DE19947373A1

DE19947373A1 - Combination preparation comprising tocopherol and magnesium ascorbate for treatment and prevention of conditions resulting from oxidative stress

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Publication number: DE19947373A1
Application number: DE19947373A
Authority: DE
Inventors: Alexander Gosslau
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2001-04-19

Abstract

A combination preparation comprising tocopherol and magnesium ascorbate is new.

Description

Die Erfindung betrifft ein natürliches Tocopherol-Präparat, das durch die Reduktion mittels Magnesium-Ascorbat dauerhaft vor dessen Oxidation geschützt wird. Durch diese besondere biologische Konservierung wird Tocopherol ohne den Zusatz künstlicher Konservierungsstoffe in seiner aktiven Form gehalten und damit die antioxidative Wirkung verstärkt. Es wurde festgestellt, daß nur dieses reduzierte Tocopherol den oxidativen Streß von Rattenzellen stark verringert. Dabei führt Magnesium-Ascorbat zu einer Regeneration von oxidiertem Tocopherol und entgiftet darüberhinaus selber äußerst effektiv freie Radikale. Somit zeigt dieses kombinierte Tocopherol-Präparat optimale Wirkungen gegen den oxidativen Streß im Körper.The invention relates to a natural tocopherol preparation by means of the reduction Magnesium ascorbate is permanently protected from its oxidation. Through this special biological preservation becomes tocopherol without the addition of artificial preservatives kept in its active form and thus enhances the antioxidative effect. It was found that only this reduced tocopherol greatly increased the oxidative stress of rat cells decreased. Magnesium ascorbate leads to a regeneration of oxidized tocopherol and also detoxifies free radicals extremely effectively. So this shows Combined tocopherol preparation optimal effects against oxidative stress in the body.

Der oxidative Streß ist durch eine Anreicherung von freien Radikalen im Körper charakterisiert, der durch ein Ungleichgewicht zwischen deren Bildung und Eliminierung entsteht. Da freie Radikale ein ungepaartes Elektronenpaar aufweisen, haben sie die Tendenz andere Moleküle zu oxidieren. Besonders reaktiv sind dabei die freien Radikale verschiedener Sauerstoffverbindungen, wobei das Hydroxylradikal am reaktivsten ist. Dieses entsteht in Gegenwart von Eisen und Kupfer aus der relativ unreaktiven Verbindung Wasserstoffperoxid (H₂O₂). Das Wasserstoffperoxid wird bei vielen physiologischen Prozessen des Körpers gebildet (insbesondere bei der Zellatmung in den Mitochondrien und bei der Aktivität Sauerstoff-verarbeitender Enzyme). Neben diesem natürlich vorkommenden oxidativen Streß entstehen auch zunehmend Sauerstoffradikale durch steigende Belastung sowohl des Körpers als auch der Umwelt (physischer und psychischer Streß, Sport, Überernährung, Rauchen, UV- und Röntgenstrahlung, Elektrosmog, Umweltgifte usw.). Der oxidative Streß spielt eine wichtige Rolle bei Alterungsprozessen der Zelle, da die freien Radikale zu einer Oxidation von Makromolekülen, wie Nucleinsäuren, Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden führen. Dabei ist die oxidative Schädigung von Zellmembranen (Lipidperoxidation) besonders gefährlich, da die mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Zellmembranen sehr sensibel gegenüber Oxidationen sind. In Kettenreaktionen entstehen dann Lipidradikale, die zu starken Zellschädigungen und schließlich zum Zelltod führen (Gosslau, Vergleichende Untersuchungen zur Induktion von Streßproteinen durch oxidativen Streß und Hitzeschock in C6-Rattengliomazellen, Dissertation, Universität Bremen, 1998, 2-12). Dadurch gilt der oxidative Streß als Auslöser von zellulären Alterungsprozessen und zahlreichen Krankheiten, wie z. B. Krebs und Herzinfakt (Knight, Free radicals: their history and current status in aging and disease, 1998, Ann. Clin. Lab. Sci., 28, 331-346). Oxidative stress is characterized by an accumulation of free radicals in the body, which arises from an imbalance between their formation and elimination. Because free radicals have an unpaired pair of electrons, they tend to oxidize other molecules. The free radicals of various oxygen compounds are particularly reactive, the hydroxyl radical being the most reactive. This arises in the presence of iron and copper from the relatively unreactive compound hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ). Hydrogen peroxide is formed in many physiological processes in the body (especially in cell respiration in the mitochondria and in the activity of oxygen-processing enzymes). In addition to this naturally occurring oxidative stress, there are also increasing amounts of oxygen radicals due to increasing stress on both the body and the environment (physical and psychological stress, sports, overeating, smoking, UV and X-rays, electrosmog, environmental toxins, etc.). Oxidative stress plays an important role in cell aging processes, since the free radicals lead to the oxidation of macromolecules such as nucleic acids, proteins, carbohydrates and lipids. The oxidative damage to cell membranes (lipid peroxidation) is particularly dangerous since the polyunsaturated fatty acids in the cell membranes are very sensitive to oxidation. Lipid radicals then develop in chain reactions, which lead to severe cell damage and ultimately cell death (Gosslau, comparative studies on the induction of stress proteins by oxidative stress and heat shock in C6 rat glioma cells, dissertation, University of Bremen, 1998, 2-12). As a result, the oxidative stress is considered to trigger cellular aging processes and numerous diseases, such as. B. Cancer and Heart Attack (Knight, Free radicals: their history and current status in aging and disease, 1998, Ann. Clin. Lab. Sci., 28, 331-346).

