DE3942129C2

DE3942129C2 - Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Gen

Info

Publication number: DE3942129C2
Application number: DE3942129A
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Sagai; Kimiko Hattori; Mamoru Takahashi
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1988-12-29
Filing date: 1989-12-20
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2009-12-21
Also published as: US5137821A; DE3942129A1; FR2641285A1; JP2742281B2; JPH02177887A; FR2641285B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Gen von Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase und ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase unter Verwendung dieses Gens.

Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, nachstehend abgekürzt als G6PDH, ist ein Enzym, welches eine enzymatische Reaktion katalysiert, durch welche Gluconsäurelacton-6-phosphat und die reduzierte Form von NAD(P), d. h. NAD(P)H, aus Glucose-6-phosphat und NAD oder NADP gebildet wird, welches nachstehend als NAD(P) bezeichnet wird. Dieses Enzym ist im Tier- und Pflanzenreich weit verbreitet, und seine hohe Aktivität wird in tierischen Geweben beobachtet, beispielsweise in der Nebennierenrinde, in der Milz und in der Brustdrüse während der Säugeperiode. Über dieses Enzym, von dem angegeben wird, daß es gereinigt werden kann, ist folgendes bekannt: G6PDH, gewonnen aus der Brustdrüse [J. Biol. Chem. 236, 754-758 (1961)]; G6PDH, gewonnen aus der Leber [Biochem. J. 55, 400-408 (1953); G6PDH, gewonnen aus roten Blutkörperchen [J. Biol. Chem. 224, 1047-1064 (1957), Meth. Enzymol. 9, 126-131 (1966) und J. Biol. Chem. 241, 4966-4976 (1966)]; G6PDH, gewonnen aus Bierhefe [J. Biol. Chem. 216, 67-79 (1955)]; G6PDH aus Candida utilis [Z. physiol. Chem., 350, 626- 634 (1969) und Biochim. Biophys. Acta, 191, 509-516 (1969)]; G6PDH aus Leuconostoc mesenteroides, Azotobactervinelandii und Pseudomonas fluorescens [Meth. Enzymol. 1, 328-334 (1955)] (Enzyme Handbook, Seiten 20-21, Asakura Press, 1984, dritte überarbeitete Fassung der Erstausgabe); G6PDH, gewonnen aus einem Bakterium, welches zur Gattung Bacillus gehört, ist ebenfalls bekannt und beschrieben in Arch. Microbiol., 98, 275-287 (1974) sowie der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 43079/ 1988. Bezüglich der Nucleotidsequenz des menschlichen G6PDG- Gens und derjenigen des G6PDH-Gens von Ratten wird in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 4157-4161 (1986) und Nucleic Acids Research 16, 7746 (1988) berichtet.

Das Enzym G6PDH wird derzeit ständig als ein Enzym zum Nachweis von Kreatinkinase verwendet, um dadurch einen Myocardialinfarkt zu diagnostizieren. Es ist daher ein außerordentlich nützliches Enzym. Wenn G6PDH als ein diagnostisches Reagens eingesetzt wird, so muß es aber sowohl eine Langzeitstabilität als auch thermische Stabilität aufweisen. Es haben sich jedoch Probleme bei der üblichen Herstellung von G6PDH-Enzym unter Verwendung von dieses Enzym erzeugenden Bakterien ergeben. Die Produktivität solcher Bakterien bezüglich der Erzeugung von G6PDH ist nämlich so niedrig, daß es schwierig ist, dieses Enzym kostengünstig in größerer Menge herzustellen, und außerdem ist es schwierig, kontaminierende Enzyme, wie beispielsweise NAD(P)H- oxidase und Lactat-dehydrogenase, daraus zu entfernen.

Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um die vorstehend genannten Probleme zu lösen, und es ist ihnen gelungen, aus einem Bakterium, welches nachstehend als zu der Gattung Bacillus gehörend definiert wird, ein Gen zu isolieren und zu reinigen, welches die Aminosäuresequenz desjenigen Polypeptids kodiert, das das Enzym G6PDH aufbaut, und außerdem ist es ihnen gelungen, speziell die Primärstruktur der DNA und derjenigen der Aminosäuresequenz aufzuklären, aus welcher das besagte Enzym aufgebaut ist. Die Erfinder bestätigen, daß die Nucleotidsequenz der DNA und die Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung beides neue Substanzen sind, weil sie sich hinsichtlich ihrer Konstitution und Homologie von den Nucleotidsequenzen der Gene von Human-G6PDH und von Ratten-G6PDH und deren Aminosäuresequenzen unterscheiden.

In den Figuren der Zeichnungen ist folgendes dargestellt:

Fig. 1 (Fig. 1A bis 1D) zeigt die Aminosäuresequenz des Polypeptids, welches das G6PDH-Enzym aufbaut.

Fig. 2 (Fig. 2A bis 2C) zeigt die DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, das das G6PDH- Enzym aufbaut.

Fig. 3 zeigt die Schnittstellenkartierung des Plasmids pG6DH1 für Restriktionsenzyme.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher unter anderem die folgenden Gegenstände:
Die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert;
ein Plasmid, welches gekennzeichnet ist durch die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert;
einen Transformand, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäurefrequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert, und welcher einer Wirtszelle fremd ist;
ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, umfassend die folgenden Maßnahmen: Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert, und welcher einer Wirtszelle fremd ist, um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium;
ein Polypeptid, bestehend aus der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator.

Die Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, welche in Fig. 1 wiedergegeben ist, kann sowohl am N-Terminator als auch am C-Terminator Aminosäurereste oder Polypeptidreste aufweisen, sie kann auch am N-Terminator von Thr aus rückwärts gerichtet eine oder mehrere Aminosäurereste aufweisen und diese(r) Aminosäurerest(e) können Met oder ein Signalpeptid sein. Auch am C-Terminator von Ile aus rückwärts gerichtet können ein oder mehrere Aminosäurereste vorhanden sein.

Die neue DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, kann eine DNA sein, welche eine Serie von irgendwelchen Codons umfaßt, welche jeweils einer Aminosäure entsprechen, welche die betreffende Aminosäuresequenz aufbauen, einschließlich Aminosäureresten oder Polypeptidresten am N-Terminator und am C-Terminator.

Eine solche DNA wird wiedergegeben durch die in Fig. 2 angegebene Nucleotidsequenz, ausgehend von dem 5′-Terminator. Diese DNA kann eine solche DNA sein, welche einen oder mehrere Codons aufweist, welche Aminosäuren codieren, die vom 5′-Terminator aus rückwärts gerichtet sind, vorausgesetzt, daß es sich dabei nicht um Codone der Struktur TAA, TAG und TGA handelt. Vorzugsweise kann die DNA ein Codon ATG oder ein Startcodon außer ATG aufweisen oder Codons, welche einem Signalpeptid entsprechen. Die DNA kann am 3′-Terminator von ATA vorwärts gerichtet eine oder mehrere Codons aufweisen, welche Aminosäuren codieren, oder sie kann ein Translations-Stopcodon haben. Falls die DNA ein oder mehrere Codons aufweist, welche Aminosäuren am 3′-Terminator codieren, kann die DNA außerdem vorzugsweise am 3′-Terminator ein Translations-Stopcodon für dasjenige Codon aufweisen, welches die Aminosäure codiert.

