochromatischen Lichtbündel in Trennrichtung abgetastet und die Intensität der diffus reflektierten Meßstrahlüng wird mit einem photoelektrischen Empfänger gemessen und beispielsweise in Abhängigkeit vom Ort mi"t einem Schreiber aufgezeichnet. Befinden sich auf der Trennschicht lichtabsorbierende Substanz-Flecke, so wird die Remissions- ;' strahlung in den Wellenlängenbereichen geschwächt, wo auch bei Transmissionsmessungen entsprechender" ν Lösungen Absorptionsbanden auftreten würden. Die Intensität der diffus reflektierten Meßstrahlung ist deshalb ein Maß für die durch die Substanz
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verursachte Absorption. Die bei der Abtastung erhaltene Absorptions -Orts -Kurve kann mit. Hilfe der Kubelka-Munk -Funkt ion quantitativ ausgewertet werden.
Bei der geschilderten Auswertung durch Messung der diffus reflektierten Meßstrahlung ist dem zu messenden Effekt stets eine in Abhängigkeit vom Ort auf der Trennschicht unterschiedliche Lichtstreuung überlagert, welche sich vor allem bei geringen Substanzmengen sehr nachteilig bemerkbar macht und die Nachweisgrenze verschlechtert. Diese substanzunspezifische Abhängigkeit der Lichtstreuung vom Ort kann eine sehr ungleichmäßige Basislinie der auszuwertenden Kurve ergeben, welche es in manchen Fällen schwierig oder sogar unmöglich macht, eindeutig zu entscheiden, ob es sich um einen zu messenden oder einen Stör-Effekt handelt. j
Es ist schon vorgeschlagen worden, zur Erhöhung der Meßempfindlichkeit vor dem Aufbringen der zu untersuchenden Substanz die Basislinie der Absorptions-Orts-Kurve aufzunehmen und bei der eigentlichen Auswertung die so ermittelten Werte von der Meßkurve abzuziehen. Dies ist möglich, da die Struktur der Trennschicht bei vorsichtigem Arbeiten erhalten bleibt.
Die Ausführung dieses Vorschlages ist jedoch umständlich und'erfordert ein sehr genaues Arbeiten.
Es ist nun die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur photometrischen Auswertung von lichtstreuenden Objekten, ins- " besondere von Dünnschicht-Chromatogrammen zu schaffen, das gegenüber den üblichen Verfahren die Meßgenauigkeit und die Nachweisgrenze wesentlich verbessert und das trotzdem eine schnelle Auswertung ermöglicht.
Das Verfahren nach der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß an der gleichen Stelle des auszuwertenden Objektes simultan die diffus reflektierte und die durchgelassene Strahlung gemessen ■ werden und daß zur Auswertung die so erhaltenen beiden Signale
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addiert werden. Das Summensignal wird dann zweckmäßig mittels eines Schreibers registriert.
Wie im Zusammenhang mit der Erfindung durchgeführte Untersuchungen zeigen, besteht zwischen der Transmissions- und der Remissions Basislinie auf substanzfreiem lichtstreuendem Untergrund ein enger Zusammenhang. Eine streuungsbedingte Änderung des Remissionsgrades hat eine ebenfalls streuungsbedingte Änderung des Transmissions grades zur Folge und beide Effekte sind in guter Näherung spiegelbildlich zueinander. Bei der erfindungsgemäßen Addition des Remissions- und des Transmissionssignales kompensieren sich daher die streuungsbedingten Signalkomponenten, d.h. die Basislinie der Meßkurve wird begradigt«
Ist auf der lichtstreuenden Unterlage eine absorbierende Substanz aufgetragen, so wird dadurch sowohl der Remissions- als auch der Transmissionsgrad vermindert. Die substanzspezifische Absorption beeinflußt also Remissions- und Transmissionssignal im gleichen Sinne, so daß durch Addition dieser Signale der zu messende Effekt verstärkt wird.
Wie ohne weiteres zu sehen ist, bringt das neue Verfahren bei der Auswertung von Dünnschicht-Chromatogrammen den Vorteil mit sich, daß die streuungsbedingte, d.h. substanzunspezifische Abhängigkeit der Lichtstreuung vom Ort der Trennschicht automatisch während der Messung beseitigt wird, während das eigentliche substanzspezifisehe Meßsignal gleichzeitig verstärkt wird.
Um zu erreichen, daß die streuungsbedingten Remissions- und Transmissionssignale sich bei der Addition möglichst vollständig kompensieren, ist es notwendig, di© Amplituden beider Signale voider Addition auf gleiche Höhe zu bringen. Dies geschieht vorteilhaft dadurch» daß man die Empfindlichkeit eines Emjifängers gegenüber dem anderen herabsetzt. Im allgemeinen wird die Empfindlich^ keit des Transmissionsempfangers herabgesetzt, da dieser die vom
τ 5 -
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Objekt durchgelassene Meßstrahlung nahezu vollständig erfaßt, •während der Remissionsempfänger das diffus reflektierte Meßlicht nur in einem begrenzten Raumwinkel erfaßt.