Gegen den oxidativen Streß verfügt der Körper über verschiedene Abwehrsysteme, wobei die direkte Entgiftung der freien Radikale durch deren Reduktion am wirksamsten ist. Diese Reduktion geschieht in allen Zellen des Körpers durch verschiedene sog. Antioxidantien. Dabei spielt das fettlösliche Vitamin E eine herausragende Rolle, da es sehr starke Wirkungen gegen den oxidativen Streß zeigt, indem es die Lipidperoxidation stark verringert. Dadurch werden die Zellmembranen des Körpers vor deren Oxidation bewahrt. Zur Gruppe von Vitamin E gehören die pflanzlichen Tocopherole, die einen Chromanring mit einer antioxidativ wirksamen phenolischen Hydroxylgruppe aufweisen (Fig. 1). Darüberhinaus besitzen sie eine Phytylseitenkette, die durch eine optimale Positionierung in den Zellmembranen für die maximale Verringerung der Lipidperoxidation sorgt (Sies, Relationship between free radicals and vitamins: an overview, 1989, Int. J. Vitamin Nutr. Res. Suppl., 30, 215-223). Von den Tocopherolen gibt es mehrere Isoformen (alpha-, beta-, gamma- und sigma), die sich durch die Positionierung der Methylgruppen am Benzolring unterscheiden: alpha (R₁ und R₂ = CH₃), beta (R₁ = CH₃; R₂ = H), gamma (R₁ = H; R₂ = CH₃) und sigma (R₁ und R₂ = H). Dabei weist alpha- Tocopherol die höchste antioxidative Aktivität auf. Von alpha-Tocopherol gibt es wiederum 8 Stereoisomere, von denen die D-alpha-Isoform (auch RRR-alpha-Tocopherol genannt) die höchste biologische Aktivität zeigt (Traber, Regulation of human plasma vitamin E., 1997, Adv. Pharmacol., 38, 49-63). Bei der Entgiftung der Lipidradikale wird das Tocopherol zum Tocopheroxylradikal oxidiert, da hierbei ein Elektron von der Hydroxylgruppe auf das Lipidradikal übertragen wird. Damit wird die Lipidradikalkettenreaktion in den Membranen unterbrochen. Auf der anderen Seite muß das Tocopherol aber wieder reduziert werden, da das Tocopheroxylradikal nicht nur antioxidativ unwirksam ist, sondern in Abwesenheit von anderen Antioxidantien sogar giftig wirkt, indem es andere Moleküle oxidiert.The body has various defense systems against oxidative stress, with the direct detoxification of free radicals being the most effective by reducing them. This reduction occurs in all cells of the body through various so-called antioxidants. The fat-soluble vitamin E plays an outstanding role here, since it shows very strong effects against oxidative stress by greatly reducing lipid peroxidation. This protects the body's cell membranes from oxidizing. The group of vitamin E includes the vegetable tocopherols, which have a chromium ring with an antioxidative phenolic hydroxyl group ( FIG. 1). In addition, they have a phytyl side chain, which ensures optimal reduction in lipid peroxidation through optimal positioning in the cell membranes (Sies, Relationship between free radicals and vitamins: an overview, 1989, Int. J. Vitamin Nutr. Res. Suppl., 30, 215-223). There are several isoforms of the tocopherols (alpha, beta, gamma and sigma) which differ in the positioning of the methyl groups on the benzene ring: alpha (R ₁ and R ₂ = CH ₃ ), beta (R ₁ = CH ₃ ; R ₂ = H), gamma (R ₁ = H; R ₂ = CH ₃ ) and sigma (R ₁ and R ₂ = H). Alpha-tocopherol has the highest antioxidative activity. There are 8 stereoisomers of alpha-tocopherol, of which the D-alpha isoform (also called RRR-alpha-tocopherol) shows the highest biological activity (Traber, Regulation of human plasma vitamin E., 1997, Adv. Pharmacol., 38, 49-63). When the lipid radicals are detoxified, the tocopherol is oxidized to the tocopheroxyl radical since an electron is transferred from the hydroxyl group to the lipid radical. This interrupts the lipid radical chain reaction in the membranes. On the other hand, the tocopherol has to be reduced again, since the tocopheroxyl radical is not only ineffective in terms of antioxidants, but in the absence of other antioxidants it even has a toxic effect by oxidizing other molecules.

Für den Körper ist eine effektive Regeneration von Tocopherol äußerst wichtig, um die Abwehr gegen den oxidativen Streß aufrechtzuerhalten. Die Reduktion von oxidiertem Tocopherol erfolgt in den Zellen hauptsächlich durch das wasserlösliche L-Ascorbat, das die biologisch- aktive Form von Vitamin C darstellt und an der Grenzfläche zwischen dem Zellinneren (Cytosol) und der Zellmembran das membranständige Tocopherol reduziert. Daneben hat Ascorbat eine wichtige antioxidative Funktion im Cytosol, da es sehr wirksam freie Radikale in dieser wässerigen Phase reduziert. Auch Magnesium hat starke antioxidative Wirkungen in der Zelle. Dadurch, daß viele Krankheiten von einem erhöhten oxidativen Streß begleitet sind, wird die Fülle von Studien verständlich, die auf eine wichtige Bedeutung von Tocopherol, Ascorbat und Magnesium bei der Prävention und Therapie von Krankheiten hinweisen und daher eine erhöhte Einnahme empfehlen. For the body, an effective regeneration of tocopherol is extremely important for defense against oxidative stress. The reduction of oxidized tocopherol takes place in the cells mainly through the water-soluble L-ascorbate, which represents active form of vitamin C and at the interface between the cell interior (Cytosol) and the cell membrane, the membrane-bound tocopherol is reduced. Next to it Ascorbate has an important antioxidant function in the cytosol since it is very effective in free radicals reduced this aqueous phase. Magnesium also has strong antioxidant effects in the Cell. Because many diseases are accompanied by increased oxidative stress the plethora of studies understandable that indicate an important meaning of tocopherol, ascorbate and magnesium in the prevention and therapy of diseases and therefore a recommend increased intake.