Die DNA, welche die in Fig. 1 wiedergegebene Aminosäuresequenz codiert bzw. die in Fig. 2 wiedergegebene DNA kann auf die folgende Weise erhalten werden:

Die DNA, welche aus dem als Donator für das G6PDH-Gen eingesetzten Bakterium, welches G6PDH bildet, isoliert und gereinigt worden ist, wird mittels Ultraschallbehandlung oder mittels Restriktionsenzymen gespalten und anschließend an ihren beiden stumpfen Enden oder an den kohäsiven Enden mit einem Plasmid mittels DNA-Ligase verknüpft und cyclisiert. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Plasmid um einen durch Spaltung linearisierten Expressionsvector. Das dabei gebildete rekombinante Plasmid wird durch Transfektion in ein Wirtsbakterium übertragen, welches in der Lage ist, die DNA zu replizieren, und es wird dasjenige Bakterium kultiviert, welches das rekombinante Plasmid enthält, und dieses Bakterium wird durch Selektion unter Verwendung eines Markers für den Vector und der G6PDH-Aktivität als Indikatoren erhalten. Die DNA als das G6PDH-Gen kann aus dem rekombinanten Plasmid gewonnen werden, welches aus der Bakterienkultur isoliert und gereinigt wurde.

Als Donatorenbakterium für die DNA wird vorzugsweise Bacillus sp.HT-3 eingesetzt, welcher die nachstehend erläuterten taxonomischen Eigenschaften aufweist, und unter der Nr. FERM BP-2172 bei der Agency of Industrial Science and Technology, the Fermentation Research Institute, hinterlegt wurde.

Der vorstehend erläuterte Bacillus sp. HT-3-Stamm hat die folgenden taxonomischen Eigenschaften:

I. Wachstumscharakteristika 1. Normales Schrägagar-Medium

Gutes Wachstum in Filamentform. Die Farbentwicklung führt zu einer Ockerfarbe oder einer grau-weißen Anfärbung. Es wird kein löslicher Farbstoff erzeugt.

2. Normale Agarplatte

Es bilden sich kreisförmige Kolonien, und deren Umfang liegt vollständig in konvexer Form vor. Die Farbe der Kolonien ist ockerfarben oder grau-weiß. Es wird kein löslicher Farbstoff gebildet.

3. BCP-Milchmedium

Es wird keine Veränderung beobachtet.

4. Flüssiges Pepton-Wassermedium

Es findet ein gutes Wachstum mit gleichförmigem Trübungsgrad statt.

II. Morphologische Eigenschaften

Der Bazillus mit einer runden oder etwas gekrümmten Umfangsregion existiert in Form einfacher oder doppelter Zellketten, gelegentlich treten auch kurzkettige Formen auf, wobei kaulquappenartige Zellen und spheroidale Zellen gleichzeitig anwesend sind. Stäbchenzellen haben die folgenden Abmessungen: 0,5 bis 0,8 µm × 2,0 bis 3,0 µm; eine Coccobacillus-Zelle hat eine Größe von 1,4 µm. Zusätzlich werden am Umfang oder einem Subumfang einer Stäbchenzelle indogene Sporen gebildet, aber diese Sporen treiben die Zelle nicht auf. Der Bazillus ist peritrich begeißelt und beweglich.

III. Physiologisches, biochemisches Kennverhalten

Gram-Färbung
+
KOH-Reaktion	-
Kapselbildung	-
Säurefeste-Anfärbung	-
OF-Test	0 (oxidiert)
Wachstum unter anaerobischen Bedingungen	-
Wachstum unter aerobischen Bedingungen	+
Wachstumstemperatur @	52°C	+
45°C	+
37°C	-
Wachstums-pH-Wert @	9,0	-
8,0	+
5,2	+
4,7	-
Salzbeständigkeit @	0%	+
10%	+
Katalase-Erzeugung	+
Oxidase-Erzeugung	+
Urease-Erzeugung (SSR)	-
Urease-Erzeugung (Chris)	(+)
Indol-Erzeugung	-
Schwefelwasserstoff (Bleiacetatpapier)	-
Acetoin-Erzeugung	-
MR-Test	-
Nitratreduktion	+
Denitrifizierungsreaktion	-
Gelatine-Zersetzung	-
Kohlehydrat-Zersetzung	+
Casein-Zersetzung	(+)
Äsculin-Zersetzung	+
Cellulose-Zersetzung	-
Tyrosin-Zersetzung	(+)
Wirksamkeitstest (Shimmons' Medium) @	Citrate	-
Maleate	-
Malate	-
Gluconate	-
Propionate	-
Malonate	-
Succinate	-
Wirksamkeitstest (Christensen′s Medium) @	Citrate	-
Maleate	-
Malate	-
Gluconate	-
Propionate	-
Malonate	-
Succinate	-
Gas-Bildung aus Glucose	-
Säure-Bildung aus Zucker (NH₄H₂PO₄ dient als Lieferant für N) @	Adonit	-
L(+)-Arabinose	+
Cellobiose	+
Durcit	-
Mesoerythrit	-
Fructose	+
Galactose	+
Glucose	+
Glycerin	+
Inosit	+
Inulin	-
Lactose	-
Maltose	+
Mannit	+
Mannose	+
Melezitose	+
Melibiose	+
Raffinose	+
L(+)-Rhamnose	-
D-Ribose	+
Salicin	+
L-Sorbose	-
Sorbit	-
Kohlehydrate	+
Saccharose	+
Treharose	+
Xylose	+
(+ positiv; (+) schwach positiv; - negativ)

IV. Haupteigenschaften des erfindungsgemäßen Bakterienstamms

Der erfindungsgemäße Bakterienstamm ist ein grampositiver Bazillus mit runder Umfangskontur und er existiert in einzelnen Zellketten oder in kurzkettiger Form. Dieser Stamm ist in die Gruppe der sporenbildenden Bakterien eingeordnet worden und besitzt das Charakteristikum der Katalase-Erzeugung. Der Stamm zersetzt Glucose oxidativ unter Erzeugung von Säuren.

V. Identifizierung des erfindungsgemäßen Bakterienstamms

Der erfindungsgemäße Bakterienstamm wurde gemäß seinen Haupteigenschaften, d. h. grampositiv, katalaseerzeugend und sporenbildend, als zur Gattung Bacillus gehörend identifiziert und als Stamm Bacillus sp. HT-3 gekennzeichnet. Er wurde unter der Nr. FERM BP 2172 bei der Agency of Industrial Science and Technology, The Fermentation Research Institute, hinterlegt.