Durch diese Maßnahmen erreicht man, daß sich die von der Trennschicht herrührenden Schwankungen der Basislinie nur noch in Größenordnungen der eigenen elektronischen Instabilität des gesamten Systems bewegen.
Die Vorrichtung zur Durchführung des neuen Verfahrens ist vorteilhaft so ausgebildet, daß die Meßstrahlung senkrecht auf die Oberfläche des auszuwertenden Objektes auftrifft, daß oberhalb dieser Oberfläche ein erster und unterhalb des Objektes ein zweiter photoelektrischer Empfänger angeordnet ist und daß beide Empfänger mit einer Anordnung zur Addition der Signale verbunden sind. Diese Anordnung steht ihrerseits zweckmäßig mit einem Schreiber in Verbindung, welcher die resultierende Absorptions -Orts-Kurve aufzeichnet.
Es ist vorteilhaft, die photoelektrischen Empfänger über unabhängig voneinander regelbare Verstärker mit der Additions-Anordnung zu verbinden.
Zweckmäßig is't es zur Erfassung des remittierten und des transmit tierten Lichtes, Photometerkugeln oder faseroptische Einrichtungen vorzusehen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Fig. 1-6 der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen zeigen:
Fig. 1 eine durch Messung der remittierten Strahlung aufgenommene Abs or pt i ons-Or-1 s-Kur ve eines Dünnschicht-Cnromatogramms sowie die zugehörige Basislinie;
Fig. 2 die durch Messung der transmittierten Strahlung aufgenommene Absorptions-Orts-Kurve desselben Dünnschicht-Chromatogramrns sowie die zugehörige Basislinie;
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Pig. 5 eine mit Hilfe des neuen Verfahrens aufgenommene Absorptions-Orts-Kurve sowie die zugehörige· Basislinie;
Fig. 4 den schematischen Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung des neuen Verfahrens;
Fig. 5 ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung, bei welchem zur integralen Erfassung der Strahlung Photometerkugeln vorgesehen sind;
Fig. 6 ein weiteres Ausführungsbeispiel der Vorrichtung, bei fc welchem faseroptische Einrichtungen zur Zuführung des Meßlichtes sowie zur Erfassung der remittierten und der transmittierten Strahlung vorgesehen sind.
In Fig. 1 ist mit 1 eine Absorptions-Orts-Kurve bezeichnet, die durch Registrierung der remittierten Strahlung bei der Auswertung eines Dünnschicht-Chromatogramms erhalten wurde. Wie man erkennt, ist dem zu messenden Effekt eine in Abhängigkeit vom Ort an der Trennschicht unterschiedliche Lichtstreuung überlagert.
Die zur Kurve 1 gehörende Basislinie ist mit 2 bezeichnet. Diese Basislinie ist sehr ungleichmäßig und es macht bei der Auswertung große Schwierigkeiten, die schraffiert .eingezeichnete Fläche mit » genügender Genauigkeit zu bestimmen.
Wertet man dasselbe Dünnschicht-Chromatogramm dessen durch Remissions· messung gewonnene Absorptions-Orts-Kurve in Fig. 1 dargestellt ist in Transmission aus, so erhält man die in Fig. 2 mit I1 bezeichnete Absorptions-Orts-Kurve. Die zugehörige Basislinie ist mit 2' bezeichnet.
Wie eine vergleichende Betrachtung der Fig. 1 und 2 zeigt, sind die auf nichtsubstanzbedingte Effekte zurückgehenden Basislinien 2 und 2' in etwa spiegelbildlich zueinander. Die substanz-
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spezifische Absorption dagegen beeinflußt die Kurven 1 und 1' im gleichen Sinne.
Gemäß der Erfindung wird nun zur Bestimmung der Absorptions-Orts-Kurve eine Vorrichtung verwendet, wie sie schematisch in Pig. 4 dargestellt ist. Das von einer Lichtquelle 3 ausgehende Licht wird im Monochromator 4 monochramatisiert und fällt über den Umlenkspiegel 5 auf das mit 6 bezeichnete Dünnschicht-Chromatogramm, Das Meßlicht trifft unter einem Winkel von O Grad zur Flächennormale auf die Trennschicht des Chromatogramms 6 auf. Mittels des photoelektrischen Empfängers 7 wird die diffus remittierte Strahlung gemessen, während gleichzeitig der Empfänger 8 die transmittierte Strahlung mißt. Das vom Empfänger 7 erzeugte Signal wird im Verstärker 9 verstärkt und einer Addierstufe 11 zugeführt. Dieser wird auch das Signal des Empfängers 8 nach Verstärkung im Verstärker 10 zugeführt. Die beiden Verstärker 9 und IO sind vorzugsweise unabhängig voneinander regelbar, so daß die Amplituden der substanzunspezifischen Signale auf gleiche Höhe gebracht weiden können. Das in der Anordnung 11 erzeugte Additionssignal gelangt zum Schreiber 12.