Mittlerweile wurden schon einige kombinierte Tocopherol-Präparate geschützt, die gegen verschiedene Krankheiten spezifische Wirkungen zeigen. Dabei wurde die kombinatorische Wirkung von Vitamin E und C zur Verringerung der Sensibilität von menschlichen Geweben gegenüber elektromagnetischer Strahlung (DE 195 36 589A1 und WO 9712610A), sowie die Kombination von Tocopherol-Azetat und Vitamin C mit organischem Chrom zur Bekämpfung cardiovaskulärer Krankheiten bereits patentiert (EP 0561744A1). Cardiovaskuläre Krankheiten sind zumeist eine Folge von Artherosklerose, gegen die Vitamin E starke Wirkungen zeigt (Diplock, Will the "good fairies" please prove to us that vitamin E lessens human degenerative disease?, 1997, Free Radic. Res., 27, 511-532). In diesem Zusammenhang wurde die Wirkung einer Kombination aus Magnesium, Vitamin E, Vitamin C, Folsäure, Selen und Melatonin gegen die Vasokonstriktion (Verengung von Gefäßen) geschützt (WO 9737670). Auch die Ergänzung verschiedener Krebstherapien mit Vitamin E, Vitamin C, β-Carotin, Selen, Zink, Magnesium und Schwefel wurde patentiert (FR 2699820). Desweiteren schützt eine Kombination von RRR-Tocopherol-Azetat in Verbindung mit Ubichinon, ungesättigten Phospholipiden, Selen und L-Methionin gegen den oxidativen Streß und daraus resultierenden Krankheiten (WO 9833495). Darüberhinaus wirken geringe Anteile an Magnesium, Selen, Vitamin E, Vitamin C, β-Carotin und Vitamin B1 in Kombination mit Molkepulver protektiv gegen oxidative Prozesse des Körpers (DE 44 13 839) und die Supplementierung der Nahrung mit Glutathion, Taurin, Magnesium, Vitamin C, Vitamin E und β-Carotin optimiert die körperliche Resistenz vor den Folgen der Umweltverschmutzung (FR 2704397).In the meantime, some combined tocopherol preparations have been protected against different diseases show specific effects. The combinatorial Effect of vitamins E and C to reduce the sensitivity of human tissues against electromagnetic radiation (DE 195 36 589A1 and WO 9712610A), and the Combination of tocopherol acetate and vitamin C with organic chromium to combat Cardiovascular diseases already patented (EP 0561744A1). Cardiovascular diseases are mostly a result of atherosclerosis, against which vitamin E has strong effects (Diplock, Will the "good fairies" please prove to us that vitamin E lessens human degenerative disease ?, 1997, Free Radic. Res., 27, 511-532). In this context, the effect a combination of magnesium, vitamin E, vitamin C, folic acid, selenium and melatonin protected against vasoconstriction (narrowing of vessels) (WO 9737670). Also the Supplementation of various cancer therapies with vitamin E, vitamin C, β-carotene, selenium, zinc, Magnesium and sulfur have been patented (FR 2699820). Furthermore, one protects Combination of RRR-tocopherol acetate in combination with ubiquinone, unsaturated Phospholipids, selenium and L-methionine against the oxidative stress and resulting Diseases (WO 9833495). In addition, small amounts of magnesium, selenium, Vitamin E, vitamin C, β-carotene and vitamin B1 in combination with protective whey powder against oxidative processes of the body (DE 44 13 839) and the supplementation of food with glutathione, taurine, magnesium, vitamin C, vitamin E and β-carotene optimizes the physical resistance to the consequences of pollution (FR 2704397).

Test results

Bei dem neuen Präparat handelt es sich um eine Kombination von natürlichem Vitamin E (Tocopherol) mit dem Salz Magnesium-L-Ascorbat. In den folgenden Versuchen wurde nun analysiert, ob D,L-α-Tocopherol und Magnesium-L-Ascorbat den oxidativen Streß in Zellen verringern können und inwieweit sie toxische Effekte auf Zellen aufweisen. Der oxidative Streß wurde durch Analyse der Lipidperoxidation, der Zellviabilität und der Expression des Streßproteins Hsp70 bestimmt, der methodisch durch den Thiobarbitursäuretest, 2 Viabilitätstests (MTT- und Neutrairottest) und SDS-Polyacrylamidelektrophorese bzw. Western-Blot nachgewiesen wurde. Alle Versuche wurden mit C6 Rattengliomazellen durchgeführt. Hierbei handelt es sich um eine Tumorzelllinie aus Rattengehirnzellen, die bei konstanten Bedingungen in einem Inkubator kultiviert wurde. Der oxidative Streß wurde durch die Verabreichung von H₂O₂ in das Nährmedium für 1 h induziert.The new preparation is a combination of natural vitamin E (tocopherol) with the salt magnesium L-ascorbate. In the following experiments it was analyzed whether D, L-α-tocopherol and Magnesium-L-ascorbate can reduce the oxidative stress in cells and to what extent they have toxic effects on cells. The oxidative stress was determined by analyzing the lipid peroxidation, the cell viability and the expression of the stress protein Hsp70, which was methodically demonstrated by the thiobarbituric acid test, 2 viability tests (MTT and neutrairot test) and SDS-polyacrylamide electrophoresis or Western blot. All experiments were carried out with C6 rat glioma cells. This is a tumor cell line from rat brain cells that was cultivated in an incubator under constant conditions. Oxidative stress was induced by the administration of H ₂ O ₂ in the nutrient medium for 1 h.