Die DNA wird aus einem Bakterium, welches als Gendonator dient, wie folgt erhalten. Beispielsweise kann irgendein der Bakterienspezies der vorstehend beschriebenen Art als Donator verwendet werden und unter Bewegung in einem flüssigen Medium unter Belüftungsbedingungen während etwa 1 bis 3 Tagen kultiviert werden. Das Kulturmedium wird dann zwecks Abtrennung der Bakterienmasse zentrifugiert, worauf eine Lysis durchgeführt wird, um ein Lysat zu erhalten, welches das G6PDH-Gen enthält. Für die Lysis der Bakterienmasse werden die Zellwände mit solubilisierenden Enzymen behandelt, beispielsweise mit Lysozym und β-Glucanase. Erforderlichenfalls können auch andere Enzyme, wie Protease, und grenzflächenaktive Stoffe, wie Natriumlaurylsulfat, allein oder in Kombination mitverwendet werden. In Kombination mit der vorstehend erläuterten Solubilisierungsmethode kann auch eine Ausfrier-Auftaubehandlung (vgl. GB-PS 21 96 018) oder eine Behandlung mittels einer Presse (French Press) angewendet werden, um die Zellwände physikalisch aufzubrechen.

Um aus dem so erhaltenen Lysat die DNA zu isolieren und zu reinigen, wird das Lysat einer geeigneten Kombination der folgenden Behandlungsmethoden unterworfen, beispielsweise einer Deproteinisierungsbehandlung mittels Phenolextraktion, einer Protease-Behandlung, einer Ribonuclease-Behandlung, einer Ausfällung mittels Alkohol oder einer Zentrifugierung. Es handelt sich dabei um auch sonst routinemäßig durchgeführte Behandlungsmethoden.

Die auf diese Weise isolierte und gereinigte bakterielle DNA läßt sich mittels verschiedener Methoden spalten, beispielsweise einer Ultraschallbehandlung oder einer Behandlung mit einem Restriktionsenzym. Vorzugsweise wird hierfür ein Restriktionsenzym eingesetzt, insbesondere ein solches des Typs II, beispielsweise EcoRI, HindIII und BamHI. Ein solches Restriktionsenzym beeinflußt spezifische Nucleotidsequenzen, so daß das dabei entstehende DNA-Fragment leicht mit einem Vector verknüpft werden kann.

Als Vectoren werden solche bevorzugt, welche aus Phagen oder Plasmiden erhalten worden sind und sich zur autonomen Vermehrung für die genetische Rekombination eignen.

Falls Escherichia coli als Wirtsbakterium verwendet wird, können die Phagen-Vectoren λ_gt · λC und λ_gt · λB verwendet werden.

Wenn Escherichia coli als Wirtszelle oder Wirtsbakterium verwendet wird, können die nachstehenden Plasmidvectoren verwendet werden: pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18 und pUC19. Falls hingegen Bacillus subtilis als Wirtsbakterium verwendet wird, dann eignen sich die folgenden Plasmidvectoren: pUB110 und pC194. Zusätzlich kann auch ein Schaukelvector verwendet werden, welcher sich autonom in zwei oder mehr Arten von Wirtsbakterien repliziert, beispielsweise in Escherichia coli und Sacchromyces cerevisiae. Solche Vectoren werden vorzugsweise mittels der gleichen Restriktionsenzyme verdaut, wie sie auch für die Spaltung der bakteriellen DNA als Donator für das G6PDH-Gen verwendet werden, um entsprechende Vectorfragmente zu erhalten.

Zur Verbindung der bakteriellen DNA-Fragmente mit den Vectorfragmenten kann eine an sich bekannte Methode verwendet werden, beispielsweise eine Methode, bei der die Verknüpfung mittels DNA-Ligase erfolgt. Nach der Verknüpfung der kohäsiven Enden der bakteriellen DNA-Fragmente mit denjenigen der Vectorfragmente dient beispielsweise eine geeignete DNA-Ligase dazu, eine rekombinante DNA zu erzeugen, welche aus den Fragmenten der bakteriellen DNA und den Vectorfragmenten besteht. Falls erforderlich, werden die DNA- und die Vectorfragmente nach der Verknüpfung durch Transfektion in ein Wirtsbakterium übertragen, um dort die rekombinante DNA unter Verwendung einer DNA- Ligase zu bilden, welche in den lebenden Organismen vorhanden ist.

Es kann jedes Wirtsbakterium verwendet werden, in welchem die rekombinante DNA stabil und autonom wachsen kann und in dem die Eigenschaften der Fremd-DNA exprimiert werden können. Beispielsweise können als Wirtsbakterien, welche zu Escherichia coli gehören, die folgenden Spezies eingesetzt werden: Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110 und Escherichia coli C600. Die Methoden zur Einführung der rekombinanten DNA in ein Wirtsbakterium umfassen eine Methode unter Verwendung von Calciumion, falls das Bakterium zur Gattung Escherichia coli gehört, während im Fall eines Bakteriums, welches zur Gattung Bacillus gehört, auch die mit kompetenten Zellen arbeitende Methode angewendet werden kann, während andererseits zur Einführung einer liposomalen rekombinanten DNA in eine Protoplast-Wirtszelle die elektrische Fusions-Transfer-Methode besonders geeignet ist. Man kann aber auch die Methode der Mikroinjektion für diesen Zweck wählen.

Ob die betreffende rekombinante DNA in ein Wirtsbakterium eingeschleust worden ist, kann unter Verwendung eines Markers für den Vector, welcher die betreffende rekombinante DNA enthält, beispielsweise ein Marker für einen pharmakologischen Wirkstoff, festgestellt werden. Ein Bakterium, welches fähig ist, G6PDH zu exprimieren, beispielsweise ein Bakterium, welches in einem Medium wächst, das selektiv für den wirkstoffresistenten Marker ist, und welches das Enzym G6PDH erzeugt, kann vorzugsweise unter Verwendung von Farbstoffen selektiert werden.

Die bei einer solchen genetischen Manipulation im allgemeinen angewendete quantitative Beziehung kann wie folgt beispielsweise angegeben werden: ein Restriktionsenzym mit einer Aktivität von etwa 1 bis 10 U, eine Ligase mit einer Aktivität von etwa 300 U und andere Enzyme mit einer Aktivität von etwa 1 bis 10 U werden für jeweils 0,1 bis 10 µg DNA aus dem Donator- Bakterium und je Plasmid-DNA eingesetzt.

Das auf diese Weise als Transformand erhaltene Bakterium, beispielsweise ein Bakterium, welches zur Species Escherichia coli oder, breiter gefaßt, zur Gattung Escherichia gehört, ist in der Lage, eine große Menge an G6PDH-Enzym in einem Nährmedium stabil zu erzeugen, in welchem es kultiviert wird. Nachstehend wird ein spezifisches Beispiel für einen solchen Transformanden gegeben: die in Fig. 2 dargestellte DNA wird in das Plasmid pACYC184 [vgl. J. Bacteriol., 134, 1141 (1981)] insertiert, transformiert dann das Wirtsbakterium Escherichia coli DHl [vgl. T. Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982), 504-506] und anschließend wird das Bakterium, welches in der Lage ist, das Enzym G6PDH zu erzeugen, selektiert, und dieses Bakterium ist definiert worden als Escherichia coli DHl.pG6PDHl, und es ist als FERM BP-2174 bei der Agency of Industrial Science and Technology, the Fermentation Research Institute hinterlegt worden.

