DE19960271A1

DE19960271A1 - Sarcosinoxidase und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE19960271A1
Application number: DE19960271A
Authority: DE
Inventors: Toshio Ichikawa; Yasuji Koyama
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1998-12-14
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2000-07-27
Anticipated expiration: 2019-12-15
Also published as: US6228626B1; JP2000175685A; DE19960271B4

Abstract

Diese Erfindung betrifft eine Sarcosinoxidase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: (a) Wirkungsweise: oxidatives Hydrolysieren von 1 Mol Sarcosin, wobei 1 Mol Glycin, 1 Mol Formaldehyd und 1 Mol Wasserstoffperoxid erhalten werden; (b) Substratspezifität: spezifisch für Sarcosin; (c) pH-Optimum: 7,0-8,0; (d) stabiler pH-Bereich: 7,0-9,5; (e) geeigneter Temperaturbereich für die Wirkung: 50 DEG C; (f) Hitzestabilität: 55 DEG C oder weniger und (g) Molekulargewicht: 44000 Daltons (durch Abschätzung aus der Aminosäuresequenz des Wildtyps) und ein Verfahren zur Herstellung der Sarcosinoxidase, umfassend die Schritte der Züchtung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit, die Sarcosinoxidase zu produzieren und der Gewinnung der Sarcosinoxidase aus der Kultur.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Sarcosinoxidase, die eine hohe Reaktivität unter neutralen Bedingungen zeigt, und ein Verfahren zur Herstellung der Sarcosinoxidase.

Sarcosinoxidase ist ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, um Sarcosin oxidativ zu hydrolysieren, wobei Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid erzeugt werden. Dieses Enzym kann zur Bestimmung von Creatinin- oder Creatinmengen in menschlichen Serum- oder Urinproben in Kombination mit Creatininase oder Creatinase verwendet werden und ist daher als ein diagnostisches Enzym für eine Vielzahl von Krankheiten wie eine Leber erkrankung nützlich.

Herkömmliche Sarcosinoxidasen weisen Nachteile, wie eine drastisch verringerte Reaktivität unter neutralen bis schwach sauren Bedingungen auf. Demgemäß wurden sie im allgemeinen unter schwach alkalischen Bedingungen verwendet. Vgl. JP-B-1-34035, JP-A-5- 115281, JP-A-8-238087, JP-A-6-113840 und JP-A-4-94688. Wenn sie jedoch mit Seren um gesetzt werden, reagieren solche Sarcosinoxidasen im optimalen pH-Bereich gut mit dem Substrat, werden aber durch Bilirubin leicht beeinflußt, was Fehler in Tests hervorruft.

Wenn dagegen Sarcosinoxidase mit Seren bei einem pH-Wert von etwa 6,5 umgesetzt werden kann, wird sie durch Bilirubin nicht beeinflußt und ruft folglich keine solche Fehler hervor. Demgemäß bestand immer ein Bedarf für eine Sarcosinoxidase, die unter neutralen bis schwach sauren Bedingungen verwendet werden kann.

Außerdem ist die Verwendung eines solchen Enzyms mit einer erhöhten Reaktivität unter schwach alkalischen Bedingungen (d. h. niedrigem Km-Wert) sehr wirtschaftlich, da eine geringere Menge des Enzyms eine ausreichende Reaktion ergeben kann, wenn es als ein diagnostisches Enzym unter normalen Bedingungen verwendet wird.

Ein Ziel der Erfindung ist, eine Sarcosinoxidase mit einer hohen Reaktivität unter neutralen Bedingungen bereitzustellen.

Ein anderes Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung der Sarcosin oxidase bereitzustellen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß eine genetische Mutation eines von Bacillus sp. NS-129 abstammenden Sarcosinoxidase-Gens (wie in JP-B- 6-65303 offenbart) eine mutierte Sarcosinoxidase ergab, die nicht nur eine höhere Reaktivität (d. h. kleineren Km-Wert) als die einer Wildtyp-Sarcosinoxidase unter schwach alkalischen Bedingungen zeigen kann, sondern auch eine relativ höhere Reaktivität unter neutralen Bedingungen (pH 7,0) beibehält.