Effect of D, L-α-tocopherol on lipid peroxidation

Zuerst wurde untersucht, welches Potential D,L-α-Tocopherol hat, eine durch oxidativen Streß induzierte Lipidperoxidation zu verringern. Der Nachweis der Lipidperoxidation erfolgte durch einen modifizierten Thiobarbitursäuretest gemäß der Methode von Bernheim und Mitarbeitern (The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipids, 1948, J. Biol. Chem., 174, 257-264), der die bei der Lipidperoxidation entstehenden Produkte, wie Malondialdehyd und andere verwandte Substanzen, bezeichnet als "Thiobarbitursäure reaktive Substanzen" (TBARS), photometrisch bestimmt. Die C6-Zellen wurden mit 500 µM D,L-α- Tocopherol für 0,5 h vorinkubiert und 1 h während eines oxidativen Stresses (OS) von 8 mM H₂O₂ coinkubiert und dann das Ausmaß der Lipidperoxidation (nmol TBARS/mg Protein) analysiert. Dabei wurden die Effekte von reduziertem und oxidiertem D,L-α-Tocopherol (Toco red bzw. Toco ox) sowohl ohne als auch während des OS (weiße bzw. schwarze Balken) untersucht. Zusätzlich wurde die Lipidperoxidation unbehandelter Kontrollzellen (K) analysiert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 6 unabhängigen Versuchen +/- Standardabweichung des Mittelwertes (SEM). Die Sterne geben die Signifikonzen gegenüber den OS-behandelten Zellen an (Fig. 2a). Der oxidative Streß von 8 mM H₂O₂ führt zu einer starken (ca. 11-fachen) Erhöhung der Lipidperoxidation (LPO) im Vergleich zur Kontrolle. Die Behandlung sowohl von reduziertem als auch oxidiertem D,L-α-Tocopherol allein führt zu einer leichten Erhöhung der LPO, die jedoch im nicht-signifikanten Bereich liegt. Reduziertes D,L-α-Tocopherol verringert hochsignifikant (*** = p < 0,001) die durch oxidativen Streß induzierte LPO sogar unterhalb des Niveaus von unbehandelten Kontrollzellen, während das oxidierte D,L-α-Tocopherol keinen signifikant inhibierenden Effekt auf die Lipidperoxidation zeigt, so daß der antilipidperoxidative Effekt von Tocopherol auf das reduzierende Potential der Hydroxylgruppe zurückzuführen ist. Danach wurde untersucht, ob das antilipidperoxidative Potential von D,L-α-Tocopherol auch nach einer alleinigen Vorinkubation erhalten bleibt. Dazu wurden die Zellen mit 500 µM reduziertem bzw. oxidiertem D,L-α-Tocopherol (Toco red bzw. Toco ox) für 2 h vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und ein oxidativer Streß von 2 mM H₂O₂ für 1 h appliziert. Gezeigt sind die Mittelwerte aus 5 unabhängigen Versuchen +/- SEM (Fig. 2b). Der OS von 2 mM H₂O₂ führt zu einer im Vergleich zu 8 mM H₂O₂ schwächeren, jedoch immer noch sehr starken Erhöhung der LPO. Wie in Fig. 2a führt die Behandlung mit reduziertem als auch oxidiertem D,L-α-Tocopherol zu einer leichten, jedoch nicht-signifikanten Erhöhung der LPO. Die Vorinkubation mit reduziertem D,L-α-Tocopherol supprimiert die durch einen nachfolgenden OS induzierte LPO hochsignifikant in die Nähe von unbehandelten Kontrollzellen (*** = p < 0,001). Im Gegensatz dazu hat oxidiertes D,L-α-Tocopherol keinen signifikanten Effekt auf die Lipidperoxidation, wie schon zuvor bei der Vor- und Coinkubation beobachtet (Fig. 2a). Dieser Versuch zeigt, daß die Zellen offensichtlich in der Lage sind, das Tocopherol aus dem Medium aufzunehmen, da nach der Vorinkubation intensiv gewaschen und ein Mediumwechsel vorgenommen wurde. Das stärkere antilipidperoxidative Potential von reduziertem D,L-α-Tocopherol bei der Vor- und Coinkubation (Fig. 2a) im Vergleich zu der reinen Vorinkubation (Fig. 2b) ist auf die zusätzliche Reduktion der freien Radikale im Medium zurückzuführen.The potential of D, L-α-tocopherol to reduce lipid peroxidation induced by oxidative stress was first investigated. The detection of lipid peroxidation was carried out by a modified thiobarbituric acid test according to the method of Bernheim and co-workers (The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipids, 1948, J. Biol. Chem., 174, 257-264) Products resulting from lipid peroxidation, such as malondialdehyde and other related substances, referred to as "thiobarbituric acid reactive substances" (TBARS), determined photometrically. The C6 cells were pre-incubated with 500 µM D, L-α-tocopherol for 0.5 h and co-incubated for 1 h during an oxidative stress (OS) of 8 mM H ₂ O ₂ and then the extent of lipid peroxidation (nmol TBARS / mg Protein). The effects of reduced and oxidized D, L-α-tocopherol (Toco red or Toco ox) were examined both without and during the OS (white or black bars). In addition, the lipid peroxidation of untreated control cells (K) was analyzed. The mean values from 6 independent tests +/- standard deviation of the mean value (SEM) are shown. The stars indicate the significance against the OS-treated cells ( FIG. 2a). The oxidative stress of 8 mM H ₂ O ₂ leads to a strong (approx. 11-fold) increase in lipid peroxidation (LPO) compared to the control. Treatment of both reduced and oxidized D, L-α-tocopherol alone leads to a slight increase in LPO, which is, however, in the non-significant range. Reduced D, L-α-tocopherol highly significantly (*** = p <0.001) reduces the LPO induced by oxidative stress even below the level of untreated control cells, while the oxidized D, L-α-tocopherol has no significant inhibitory effect on lipid peroxidation shows that the antilipid peroxidative effect of tocopherol is due to the reducing potential of the hydroxyl group. It was then examined whether the antilipid peroxidative potential of D, L-α-tocopherol was retained even after preincubation alone. For this purpose, the cells were preincubated with 500 μM reduced or oxidized D, L-α-tocopherol (Toco red or Toco ox) for 2 h. The cells were then washed and an oxidative stress of 2 mM H ₂ O _{2 was} applied for 1 h. The mean values from 5 independent experiments +/- SEM are shown ( FIG. 2b). The OS of 2 mM H ₂ O ₂ leads to a weaker but still very strong increase in LPO compared to 8 mM H ₂ O ₂ . As in Fig. 2a, treatment with reduced as well as oxidized D, L-α-tocopherol leads to a slight but insignificant increase in LPO. Pre-incubation with reduced D, L-α-tocopherol significantly suppressed the LPO induced by a subsequent OS in the vicinity of untreated control cells (*** = p <0.001). In contrast, oxidized D, L-α-tocopherol has no significant effect on lipid peroxidation, as has already been observed with pre- and co-incubation ( Fig. 2a). This experiment shows that the cells are obviously able to take up the tocopherol from the medium, since after the preincubation, the cells were washed intensively and the medium was changed. The stronger antilipid peroxidative potential of reduced D, L-α-tocopherol in the pre- and co-incubation ( Fig. 2a) compared to the pure pre-incubation ( Fig. 2b) is due to the additional reduction of free radicals in the medium.