Die einmal auf diese Art und Weise ausgewählte rekombinante DNA kann leicht aus dem Transformanden isoliert werden, welcher die rekombinante DNA enthält, und kann dann in andere Wirtsbakterien eingeführt werden. Außerdem kann die rekombinante DNA mit Restriktionsenzymen gespalten werden, um so diejenige DNA herauszuschneiden, welche die Aminosäuresequenz desjenigen Polypeptids codiert, das das Enzym G6PDH aufbaut. Anschließend erfolgt eine Verknüpfung mit den Enden eines linearisierten Vectors, welcher durch Verdauung in der gleichen Art und Weise erhalten worden ist, wie vorstehend beschrieben, und auf diese Weise läßt sich eine rekombinante DNA herstellen, welche ein ganz neues Merkmal aufweist. Diese neue rekombinante DNA kann auch in einfacher Weise in andere Wirtsbakterien eingeschleust werden.

Die betreffende rekombinante DNA und der Vector, welcher diese rekombinante DNA enthält, können durch Kolonie-Hybridisierung selektiert werden; wobei man eine Probe verwendet, die aus einer partiellen Nucleotid-Sequenz derjenigen DNA hergestellt worden ist, welche die in Fig. 1 wiedergegebene Aminosäuresequenz codiert oder der in Fig. 2 dargestellten DNA.

Das G6PDH-Enzym, welches gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten worden ist, kann mittels bekannter gentechnologischer Techniken bezüglich seines Peptids variiert werden und die so erhaltene codierende Mutanten-DNA bedeutet, daß aus dem G6PDH-Gen der vorliegenden Erfindung mittels gentechnologischer Maßnahmen eine künstliche Genvariante erzeugt wird. Eine solche künstliche Genvariante kann unter Verwendung einer Vielzahl gentechnologischer Maßnahmen erhalten werden, beispielsweise mittels Punktmutation an lokalisierten Basenbereichen oder durch Ersatz eines spezifischen DNA-Fragmentes des betreffenden objektiven Gens durch ein künstlich variiertes Fragment. Von den so erhaltenen künstlichen Genvarianten wird eine mutierte DNA von G6PDH mit besonders ausgezeichneten Eigenschaften schließlich in einen Vector insertiert, um so eine rekombinante DNA zu erzeugen und anschließend ermöglicht die Einführung der so resultierenden rekombinanten DNA die Erzeugung eines G6PDH- Muteins. Ein spezifisches Beispiel für Vectoren, welche eine G6PDH-codierende DNA enthalten, ist ein Plasmid, nachstehend als pG6PDH1 bezeichnet, welches aus Escherichia coli DH1.G6PDH erhalten worden ist. Die Schnittstellenkartierung dieses Plasmids pG6PDH1 ist in Fig. 3 dargestellt.

Die Nucleotidsequenz der DNA, welche die Aminosäuresequenz desjenigen Polypeptids codiert, das das Enzym G6PDH aufbaut, und welche mittels der vorstehend erläuterten Methoden erhalten worden ist, wurde mittels der Dideoxy-Methode bestimmt (vgl. "Science", 214, S. 1205-1210 (1981)). Hingegen wurde die Aminosäuresequenz desjenigen Polypeptids, das das Enzym G6PDH aufbaut, aus der Nucleotidsequenz abgeschätzt und bestimmt. Nach einer anderen Arbeitsweise wurde die Aminosäuresequenz am N-Terminator des Polypeptids von G6PDH, welches durch die nachstehenden Methoden kultiviert und gereinigt worden war, mittels eines Proteinsequenzanalysators in flüssiger Phase (BECKMAN System 890ME, hergestellt durch die Fa. Beckman Co., Ltd.) bestimmt. Anschließend wurde bestätigt, daß die Aminosäuresequenz zumindest am N-Terminator des G6PDH-Enzyms derjenigen Teil-Aminosäuresequenz entspricht, welche wie vorstehend angegeben abgeschätzt wurde.

Das Verfahren zur Herstellung des G6PDH-Enzyms aus dem Transformanden umfaßt das Kultivieren des Transformanden in einem Nährmedium zwecks Erzeugung von G6PDH in einem Bakterium oder in einer Nährbrühe, das Sammeln der Bakterienmasse durch Filtration oder Zentrifugieren oder das Sammeln der Nährbrühe nach Beendigung des Kulturverfahrens sowie das anschließende mechanische oder enzymatische Aufbrechen des Bakteriums, beispielsweise unter Verwendung von Lysozym, wobei gegebenenfalls EDTA und/oder ein geeignetes grenzflächenaktives Mittel zugesetzt werden, und schließlich das Isolieren und Sammeln des erzeugten G6PDH in einer Pufferlösung. Die so erhaltene G6PDH- Lösung kann aufkonzentriert oder wahlweise mittels einer Ammoniumsulfatfraktionierung, einer Gelfiltration, einer Absorptionschromatographie, einschließlich einer Affinitätschromatographie und einer Ionenaustauschchromatographie behandelt werden, um auf diese Weise G6PDH von großer Reinheit zu erhalten.

Falls als Wirtsbakterium beispielsweise ein Escherichia coli- Bakterium ausgewählt wird, wird vorzugsweise dem vorstehend beschriebenen Verfahren auch noch eine Erhitzungsbehandlung angefügt. Beispielsweise ermöglicht eine Behandlung der Nährbrühe und des aufgebrochenen solubilisierten Bakteriums während 16 Stunden bei 60°C eine außerordentlich einfache Reinigung des G6PDH-Enzyms und darüber hinaus eine wirksame Entfernung von möglicherweise kontaminierenden Enzymen, welche zu Problemen bei der Anwendung des G6PDH-Enzyms für die klinische Diagnose führen können. Auf diese Weise läßt sich ein G6PDH-Enzym mit sehr guten Eigenschaften herstellen, welches in nicht mehr nachweisbarer Weise durch kontaminierende Enzyme in seiner Wirkung beeinträchtigt wird. Bei diesen kontaminierenden Enzymen kann es sich um die folgenden Enzyme handeln: NAD(P)H-Oxidase, Lactatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase, Glucoseisomerase, ATPase, alkalische Phosphatase, Phosphoglucomutase, Hexose-6-phosphatisomerase, NAD(P)-Nucleosidase, Malatdehydrogenase und Succinatdehydrogenase. In bezug auf die Enzyme NAD(P)H-Oxidase und Lactatdehydrogenase, welche nur schwer zu entfernen sind und daher bei der Anwendung von G6PDH für die klinische Diagnose zu Problemen führen, kann festgestellt werden, daß es gemäß der Erfindung möglich ist, ein G6PDH zu erhalten, in welchem die Aktivität von NAD(P)H- Oxidase und Lactatdehydrogenase jeweils nur 0,0001 Einheiten oder weniger je 100 Einheiten des Enzyms G6PDH entspricht.

Die Kultivierungsbedingungen für das als Transformand verwendete Bakterium können entsprechend dessen physiologischen Erfordernissen für Nährstoffe ausgewählt werden. In vielen Fällen läßt sich die Kultivierung in einem flüssigen Medium durchführen.

