DE19945441A1

DE19945441A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen in eukaryontische Zellen

Info

Publication number: DE19945441A1
Application number: DE1999145441
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Kroemer; Georg Orberger
Original assignee: ARIMEDES BIOTECHNOLOGY GmbH
Current assignee: ARIMEDES BIOTECHNOLOGY GmbH
Priority date: 1999-09-22
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2001-04-05

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen in eukaryontische Zellen, zu diesem Zweck einsetzbare Zusatzstoffe auf Calciumphosphat-Basis sowie Transfektionsagentien. Die Erfindung betrifft auch Vorrichtungen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, sowie ein Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen, das kontinuierlich durchgeführt wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können Nukleinsäuren sowie Proteine und Peptide auch im großtechnischen Maßstab kostengünstig sowohl in adhärente als auch in nicht-adhärente Zellen eingebracht werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen in eukaryontische Zellen, zu diesem Zweck einsetzbare Zusatzstoffe und Transfektionsagentien, sowie Vorrichtungen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.

Im Stand der Technik wurden verschiedene Verfahren zur Transfektion von eukaryontischen Zellen beschrieben. Einige dieser Verfahren machen sich die Einwirkung bestimmter Zusatzstoffe zunutze, die die einzuführende Nukleinsäure oder das einzuführende Protein binden bzw. enthalten.

Ein bekanntes Transfektionsverfahren ist die Calciumphosphat-Kopräzipitation (siehe z. B. Graham und von der Eb, Virology 52 (1973), 456-467). Es basiert auf der gemeinsamen Fällung von Nukleinsäure und Calciumphosphat, z. B. durch Zugabe eines Überschusses an Ca²⁺ Ionen zu einer DNA und Phosphat enthaltenden Lösung. Anschließend wird dann der kopräzipitierte Bodenkörper, der DNA und Calciumphosphat enthält, zur Transfektion eukaryontischer Zellen verwendet.

Kopräzipitation mit Calciumphosphat wurde auch verwendet, um Proteine in Zellen einzuführen. So beschreiben Howcroft et al. die Einführung von β-Galactosidase in Hela-, COS-7- und CHP-126-Zellen mittels einer Calciumphosphat-Kopräzipitationsmethode (Anal. Biochem. 244 (1997), 22-27).

Die Calciumphosphat-Kopräzipitationsmethode ist zwar ein relativ kostengünstiges Verfahren, weist jedoch die Nachteile auf, daß ihre Reproduzierbarkeit gering ist und keine Möglichkeit des "Upscaling", also der Maßstabsvergrößerung, besteht.

Bei der Calciumphosphat-Kopräzipitationsmethode muß ferner das nach diesem Verfahren erhaltene Transfektionsagens für jeden neuen Ansatz erneut hergestellt werden, da es einer raschen "Alterung" unterliegt, die die Transfektion nachteilig beeinflußt. Dies ist auch insofern nachteilig, als die Bildung von für die Transfektion optimalen Nukleinsäure- Calciumphosphat-Kopräzipitaten von vielerlei mitunter schwierig zu kontrollierenden Faktoren abhängt, so daß die Transfektionseffizienz bei separaten Ansätzen mitunter deutlich unterschiedlich ausfällt, da jede neu hergestellte Transfektionslösung andere Molekülspezies bzw. -aggregate enthält.

Weitere bekannte Verfahren zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen umfassen die Verwendung von Zusatzstoffen wie DEAE-Dextran und Poly-L-Lysin. Diese Transfektionsverfahren werden z. B. bei Ehrlich et al. (Biochim. Biophys. Acta 454 (1976), 397-409) vergleichend beschrieben.

Als die Transfektion fördernde Zusatzstoffe wurden auch liposomenbildende Agentien verwendet (siehe z. B. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7413-7417; Gao und Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (1991), 280-285). Es wird derzeit angenommen, daß die Liposomen an die DNA binden, diese Komplexe anschließend mit der Zellmembran interagieren und die DNA schließlich durch einen unbekannten Mechanismus in die Zelle eintreten kann.

Als die Transfektion fördernder Zusatzstoff wurden auch synthetische aktivierte Dendrimere verwendet, die unter dem Markennamen SuperFect™ im Handel erhältlich sind (Qiagen).

Weiterhin wird bei Appel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 7670-7674) exogene Plasmid-DNA unter Verwendung von Serpentinasbestfasern als Trägermaterial in COS-7-Zellen von Affen eingeführt.

Andererseits wurden im Stand der Technik Transfektionsverfahren beschrieben, die die temporäre Perforation der Zellen - und damit die Aufnahme des gewünschten Stoffes - unter Zuhilfenahme physikalischer, insbesondere mechanischer, elektrischer oder akustischer Mittel erreichen. So wird z. B. bei Bao et al. (Ultrasound in Med. & Biol. 23 (1997), 953-959) ein Reporter-Plasmid durch Ultraschalleinwirkung in CHO-Zellen (Ovarzellen des chinesischen Hamsters) eingeführt, und anschließend das vom Plasmid kodierte Protein (Luziferase) in den transfizierten Zellen exprimiert.

Ultraschall wurde auch von Fechheimer et al. zum Einbringen einer makromolekularen chemischen pH-Sonde, in diesem Falle Fluoreszein-markiertes Dextran, in Zellen von Amöben verwendet (Eur. J. Cell Biol. 40 (1986), 242-247).

Kim et al. beschreiben die Verwendung verschiedener Ultraschallexpositionszeiten und deren Auswirkung auf die Transfektionseffizienz in Säugerzellen (Human Gene Therapy 7 (1996), 1339-1346). Generell ist festzustellen, daß die auf Ultraschall basierenden Transfektionsverfahren keine hohe Transfektionseffizienz ermöglichen, d. h. das die Ausbeute an transfizierten Zellen bei diesen Verfahren gering ist.

Als weiteres mechanisches Verfahren, um die Aufnahme von Makromolekülen in Zellen zu ermöglichen, wird in der US-PS 5,658,892 die Verwendung lasergenerierter Druckimpulse zur temporären Permeabilisierung von Zellen beschrieben. Bei dieser Technik werden Laserpulse auf ein absorbierendes Material gerichtet, so daß die entstehende Absorptionswärme eine Expansion des umgebenden Mediums und damit einen Druckimpuls erzeugt, der auf die Zelle einwirkt und diese transient permeabilisiert.

Verschiedene mechanische Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen und Organe, die auf kurzzeitigen Druckerhöhungen basieren, sind aus der US-PS 5,766,901 bekannt.

Ein weiteres mechanisches Verfahren beschreiben Clarke und McNeill, die Scherkräfte zum Einbringen von fluoreszenzmarkiertem Dextran in Zellen verwenden (J. Cell Sci. 102 (1992), 533-541). Die Scherkräfte werden dabei durch Passage der Zellsuspension durch eine Hohlnadel oder eine ähnliche Vorrichtung erzeugt, was zu einer kurzzeitigen reversiblen Verletzung der Zellmembran und anschließender Aufnahme des zu transfizierenden Materials führt.

Im Zusammenhang mit der therapeutischen Verabreichung von Substanzen wurde die Verwendung gasgefüllter Mikrosphären, z. B. Liposomen, beschrieben (US-PS 5,770,222). Dabei werden Nukleinsäuren oder andere in den Mikrosphären enthaltene therapeutisch wirksame Substanzen im Zielgewebe des Patienten durch Ultraschallbehandlung freigesetzt.

Bei der Entwicklung neuer und/oder verbesserter pharmazeutischer Wirkstoffe, z. B. auf rekombinantem Wege hergestellter Proteine oder Peptide, stehen dem Fachmann verschiedene Vorgehensweisen zur Verfügung, um die für eine aussagekräftige Wirkungsanalyse, z. B. Versuche in vivo, benötigte Menge des gewünschten Stoffes bereitzustellen. Eine Möglichkeit besteht in der Entwicklung transgener Organismen bzw. Tiere, die den durch die eingeführte Nukleinsäure kodierten Wirkstoff in entsprechend großen Mengen exprimieren. Als weitere Möglichkeit kommt die Herstellung stabiler rekombinanter Zellinien in Betracht (z. B. Säugerzellinien, die dem humanen Vorbild sehr ähnliche Glykoproteine erzeugen können). Beide Vorgehensweisen sind jedoch mit hohem Arbeits- und Zeitaufwand verbunden, wobei zudem keine Gewißheit besteht, ob am Ende ein geeigneter transgener Organismus bzw. eine stabile Zellinie erhalten wird.