Folglich betrifft die vorliegende Erfindung eine Sarcosinoxidase, die die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften besitzt:

a) Wirkungsweise: oxidatives Hydrolysieren von 1 Mol Sarcosin, wobei 1 Mol Glycin, 1 Mol Formaldehyd und 1 Mol Wasserstoffperoxid erhalten werden;
b) Substratspezifität: spezifisch für Sarcosin;
c) pH-Optimum: 7,0-8,0;
d) stabiler pH-Bereich: 7,0-9,5;
e) geeigneter Temperaturbereich für die Wirkung: 50°C;
f) Thermostabilität: 55°C oder weniger; und
g) Molekulargewicht: 44.000 Daltons (bei der annähernden Abschätzung aus der Amino säuresequenz des Wildtyps).

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Sarcosinoxidase aus E. coli JM109 (pSO12 EH) (Hinterlegungsnr. FERM BP-6597) oder einer davon abstammenden Variante erhältlich.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Sarco sinoxidase, umfassend die Schritte der Züchtung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit die Sarcosinoxidase zu produzieren, und Gewinnung der Sarcosinoxidase aus der Kultur.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Mikroorganismus E. coli JM109 (pSO12 EH) (Hinterlegungsnr. FERM BP-6597) oder eine davon abstammende Variante.

Der hier verwendete Begriff "Variante" bezeichnet einen mutierten Stamm von E. coli JM109 (pSO12 EH), der in der Lage ist, eine Sarcosinoxidase mit den vorstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften zu produzieren.

Diese Beschreibung schließt einen Teil oder alle der in der Beschreibung und/oder den Zeichnungen der Japanischen Patentanmeldung Nr. 10-354482, die eine Prioritätsanmel dung der vorliegenden Anmeldung ist, offengelegten Inhalte ein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm, das das pH-Optimum des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.

Fig. 2 ist ein Diagramm, das den geeigneten Temperaturbereich für die Reaktion des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.

Fig. 3 ist ein Diagramm, das den geeigneten pH-Bereich für die Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.

Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Thermostabilität des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.

Fig. 5 ist ein Diagramm, das den Vergleich der Reaktivität zwischen dem erfin dungsgemäßen mutierten Enzym, dem Wildtyp-Enzym und einer im Handel von einem anderen Hersteller erhältlichen bestimmten Sarcosinoxidase zeigt.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.

Die erfindungsgemäße Sarcosinoxidase kann erhalten werden, zum Beispiel wie nachstehend beschrieben.

Zuerst wird rekombinantes Plasmid pSO12-DNA, die ein aus einem isolierten Bacillus sp. NS-129-Stamm stammendes Sarcosinoxidase-Gen enthält (Agricultural and Biological Chemistry 55(5) (1991), 1259-1263), extrahiert und aus E. coli JM109 (pSO12) unter Verwendung von QIAGEN (Funakoshi Co., Ltd., Tokyo, Japan) gereinigt.

Vektor-DNAs, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind nicht auf die vorstehend beschriebene Plasmidvektor-DNA begrenzt, sondern schließen weiterhin zum Beispiel Bakteriophagenvektor-DNAs und jegliche andere Plasmidvektor-DNAs ein. Ins besondere wird pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan) bevorzugt.