Effect of D, L-α-tocopherol on cell viability

In den nächsten Experimenten wurde untersucht, ob sich das antilipidperoxidative Potential von D,L-α-Tocopherol (Fig. 2a,b) auch cytoprotektiv bei oxidativem Streß auswirkt. Dieses wurde durch den MTT-Test analysiert, der die Viabilität der Zellen durch die Umwandlung des Tetrazoliumsalzes MTT (3,(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid) zu blauem, wasserunlöslichem Formazan durch die mitochondrialen Dehydrogenasen bestimmt (Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, 1983, J. Immunol. Meth., 65, 55-63). Der MTT- Viabilitätstest wurde gemäß der von Hansen und Mitarbeitern beschriebenen Methode durchgeführt (Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill, 1989, J. Immunol. Meth., 119, 203-210). Es wurde der Einfluß der Vorinkubation (0,5 h) und Coinkubation von 500 µM reduziertem D,L-α-Tocopherol (Toco red) während des OS (2 mM H₂O₂, 1 h) auf die Zellviabilität nach 3 Tagen Erholung analysiert. Ebenso wurde eine Kontrolle mit D,L-α-Tocopherol (1,5 h Inkubation, 3 Tage Erholung) durchgeführt. Die Viabilität ist jeweils in Prozent der unbehandelten Kontrollzellen (K) angegeben. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 5 unabhängigen Versuchen +/- SEM (Fig. 3). Der OS von 2 mM H₂O₂ wirkt sehr cytotoxisch, indem die Zellviabilität auch 3 Tage nach dem OS nur ca. 14% der Kontrolle betrug. Eine Behandlung der Zellen mit reduziertem D,L-α- Tocopherol zeigt keine signifikanten Effekte auf die Zellviabilität. Die Vor- und Coinkubation der Zellen mit reduziertem D,L-α-Tocopherol während des OS zeigt einen leicht cytoprotektiven Effekt, da nach 3 Tagen die mitochondriale Stoffwechselaktivität um 11% höher liegt im Vergleich zu den OS-behandelten Zellen. Jedoch liegt dieser cytoprotektive Effekt im nicht-signifikanten Bereich.In the next experiments it was examined whether the antilipid peroxidative potential of D, L-α-tocopherol ( Fig. 2a, b) also has a cytoprotective effect in the case of oxidative stress. This was analyzed by the MTT test, which determined the viability of the cells by converting the tetrazolium salt MTT (3, (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) to blue, water-insoluble formazan determined by mitochondrial dehydrogenases (Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, 1983, J. Immunol. Meth., 65, 55-63). The MTT viability test was carried out according to the method described by Hansen and co-workers (Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth / cell kill, 1989, J. Immunol. Meth., 119, 203-210 ). The influence of pre-incubation (0.5 h) and co-incubation of 500 µM reduced D, L-α-tocopherol (Toco red) during OS (2 mM H ₂ O ₂ , 1 h) on cell viability after 3 days of recovery analyzed. A control with D, L-α-tocopherol (1.5 h incubation, 3 days recovery) was also carried out. The viability is given in percent of the untreated control cells (K). The mean values from 5 independent experiments +/- SEM are shown ( FIG. 3). The OS of 2 mM H ₂ O ₂ is very cytotoxic in that the cell viability was only about 14% of the control even 3 days after the OS. Treatment of the cells with reduced D, L-α-tocopherol shows no significant effects on cell viability. The pre- and co-incubation of the cells with reduced D, L-α-tocopherol during the OS shows a slightly cytoprotective effect, since after 3 days the mitochondrial metabolic activity is 11% higher compared to the OS-treated cells. However, this cytoprotective effect is insignificant.

Effect of D, L-α-tocopherol on the expression of Hsp70

Einen Schutz gegen die Auswirkung des oxidativen Stresses bilden die Streßproteine. Die bekanntesten Streßproteine umfassen die Familie von Hsp70, die zur Gruppe von Hitzeschockproteinen gehören und ein Molekulargewicht von ca. 70 KDa aufweisen. Hsp70 repariert geschädigte Proteine, die infolge von oxidativem Streß denaturiert wurden. In C6- Zellen führt der oxidative Streß dosisabhängig zur Expression des Streßproteins Hsp70. Daher kann die Expressionsstärke von Hsp70 als diagnostischer Parameter für den Grad des zellulären oxidativen Stresses herangezogen werden (Gosslau, Vergleichende Untersuchungen zur Induktion von Streßproteinen durch oxidativen Streß und Hitzeschock in C6- Rattengliomazellen, Dissertation, Universität Bremen, 1998, 47-60). Die Expression von Hsp70 wurde durch Auftrennung der Proteine mittels SDS-Polyacrylamidelectrophorese (PA(GE) und Western-Blot gemäß den Methoden von Laemmli (Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage T4, 1970, Nature, 227, 680-685) und Towbin und Mitarbeitern (Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamid gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 4350-4354) analysiert. Anschließend wurde Hsp70 mittels eines spezifischen Antikörpers detektiert. Die Stärke der Expression von Hsp70 wurde am Computer quantifiziert und als relative densitometrische Einheiten dargestellt. Fig. 4 zeigt die Wirkung der Inkubation (2 h) von reduziertem D,L-α-Tocopherol (Toco red) vor dem OS (2 mM H₂O₂, 1 h) auf die Expression des Streßproteins Hsp70 nach einer weiteren Erholungszeit von 18 h. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen +/- SEM. Ein repräsentativer Blot befindet sich unter dem Histogramm. Sowohl unbehandelte (K) als auch mit D,L-α-Tocopherol-behandelte Zellen (2 h, 18 h Erholung) zeigen keine Expression von Hsp70. Dagegen führt ein OS von 2 mM 1t02 (lh, 18 h Erholung) zur Expression von Hsp70. Eine Vorinkubation (2 h) der Zellen mit 500 µM reduziertem D,L-α-Tocopherol, gefolgt von dem OS (2 mM H₂O₂, Ih) mit entsprechender Erholungszeit (18 h), führt zu einer Verringering der Expression von Hsp70, womit die Ergebnisse der Verringerung des oxidativen Stresses in den Lipidperoxidations- und Viabilitätstests (Fig. 2-3) durch reduziertes D,L-α-Tocopherol bestätigt wurden.The stress proteins provide protection against the effects of oxidative stress. The best known stress proteins include the family of Hsp70, which belong to the group of heat shock proteins and have a molecular weight of approximately 70 KDa. Hsp70 repairs damaged proteins that have been denatured as a result of oxidative stress. In C6 cells, the oxidative stress leads, depending on the dose, to the expression of the stress protein Hsp70. The expression level of Hsp70 can therefore be used as a diagnostic parameter for the degree of cellular oxidative stress (Gosslau, comparative studies on the induction of stress proteins by oxidative stress and heat shock in C6 rat glioma cells, dissertation, University of Bremen, 1998, 47-60). The expression of Hsp70 was determined by separation of the proteins by means of SDS polyacrylamide electrophoresis (PA (GE) and Western blot according to the methods of Laemmli (Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage T4, 1970, Nature, 227, 680-685) and Towbin and co-workers (Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 4350-4354). Hsp70 was then detected using a specific antibody The level of expression of Hsp70 was quantified on the computer and represented as relative densitometric units .. Figure 4 shows the effect of the incubation (2 h) of reduced D, L-α-tocopherol (Toco red) before the OS (2 mM H ₂ O ₂ , 1 h) on the expression of the stress protein Hsp70 after a further recovery time of 18 h. The mean values from 3 independent experiments +/- SEM are shown me under the histogram. Both untreated (K) and cells treated with D, L-α-tocopherol (2 h, 18 h recovery) show no expression of Hsp70. In contrast, an OS of 2 mM 1t02 (1h, 18h recovery) leads to the expression of Hsp70. A pre-incubation (2 h) of the cells with 500 µM reduced D, L-α-tocopherol, followed by the OS (2 mM H ₂ O ₂ , Ih) with a corresponding recovery time (18 h) leads to a reduction in the expression of Hsp70 , with which the results of the reduction in oxidative stress in the lipid peroxidation and viability tests ( Fig. 2-3) were confirmed by reduced D, L-α-tocopherol.