Vorzugsweise wird eine unter Bewegen durchgeführte Tiefbelüftungskultivierung verwendet. Als Nährstoffe eignen sich solche, welche üblicherweise für Bakterienkulturen in weitem Umfang verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen können beliebige Kohlehydrate verwendet werden, welche metabolisieren können, beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose und Honig. Als Stickstoffquellen können beliebige stickstoffhaltige Verbindungen eingesetzt werden, beispielsweise Pepton, Fleischbrühe, Hefeextrakt oder Kaseinhydrolysat. Zusätzlich können, falls erforderlich, auch Salze mitverwendet werden, wie Phosphate, Carbonate, Sulfate, Salze von Magnesium, Kalzium, Kalium, Eisen, Mangan und Zink oder auch spezifische Aminosäuren und spezifische Vitamine.

Die Kultivierungstemperatur wird in geeigneter Weise innerhalb des Bereiches gewählt, in welchem das Bakterium unter Erzeugung von G6PDH wachsen kann. Im Fall von Escherichia coli liegt dieser Temperaturbereich vorzugsweise zwischen etwa 20 und 42°C. Die Kultivierungszeiten variieren mehr oder weniger in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen. Üblicherweise erfolgt die Kultivierung während 12 bis 48 Stunden, wonach die Kultivierung zu einem geeigneten Zeitpunkt abgebrochen wird, der sich danach richtet, daß eine maximale Ausbeute an G6PDH erhalten wird. Auch der pH-Wert des Kulturmediums kann innerhalb eines angemessenen Bereiches modifiziert werden, so daß das Bakterium unter Erzeugung von G6PDH angemessen wächst, und vorzugsweise liegt der pH-Wertbereich zwischen 6,0 und 8,0.

Die das Bakterium enthaltende Nährbrühe wird so genommen, wie sie ist, um das darin enthaltene G6PDH-Enzym zu gewinnen. Wenn die Brühe selbst das Enzym G6PDH enthält, wird sie mittels Filtration oder Zentrifugieren in eine G6PDH-haltige Lösung und die bakterielle Zellmasse aufgetrennt. Wenn sich das Enzym G6PDH in den Zellen selbst befindet, wird die Bakterienmasse beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren von der Nährbrühe abgetrennt und dann werden die Zellen entweder mechanisch oder enzymatisch unter Verwendung von Lysozym aufgebrochen. Erforderlichenfalls werden ein chelatierendes Mittel, wie EDTA, und/oder oberflächenaktive Stoffe zugesetzt, um das G6PDH-Enzym zu solubilisieren und dann in einer Pufferlösung zu isolieren und zu sammeln.

Die so erhaltene, das G6PDH enthaltende Lösung läßt man durch Aufkonzentrierung unter vermindertem Druck, durch Membrankonzentration, durch Aussalzverfahren unter Verwendung von Ammoniumsulfat einen Niederschlag bilden. Man kann auch eine fraktionelle Niederschlagsbildung unter Verwendung von hydrophilen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Methanol, Äthanol und Aceton anwenden. Der Niederschlag wird anschließend in Wasser gelöst und gegen eine semipermeable Membran dialysiert, um so Verunreinigungen von niedrigem Molekulargewicht abzutrennen. Diese G6PDH-haltige Lösung wird mittels Gelfiltration unter Anwendung von absorbierenden Mitteln oder Gelfiltrationsmitteln, durch Adsorptionschromatographie, wie beispielsweise Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie, weiter gereinigt. Schließlich wird sie unter vermindertem Druck aufkonzentriert und lyophilisiert, bis ein G6PDH-Enzym in gereinigter Form erhalten wird.

Auf diese Weise läßt sich beispielsweise ein G6PDH mit den folgenden Eigenschaften herstellen:

(1) Aktivitätsmessung Messung der G6PDH-Aktivität

Reaktionslösung
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)\|0,2 ml
10% BSA (Rinderserumalbumin)	0,05 ml
1% Triton X-100	0,1 ml
10 mM NADP	0,1 ml
100 U/ml Diaphorase	0,05 ml
0,25% NBT	0,1 ml
0,1 M Glucose-6-phosphat	0,2 ml
destilliertes Wasser	0,2 ml

Durchführung

1,0 ml der Reaktionslösung mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung wird in ein Reagenzglas eingefüllt und 3 Minuten lang auf 37°C vorerwärmt. Anschließend setzt man 20 µl einer Enzymlösung zu, welche G6PDH enthält. Man läßt diese Mischung 10 Minuten lang bei 37°C stehen, damit die enzymatische Reaktion ablaufen kann. Die Reaktion wird durch Zusatz von 2,0 ml einer 0,1 N-HCl abgebrochen, und dann wird die Extinktion bei 550 nm gemessen. Die Aktivität von G6PDH, die pro Minute 1 µMol Glucose-6-phosphat zu Gluconsäure-lacton- 6-phosphat oxydiert, wird als eine Einheit (U) definiert.

Messung der NAD (P)H-Oxidaseaktivität

Reaktionslösung
80 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)\|0,5 ml
0,6 mM NAD(P)H	0,5 ml

Durchführung

1,0 ml der Reaktionslösung mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung wird in eine Quarzzelle von 2,0 ml Fassungsvermögen eingefüllt und 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Zu dieser Lösung setzt man dann unter Rühren 0,2 ml der G6PDH- Lösung zu, deren Konzentration auf 5000 U/ml eingestellt wurde. Die Reduktion von A₃₄₀ (Δ A) wird in Zeitabständen bei 37°C bestimmt. Die Aktivität der NAD(P)H-Oxidase, welche die Menge an NAD(P)H mit einer Geschwindigkeit von 1 µMol/min vermindert, wird als eine Einheit (U) definiert.

T; Reaktionszeit
6,22; millimolarer Extinktionskoeffizient von NAD(P)H bei 340 nm (cm²/µmol)

Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität

Reaktionslösung
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)\|0,2 ml
0,1 M Natriumpyruvat	0,1 ml
3 mM NAD(P)H	0,1 ml
destilliertes Wasser	0,6 ml

Durchführung

1,0 ml der Reaktionslösung mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung wird in eine Quarzzelle von 2,0 ml Fassungsvermögen eingefüllt und 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Zu der so erhaltenen Lösung setzt man unter Rühren 0,2 ml der G6PDH-Lösung zu, deren Konzentration auf 5000 U/ml eingestellt wurde. Anschließend wird die Reduktion von A₃₄₀ (ΔA) in Zeitabständen bei 37°C gemessen. Die Aktivität der Lactat-Dehydrogenase, welche die Menge an NAD(P)H mit einer Geschwindigkeit von 1 µMol/Minute verringert, wird als eine Einheit (U) definiert.

(2) Physikalisch-chemische Eigenschaften

(a) Enzymatische Wirkung: katalysiert die enzymatische Reaktion der Bildung von Gluconsäurelacton-6-phosphat und NAD(P)H aus Glucose-6-phosphat und NAD(P).

(b) Substratspezifität: wirkt mindestens auf Glucose-6-phosphat als Substrat ein.