Darüber hinaus können bestimmte Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellkulturen oder in transgenen Organismen nur unter großen Schwierigkeiten oder gar nicht permanent exprimiert werden. Ebenso können auch bestimmte Proteine oder Peptide nur für kurze Zeit in Zellen eingeführt werden, ohne daß die Zellen geschädigt werden oder absterben. Dies rührt unter anderem daher, daß die exprimierten bzw. eingeführten Proteine oder Peptide für die Zellen mitunter toxisch sind, wie es z. B. bei Proteasen, Nukleasen, Lipasen oder Porenbildnern und ebenso bei Membranproteinen bzw. hydrophoben Proteinen der Fall sein kann.

Andererseits besteht bei der transienten Expression, bei der nicht auf stabile Integration in das Genom der transfizierten Zellen selektioniert wird, wie auch beim Einbringen von Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen, das Problem der mit den bekannten Transfektionsverfahren zu erzielenden relativ geringen Möglichkeiten, das Verfahren im größeren Maßstab durchzuführen, um beispielsweise in einem kurzen Zeitraum größere Mengen an Protein zu erhalten. Auch die durch Verwendung bekannter transfektionsfördernder Zusatzstoffe, z. B. Calciumphosphat, verursachten unerwünschten toxischen Nebeneffekte, etwa das frühzeitige Absterben der Zellen unmittelbar bei oder kurz nach der Transfektion, sowie die mangelnde Reproduzierbarkeit des jeweiligen Transfektionsansatzes, wirken sich in diesem Zusammenhang nachteilig aus. Schließlich sind die bei vielen vorbekannten Verfahren benötigten Mengen an zusätzlichen Reagenzien, wie z. B. kommerziell erhältliche Transfektionsreagenzien bzw. Zusatzstoffe, relativ teuer, was das bereits erwähnte "Upscaling" oder gar den großtechnischen Einsatz äußerst unwirtschaftlich macht.

Will der Fachmann die Eigenschaften eines bestimmten von ihm rekombinant hergestellten bzw. isolierten Proteins oder Peptids untersuchen, so ist es häufig wünschenswert, Antikörper gegen dieses Protein oder Peptid zu erzeugen, oder seine Wirkung auf das Organsystem eines Tieres zu ermitteln. Diese Schritte werden erleichtert, wenn eine ausreichende Menge an Protein innerhalb kürzester Zeit zur Verfügung steht, so daß nach entsprechenden Tests unmittelbar entschieden werden kann, ob für das betreffende Protein der Aufwand einer Weiterentwicklung, einhergehend z. B. mit der Etablierung permanent exprimierender Zellinien oder transgener Organismen, lohnend erscheint. Wünschenswert ist oftmals auch die Möglichkeit, den Einfluß der Einführung des Proteins oder Peptids in eine große Anzahl von Zellen in Kultur zu erforschen. Auch in diesem Zusammenhang wirkt sich eine lediglich geringe Menge an Protein oder Peptid, die mit den bekannten Transfektionsverfahren erhalten bzw. in Zellen eingeführt werden kann, nachteilig aus.

Entsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen bereitzustellen, das eine hohe Reproduzierbarkeit bietet. Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen, das eine kostengünstige Transfektion von großen Zellmengen bei gleichzeitig guter Transfektionseffizienz erlaubt. Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusatzstoffe und diese enthaltende Transfektionsagentien bereitzustellen, die nach ihrer Herstellung über längere Zeit verwendet werden können.

Diese und weitere Aufgaben werden durch den Gegenstand von Anspruch 1 und den der nachfolgenden Ansprüche gelöst. Diese betreffen Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen in eukaryontische Zellen, die erfindungsgemäßen Transfektionsagentien und Zusatzstoffe, sowie zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Vorrichtungen.

Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen, das folgende Schritte umfaßt:

a) Mischen der Zellen mit einem Transfektionsagens, das die einzubringende Nukleinsäure oder das einzubringende Protein oder Peptid sowie einen Calcium und Phosphat umfassenden Zusatzstoff enthält,
b) Behandlung des in Schritt i) erhaltenen Gemisches mit Ultraschall oder Scherkräften.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Kombination von Transfektionsverfahren, bei denen Nukleinsäuren oder Proteine mit einem Calcium und Phosphat umfassenden Zusatzstoff in eukaryontische Zellen eingeführt werden, mit Transfektionsverfahren unter Verwendung physikalischer Mittel, zu einer verbesserten Transfektionseffizienz gegenüber Transfektionsverfahren, die physikalische Mittel einsetzen, führt, was speziell beim "Upscaling", d. h. bei der Auslegung von Verfahren im größeren Maßstab, von Bedeutung ist. Ferner lassen sich die erfindungsgemäßen Verfahren zur Transfektion adhärenter Zellen auch auf nicht-adhärente Zellen anwenden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem Schritt ii) und gegebenenfalls Schritt i) in einem kontinuierlichen Verfahren, d. h. im Durchfluß, durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft auch mit Proteinen oder Nukleinsäuren transfizierte Zellen, die durch eines der oben genannten Verfahren erhältlich sind bzw. hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Calcium und Phosphat umfassenden Zusatzstoffes für ein Transfektionsagens zum Einbringen von Nukleinsäuren oder Proteinen und Peptiden in eukaryontische Zellen, welches folgende Schritte umfaßt:

a) Mischen einer Ca²⁺-Ionen enthaltenden Lösung mit einer P_i und gegebenenfalls X enthaltenden Lösung, so daß in der Mischung ein Präzipitat entsteht, wobei P_i Phosphat, Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat oder Phosphorsäure ist und X Cl^-, F^- oder OH^- ist, und Inkubieren des Gemisches zur Bildung eines Calcium und Phosphat enthaltenden Präzipitats;
b) Abtrennen des entstandenen Präzipitats aus dem Gemisch von Schritt a) und Verwerfen des Überstandes;
c) gegebenenfalls Resuspendieren des in Schritt b) erhaltenen Präzipitats.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß ein nach dem o. g. Verfahren hergestellter Zusatzstoff, erhalten bzw. erhältlich entweder nach Schritt b) (d. h. der in diesem Schritt erhaltene Bodenkörper bzw. das Präzipitat) oder nach Schritt c) (d. h. die nach Resuspension des Präzipitats erhaltene Suspension), eine lange Haltbarkeit aufweist (mehrere Tage oder Wochen unter geeigneten Bedingungen, z. B. Lagerung bei 4°C), d. h. lediglich einer geringen "Alterung" unterliegt. Im Gegensatz zu den im Wege der herkömmlichen Calciumphosphat/DNA-Kopräzipitation erhaltenen Präzipitaten kann der so erhaltene Zusatzstoff somit auch nach längerer Lagerung gemäß dem unten dargestellten Verfahren zur Herstellung eines Transfektionsagens, ggf. auch in Portionen, jeweils mit in Zellen einzubringender Nukleinsäure oder einzubringenden Proteinen oder Peptiden gemischt und inkubiert werden (siehe Schritt c) des Verfahrens zur Herstellung eines Transfektionsagens).