Anschließend kann jegliches Verfahren angewendet werden, um ein Sarcosin oxidase-Gen zu erhalten, das ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1, aber mit Deletionen, Substitutionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren darin; und mit einer Sarcosinoxidase-Aktivität, vorzugsweise einer relativ hohen Reaktivität unter neutralen bis schwach sauren Bedingungen, codiert. Beispiele eines solchen Verfahrens umfassen die Zufallspunktmutation der vorstehend beschriebenen rekombinanten Plasmid- DNA, die erzeugt wird durch Verwendung chemischer Mutagenesemittel, wie Hydroxylamin oder salpetrige Säure, oder durch PCR-Verfahren; die gut bekannte ortsspezifische Mutagenese der rekombinanten Plasmid-DNA, wobei ortsspezifische Mutationen wie Sub stitutionen oder Deletionen durch Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits erzeugt werden; und die Oligonucleotid-Mutagenese, ein Verfahren, das die Schritte der selektiven Spaltung der rekombinanten Plasmid-DNA, Entfernung oder Addition eines oder mehrerer ausgewählter Oligonucleotide und dann die Ligierung der DNA umfaßt.

Die wie vorstehend beschrieben behandelten rekombinanten DNAs können durch Verwendung von zum Beispiel einer Entsalzungssäule oder QIAGEN (Funakoshi Co., Ltd., Tokyo, Japan) gereinigt werden, um verschiedene rekombinante DNAs zu erhalten.

Die auf diese Weise erhaltene rekombinante DNA kann verwendet werden, um eine Transformante oder Transfektante, die eine rekombinante DNA umfaßt, enthaltend ein belie biges Fragment des Sarcosinoxidase-Gens, durch Transformieren oder Transfizieren von zum Beispiel E. coli K12, vorzugsweise E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan), oder XL1-Blue (Funakoshi Co., Ltd., Tokyo, Japan) zu erhalten.

Durch Transformation kann zum Beispiel ein Stamm, der eine Sarcosinoxidase mit der gewünschten Eigenschaft produziert (d. h. eine hohe Reaktivität in einem neutralen pH- Bereich), aus der so erhaltenen Transformante (die eine rekombinante Plasmid-DNA umfaßt, enthaltend ein mutiertes Sarcosinoxidase-Gen) durch das folgende Verfahren erhalten wer den:
Jede Kolonie der erhaltenen Transformante wird in einem Flüssigmedium wie TY- Medium (supplementiert mit 50 µg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG) gezüchtet, um verschie dene mutierte Sarcosinoxidasen zu induzieren, die von den rekombinanten Plasmid-DNAs codiert werden. Nach der Züchtung wird die Kultur einer Ultraschallbehandlung unterzogen und die rohe Enzymextraktlösung wird in Bezug auf ihre Sarcosinoxidase-Aktivität klassifi ziert. Die 100 mE entsprechende Menge der rohen Enzymlösung wird aus dem erhaltenen Aktivitätswert berechnet. Dann läßt man das Rohenzym der 100 mE entsprechende Menge mit 0,5 mM Sarcosin in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) reagieren. Jede Variante wird extra hiert und in Bezug auf ihren Aktivitätswert klassifiziert, der mit dem des Wildtyp-Proteins verglichen wird, um eine Transformante von Interesse auszuwählen.

Durch Verwendung einer wie vorstehend beschrieben hergestellten Transformante oder Transfektante, die die Fähigkeit besitzt, eine Sarcosinoxidase zu produzieren, die eine hohe Reaktivität in einem neutralen pH-Bereich zeigt, und vorzugsweise unter Verwendung einer zur Gattung Escherichia gehörenden Transformante oder Transfektante kann eine Sarcosinoxidase, die eine hohe Reaktivität in einem neutralen pH-Bereich zeigt, wie folgt hergestellt werden:
Eine Standardfeststoffkultur kann verwendet werden, um den vorstehend beschrie benen Mikroorganismus zu züchten, obwohl eine Flüssigkultur bevorzugt wird.

Beispiele von Medien zur Züchtung des vorstehend beschriebenen Mikroorganis mus schließen solche ein, die ein oder mehrere anorganische Salze, wie Kaliumdihydrogen phosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-sulfat und Mangansulfat, zusammen mit einer oder mehreren Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser und Exsudat von Sojabohne oder Weizenkoji, enthalten. Saccharinmaterialien, Vitamine und ähnliches können gegebenenfalls zugegeben werden.