Substrat
Relative Aktivität (%)
Glucose-6-phosphat
100
Mannose-6-phosphat	38,5
Galactose-6-phosphat	19,3
Fructose-6-phosphat	0
Glucose-1-phosphat	0
Glucosamin-6-phosphat	0
6-Phosphogluconsäure	0
Coenzyme	KM-Wert (mM)
NADP	ca. 8,3 × 10^-3
NAD	ca. 1,2

(c) Optimaler pH-Wert: 8 bis 9
Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten werden zur Bestimmung des optimalen pH-Wertes gemäß der vorstehend erläuterten Enzymbestimmungsmethode verwendet. Die Ergebnisse bestätigen, daß der optimale pH-Wert im Bereich von 8 bis 9 liegt.
(d) Isoelektrischer Punkt: 6,1 ± 0,6
Es wird die Methode der isoelektrischen Punkt-Elektrophorese unter Verwendung von AMPHOLINE PAGPLATE®, hergestellt von LKB CO., LTD., ausgenutzt, um auf diese Weise den isoelektrischen Punkt zu bestimmen. Die Ergebnisse bestätigen, daß der isoelektrische Punkt pI einen Wert von 6,1 ± 0,6 hat.
(e) Thermische Stabilität: das Enzym ist während 15 Minuten bei einer Behandlung von etwa 65°C stabil.
Wenn eine Probe von G6PDH in 40 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 15 Minuten lang bei unterschiedlichen Temperaturen behandelt wird, dann beträgt die Restaktivität bei 65°C oder darunter etwa 100% und bei 70°C etwa 70%.
(f) pH-Stabilität: das Enzym ist während 15 Minuten bei einer Temperatur von 70°C im pH-Wertbereich von 6 bis 8 stabil.
Für diesen pH-Test werden verschiedene Pufferlösungen verwendet, nämlich 40 mM Dimethylglutarsäure für den pH-Wertbereich von 4,5 bis 6,5, 40 mM Phosphatpuffer für den pH-Wertbereich von 6,0 bis 8,0 und 40 mM Tris-HCl-Puffer für den pH-Wertbereich von 7,0 bis 9,0.
(g) Molekulargewicht: dieses liegt bei etwa 270 000. Das Molekulargewicht wird bestimmt durch Säulenchromatographie an einem TSK-Gel des Typs G3000 SW. Die folgenden Proteine werden als Referenzproteine verwendet:

Ovalbumin

45 000

Rinderserumalbumin 67 000

Aldorase (aus Kaninchenmuskel) 150 000

Catalase (Kalbsleber) 210 000

Das gemessene Molekulargewicht wird zum Vergleich auch noch bezüglich der Aminosäuresequenz von G6PDH geprüft und gemäß einer darauf beruhenden Schätzung existiert G6PDH in Form eines Assoziationskörpers der Popypeptide von 4 bis 6.
(h) Inhibitorwirkung: die Enzymaktivität wird durch die Anwesenheit von Mn²⁺, Cu²⁺, Al³⁺ inhibiert.

In der Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen für Aminosäuren, Peptide, Nucleinsäuren und andere Bausteine verwendet, wobei diese Abkürzungen auch sonst üblicherweise im Stand der Technik verwendet werden. Alle Aminosäuren entsprechen der L-Form.

DNA: Deoxyribonucleinsäure
RNA: Ribonucleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
Ala: Alanin
Arg: Arginin
Asn: Asparagin
Asp: Asparaginsäure
Cys: Cystein
Gln: Glutamin
Glu: Glutaminsäure
Gly: Glycin
His: Histidin
Ile: Isoleucin
Leu: Leucin
Lys: Lysin
Met: Methionin
Phe: Phenylalanin
Pro: Prolin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Trp: Tryptophan
Tyr: Tyrosin
Val: Valin

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Isolierung der chromosomalen DNA

Chromosomale DNA wird durch die nachstehende Methode aus dem Stamm Bacillus sp.HT-3 isoliert, welcher unter der Nr. FERM BP-2172 hinterlegt worden ist. Dieser Bakterienstamm wird über Nacht bei 50°C in 150 ml einer normalen Nährbouillon unter Schütteln kultiviert, dann 10 Minuten lang bei 3000 UpM zentrifugiert und die Zellmasse abgetrennt. Zu dieser Zellmasse setzt man 10 mg/ml Lysozymlösung in 5 ml einer Lösung hinzu, die 10% Saccharose enthält. Außerdem setzt man 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 50 mM EDTA hinzu und hält diese Mischung 15 Minuten lang auf 37°C. Anschließend setzt man 1 ml einer 10prozentigen Lösung von Natriumdodecylsulfat hinzu. Zu der sich bildenden Suspension wird eine gleiche Volumenmenge einer gemischen Lösung von Chloroform und Phenol (Mischungsverhältnis 1 : 1) hinzugesetzt und dann unter Bewegung gut vermischt. Schließlich zentrifugiert man 3 Minuten lang bei 10 000 UpM, um so eine wäßrige Phase von einer Lösungsmittelphase abzutrennen. Die abgetrennte wäßrige Phase wird mit der zweifachen Volumenmenge an Äthanol überschichtet und DNA wird daraus in Form eines Bandes isoliert, welches sich um einen Glasstab windet, während man mit dem Glasstab allmählich rührt. Die so isolierte DNA wird in 10 ml einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthält. Diese Lösung wird nachstehend als TE abgekürzt. Schließlich setzt man die identische Volumenmenge einer gemischten Lösung von Chloroform/ Phenol (Mischungsverhältnis 1 : 1) hinzu und zentrifugiert zwecks Abtrennung einer wäßrigen Phase. Zu der so abgetrennten wäßrigen Phase setzt man die zweifache Volumenmenge an Äthanol hinzu und wiederholt die vorstehend erläuterte Maßnahme, um wiederum DNA abzutrennen, welche in 2 ml TE-Lösung solubilisiert wird.

Beispiel 2 Isolierung von pACYC184 Plasmid-DNA

Escherichia coli pM191, welcher das Plasmid pACYC184 enthält, (vgl. "J. Bacteriol." 134, 1441(981); ATCC 37033) wird unter Schütteln in 1 Liter BHI-Medium (Produkt der Firma Difco Laboratories) kultiviert. Wenn der Trübungsgrad des Mediums einen Wert OD₆₆₀ = 1,0 erreicht hat, wird Spectinomycin bis zu einer Endkonzentration von 300 µg/ml hinzugesetzt und es wird weitere 16 Stunden bei 37°C kultiviert. Die Bakterienzellmasse wird durch 10minütiges Zentrifugieren bei 3000 UpM abgetrennt und dann zwecks Herstellung der Plasmid-DNA mittels der Lysozym- Natriumdodecylsulfatmethode und der Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid- Methode behandelt (vgl. Maniatis: "Molecular Cloning", Seiten 86-94, Cold Spring Harbor (1982)).