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Transfektionsagens zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen, umfassend:

a) Mischen einer Ca²⁺-Ionen enthaltenden, einer P_i und gegebenenfalls X enthaltenden Lösung, so daß in der Mischung ein Präzipitat entsteht, wobei P_i Phosphat, Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat oder Phosphorsäure ist und X Cl^-, F^- oder OH^- ist, und Inkubieren des Gemisches zur Bildung eines Calcium und Phosphat enthaltenden Präzipitats;
b) Abtrennen des entstandenen Präzipitats aus dem Gemisch von Schritt a) und Verwerfen des Überstandes;
c) Resuspendieren des in Schritt b) erhaltenen Präzipitats mit einer die Nukleinsäure oder das Protein oder Peptid enthaltenden Lösung und gegebenenfalls Abtrennen und Verwerfen des Präzipitats; oder
d) Resuspendieren des in Schritt b) erhaltenen Präzipitats, sowie anschließendes Mischen des resuspendierten Präzipitats mit einer die Nukleinsäure oder das Protein oder Peptid enthaltenden Lösung und gegebenenfalls Abtrennen und Verwerfen des Präzipitats.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß das in den vorstehend genannten Schritten c) oder d) erhaltene Transfektionsagens, dabei insbesondere der nach Vornahme der gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorgenommenen Abtrennung des Bodenkörpers bzw. Präzipitats erhaltene Überstand (d. h. das in den Schritten c) bzw. d) durch Fraktionierung erhaltene Transfektionsagens), bei Verwendung für die Transfektion von eukaryontischen Zellen im erfindungsgemäßen Verfahren zu einer besonders hohen Transfektionseffizienz und einer hohen Reproduzierbarkeit führt.

Die Verwendung eines fraktionierten Transfektionsagens gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich im übrigen von vorbekannten, auf Calciumphosphat- Kopräzipitation basierenden Transfektionsverfahren, bei denen immer der Bodenkörper verwendet wird. Ein Vorteil des nach dem oben genannten Verfahren (Schritt c) und d)) erhaltenen bzw. erhältlichen fraktionierten Transfektionsagens liegt in diesem Zusammenhang darin, daß keine makroskopischen Mengen an Calciumphosphat auf die zu transfizierenden Zellen gegeben werden und damit störende, durch große Calciumphosphat- Präzipitate verursachte, Nebeneffekte, wie z. B. das Absterben der Zellen in Kultur, reduziert bzw. vermieden werden.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen wie vorstehend ausgeführt, bei dem der Zusatzstoff bzw. das Transfektionsagens nach einem der beiden genannten Verfahren hergestellt wird bzw. erhältlich ist.

Die Erfindung betrifft zudem einen Zusatzstoff für ein Transfektionsagens oder ein Transfektionsagens zum Einbringen von Nukleinsäuren oder Proteinen und Peptiden in eukaryontische Zellen, das nach einem der oben genannten Verfahren erhalten wurde oder erhältlich ist, sowie die Verwendung des genannten Zusatzstoffes bzw. Transfektionsagens in einem Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen.

Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung eines der vorstehend genannten Verfahren, die folgende Komponenten umfaßt:

a) eine Ultraschallkammer mit einer Ultraschallquelle
b) einen Zufluß und einen Abfluß, die jeweils mit der Ultraschallkammer verbunden sind;
c) eine an den Zufluß angeschlossene Reservoirkammer, die gegebenenfalls ein Gemisch aus Zellen mit einem Transfektionsagens gemäß der vorliegenden Erfindung enthält.

Die Erfindung betrifft auch Vorrichtungen wie vorstehend erwähnt, bei denen die Ultraschallquelle eine Metallspitze ist, oder die Ultraschallkammer als Ultraschallbad ausgestaltet ist.

Die Erfindung betrifft zudem eine Vorrichtung wie vorstehend erwähnt, bei der die Reservoirkammer einen Abfluß und einen Zufluß aufweist, wobei die Reservoirkammer über den Abfluß mit einem Kulturgefäß oder Bioreaktor verbunden sein kann, und wobei der an die Reservoirkammer angeschlossene Abfluß bzw. Zufluß durch Pumpen, z. B. Peristaltikpumpen, geregelt werden kann.

Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung einer Vorrichtung wie vorstehend erwähnt in einem Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen.

In den Abbildungen sind Beispiele bevorzugter erfindungsgemäßer Vorrichtungen dargestellt, sowie die Ergebnisse der Ausführungsbeispiele 1-8.

Abb. 1 zeigt einen Teil einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen in eukaryontische Zellen, die eine Beschallung eines im kontinuierlichen Durchfluß geführten Gemisches aus eukaryontischen Zellen und Transfektionsagens erlaubt. Die Pfeile zeigen die Flußrichtung der suspendierten Zellen an, die gegebenenfalls vorher in einer separaten Reservoirkammer (nicht dargestellt) mit dem Transfektionsagens gemischt wurden. Die abgebildete Vorrichtung eignet sich auch für Verfahren zur Transfektion großer Zellmengen. In der gezeigten Ausführungsform wird ein Entkoppler 1 verwendet, der die Ultraschallquelle (Spitze) 2 von der umgebenden Ultraschallkammer 3 akustisch entkoppelt. Die Vorrichtung enthält außerdem einen Zufluß Z und einen Abfluß A,

Abb. 2 zeigt eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einbringen von Nukleinsäuren oder Proteinen und Peptiden in eukaryontische Zellen mit anschließender Expression der transfizierten Nukleinsäure bzw. weiteren Kultivierung der Zellen. Die abgebildete Vorrichtung eignet sich auch für Verfahren zur Transfektion großer Zellmengen. In der gezeigten Ausführungsform wird ein Entkoppler 1 verwendet, der die Ultraschallquelle (Spitze) 2 von der umgebenden Ultraschallkammer 3 akustisch entkoppelt. Die Vorrichtung umfaßt außerdem einen Behälter mit Transfektionsagens 12, einen Behälter mit frischem (Zellkultur-)Medium 7 und einen Behälter für verbrauchtes Medium 8. Diese Behälter sind über Rohrleitungen, die die Pumpen 9, 9' und 9'' umfassen, mit der Reservoirkammer (bzw. dem Mischtank) 6 verbunden. Die Rohrleitung für den Ablauf von verbrauchtem Medium in den Behälter 8 umfaßt ferner eine Vorrichtung 10 (z. B. Sieb, Filter oder Membran), die den Transfer der Zellen in den Behälter für verbrauchtes Medium 8 verhindert. Die Vorrichtung enthält weiterhin eine Pumpe 9''', die zwischen die Reservoirkammer 6 und die Ultraschallkammer 3 geschaltet ist. Schließlich enthält die Vorrichtung einen (Bio-)Reaktor 11,

Abb. 3 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 1 beschriebenen Experimente, wobei auf der Ordinate die absolute gemessene SEAP-Aktivität in mU und auf der Abszisse die Nr. des Ansatzes aufgetragen ist,

Abb. 4 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 2 beschriebenen Experimente, wobei auf der Ordinate die absolute gemessene SEAP-Aktivität in mU und auf der Abszisse die Nr. des Ansatzes aufgetragen ist,

Abb. 5 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 3 beschriebenen Experimente, wobei auf der Ordinate die absolute gemessene SEAP-Aktivität in mU und auf der Abszisse die Nr. des Ansatzes aufgetragen ist. Die drei Inkubationszeiten der Zellkultur (24 h, 48 h, 72 h) werden durch verschieden gemusterte Balken dargestellt, s. a. Legende in der Grafik,

Abb. 6 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 5 beschriebenen Experimente, wobei auf der Ordinate die absolute gemessene SEAP-Aktivität in mU und auf der Abszisse die Nr. des Ansatzes aufgetragen ist,

Abb. 7 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 6 beschriebenen Experimente, wobei auf der Ordinate die Absorption bei 405 nm (SEAP-Aktivitätstest) und auf der Abszisse die Nr. des Ansatzes aufgetragen ist,

Abb. 8 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 7 beschriebenen Experimente, wobei auf der Ordinate die Absorption bei 405 nm (SEAP-Aktivitätstest) und auf der Abszisse die Nr. des Ansatzes aufgetragen ist,

Abb. 9 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 8 beschriebenen Experimente, wobei auf der Ordinate die absolute gemessene SEAP-Aktivität in mU und auf der Abszisse die laufende Nr. der einzelnen Fraktionen aufgetragen ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen in eukaryontische Zellen umfaßt zwei Schritte. Im ersten Schritt (i) werden eukaryontische Zellen mit einem Transfektionsagens gemischt, das einen Calcium und Phosphat enthaltenden Zusatzstoff enthält, der die Transfektion erleichtert, sowie eine in die Zellen einzubringende Nukleinsäure bzw. ein einzubringendes Protein oder Peptid. Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Transfektion" meint das Einbringen exogener Moleküle, insbesondere Nukleinsäuren oder Proteine und Peptide in eukaryontische Zellen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Zelldichte von 10⁴ bis 10⁹ Zellen mL^-1 nach Mischen der Zellösung mit dem Transfektionsagens vorteilhaft, bevorzugt sind 10⁵ bis 10⁷ Zellen mL^-1 besonders bevorzugt ist eine Zelldichte von etwa 10⁶ Zellen mL^-1.