Effect of D, L-α-tocopherol and magnesium L-ascorbate on cell viability

Mittels zweier Viabilitätstests (MTT- und Neutralrot-Test) wurde der Einfluß von D,L-α- Tocopherol und Magnesium-L-Ascorbat auf die Viabilität von Zellen analysiert. Während der MTT-Test die Viabilität der Zellen durch Bestimmung der mitochondrialen Stoffwechselaktivität erfaßt, wird die Zellviabilität beim Neutralrot (NR)-Test durch die endocytotische Aufnahme von Neutralrot analysiert (Babich and Borenfreund, Structure activity relationship (SAR): models established in vitro with the neutral red cytotoxicity assay, 1987, Toxicol. in vitro, 1, 3-9). Die Zellen wurden mit 500 M reduziertem D,L-α-Tocopherol (Toco red) und 2 mM Magnesium-L-Ascorbat (Mg-Asc) für 2 h inkubiert. Anschließend wurde ein Mediumwechsel durchgeführt und die Zellviabilität nach 18 h durch den MTT- und NR-Test bestimmt. Die Viabilität der Zellen ist jeweils in Prozent der unbehandelten Kontrollzellen (K) angegeben. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 8 (MTT) bzw. 3 (NR) unabhängigen Versuchen +/- Standardabweichung (Fig. 5). Beide Tests zeigen, daß sowohl D,L-α-Tocopherol als auch Magnesium-L-Ascorbat keine toxischen Effekte auf die Zellen haben, sondern sogar leicht cytoprotektiv wirken, da die Viabilität leicht erhöht wurde (nicht-signifikant). In Fig. 3 wurde bereits gezeigt, daß D,L-α-Tocopherol auch längerfristig (nach 3 Tagen) keine cytotoxischen Effekte aufweist.The influence of D, L-α-tocopherol and magnesium-L-ascorbate on the viability of cells was analyzed by means of two viability tests (MTT and neutral red test). While the MTT test measures the viability of the cells by determining the mitochondrial metabolic activity, the cell viability in the neutral red (NR) test is analyzed by the endocytotic uptake of neutral red (Babich and Borenfreund, Structure activity relationship (SAR): models established in vitro with the neutral red cytotoxicity assay, 1987, Toxicol. in vitro, 1, 3-9). The cells were incubated with 500 M reduced D, L-α-tocopherol (Toco red) and 2 mM magnesium L-ascorbate (Mg-Asc) for 2 h. The medium was then changed and the cell viability was determined after 18 h by the MTT and NR test. The viability of the cells is given in percent of the untreated control cells (K). The mean values from 8 (MTT) or 3 (NR) independent tests +/- standard deviation are shown ( Fig. 5). Both tests show that both D, L-α-tocopherol and magnesium L-ascorbate have no toxic effects on the cells, but are even slightly cytoprotective, since the viability has been increased slightly (insignificantly). In Fig. 3 it has already been shown that D, L-α-tocopherol has no cytotoxic effects even in the long term (after 3 days).

Effect of magnesium L-ascorbate on lipid peroxidation

Abschließend wurde untersucht, ob auch Magnesium-L-Ascorbat die LPO verringern kann.Finally, it was examined whether magnesium L-ascorbate can also reduce LPO.