Beispiel 3 Konstruktion von Plasmid pG6PDH 1 mit dem G6PDH-Gen

(i) 2 µl (etwa 0,5 g) der chromosomalen DNA des Stammes Bacillus sp. HT-3, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden vermischt mit 1 µl eines Spaltpuffers mit der 10fachen Konzentration, bezogen auf die üblicherweise für eine enzymatische Reaktion verwendete Konzentration. [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 70 mM MgCl₂, 1,0 M kCl, 70 mM Mercaptoäthanol]; ferner setzt man 1 µl von 3 Einheiten/ml Restriktionsenzym MboI (hergestellt von der Firma Takara, Co.) und 6 µl Wasser hinzu und führt die Spaltungsreaktion eine Stunde lang bei 37°C durch. Etwa 0,3 g Plasmid pACYC184-DNA wurden gemäß einer anderen Ausführungsform unter Anwendung der gleichen Technik mittels BamHI gespalten, und dann wurden 0,6 Einheiten alkalische Phosphatase zugesetzt, und es wurde eine Stunde lang bei 65°C inkubiert. Diese beiden Lösungen, welche jeweils gespaltene DNA enthielten, wurden miteinander vermischt, und dann setzte man ¹/₁₀ Volumen einer 3 M Natriumacetatlösung hinzu. Die so erhaltene gemischte Lösung wurde mit einem Lösungsmittelgemisch von Chloroform/Phenol in einer Volumenmenge, welche dem Gesamtvolumen der resultierenden Lösung entsprach, behandelt, und dann zentrifugierte man zur Abtrennung einer wäßrigen Phase. Zu dieser wäßrigen Phase setzte man die zweifache Volumenmenge an Äthanol hinzu und zentrifugierte die ausgefallene DNA ab. Diese DNA wurde gesammelt und unter vermindertem Druck getrocknet und dann in 89 µl Wasser aufgelöst, worauf man 10 µl eines Verknüpfungspuffers zusetzte, dessen Konzentration dem 10fachen der sonst üblichen Konzentration entsprach und der die folgenden Bestandteile enthielt: 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 0,1 M MgCl₂, 1,0 M Dithiothreitol, 10 mM Spermidin und 10 mM ATP. Außerdem setzte man 1 µl (175 Einheiten) der T4 DNA-Ligase zu (Produkt der Firma Takara, Co.). Die so erhaltene DNA-Lösung ließ man über Nacht bei 4°C stehen. Diese DNA-Lösung wurde mit Chloroform und Phenol behandelt und dann unter Zusatz von Äthanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgetrennt, unter vermindertem Druck getrocknet und wiederum in 10 µl einer TE-Lösung aufgelöst.

(ii) Der Stamm Escherichia coli DH1 (zur Verfügung gestellt durch The National Institute of Genetics in Japan, dort geführt unter der Nr. ME8569; Hinterlegungs-Nr. ATCC 33849) wurde in 100 ml des BHI-Mediums kultiviert und in der logarithmischen Wachstumsphase durch 2minütiges Zentrifugieren bei 10 000 UpM gesammelt. Die abgetrennte Zellmasse wurde in einer eiskalten Lösung suspendiert, welche die folgenden Bestandteile enthielt: 30 mM Kaliumacetat (pH 5,8), 100 mM RbCl, 10 mM CaCl₂, 50 mM MnCl₂ und 15% Glycerin. Dann ließ man die Lösung 5 Minuten bei 0° stehen und zentrifugierte sie schließlich, wobei der flüssige Überstand verworfen wurde. Der gesammelte Niederschlag wurde wiederum in 4 ml einer Lösung suspendiert, welche 10 mM MOPS-Puffer (hergestellt durch die Firma Dohtite Co.) mit einem pH-Wert von 6,5 sowie 75 mM CaCl₂, 10 mM RbCl und 15% Glycerin enthielt. Man ließ das Ganze 15 Minuten lang bei 0°C stehen und die dabei gebildeten Zellen wurden als kompetente Zellen verwendet.

(iii) Zu 200 µl der Zellsuspension setzte man 10 µl der gemäß Abschnitt (i) hergestellten DNA-Lösung hinzu und ließ das Ganze 30 Minuten bei 0°C stehen. Anschließend setzte man 1 ml des BHI-Mediums hinzu. 100 µl der so erhaltenen Lösung breitete man auf einer BHI-Agarplatte aus, welche 25 µg/ml Chloramphenicol enthielt, und kultivierte über Nacht bei 37°C, um so Transformanden zu erzeugen. Diese Transformanden wurden auf einer Platte von Versuchsagar (bestehend aus 4 ml 1 M Phosphatpuffer (pH 6,5), 1 ml 10% Triton X-100, 1 ml 100 mM NADP, 1 ml 500 U/ml Diaphorase, 2,5 ml 1% NBT, 2 ml 1 M Glucose-6-phosphat, 1,5 g Agar und 88,5 ml destilliertem Wasser) repliziert, und anschließend wurde die Farbänderung bei Zimmertemperatur beobachtet.

Der Transformand bildete etwa 4500 Kolonien. Es zeigte sich, daß nur eine Kolonie unter den 4500 Transformanden eine stärkere Blaufärbung aufwies als die anderen Kolonien, und dieser Bakterienstamm wurde als Escherichia coli DH1 · pG6PDH1, FERM 2174 definiert. Nach der Isolation und Reinigung wurde dieses Bakterium in dem BHI-Medium bei 37°C über Nacht kultiviert, um seine Fähigkeit zur Erzeugung von G6PDH zu prüfen. Es zeigte sich, daß die Aktivität von G6PDH 18 U/ml entsprach.

Das in diesen Bakterienstamm eingebaute Plasmid wurde gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2 isoliert und wurde definiert als pG6PDH1, welches das G6PDH-Gen und das pACYC184-Gen enthielt.

Beispiel 4 Kartierung von pG6PDH1 und Bestimmung der Nucleotidsequenz des G6PDH-Gens

Unter Verwendung des Stammes Escherichia coli DH1 · pG6PDH1 wurde gemäß der gleichen Arbeitsweise wie für pACYC 184 beschrieben die pG6PDH1-Plasmid-DNA hergestellt.

Mittels der nachstehenden Restriktionsenzyme EcoRI, ClaI, EcoRV, HindIII, BglII, BamHI, SphI, NruI, HpaI, MluI, NcoI, ApaLI und XbaI (die Restriktionsenzyme waren alle Produkte der Firma Takara, Co.) wurde die Schnittstellenkartierung für die pG6PDH1- Plasmid-DNA erstellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 wiedergegeben. Die Nucelotidsequenz für die DNA, welche das G6PDH-Gen enthält, wurde mittels der Di-deoxy-Methode unter Verwendung einer M13- Phage bestimmt (vgl. "Science" 214, Seiten 1205-1210 (1981)).

Die Aminosäuresequenz und die Nucleotidsequenz des G6PDH-Strukturgens sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt.

Beispiel 5 Erzeugung von G6PDH

Der Stamm Escherichia coli DH1.pG6PDH1 wurde in 4 l des BHI- Mediums (Difco Laboratories) kultiviert, welches 30 µg/ml Chloramphenicol (Sankyo Pharmaceuticals Co.) enthielt, und zwar in einem Kulturgefäß bei 37°C während 18 Stunden. Die Zellmasse wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei 5000 UpM abgetrennt.