Die zu transfizierenden eukaryontischen Zellen können Pflanzenzellen sein, wobei diese jedoch vorher nach bekannten Verfahren zu behandeln sind, so daß die Zellwand entfernt wird und nurmehr die Pflanzenzellprotoplasten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Bevorzugt sind jedoch tierische Zellen oder Hefezellen, wobei es sich bei den tierischen Zellen z. B. um Zellen aus primären Zellkulturen bzw. -präparationen, etwa Lymphozytenpräparationen oder primäre Fibroblasten, handeln kann. Bevorzugt sind auch Zellinien, wobei es sich dabei auch um Zellinien handeln kann, die nicht von Säugern stammen, etwa Hefezellinien oder Insektenzellinien (z. B. die von Spodoptera frugiperda abgeleiteten Sf21- und Sf9-Zellen oder die von Trichoplusia ni abgeleiteten BTI-TN-5B1- 4-Zellen). Ebenfalls bevorzugt sind Säugerzellinien, wobei sowohl in Zellkultur adhärent wie auch nicht-adhärent wachsende Zellen geeignet sind, z. B. COS-Zellen, CHO-Zellen, HEK 293-Zellen, NIH 3T3-Zellen, BM2-Zellen, Huh7-Zellen, Jurkat-Zellen, BAEC- Zellen, MDCK-Zellen, BHK-Zellen und Hela-Zellen. Zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind CHO-Zellen und HEK 293-Zellen besonders bevorzugt. Handelt es sich bei den zu transfizierenden Zellen um adhärent wachsende Zellen, so werden die Zellen vor dem Mischen mit dem erfindungsgemäßen Transfektionsagens gemäß dem vorstehend genannten Schritt i) zunächst enzymatisch (Trypsinisierung), chemisch (z. B. durch EDTA-haltigen Puffer) oder mechanisch (starkes Schütteln, Cell- Scraper) vom Substrat abgelöst. Besonders bevorzugt sind nicht-adhärente Zellinien.

In die Zellen einzubringende (bzw. zu transfizierende) Nukleinsäuren im Sinne der vorliegenden Erfindung können natürlich vorkommende Moleküle sein, z. B. Isolate von DNA, mRNA aus Tier-, Pflanzen- oder Pilzzellen und RNA oder DNA aus Viren, Viroiden, Virusoiden, Bakterien oder Mikroorgansimen. Weiterhin kann es sich um gentechnologisch hergestellte, rekombinante Konstrukte handeln, wie Plasmide, Cosmide, cDNA, Phagen- und Viren-DNA bzw. RNA, mRNA, tRNA, sowie um synthetische Oligo- und Polynukleotide. Die zu transfizierende Nukleinsäure kann dabei einzelsträngig (ssDNA bzw. ssRNA, ss = "single stranded") oder doppelsträngig (dsDNA oder dsRNA, ds = "double stranded") sein. Besonders bevorzugt ist die Transfektion von Expressionsplasmiden, die für ein gewünschtes Protein kodierende Sequenzen, z. B. eine Reportergensequenz oder eine für ein Strukturprotein oder Enzym, das von Interesse ist, kodierende Sequenz, kombiniert mit geeigneten Expressionssignalen und gegebenenfalls ein oder mehrere Resistenzgene (z. B. Antibiotikaresistenz zur Amplifikation in Bakterien und/oder Gene zur Selektion auf stabile Integration in eukaryontischen Zellen) enthält.

Weiterhin eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Transfektion von Nukleinsäuren, die nicht natürlich vorkommende Nukleotide sowie gegenüber ihrer natürlich vorkommenden Form Basenaustausche, Insertionen und Deletionen enthalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere auch für die Transfektion und anschließende Expression von Nukleinsäuresequenzen, die für cytotoxische Proteine kodieren (z. B. Proteasen, Nukleasen, Lipasen, Kanalproteine etc.), sowie für Proteine, die bei Expression in eukaryontischen Systemen häufig Probleme bereiten, wie z. B. Membranproteine, da das erfindungsgemäße Verfahren keine Proliferation der Zellen über einen längeren Zeitraum erfordert und daher eine hohe Ausbeute auch an diesen Proteinen ermöglicht.

Das erfindungsgemäße Transfektionsverfahren eignet sich ferner zum Einführen von Mischungen verschiedener der vorstehend genannten Nukleinsäuren.

In die Zellen einzubringende (bzw. zu transfizierende) Proteine und Peptide im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen virale und bakterielle Proteine und Peptide, Proteine und Peptide von Eukaryonten, Prione, sowie synthetische (d. h. nicht natürlich vorkommende) Proteine und Peptide. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch für die Transfektion posttranslational oder in sonstiger Weise chemisch modifizierter Proteine und Peptide, einschließlich Proteine und Peptide, die nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, Aminosäureaustausche, Insertionen und Deletionen enthalten. Das erfindungsgemäße Transfektionsverfahren eignet sich ferner zum Einführen von Mischungen und Aggregaten verschiedener der vorstehend genannten Proteine oder Peptide.

Bei den erfindungsgemäßen Zusatzstoffen handelt es sich um Calcium und Phosphat enthaltende oder von Calciumphosphat abgeleitete Stoffe oder Stoffaggregate. Als Zusatzstoffe geeignet sind auch solche von Calciumphosphat abgeleitete Stoffe oder Stoffaggregate, die bereits allein, d. h. ohne zusätzliche Verwendung von physikalischen Hilfsmitteln, wie Beschallung oder Scherkräfte, das Einbringen von Nukleinsäuren oder Proteinen und Peptiden in eukaryontische Zellen fördern.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Zusatzstoff Calciumphosphat verwendet, wobei hier verschiedene Formen von Calciumphosphat geeignet sind. Eine bevorzugte Form des Calciumphosphats ist Hydroxyapatit, wie er z. B. durch Zusammenbringen einer Ca²⁺ enthaltenen Lösung mit einem Phosphat enthaltenden Puffer und Ausfällen durch Überschreiten des Löslichkeitsproduktes von Calciumphosphat erhalten werden kann bzw. erhältlich ist. Geeignete Ca²⁺ enthaltende Lösungen und geeignete Puffer sowie Konzentrationen und pH-Bedingungen sind dabei beispielsweise den im Stand der Technik praktizierten Calciumphosphat-Kopräzipitationsverfahren zu entnehmen, wobei bei der vorliegenden Erfindung jedoch die Fällung in Abwesenheit von Nukleinsäure oder Protein oder Peptid durchgeführt wird. Geeignet sind auch zusätzlich weitere Ionen enthaltende, vorzugsweise F^-, Cl^- und OH^- enthaltende, Abkömmlinge des Calciumphosphats, z. B. Calciumfluorophosphat.

Diese erfindungsgemäßen Zusatzstoffe können in grobkristalliner, feinkristalliner oder gelöster Form vorliegen, als Faser oder Kügelchen, sowie als Gel. Wichtig ist hierbei stets, daß der Calcium und Phosphat enthaltende Zusatzstoff entweder eine Interaktion mit dem einzuführenden Molekül, also der Nukleinsäure oder dem Protein oder Peptid, eingeht, wobei Interaktion heißt, daß der Zusatzstoff entweder als Trägersubstanz dient oder aber durch Anlagerung an das zu übertragende Molekül und gegebenenfalls an die Zelle selbst einen beschleunigten Eintritt des zu transfizierenden Moleküls in dieselbe ermöglicht, wobei die Mechanismen, die den Durchtritt ermöglichen, verschiedener Natur sein können.