Der anfängliche pH-Wert des Mediums kann in geeigneter Weise auf einen Wert von 7-9 eingestellt werden. Der Mikroorganismus kann vorzugsweise bei einer Temperatur von 30-42°C und vorzugsweise etwa 37°C für einen Zeitraum von 6-24 Stunden durch zum Beispiel submerse Belüftungskultur, Schüttelkultur oder Standkultur gezüchtet werden. Nach der Züchtung kann die Sarcosinoxidase aus der Kultur durch übliche Enzymgewinnungsverfahren gewonnen werden.

Die Zellen werden von der Kultur durch Filtration, Zentrifugation und ähnliches getrennt und dann gewaschen. Vorzugsweise kann die Sarcosinoxidase aus den Zellen ge wonnen werden. In diesem Fall können die Zellen per se verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Sarcosinoxidase vorzugsweise aus den Zellen durch zum Beispiel Aufbrechen der Zellen unter Verwendung von beliebigen Mitteln wie einem Ultraschall-Dis ruptionsgerät, einer "French Press", "Diner Mill" und ähnlichen, Lyse der Zellwände unter Verwendung eines die Zellwand lysierenden Enzyms wie Lysozym oder Extraktion des Enzyms aus den Zellen mit Tensiden wie Triton X-100 gewonnen werden.

Nützliche Verfahren zur Reinigung eines Enzyms können angewendet werden, um die Sarcosinoxidase aus der wie vorstehend beschrieben erhaltenen rohen Enzymlösung zu isolieren. Zum Beispiel können eine Ammoniumsulfatfällung, organische Lösungsmittel fällung, Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Absorptionschro matographie und Elektrophorese allein oder in Kombination miteinander verwendet werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Sarcosin oxidase sind wie folgt:

1. Wirkungsweise
Dieses Enzym hydrolysiert oxidativ 1 Mol Sarcosin, wobei 1 Mol Glycin, 1 Mol Formaldehyd und 1 Mol Wasserstoffperoxid hergestellt werden;
2. Substratspezifität
Dieses Enzym ist für Sarcosin spezifisch;
3. pH-Optimum
Die relative Reaktivität des Enzyms wurde bei 37°C für 10 Minuten unter ver schiedenen pH-Bedingungen in 50 mM MES-Puffer (pH 5,5-7,0), 50 mM Phos phatpuffer (pH 6,5-8,0), 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0-8,5) und 50 mM CAPS- Puffer (pH 9,0-9,5) bestimmt. Die relativen Aktivitäten sind in Fig. 1 gezeigt, aus der sich ergibt, daß das pH-Optimum des Enzyms in einem Bereich von pH 7,0-8,0 liegt.
4. Geeignete Temperatur für die Wirkung
Die Reaktivität des Enzyms wurde bei verschiedenen Temperaturen in einer Reak tionslösung bestimmt, umfassend die gleichen Zusammensetzungen wie die, die in dem nachstehend beschriebenen Test zu verwenden sind. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt, aus der sich ergibt, daß die geeignete Temperatur zur Umsetzung des Enzyms 50°C beträgt.
5. Stabiler pH-Bereich des Enzyms
Die pH-Stabilität des Enzyms wurde bei 20°C für 20 Stunden bei pH 6,0-11,0 in 50 mM MES-Puffer (pH 6,0-8,0), 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0-8,0), 50 mM Tris- HCl-Puffer (pH 8,0-9,0), 50 mM CHES-Puffer (pH 9,0-10,0) und 50 mM CAPS- Puffer (pH 10,0-11,0) getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt, aus der sich ergibt, daß der stabile pH-Bereich pH 7,0-9,5 ist.
6. Hitzestabilität
Die Hitzestabilität des Enzyms wurde in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,7) bei verschiedenen Temperaturen 10 Minuten getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt, aus der sich ergibt, daß das Enzym bei einer Temperatur von bis zu etwa 55°C stabil ist.
7. Enzymtest
0,25 M Phosphatpuffer (0,1 ml, pH 7,7), 0,2 M Sarcosinlösung (0,3 ml) und die Enzymlösung mit der geeigneten Konzentration (0,1 ml) wurden gemischt und bei 37°C 10 Minuten umgesetzt. Dann wurde 1,0 N Essigsäurelösung (0,5 ml) zu dem Gemisch zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Zu dem Gemisch wurden 3 ml Acetylaceton-Farbentwicklungslösung (Acetylaceton, 0,2% (Vol./Vol.) und Diammoniumhydrogenphosphat, 10% (Gew./Vol.)) (pH 6,5), zugegeben, um den Farbstoff bei 37°C für 40 Minuten zu entwickeln. Die Absorption wurde bei 410 nm durch ein Spektrophotometer bestimmt. Dann wurde die Ausbeute des Enzyms aus der vorher hergestellten Kalibrierungskurve von Formaldehyd bestimmt. Die Menge des Enzyms, die 1 µMol Formaldehyd pro Minute bei 37°C erzeugt, wurde als 1 Einheit definiert.
8. Km-Wert
Der Km-Wert des Enzyms wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Tests bestimmt. Aus einem Lineweaver-Burk-Diagramm ergab sich ein Km-Wert von etwa 3,5 mM (für Sarcosin).
9. Reaktivität unter neutralen Bedingungen
Da das mutierte Enzym eine höhere Reaktivität als andere Sarcosinoxidasen unter neutralen Bedingungen (pH 7,0) zeigt, wurde die Reaktivität von 30 mE/ml Enzym mit 0,5 mM Substrat (Sarcosin) mit der einer im Handel erhältlichen Sarcosin oxidase verglichen, die einen Km-Wert aufwies, der zu dem Enzym praktisch äqui valent war, und die eine große Homologie zu dem Enzym aufwies. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Das vorliegende mutierte Enzym zeigt eine relativ geringere Reaktivität als die der im Handel erhältlichen Sarcosinoxidase, aber eine außerordentlich höhere Reaktivität als die des Wildtyps unter schwach alkalischen Bedingungen, während es eine höhere Reaktivität unter neutralen bis schwach sauren Bedingungen (pH 7,0-6,5) zeigte.
10. Molekulargewicht
Dieses Enzym weist ein Molekulargewicht von 44.000 Daltons auf (durch Abschätzung aus der Aminosäuresequenz des Wildtyps).

Beispiele

Bestimmte Beispiele der vorliegenden Erfindung werden nachstehend beschrieben.

Beispiel 1 (1) Herstellung rekombinanter Plasmid pSO12-DNA

E. coli JM109 (pSO12) (Agricultural and Biological Chemistry 55(5) (1991), 1259- 1263) wurde in 20 ml TY-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl, pH 7,5) beimpft und durch Schüttelkultur bei 37°C 18 Stunden gezüchtet. Die Kultur wurde bei 6.000 UpM 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Rekombinante Plasmid pSO12- DNA wurde extrahiert und aus den Zellen unter Verwendung von QIAGEN-Tip-100 (Funakoshi Co., Ltd., Tokyo, Japan) gereinigt, wobei 70 µg rekombinante Plasmid pSO12- DNA erhalten wurden.