Die abgetrennte Bakterienzellmasse wurde mit 1 l einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen und dann in 500 ml einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Zu dieser Suspension setzte man Lysozym, EDTA-2Na und Triton X-100 entsprechend Endkonzentrationen von 1 mg/ml, 2 mM und 0,1% hinzu und ließ dann 30 Minuten bei 37°C stehen. Der pH-Wert wurde dann auf 7,0 eingestellt und man erhitzte 6 Stunden lang auf 60°C, worauf man 15 Minuten lang bei 5000 UpM zentrifugierte und auf diese Weise 420 ml eines flüssigen Überstandes abtrennte, dessen Aktivität in bezug auf G6PDH 162 U/ml entsprach. Zu diesem flüssigen Überstand setzte man 840 ml Aceton hinzu und zentrifugierte dann 15 Minuten lang bei 5000 UpM, um einen Niederschlag abzutrennen, der in 500 ml eines 20 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) resuspendiert wurde. Man zentrifugierte wiederum 15 Minuten bei 5000 UpM und trennte auf diese Weise 480 ml eines flüssigen Überstandes ab, dessen Aktivität in bezug auf G6PDH 114 U/ml entsprach. Durch Ionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (Hersteller; Pharmacia Fine Chemicals Co.), welche mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) abgepuffert war, wurden aktive Fraktionen aus dem Überstand fraktioniert, welche vereinigt und unter Verwendung eines nahtlosen Celluloseschlauches entsalzt wurden. Man erhielt so 300 ml eines Enzymproduktes, dessen Aktivität in bezug auf G6PDH 148 U/ml entsprach.

Vergleichsbeispiel 1 Übliche Arbeitsweise

Der Stamm Bacillus sp. HT-3 (FERM BP-2172) wurde in 4 l des BHI-Mediums (Difco Laboratories) in einem Fermentierkolben 18 Stunden bei 55°C kultiviert und dann wurde die Zellmasse durch 15minütiges Zentrifugieren bei 5000 UpM abgetrennt.

Die abgetrennte Bakterienmasse wurde mit 1 l eines 20 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) gewaschen und dann in 500 ml des 20-mM-Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert. Zu dieser Suspension setzte man Lysozym, EDTA-2Na und Triton X-100 bis zu Endkonzentrationen von 1 mg/ml, 2 mM bzw. 0,1% hinzu und ließ das Ganze 30 Minuten lang bei 37°C stehen. Anschließend wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt und dann behandelte man 6 Stunden lang bei einer Temperatur von 60°C. Es erfolgte wiederum eine Zentrifugierung während 15 Minuten bei 5000 UpM und auf diese Weise wurden 420 ml eines flüssigen Überstandes abgetrennt. Zu diesem flüssigen Überstand setzte man 840 ml Aceton hinzu, zentrifugierte wiederum 15 Minuten bei 5000 UpM und trennte auf diese Weise einen Niederschlag ab. Dieser Niederschlag wurde in 500 ml des 20 mM-Phosphatpuffers (pH 7,0) resuspendiert und dann erfolgte nochmals während 15 Minuten eine Zentrifugierung bei 5000 UpM, wodurch 480 ml eines flüssigen Überstandes abgetrennt wurden. Man führte dann eine Ionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Sepharose CL-6B- Säule durch, welche mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) abgepuffert war und gewann so aktive Fraktionen, welche vereinigt und unter Verwendung eines nahtlosen Celluloseschlauches entsalzt wurden. Die Chromatographie an einer Octyl-Sepharose- CL-4B-Säule (Pharmacia Fine Chemicals Co.), die mit 30% gesättigter Ammoniumsulfatlösung abgepuffert war, ergab aktive Fraktionen, welche vereinigt und unter Verwendung eines nahtlosen Celluloseschlauches entsalzt wurden. Anschließend führte man eine Chromatographie an Hydroxylapatit (KOKEN Co.) durch und erhielt so wiederum aktive Fraktionen, welche vereinigt und unter Verwendung eines nahtlosen Celluloseschlauches entsalzt wurden. An einer blauen Sepharose-Säule (Pharmacia Fine Chemicals Co.) wurde eine Chromatographie unter Gewinnung aktiver Fraktionen durchgeführt, welche vereinigt und unter Verwendung eines nahtlosen Celluloseschlauches entsalzt wurden. Auf diese Weise erhielt man ein Enzymprodukt.

Zu jedem der beiden Enzymprodukte, welche gemäß Beispiel 5 und Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurden, setzte man eine geringe Menge BSA von RIA-Qualität hinzu (Produkt der Firma Sigma Co.) und lyophilisierte gemäß üblicher Methode. Die spezifische Aktivität der folgenden Enzyme G6PDH, NAD(P)H- Oxidase, (NAD(P)Hox) und Lactatdehydrogenase (LHD) in den lyophilisierten Produkten wurde bestimmt, und es wurden dabei die folgenden Ergebnisse erhalten:

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine DNA, welche die in Fig. 1 wiedergegebene Aminosäuresequenz codiert bzw. die in Fig. 2 dargestellte DNA und der Transformand, welcher diese DNA enthält, für ein Verfahren zur stabilen Erzeugung von G6PDH in großem Maßstab durch Kultivieren des Transformanden verwendet. Auf diese Weise läßt sich ein G6PDH-Enzym mit ausgezeichneter und überraschender Langzeitstabilität und thermischer Stabilität erhalten, welches keine kontaminierenden Enzyme enthält, die Probleme bei der Verwendung als diagnostisches Mittel ergeben könnten.

Claims

1. Die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz, beginnend mit dem N-Terminator, codiert, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Die DNA gemäß Anspruch 1, deren Nucleotidsequenz in Fig. 2 dargestellt ist, beginnend mit dem 5′-Terminator, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

3. Ein Plasmid, gekennzeichnet durch die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

4. Ein Transformand, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert, und welcher einer Wirtszelle fremd ist, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

5. Der Transformand gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium zur Gattung Escherichia gehört und ein Bakterium ist, welches zu Escherichia coli gehört.

6. Der Transformand gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er definiert ist als Escherichia coli DHl.pG6PDH, hinterlegt unter der Nr. FERM BP-2174 bei der Agency of Industrial Science and Technology, the Fermentation Research Institute.

7. Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Maßnahmen:
Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert und welcher einer Wirtszelle fremd ist, um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

8. Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase nach Anspruch 2, umfassend die folgenden Maßnahmen:
Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, deren Nucleotidsequenz in Fig. 2 dargestellt ist - beginnend mit dem 5′-Terminator - um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

9. Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphat- dehydrogenase gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der kontaminierenden Enzyme NAD(P)H-Oxidase und Lactase-dehydrogenase in der erzeugten Glucose-6-phosphat- dehydrogenase jeweils 0,0001 Einheiten oder weniger je 100 Einheiten der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Aktivität beträgt und daß die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

(a) Enzymatische Wirkung: sie katalysiert eine enzymatische Reaktion, durch welche Gluconsäure-lacton-6-phosphat und NAD(P)H aus Glucose-6-phosphat und NAD(P) gebildet wird;
(b) Substratspezifität: sie weist mindestens Substratspezifität in bezug auf Glucose-6-phosphat auf;
(c) der optimale pH-Wert liegt im Bereich von 8 bis 9;
(d) der optimale isoelektrische Punkt hat einen Wert von 6,1 ±0,6;
(e) Thermische Stabilität: sie ist 15 Minuten lang bei etwa 65°C stabil;
(f) pH-Stabilität: sie ist 15 Minuten lang bei 70°C bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 stabil.

10. Ein Polypeptid, bestehend aus der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz, beginnend mit dem N-Terminator, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.