In Schritt ii) des erfindungsgemäßen Transfektionsverfahrens wird zusätzlich eine physikalische Behandlung der Zellen vorgenommen, die einen verbesserten Durchtritt der zu transfizierenden Substanzen durch die Zellmembranbarriere ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt diese physikalische Behandlung die Anwendung von Scherkräften auf die zu transfizierenden Zellen in der Anwesenheit des Transfektionsagens. Dies kann z. B. durch die Passage der Zellsuspension durch eine Kanüle oder eine geeignete Extrusionsvorrichtung mit entsprechender Membran erreicht werden. Vorteilhaft ist ein Kanüleninnendurchmesser von 0,05 bis 1 mm, bevorzugt ist ein Durchmesser von 0,1 bis 0,8 mm, besonders bevorzugt sind 0,2 mm. Bei der Verwendung von Membranen (z. B. Extrusionsmembranen) ist eine durchschnittliche Porengröße von 0,5 bis 50 µm vorteilhaft, wobei 1 bis 20 µm bevorzugt und 5 µm besonders bevorzugt ist. Dabei findet die Passage der Zellsuspension durch die Kanüle bzw. Membran mindestens einmal statt, vorzugsweise mehrfach, insbesondere 2- bis 10fach, besonders bevorzugt 3- bis 6fach. Die auftretenden Scherkräfte bewirken die temporäre Entstehung von Membrandefekten, was einen Durchtritt der im Transfektionsagens enthaltenen Nukleinsäure oder des darin enthaltenen Proteins oder Peptids durch die Membranbarriere ermöglicht. Die Versuchsbedingungen, und damit die geeigneten Scherkräfte, variieren von Zelltyp zu Zelltyp und können vom Fachmann ohne weiteres experimentell bestimmt werden. Zu berücksichtigende Parameter sind die Anzahl der Passagen durch die Kanüle bzw. die Membran, der Durchmesser der Öffnung bzw. Poren, sowie die Zelldichte. Im Ergebnis ist es wichtig, einen Kompromiß zwischen auftretenden Membrandefekten, die für die Zellen lethal sind, und einer genügenden Anzahl von Membrandefekten, die einen Durchtritt der zu transfizierenden Substanz ermöglichen, zu finden. Für den Fachmann sind ohne weiteres geeignete Abwandlungen dieser auf Scherkräften basierenden Techniken denkbar.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die zu transfizierenden Zellen in Schritt ii) mit Ultraschall behandelt. Hierfür sind insbesondere Geräte einsetzbar, die normalerweise für den Zellaufschluß mittels Ultraschall verwendet werden und kommerziell erhältlich sind. Hierbei ist insbesondere die Verwendung einer Metallspitze, die an einen Ultraschallgenerator angeschlossen ist (z. B. Geräte der Firma Bandelin, Berlin), besonders geeignet. Die Ultraschallbehandlung der zu transfizierenden Zellen findet vorzugsweise in einem Beschallungsgefäß bzw. einer Ultraschallkammer statt, wobei ein System, das einen kontinuierlichen Zu- bzw. Abfluß der Zellsuspension und des Transfektionsagens erlaubt, besonders bevorzugt ist, was z. B. durch die Verwendung von Pumpen, etwa Peristaltikpumpen, erreicht werden kann. Die Verwendung kommerziell erhältlicher Ultraschallbäder als Ultraschallkammer ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls möglich.

Das erfindungsgemäße Transfektionsverfahren eignet sich für Ansätze im Batch-Verfahren, wobei hier das Gemisch aus Schritt i) in einer geeigneten Ultraschallkammer mit Ultraschall behandelt wird und die beschallten Zellen anschließend weiterbehandelt werden, z. B. mit Kulturmedium versetzt und in ein Kulturgefäß oder einen Bioreaktor überführt werden.

Das Mischen der zu transfizierenden Zellen mit dem Transfektionsagens gemäß Schritt i) findet, wie in Abb. 2 gezeigt, vorzugsweise in einer Reservoirkammer 6 statt, in der das Transfektionsagens auf die Zellen einwirken kann. Das Mischen kann allerdings auch in geeigneter Weise in einem externen Gefäß erfolgen.

Insbesondere bei großen Ansätzen, d. h. bei der Transfektion großer Volumina von Zellsuspensionen, werden der Schritt ii) und vorzugsweise auch der Schritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens im kontinuierlichen Durchfluß durchgeführt. Dabei kann beispielsweise wie folgt verfahren werden: Wie in Abb. 2 dargestellt, werden die zu transfizierenden Zellen im entsprechendem Zellkulturmedium in der Reservoirkammer (bzw. dem Mischtank) 6 vorgelegt, wobei das Transfektionsagens aus einem Behälter 12 durch einen Zulauf mit Hilfe der Pumpe 9'' in die Reservoirkammer 6 geleitet und mit den zu transfizierenden Zellen gemischt wird. Außerdem wird aus einem Behälter mit Medium 7 bei Bedarf frisches Zellkulturmedium über die Pumpe 9' in die Reservoirkammer geleitet. Die Reservoirkammer 6 ist ferner mit einem Abfluß versehen, über den sie mit dem Behälter für verbrauchtes Medium 8, mit der zwischengeschalteten Pumpen 9 verbunden ist, so daß ein Abführen von verbrauchtem Medium möglich ist. Zwischen dem Auffanggefäß für verbrauchtes Medium und der Reservoirkammer (bzw. dem Mischtank) 6 befinden sich in einer bevorzugten Ausführungsform Filter bzw. Membranen 10, die einen Transfer der Zellen in das Auffanggefäß verhindern. Anschließend wird das in der Reservoirkammer 6 befindliche Gemisch aus Medium, Transfektionsagens und Zellen durch eine vierte Pumpe 9''' in die Ultraschallkammer 3 gepumpt, wo es an der an einem Entkoppler 1 befestigten Ultraschallquelle 2 vorbeigeleitet und beschallt wird. Im dargestellten Beispiel fließt das Gemisch nach dem Passieren der Ultraschallquelle in eine weitere Kammer (Bioreaktor) 11, in der die Expression eines Proteins unter Kultivierungsbedingungen (z. B. nach Transfektion mit exogener DNA) oder die weitere Kultivierung der Zellen (z. B. nach Einführen eines exogenen Proteins oder Peptids) erfolgt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, wenn die Zellsuspension mit konstanter Flußrate an der Ultraschallquelle vorbeigeleitet wird. Dem Fachmann ist es ohne weiteres möglich, geeignete Flußraten bzw. theoretische Expositionszeiten für jedes Zellen enthaltende Volumenelement sowohl bei kontinuierlicher wie auch in Form von Pulsen durchgeführter Beschallung so einzustellen, daß eine hohe Transfektionseffizienz bei gleichzeitig möglichst schonender Behandlung der Zellen und, im Falle der Transfektion zu exprimierender Nukleinsäuren, hoher Ausbeute an exprimiertem Produkt erreicht wird. Bei einem gegebenen Volumen der Mischkammer 6 von 1 mL und den im folgenden genannten Beschallungszeiten und -amplituden ist eine Flußgeschwindigkeit von 15-60 mL/min vorteilhaft, wobei ein Bereich von 20-40 mL/min. insbesondere 30 mL/min. bevorzugt ist.

Die Ultraschallbehandlung in Schritt ii) findet vorzugsweise in Zyklen, d. h. in Form von Pulsen, statt, sowohl im Batch-Verfahren als auch beim Verfahren mit kontinuierlichem Durchfluß. Geeignete Werte für Schallfrequenz, Pulsdauer und Pulsintensität können von Zelltyp zu Zelltyp variieren und sollten jeweils von Fall zu Fall angepaßt werden, was dem Fachmann in Vorversuchen ohne weiteres möglich ist. Für einen stationären Ansatz, d. h. bei der Flußrate 0 (Batchverfahren), ergeben sich bei einer konstanten Frequenz von 20 kHz und einer Amplitude von 40% der Maximalamplitude vorteilhafte Pulslängen zwischen 0,01 s und 1 s, wobei eine Pulslänge zwischen 0,05 s und 0.5 s bevorzugt und eine Pulslänge zwischen 0,1 s und 0,2 s besonders bevorzugt ist. Die Anzahl der (gleichartigen) Pulse liegt in einer vorteilhaften Ausführungsform zwischen 1 und 20, bevorzugt sind zwischen 1 und 10 Pulse, besonders bevorzugt sind zwischen 2 und 4 Pulse gleicher Energie und Dauer. Dabei ist die Verwendung von Ultraschall-Frequenzen zwischen 18 kHz und 3 MHz ist vorteilhaft, Frequenzen zwischen 19 kHz und 2 MHz sind bevorzugt, besonders bevorzugt sind 20 kHz. Für die Umrechnung auf Flußraten, die ungleich 0 sind, ergibt sich, daß die durchschnittliche Verweilzeit eines Volumenelementes in der Ultraschallkammer sich aus der Einwirkung einer bevorzugten Pulsanzahl auf das jeweilige Volumenelement ergibt. Sind also beispielsweise 2 Pulse bevorzugt, so sollte die Flußgeschwindigkeit derart eingestellt werden, daß nach Verstreichen von 2 Ultraschallpulsen das jeweilige Volumenelement, das bevorzugt dem Fassungsvermögen der Ultraschallkammer entspricht, die Ultraschallkammer verlassen haben sollte.