Wie in Fig. 2 wurden die Effekte sowohl einer alleinigen Inkubation vor dem oxidativen Streß als auch einer Vor- bzw. Coinkubation während des OS untersucht. Zusätzlich wurden die bereits gezeigten Ergebnisse der Wirkungen von reduziertem D,L-α-Tocopherol (Fig. 2a,b) jeweils als Vergleich dargestellt. Zunächst wurden die Effekte der Inkubation vor dem OS untersucht. Dazu wurden die Zellen mit 2 mM Magnesium-L-Ascorbat (Mg-Asc) für 2 h vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, ein OS (2 mM H₂O₂, 1 h) induziert und anschließend das Ausmaß der Lipidperoxidation (nmol TBARS/mg Protein) bestimmt. In Fig. 6a sind die Mittelwerte aus 5 unabhängigen Versuchen +/- SEM dargestellt, wobei die Sterne jeweils die Signifikonzen gegenüber den OS-behandelten Zellen angeben. Wie beim reduziertem D,L-α-Tocopherol führt auch die Behandlung mit Magnesium-L-Ascorbat allein zu einer leichten Erhöhung der LPO, die jedoch im nicht-signifikanten Bereich liegt. Die Vorinkubation mit Magnesium-L-Ascorbat inhibiert die OS-induzierte LPO signifikant um ca. ein Drittel (* = p < 0,05), wogegen die Verringerung der Lipidperoxidation durch D,L-α- Tocopherol deutlicher ist (*** = p < 0,001). Da beide Antioxidantien vorinkubiert wurden und vor der Applikation des OS intensiv gewaschen und ein Mediumwechsel durchgeführt wurde, ist eine direkte Entgiftung der freien Radikale im Medium durch D,L-α-Tocopherol und Magnesium-L-Ascorbat auszuschließen. Vielmehr zeigt dieser Versuch, daß die Zellen das fettlösliche D,L-α-Tocopherol während der Vorinkubation in den Membranen anreichern, welches die beim nachfolgenden OS entstehenden Lipidradikale dann direkt reduziert. Der etwas schwächere antilipidperoxidative Effekt vom wasserlöslichen Magnesium-L-Ascorbat basiert sekundär auf einer Regeneration von Tocopherol. Dabei wird das durch zahlreiche zellphysiologische Stoffwechselprozesse ständig oxidierte Tocopherol während der Vorinkubation mit Magnesium-L-Ascorbat teilweise regeneriert. Bei dem anschließenden oxidativen Streß kann dann dieses reduzierte Tocopherol die Lipidperoxidation in den Zellmembranen effektiver inhibieren. Dabei spielt Magnesium eine Rolle bei der Regeneration von oxidiertem Ascorbat, das während der Regeneration von Tocopherol zunehmend entsteht. Danach wurde untersucht, welchen Effekt eine Coinkubation von Magnesium-L-Ascorbat während des OS auf die LPO von Zellen hat. Die Zellen wurden mit 2 mM Magnesium-L- Ascorbat für 0,5 h vorinkubiert und 1 h während des OS (8mM H₂O₂) coinkubiert. Anschließend wurde das Ausmaß LPO bestimmt. Angegeben sind die Mittelwerte aus 6 unabhängigen Versuchen +/- SEM (Fig. 6b). Magnesium-L-Ascorbat (Mg-Asc) verringert hochsignifikant die durch oxidativen Streß induzierte LPO (*** = p < 0,001), jedoch schwächer im Vergleich mit reduziertem D,L-α-Tocopherol. Dabei zeigen beide Antioxidantien jeweils stärkere antilipidperoxidative Effekte bei der hier vorliegenden Vor- und Coinkubation im Vergleich zu der reinen Vorinkubation (Fig. 6a). Die starke Wirkung von D,L-α-Tocopherol ist auf einer äußerst effektiven Reduktion von Lipidradikalen in der lipophilen Phase der Zellmembranen zurückzuführen. Das antilipidperoxidative Potential von Magnesium-L-Ascorbat ist sowohl auf einer Regeneration von Tocopherol als auch auf einer zusätzlichen direkten Reduktion der freien Radikale durch anionisches Ascorbat und divalent kationisches Magnesium im Medium zurückzuführen, in das Magnesium-L-Ascorbat sofort zerfällt. Dadurch bleibt ein größerer Anteil von Tocopherol in der reduzierten Form erhalten, weil weniger zu entgiftende Lipidradikale in den Zellmembranen entstehen.As in FIG. 2, the effects of both a sole incubation before the oxidative stress and a pre-or co-incubation during the OS were examined. In addition, the results of the effects of reduced D, L-α-tocopherol ( FIG. 2a, b) already shown were each shown as a comparison. First, the effects of incubation before the OS were examined. For this purpose, the cells were preincubated with 2 mM magnesium L-ascorbate (Mg-Asc) for 2 h. The cells were then washed, an OS (2 mM H ₂ O ₂ , 1 h) was induced and then the extent of lipid peroxidation (nmol TBARS / mg protein) was determined. In Fig. 6a, the averages of 5 independent experiments +/- SEM are shown, wherein the star each OS-treated specify the significances to the cells. As with reduced D, L-α-tocopherol, treatment with magnesium L-ascorbate alone leads to a slight increase in LPO, which is, however, in the non-significant range. Pre-incubation with magnesium L-ascorbate significantly inhibits OS-induced LPO by about a third (* = p <0.05), whereas the reduction in lipid peroxidation by D, L-α-tocopherol is more pronounced (*** = p <0.001). Since both antioxidants were preincubated and washed intensively before the application of the OS and the medium was changed, direct detoxification of the free radicals in the medium by D, L-α-tocopherol and magnesium-L-ascorbate can be ruled out. Rather, this experiment shows that the cells accumulate the fat-soluble D, L-α-tocopherol in the membranes during the preincubation, which then directly reduces the lipid radicals formed in the subsequent OS. The somewhat weaker anti-lipid peroxidative effect of the water-soluble magnesium L-ascorbate is based on a regeneration of tocopherol. The tocopherol, which is constantly oxidized by numerous cell physiological metabolic processes, is partially regenerated during the pre-incubation with magnesium L-ascorbate. In the subsequent oxidative stress, this reduced tocopherol can more effectively inhibit lipid peroxidation in the cell membranes. Magnesium plays a role in the regeneration of oxidized ascorbate, which is increasingly produced during the regeneration of tocopherol. The effect of coincubation of magnesium L-ascorbate during the OS on the LPO of cells was then investigated. The cells were preincubated with 2 mM magnesium L-ascorbate for 0.5 h and co-incubated for 1 h during the OS (8mM H ₂ O ₂ ). The extent of LPO was then determined. The mean values from 6 independent experiments +/- SEM are given ( FIG. 6b). Magnesium L-ascorbate (Mg-Asc) highly significantly reduces the LPO induced by oxidative stress (*** = p <0.001), but is weaker compared to reduced D, L-α-tocopherol. Both antioxidants each show stronger antilipid peroxidative effects in the pre- and co-incubation here compared to the pure pre-incubation ( Fig. 6a). The strong effect of D, L-α-tocopherol is due to an extremely effective reduction of lipid radicals in the lipophilic phase of the cell membranes. The antilipid peroxidative potential of magnesium L-ascorbate is due to regeneration of tocopherol as well as an additional direct reduction of free radicals by anionic ascorbate and divalent cationic magnesium in the medium, into which magnesium L-ascorbate immediately breaks down. As a result, a larger proportion of tocopherol is retained in the reduced form, because fewer lipid radicals to be detoxified arise in the cell membranes.