Die vom Schreiber 12 registrierte Absorptions-Orts-Kurve 13 ist in Pig. 3 dargestellt. Die zu dieser Kurve gehörende Basislinie ist ebenfalls in Fig. 3 dargestellt und ist dort mit 14 bezeichnet. Wie man erkennt, ist jetzt die Basislinie so weit eingeebnet, daß die von Ungleichmäßigkeiten der Trennschicht herrührenden Schwankungen nur noch in der Größenordnung der eigenen elektronischen Instabilität des gesamten Systems liegen. Die Auswertung der Kurve 13 ist jetzt verhältnismäßig einfach und kann vor allem mit großer Genauigkeit vorgenommen werden.
Wie ohne weiteres einzusehen ist, läßt sich mit dem neuen Verfahren auch die Nachweisgrenze verbessern, da die Aussehläge der Meßkurye soweit sie für eine Auswertung in Betracht kommen, nur noch auf substanzspezifische Effekte zurückzuführen sind.
Bei dem in Fig. 5 dargestellten Ausführungsbeispiel ist oberhalb
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der Chromatogrammplatte 6 eine Photοmeterkugel 15 angeordnet, welche eine öffnung 16 zum Durchtritt der Meßstrahlung 17 enthält. Die von der Trennschicht der Platte 6 diffus reflektierte Strahlung gelangt gegebenenfalls nach mehrfacher Reflexion an der Photometerkugel 15 zum photoelektrischen Empfänger 18. Unterhalb der Platte ist eine weitere Photometerkugel I9 angeordnet, welche den photoelektrischen Empfänger 20 enthält. Die durch die Trennschicht der Chromatogrammplatte 6 tretende Strahlung gelangt gegebenenfalls nach mehrfacher Reflexion an der Photometerkugel I9 zum Empfänger 20.
Bei dem in Fig. 5 gezeigten Ausführungsbeispiel gelingt es sowohl die remittierte als auch die transmittierte Strahlung weitegehend integral zu erfassen. Dadurch wird die Meßgenauigkeit gegenüber einer einfachen Vorrichtung noch erhöht.
In Fig. 6 1st mit 6 wiederum eine Chromatogrammplatte bezeichnet. Die Meßstrahlung I7 wird über ein Glasfaserbündel 21 zu der auszuwertenden Stelle der Platte 6 geleitet. Das Bündel 21 ist an dieser Stelle geteilt und das Teilbündel 21' leitet das diffus remittierte Licht zu der mit 22 bezeichneten photoelektrischen Zelle. Unterhalb der Auftreffstelle des Meßlichtes I7 ist ein weiteres Glasfaserbündel 2J angeordnet, welches die transmittierte Strahlung erfaßt und zum photoelektrischen Empfänger 24 leitet. Es ist auch möglich, die hier dargestellte Vorrichtung so abzuwandeln, daß nur meßseitig Glasfaserbündel zur Lichtleitung vorgesehen sind.
Bei dem in Fig. 4 dargestellten Ausführungsbeiopiel ist es auch möglich, auf die beiden Verstärker 9 und 10 zu verzichten. In diesem Fall wird die Empfindlichkeit des Transmissionsempfängers 8 so weit herabgesetzt, daß die von den beiden Empfängern 7 und 8 gelieferten substanzunspezifischen Signale gleiche Amplituden aufweisen. Die Verstärkung der Signale kann in diesem Fall nach erfolgter Addition vorgenommen werden.
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Bei dem neuen Verfahren ergeben sich Eichkurven., die zumindest Im Bereich geringer Swbstanzmengen nahezu linear sind* Das neue Verfahren findet deshalb besonders zweckmäßige Anwendung zur Auswertung von Dünnschicht-Chromatogrammen, bei denen nur sehr geringe Substanzmengen zur Verfügung stehen.
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Claims (4)

  1. Pat e ntansprüc he
    (1 «j Verfahren zur photometrischen Auswertung von lichtstretenden Objekten, dadurch gekennzeichnet, daß an der gleichen Stelle des auszuwertenden Objektes simultan die diffus reflektierte und die durchgelassene Strahlung gemessen werden und daß die so erhaltenen beiden Signale addiert werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplituden beider Signale vor der Addition auf gleiche Höhe gebracht werden.
  3. 3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Empfindlichkeit eines Signalempfängers gegenüber der des anderen herabgesetzt wird.
  4. 4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßstrahlung senkrecht auf die Oberfläche des auzuwertenden Objektes (6) auftrifft, daß oberhalb dieser Oberfläche ein erster (7) und unterhalb des Objektes ein zweiter photoelektrisoher Empfänger (8) angeordnet ist und daß beide Empfänger mit einer Anordnung (11) zur Addition der Signale verbunden sind.
    5· Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die photoelektrischen Empfänger (7*8) über unabhängig voneinander regelbare Verstärker (9,10) mit der Additions-Anordnung (11) verbunden sind.
    6» Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß beide Oberflächen des auszuwertenden Objektes (6) mit Photometerkugeln (15,19) in Kontakt stehen, welche die photpelektrischen Empfänger (18,20) enthalten.
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    7· Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß faseroptische Einrichtungen (21,21',2J) zur Zufuhr des Meß lichtes (17) und/oder zur Erfassung der transmittierten und/oder der remittierten Strahlung vorgesehen sind.
    W/ih/Hgs
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