Als Ultraschallquellen werden in einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kommerziell erhältliche Quellen (z. B. das Gerät UW 2070 der Firma Bandelin, Berlin) mit den dazugehörigen Spitzen verwendet, wobei die Verwendung von Spitzen mit einem Durchmesser zwischen 1-10 mm vorteilhaft ist, ein Durchmesser von 2-8 mm bevorzugt und ein Durchmesser von 2-6 mm besonders bevorzugt ist. Es können beispielsweise die Spitzen MS 73 (3 mm Durchmesser) und KE 76 (6 mm Durchmesser) der Firma Bandelin verwendet werden. Für das Durchflußverfahren sind generell Spitzen mit einem höheren Durchmesser bevorzugt als für den stationären Ansatz. Die genauen Betriebsbedingungen der Spitzen und der Ultraschallquelle kann der Fachmann ohne weiteres den Betriebsanleitungen der entsprechenden Hersteller entnehmen. Die Spitzen sollten in jedem Fall vor der Verwendung gereinigt und sterilisiert werden, was z. B. durch Einwirkung von Chemikalien wie Ethanol oder durch Autoklavieren geschehen kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind im zu beschallenden Gemisch von Zellen und Transfektionsagens aus Schritt i) zusätzlich akustisch labile Zusatzstoffe enthalten, die bei Ultraschallexposition zerfallen, die Kavitation fördern und so die Permeabilisierung der Zellen während des Beschallungsschrittes vorteilhaft beeinflussen. Viele dieser Zusatzstoffe sind als sog. Ultraschallkontrastmittel im Handel erhältlich.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können außerdem während des Beschallungsvorganges zusätzlich niedermolekulare organische Substanzen in die zu transfizierenden Zellen eingeführt werden, wobei dies in einer bevorzugten Ausführungsform Effektoren sind, also Aktivatoren oder Inhibitoren von Enzymen. Gleichermaßen können aber auch andere, mit weiteren zellulären Komponenten (wie z. B. Zellmembran oder ER) oder Substanzen (z. B. DNA oder Lipiden) interagierende Moleküle eingebracht werden, wie z. B. Coenzyme, Hormone und Hormonvorstufen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zellsuspension nach Vorbeiführen an der Ultraschallquelle direkt in einen Reaktor (z. B. einen Bioreaktor) bzw. in ein Gefäß (z. B. ein Zellkulturgefäß 11) überführt, in dem sie dann vorzugsweise mit Zellkulturmedium versetzt und z. B. zur Expression der transfizierten DNA weiter kultiviert werden.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Gefäße können sowohl zum Zweck des erfindungsgemäßen Verfahrens speziell angefertigt werden, als auch Kombinationen von kommerziell erhältlichen Gefäßen umfassen (bezügl. einer Auswahl geeigneter Beschallungsgefäße siehe z. B. die Betriebsanleitungen der Firma Bandelin). Die Geometrie der Ultraschallkammer ist für das erfindungsgemäße Verfahren von großer Bedeutung, da von der Form der Kammer die Art und Stärke der akustischen Effekte, die auf die Zellen einwirken, abhängen. Auch Parameter wie Wärmeabfuhr und Durchmischung sind von der Gefäßgeometrie abhängig und sollten bei der Auslegung der Vorrichtung berücksichtigt werden. Die folgenden Ausführungen beziehen sich auf die in Abb. 1 wiedergegebene Vorrichtung. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, ein leicht konisches (Glas-)Gefäß als Ultraschallkammer (3) zu verwenden. Die bevorzugten Abmessungen der Ultraschallkammer und der darin befindlichen Ultraschallquelle (Spitze) lauten wie folgt: Durchmesser der Spitze 6 mm, mittlerer Innendurchmesser der Ultraschallkammer 1 cm, Abstand der Spitze vom Boden der Kammer 1 cm, mittlerer Wandabstand der Spitze 2 mm, Mindesthöhe des Abflusses (A) über dem Kammerboden 2,5 cm, Lage des Zuflusses (Z) unmittelbar über dem Boden der Ultraschallkammer, Innendurchmesser von Z und A 1-6 mm, abhängig von der Flußgeschwindigkeit.

Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht in der Möglichkeit, im Durchflußverfahren eine transiente Transfektion von Zellen im großen Maßstab zu erreichen. Dies führt dazu, daß auch eine transiente Transfektion im großtechnischen Maßstab durchgeführt werden kann, was die Herstellung größerer Proteinmengen ermöglicht, ohne daß der Fachmann eine stabil transfizierte Zellinie anlegen muß. Dadurch besteht die Möglichkeit, schnell und effizient zu Proteinquantitäten im Milligramm- oder gar Gramm-Bereich zu gelangen, die Testreihen im Tiermodell (oder auch beim Patienten) und die effiziente Erzeugung von gegen das Protein gerichteten Antikörpern gestatten. Folglich braucht der Fachmann erst nachdem diese Experimente durchgeführt wurden eine permanente Expression von vielversprechenden "Kandidaten-Proteinen" durchzuführen und erspart sich unnötigen Aufwand bei der zudem nicht immer unproblematischen Erzeugung von permanent transfizierten Zellinien. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine wertvolle Ergänzung vieler Screening-Verfahren mit hohem Probendurchsatz dar, die in der Regel lediglich geringe Substanzmengen und deren Interaktionen und Eigenschaften in vitro untersuchen können.

Auch bei der Expression oder dem Einbringen von Proteinen, die toxisch wirken, wie Nukleasen, Proteasen, Lipasen, Prionen oder porenbildenden Proteinen, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine erhöhte Transfektionsausbeute und eröffnet damit die Möglichkeit, größere Mengen dieser Substanzen in transient transfizierten Zellen herzustellen oder in diese einzubringen. Auch hydrophobe Proteine, die in der Regel bei der permanenten Transfektion große Probleme bereiten, können so in größerer Menge in einem kurzen Zeitrahmen erhalten werden.

Desweiteren umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines effizienten, die Transfektion erleichternden Zusatzstoffes auf Calciumphosphat-Basis, der gegenüber den vorbekannten Zusatzstoffen zahlreiche Vorteile bietet. Während bei der Calciumphosphat-Kopräzipitationsmethode aus dem Stand der Technik Nukleinsäure oder Protein und Calciumphosphat gemeinsam gefällt werden, was z. B. durch Vorlegen einer DNA und Phosphat enthaltenden Lösung mit anschließender Zugabe von CaCl₂ geschehen kann, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst die Fällung durchgeführt (Schritt a)), wobei das Präzipitat (Schritt b)) oder die nach Resuspendieren des Präzipitats aus Schritt b) erhaltene Suspension (Schritt c)) dann für mehrere Tage oder auch Wochen zur Herstellung des erfindungsgemäßen Transfektionsagens verwendet werden kann.

Um die Fällung in Schritt a) zu erreichen, werden zwei Lösungen gemischt, wobei die eine Lösung Ca²⁺ Ionen und die andere PO₄ ^3-, HPO₄ ^2-, H₂PO₄ ^-, oder H₃PO₄, sowie gegebenenfalls F^-, Cl^- oder OH^- enthält. Dem Fachmann ist ohne weiteres ersichtlich, daß es sich bei dem Fällungsvorgang um eine pH- und temperaturabhängige Reaktion handelt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden in Schritt a) die beiden Lösungen sofort komplett gemischt, so daß der Fällungsvorgang schlagartig abläuft.