Bislang gibt es das Problem, daß sich Tocopherol-Präparate in Abhängigkeit des Herstellungsverfahrens in einem mehr oder weniger reduzierten Zustand befinden, wobei eine Stabilisierung von Vitamin E durch die Kombination mit anderen fettlöslichen Vitaminen erzielt werden kann (EP 0835613A2). Außerdem wird durch die Suspendierung von Vitamin E und C in Neutralöl ein retardierender Effekt beider Vitamine im Körper erzielt (EP 0176772A1). Weitergehend wurde die Herstellung synthetischer Vitamin E/C-Konjugate bereits patentiert (JP 4099772, JP 5331166 und JP 60097915). Die Ergebnisse mit den Rattengliomazellen zeigen, daß nur reduziertes Tocopherol wirksam gegen oxidativen Streß in Zellen schützt: Im Gegensatz zu oxidiertem Tocopherol verringert reduziertes Tocopherol die Lipidperoxidation hochsignifikant, wobei eine Vor- und Coinkubation effektiver als eine alleinige Vorinkubation wirkt. Tocopherol selbst wirkt nicht toxisch und kann die cytotoxischen Effekte des oxidativen Stresses leicht verringern. Diese Verringerung von OS durch reduziertes Tocopherol wird anhand der Supprimierung der Expression des Streßproteins Hsp70 bestätigt. Zudem verringert auch Magnesium-Ascorbat signifikant die Lipidperoxidation und zeigt keine toxischen Effekte auf die Zellen. Somit stellen sowohl reduziertes Tocopherol als auch Magnesium-Ascorbat einen wirksamen Zellschutz vor dem oxidativen Streß dar. Der Schutz vor der Lipidperoxidation beruht sowohl auf der direkten Reduktion der Lipidradikale in der lipophilen Phase durch Tocopherol als auch auf der Entgiftung von freien Radikalen in der wässerigen Phase des Mediums durch Magnesium-Ascorbat. Zusätzlich wird oxidiertes Tocopherol durch Magnesium-Ascorbat reduziert. Diese biologische Regeneration wird beim neuen Tocopherol-Präparat genutzt, das durch die Kombination mit Magnesium-Ascorbat dauerhaft reduziert wird. Dadurch wird sichergestellt, daß Tocopherol auf natürliche Weise oxidationsgeschützt in seiner aktiven Form konserviert wird. Dieses spiegelt das biologische Regenerationssystem von Tocopherol in der Zelle und weitergehend des gesamten Körpers wieder. Da viele epidemiologischen Studien eine starke Wirkung vor allem von reduzierten Tocopherol, aber auch von Ascorbat und Magnesium, gegen diverse Krankheiten zeigen, stellt das natürlich kombinierte Tocopherol-Präparat durch eine optimierte Verringerung des oxidativen Stresses einen Beitrag zur Prävention und Therapie von Krankheiten dar.So far there is the problem that tocopherol preparations depending on the Manufacturing process are in a more or less reduced state, one Stabilization of vitamin E through the combination with other fat-soluble vitamins can be achieved (EP 0835613A2). In addition, the suspension of vitamin E and C in neutral oil has a retarding effect on both vitamins in the body (EP 0176772A1). The manufacture of synthetic vitamin E / C conjugates also went further already patented (JP 4099772, JP 5331166 and JP 60097915). The results with the Rat glioma cells show that only reduced tocopherol is effective against oxidative stress in Protects cells: In contrast to oxidized tocopherol, reduced tocopherol reduces the Lipid peroxidation highly significant, with a pre- and co-incubation more effective than one sole pre-incubation works. Tocopherol itself is not toxic and can Slightly reduce the cytotoxic effects of oxidative stress. This reduction in OS by reduced tocopherol is based on the suppression of the expression of the stress protein Hsp70 confirmed. Magnesium ascorbate also significantly reduces lipid peroxidation and shows no toxic effects on the cells. Thus both reduced tocopherol as well as magnesium ascorbate is an effective cell protection against oxidative stress Protection against lipid peroxidation is based both on the direct reduction of lipid radicals in the lipophilic phase by tocopherol as well as on the detoxification of free radicals in the aqueous phase of the medium due to magnesium ascorbate. In addition, it is oxidized Tocopherol reduced by magnesium ascorbate. This biological regeneration is carried out at new tocopherol preparation used by combining with magnesium ascorbate is permanently reduced. This ensures that tocopherol is found in a natural way is protected from oxidation in its active form. This reflects the biological Regeneration system of tocopherol in the cell and in the whole body again. Because many epidemiological studies have a strong impact especially from reduced Tocopherol, but also of ascorbate and magnesium, against various diseases the naturally combined tocopherol preparation by an optimized reduction of the oxidative stress contributes to the prevention and therapy of diseases.

Claims

1. Combined preparation consisting of tocopherol and magnesium ascorbate for optimized reduction of oxidative stress in cells.

2. Combined preparation according to claim 1, characterized in that the Composition of tocopherol and magnesium ascorbate in a ratio of 1: 1 to 1:20 stands.

3. Combined preparation according to claim 1-2, characterized in that tocopherols, in particular alpha, beta, gamma, sigma tocopherols or their derivatives Magnesium ascorbate in the ratio mentioned.

4. Combined preparation according to claims 1-3, characterized in that an emulsion consisting of tocopherol and magnesium ascorbate through a polymer protective layer is completed.

5. Combined preparation according to claims 1-3, characterized in that a core consisting of tocopherol and a polymer protective layer from a jacket consisting of magnesium ascorbate is encased.