(2) Mutagenese

2 µg der vorstehend erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA wurden verwendet, um XL1-RED-Zellen (STRATAGENE Co., USA) (die mit größerer Wahrscheinlichkeit einen Fehler bei der Plasmidreplikation erzeugen und folglich mit größerer Wahrscheinlichkeit eine Mutation erzeugen) gemäß dem Verfahren von Morrison D. M. (Method in Enzymology 68 (1979), 326-331) zu transformieren, wobei etwa 1500 Kolonien der Transformante erhalten wurden, von denen 500 Kolonien jeweils in 20 ml TY-Medium beimpft und bei 37°C 18 Stunden durch Schüttelkultur gezüchtet wurden. Die Kultur wurde bei 6000 UpM 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Dann wurde das Plasmid pSO12 extrahiert und aus den Zellen unter Verwendung von QIAGEN-Tip-100 (Funakoshi Co., Ltd., Tokyo, Japan) ge reinigt, wobei 70 µg mutierte rekombinante Plasmid pSO12-DNA erhalten wurden, von denen 5 µg verwendet wurden, um den E. coli JM109-Stamm (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan) gemäß dem Verfahren von Morrison D. M. (a.a.O.) zu transformieren, wobei etwa 2000 Transformanten erhalten wurden, die mutierte Plasmide enthielten. E. coli JM109 (pSO12 EH), das eine Sarcosinoxidase mit einer hohen Reaktivität in einem neutralen pH- Bereich produziert, wurde durch Durchmusterung unter neutralen Bedingungen (pH 7,0) gemäß dem nachstehend in (3) beschriebenen Verfahren erhalten.

(3) Durchmusterung einer Variante, die eine hohe Reaktivität in einem neutralen pH- Bereich zeigt

Zuerst wurde jede Kolonie der vorstehend erhaltenen Transformanten in einem Flüssigmedium, 2 ml TY-Medium (supplementiert mit 50 µg Ampicillin und 1 mM IPTG), gezüchtet und verschiedene Sarcosinoxidasen, die von den Plasmiden codiert werden, wurden induziert, so daß sie produziert wurden. Anschließend wurde die Kultur einer Ultraschall behandlung unterzogen. Die so erhaltene rohe Enzymextraktlösung wurde in Bezug auf ihre Reaktivität bei pH 7,0 klassifiziert. Der erhaltene Wert wurde verwendet, um eine 100 mE entsprechende Menge der rohen Enzymlösung zu berechnen. Die rohe Enzymlösung einer 100 mE entsprechende Menge ließ man mit 0,5 mM Substrat (Sarcosin) reagieren, um deren Reaktivität zu bestimmen. In ähnlicher Weise wurde jede der anderen Varianten extrahiert und deren Reaktivität wurde mit der der Wildtyp-Sarcosinoxidase verglichen. Eine Variante, die das Ziel der vorliegenden Erfindung erfüllt, wurde ausgewählt, und eine Sarcosinoxidase, die eine hohe Reaktivität in einem neutralen pH-Bereich zeigte, wurde aus der ausgewählten Variante E. coli JM109 (pSO12 EH) erhalten. E. coli JM109 (pSO12 EH) wurde gemäß dem Budapester Vertrag beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) als FERM BP-6597 am 11. Dezember 1998 hinterlegt.

Beispiel 2

Die vorstehend erhaltene Variante, d. h. E. coli JM109 (pSO12 EH), wurde in 100 ml 1 mM Isopropyl-β-D-galactosid-enthaltendem TY-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefe extrakt, 0,25% NaCl, pH 7,5) verteilt in Sakaguchi-Kolben 16 Stunden durch Schüttelkultur gezüchtet und dann in 20 l eines in ähnlicher Weise hergestellten TY-Mediums in einem 30 l- Kulturgefäß flammbeimpft. Nach dem Beimpfen wurde der E. coli-Stamm bei 450 UpM, 20 l Luft/min und 37°C etwa 20 Stunden gezüchtet.

Nach der Züchtung wurden die Zellen aus 20 l der Kultur durch eine Microzer- Vorrichtung (PW-303, erhältlich von Asahi Chemical Industry Co., Ltd., Osaka, Japan) ge wonnen, in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und in 10 l des gleichen Phosphat puffers suspendiert.