In Schritt b) wird dann, nach einer Inkubationszeit von mehreren Minuten bis Stunden, der entstandene Niederschlag abgetrennt. Das Abtrennen kann durch verschiedene, dem Fachmann geläufige, Verfahren geschehen, wie Zentrifugation (z. B. 4 krpm, 10 min. Heraeus Minifuge) oder Filtern. Der Überstand wird verworfen und das Präzipitat vor Inkubation mit der Nukleinsäure oder Protein oder Peptid oder vor der Weiterverarbeitung gegebenenfalls aufbewahrt.

In einer vorteilhaften Ausführungsform wird das Präzipitat aus Schritt b) resuspendiert. Die Resuspension erfolgt in einer Lösung, die für die Weiterverarbeitung des Calcium und Phosphat enthaltenden Zusatzstoffes zum Transfektionsagens geeignet ist, wobei isotonische biokompatible Puffer, wie z. B. Hepes-gepufferte NaCl-Lösung, bevorzugt sind. Es ist hierbei zu betonen, daß das vorliegende Verfahren nicht nur das Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen umfaßt, sondern auch ein effizientes Einführen von Proteinen und Peptiden ermöglicht.

Entsprechend kann in einer bevorzugten Ausführungsform das Resuspendieren des in Schritt b) erhaltenen Präzipitats in einer Lösung erfolgen, die bereits die zu transfizierende Nukleinsäure bzw. das zu transfizierende Protein oder Peptid enthält. Hierbei wird der Calciumphosphat-Bodenkörper aus Schritt b) beispielsweise durch mehrfaches Ansaugen und Ausstoßen mittels einer Pipette in der genannten Lösung suspendiert. Danach wird das Gemisch inkubiert, wobei dies bevorzugt einige Minuten bis Stunden geschieht, und anschließend zur Transfektion verwendet (Schritt i) des erfindungsgemäßen Transfektionsverfahrens). Vorzugsweise wird vor der Weiterverwendung in Schritt i) des Transfektionsverfahrens das Präzipitat aus dem genannten Gemisch abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren (4 krpm, 10 min. Heraeus Minifuge) oder Filtration, und nur der so erhaltene Überstand für die Transfektion verwendet.

Ebenfalls bevorzugt ist es, das Präzipitat aus Schritt b) zunächst in einer geeigneten Lösung, die keine Nukleinsäuren, Proteine oder Peptide enthält, z. B. einem biokompatiblen isotonischen Puffer (s. o.), zu resuspendieren und die Suspension anschließend mit einer Lösung zu mischen, die die zu transfizierende Nukleinsäure bzw. das zu transfizierende Protein oder Peptiden enthält, und das so erhaltene Gemisch, ggf. nach Inkubation für mehrere Minuten bis Stunden, zur Transfektion gemäß Schritt i) des erfindungsgemäßen Transfektionsverfahrens einzusetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Präzipitat aus dem Gemisch zunächst durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, und lediglich der so erhaltene Überstand zur Transfektion verwendet.

Im Unterschied zur Calciumphosphat-Kopräzipitationsmethode wird bei den genannten bevorzugten Ausfühnungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens der Überstand zur Transfektion verwendet, während man den Bodenkörper verwirft. Dies hat gegenüber den bekannten Verfahren den Vorteil, daß keine makroskopischen Mengen an Calciumphosphat in den Transfektionsansatz und damit in das Zellkulturmedium eingeschleppt werden, was vor allem in bezug auf die Adsorption von dort vorhandenen Proteinen problematisch sein kann (Hydroxyapatit, ein Hydroxyl-Ionen enthaltendes Calciumphosphat, wird zur Proteinreinigung eingesetzt) und außerdem die Zellhomöostase negativ beeinflußt, da sich bei der Kopräzipitationsmethode der aufgeschlämmte Calciumphosphat/DNA-Bodenkörper auf den Zellen absetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Verwendung des erfindungsgemäßen Transfektionsagens mit dem Zusatzstoff auf Calciumphosphat-Basis führen außerdem, wie u. a. in Beispiel 3 gezeigt, zu einer verbesserten Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz, geringer Zellschädigung und langer Zellebensdauer nach Transfektion und damit hoher (Gesamt-)Produktausbeuten pro Kulturansatz, was einen wichtigen wirtschaftlichen Faktor darstellt.

Es folgen Ausführungsbeispiele, die die vorliegende Erfindung näher erläutern sollen, jedoch nicht in die Erfindung einschränkender Weise zu verstehen sind.

Beispiel 1 Transfektion von CHO-Zellen mit DNA unter Verwendung von Calciumphosphat und Ultraschallbehandlung, Optimierung von Pulsdauer und -anzahl

Zunächst wird ein DNA-enthaltendes Transfektionsagens unter Verwendung des Zusatzstoffes Calciumphosphat hergestellt. Zu diesem Zweck wird zunächst ein Calciumphosphat-Präzipitat hergestellt. Dies geschieht durch Mischen gleicher Volumina an sterilfiltrierter 0,25 M CaCl₂ Lösung und 2 × HBS (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES, 1,5 mM Na₂HPO₄, mit NaOH auf pH 7,05 eingestellt). Die Reaktionsmischung wird für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 10 min bei 4 krpm zentrifugiert (Heraeus Minifuge). Das entstandene Pellet wird schließlich in 1/10 des Ausgangsvolumens aufgenommen (steriler 20 mM HEPES Puffer, 150 mM NaCl (pH 7,4)) und bei 4°C gelagert.

Anschließend werden 30 µL einer resuspendierten und wie oben beschrieben hergestellten Calciumphosphat-Suspension mit 30 µg des Plasmids pCSEAP in 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4, gemischt, um das Transfektionsagens in einem Endvolumen von 100 µL zu erhalten. Das Plasmid pCSEAP kodiert für die sekretorische alkalische Phosphatase (SEAP). Das Plasmid enthält außerdem einen CMV-Promotor, wobei die Aktivität der SEAP im Überstand von transient transfizierten Zellen nach der Methode von Berger et al. (Berger et al., Gene 66, S. 1-10, (1988)) problemlos bestimmt werden kann. Die so erhaltenen 100 µL Transfektionsagens werden anschließend vorsichtig mit 1 mL serumfrei kultivierter CHO-Zellen (Zelldichte = 2 × 10⁶ Zellen/mL) in einem sterilen Gefäß gemischt. Die verwendeten CHO-Zellen werden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und die gewünschte Zelldichte (2 × 10⁶ Zellen/mL) wird durch Zugabe entsprechender Mengen vorgewärmten Zellkulturmediums eingestellt.

Anschließend werden die transfizierten Zellen unmittelbar einer Ultraschallbehandlung mit einem Bandelin Beschallungsgerät (UW 2070 mit Stufenhorn SH 70 G und HF-Generator GM 2070) unterzogen, wobei eine (Mikro-)Spitze mit 3 mm Durchmesser verwendet wird. Die Spitze wird vor der Verwendung mit 70% Ethanol desinfiziert. Nach 48 Stunden unter Standardexpressionsbedingungen (37°C) werden 100 µL des Ansatzes entnommen und 10 min bei 65°C hitzeinaktiviert. Anschließend wird die SEAP-Aktivität nach dem o. g. Standardverfahren bestimmt.

Um eine optimale Transfektionseffizienz zu erreichen, werden Optimierungsexperimente mit einer variierenden Anzahl von Ultraschall-Pulsen sowie verschiedenen Ultraschall- Pulslängen durchgeführt. Die Schallenergie beträgt bei jedem dieser Experimente 40% der Maximalamplitude. Dabei werden die folgenden, in Tabelle 1 genannten, Ansätze untersucht:

Tabelle 1

Die Ergebnisse der in Tabelle 1 gezeigten Experimente sind in Abb. 3 wiedergegeben. Die Experimente belegen, daß unter den gegebenen Versuchsbedingungen längere Beschallungszeiten (0,2 s) eine deutliche niedrigere Transfektionseffizienz bewirken, wobei eine steigende Zahl von Pulsen sich bei höherer Pulslänge ebenfalls negativ bemerkbar macht. Die gezeigten Experimente ermöglichen dem Fachmann eine Optimierung und Anpassung des erfindungsgemäßen Verfahrens an verschiedene Transfektionssysteme.