Zwanzig Gramm Lysozym (in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 100 ml) und. 1 l 0,55 M EDTA (pH 8,0) wurden zu 10 l der vorstehend beschriebenen Zellsuspension zuge geben, gemischt, bei 30°C über Nacht stehengelassen und dann mit 500 ml 5%iger Protamin lösung (pH 8,0) tropfenweise unter Rühren versetzt, um Nucleinsäuren zu entfernen. Die wäßrige Phase wurde gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) (nachstehend bezeichnet als "Puffer A") dialysiert.

Nachdem etwa 3 kg (bezogen auf die Feuchtmasse) DEAE-Cellulose zu etwa 281 des Dialysats zugegeben und eingemischt wurden, um zu ermöglichen, daß die Sarcosin oxidase daran adsorbiert wird, wurde die DEAE-Cellulose mit Puffer A, enthaltend 5% Glycerin und 0,05% 2-Mercaptoethanol, gewaschen. Dann wurde die Sarcosinoxidase mit 0,5 M KCl enthaltendem Puffer A vor der Ultrafiltration und Konzentration eluiert.

Etwa 1,0 kg (Feuchtmasse) DEAE-Sepharose CL-4B wurde zu der vorstehend be schriebenen konzentrierten Lösung (etwa 1,0 l) zugegeben und eingemischt, um zu ermögli chen, daß die Sarcosinoxidase daran adsorbiert wird. Die DEAE-Sepharose CL-4B wurde mit 0,05 M KCl enthaltendem Puffer A gewaschen und die Sarcosinoxidase wurde mit Puffer A, enthaltend 0,3 M KCl, vor der Ultrafiltration und Konzentration eluiert.

Anschließend wurde ein Teil der rohen Enzymlösung an eine mit Puffer A äquili brierte QAE-Sephadex A-50-Säule (6,0 × 30 cm) adsorbiert und mit einem Gradienten von Puffer A zu 0,4 M Kaliumchlorid enthaltendem Puffer A eluiert, wobei eine die Sarcosin oxidase enthaltende gelbe Fraktion erhalten wurde.

Nach Extrafiltration und Konzentration der Sarcosinoxidase-enthaltenden Fraktion wurde das Konzentrat gefriergetrocknet, wobei etwa 1 g der gereinigten, pulverförmigen Sarcosinoxidase erhalten wurde.

Vorteilhafte Wirkung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung kann ein Verfahren für die effiziente Herstellung einer Sarcosinoxidase, die eine hohe Reaktivität in einem neutralen pH-Bereich zeigt und folglich industriell verwendbar ist, bereitstellen.

Alle Veröffentlichungen einschließlich der hier angeführten Patente und Patent anmeldungen sind hier unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.

Die hier beschriebene Sequenz von SEQ ID Nr. 1 wird nachstehend angegeben.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Sarcosinoxidase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

- Wirkungsweise: oxidatives Hydrolysieren von 1 Mol Sarcosin, wobei 1 Mol Glycin, 1 Mol Formaldehyd und 1 Mol Wasserstoffperoxid erhalten werden:
- Substratspezifität: spezifisch für Sarcosin;
- ph-Optimum: 7,0-8,0;
- stabiler ph-Bereich: 7,0-9, 5;
- geeignete Temperatur für die Wirkung: 50°C;
- Hitzestabilität: 55°C oder weniger; und
- Molekulargewicht: 44.000 Daltons (durch Abschätzung aus der Aminosäuresequenz des Wildtyps).

2. Sarcosinoxidase nach Anspruch 1, wobei die Sarcosinoxidase erhältlich ist aus E. coli JM109 (pSO12 EH) (Hinterlegungsnr. FERM BP-6597) oder einer davon stammenden Variante.

3. Verfahren zur Herstellung der Sarcosinoxidase, umfassend die Schritte der Züchtung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit, die Sarcosinoxidase nach Anspruch 1 zu produzieren, und der Gewinnung der Sarcosinoxidase aus der Kultur.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus E. coli JM109 (pSO12 EH) (Hinterlegungsnr. FERM BP-6597) oder eine davon abstammende Variante ist.