Beispiel 2 Transfektion von CHO-Zellen mit DNA unter Verwendung von Calciumphosphat und Ultraschallbehandlung, Optimierung von Pulsdauer und -energie

In diesem Ausführungsbeispiel wurde für das gegebene System CHO-Zellen/pCSEAP- Plasmid eine Optimierung der Pulsenergie in Verbindung mit einer unterschiedlichen Anzahl von Ultraschallpulsen vorgenommen. Die Herstellung des CaP_i-Präzipitates sowie des Transfektionsagens erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Tabelle 2 stellt die verschiedenen Versuchsansätze schematisch dar. Es wurde jeweils eine konstante Pulsdauer von 0,1 s verwendet.

Tabelle 2

Die Ergebnisse der in Tabelle 2 wiedergegebenen Experimente sind in Abb. 4 dargestellt. Es zeigt sich, daß für das verwendete System bei einer Pulsdauer von 0,1 s, einer Pulsenergie von 40% Leistung (Geräteeinstellung beim Bandelin Sonifier) und zwei Pulsen eine besonders hohe Transfektionseffizienz erzielt wird.

Beispiel 3 Transfektion von CHO-Zellen mit DNA unter Verwendung von Calciumphosphat und Ultraschallbehandlung, Optimierung der Expressionsdauer sowie der DNA- und Calciumphosphat-Menge

Die Versuchsbedingungen sind identisch zu denen unter Beispiel 1 angegebenen, mit dem Unterschied, daß im Rahmen der Experimente die Menge an Plasmid (pCSEAP) und an Calciumphosphat, sowie die Expressionsdauer variiert wird. Tabelle 3 stellt die verschiedenen Versuchsansätze schematisch dar. Die Plasmidkonzentration der Stammlösung beträgt 1 mg/mL, die Calciumphosphat-Lösung wurde hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben.

Tabelle 3

Die Ergebnisse der in Tabelle 3 schematisch aufgelisteten Experimente sind in Abb. 5 dargestellt. Auf der Ordinate ist die absolute SEAP-Aktivität [mU] aufgetragen, auf der Abszisse sind die Nummern der entsprechenden Ansätze vermerkt. Es wurden, außer in Ansatz 1 und 17, jeweils drei Expressionszeiten, 24 h, 48 h und 72 h, gemessen. Es stellt sich heraus, daß die Zellen auch nach drei Tagen noch in der Lage waren, Proteine zu produzieren und daß die Verwendung von 40 µL Plasmid (1 mg/mL) und 20 µL Calciumphosphat-Suspension zu optimaler Expression des Enzyms und geringer Zellschädigung und damit zu den höchsten Produktausbeuten führt.

Beispiel 4 Transfektion von CHO-Zellen mit DNA unter Verwendung von Calciumphosphat und Ultraschallbehandlung, Einsatz von HEK 293-Zellen

Bei diesem Versuch werden HEK 293-Zellen anstelle von CHO-Zellen eingesetzt, um die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Transfektionsverfahrens auf verschiedene Zellinien zu dokumentieren. Dazu werden HEK 293-Zellen in DMEM-Medium, das 10% fetales Kälberserum enthält, kultiviert. Anschließend werden die Zellen unter Verwendung einer enzymfreien Dissoziationslösung (Sigma) geerntet und abzentrifugiert. Dann werden die Zellen in serumfreiem Medium resuspendiert, so daß eine Zelldichte von 2 × 10⁶ Zellen/mL resultiert. Anschließend werden 30 µg pCSEAP in 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4, mit 30 µL der unter Beispiel 1 beschriebenen Calciumphosphat-Suspension gemischt, so daß ein Endvolumen von 100 µL resultiert. Zu dieser Mischung wird 1 mL Zellsuspension hinzugefügt, anschließend wird der Ansatz in ein Inkubationsgefäß überführt. Schließlich wird 2 × 0,1 s mit 40% Leistung mit dem Bandelin Ultraschallgerät unter Verwendung einer 3 mm-Spitze beschallt. Nach 48 h Inkubationszeit (Expression) werden 100 µL des Ansatzes entnommen und auf SEAP-Aktivität untersucht. Das Ergebnis ist eine Aktivität von 1,275 mU SEAP-Gesamtaktivität. Dieses Experiment belegt, daß auch andere Zellinien als CHO-Zellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.

Beispiel 5 Transfektion von CHO-Zellen mit DNA unter Verwendung verschiedener Calciumphosphat-Fraktionen und Ultraschallbehandlung

30 µg pCSEAP in 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4 werden mit 20 µL CaP_i- Suspension (hergestellt wie in Beispiel 1) gemischt, so daß ein Gesamtvolumen von 100 µL resultiert. Anschließend wird die Suspension 5 min bei 13 krpm zentrifugiert (Heraeus Minifuge). Der Überstand wird dann direkt zur Transfektion eingesetzt; das Pellet wird in 100 µL 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4 resuspendiert und anschließend ebenfalls zur Transfektion eingesetzt. Die so erhaltenen 2 × 100 µL Transfektionsagens werden anschließend jeweils vorsichtig mit 1 mL serumfrei kultivierter CHO-Zellen (Zelldichte 2 × 10⁶ Zellen/mL) in einem sterilen Gefäß gemischt. Die verwendeten CHO-Zellen werden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und die gewünschte Zelldichte wird durch Zugabe entsprechender Mengen vorgewärmten Zellkulturmediums eingestellt. Anschließend werden die zu transfizierenden Zellen unmittelbar einer Ultraschallbehandlung mit einem Bandelin Beschallungsgerät (Bandelin, Berlin) unterzogen, wobei 2 × 0,1 s bei 40% Leistung beschallt wird und eine (Mikro-)Spitze mit 3 mm Durchmesser verwendet wird. Die Spitze wird vor der Verwendung mit 70% Ethanol desinfiziert. Nach 40 Stunden unter Standardexpressionsbedingungen (37°C) werden 100 µL des Ansatzes entnommen und 10 min bei 65°C hitzeinaktiviert. Anschließend wird die SEAP-Aktivität nach einem Standardverfahren bestimmt. Tabelle 4 stellt die verschiedenen Versuchsansätze schematisch dar.

Tabelle 4

Die Ergebnisse der in Tabelle 4 schematisch dargestellten Versuchsreihe sind in Abb. 6 wiedergegeben. Es zeigt sich, daß die Verwendung des Überstandes nach Mischen einer Calciumphosphat-Suspension mit DNA und Abzentrifugieren zur Transfektion weitaus besser geeignet ist, als der hohe Konzentrationen an Calciumphosphat enthaltende resuspendierte Bodenkörper (Pellet) (s. Ansatz Nr. 6).

Beispiel 6 Transfektion von CHO-Zellen mit DNA unter Verwendung von Calciumphosphat und Scherkräften

Unter serumfreien Bedingungen kultivierte CHO-Zellen werden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und auf eine Zelldichte von 2 × 10⁶ Zellen/mL gebracht. Die Herstellung des Zusatzstoffes erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben. Anschließend werden 30 µg pCSEAP mit 20 µL bzw. 200 µL Calciumphosphat-Suspension gemischt und zu 1 mL Zellsuspension gegeben. Anschließend wird die Mischung in eine 1 mL-Spritze, bestückt mit einer 0,4 × 20 mm Hohlnadel, aufgesaugt. Anschließend wird die Suspension mehrfach ausgestoßen und wieder aufgesaugt (s. Tabelle). Nach 20 h Inkubation werden 50 µL des 10 min bei 65°C hitzeinaktivierten Kulturmediums entnommen und eine SEAP- Aktivitätstest durchgeführt. In diesem Fall wurde die Absorption bei 405 nm nach 2 h Inkubation bei 37°C bestimmt. Tabelle 5 zeigt eine Zusammenstellung der durchgeführten Experimente.

Tabelle 5

Die Ergebnisse der in Tabelle 5 aufgeführten Versuche sind in Abb. 7 dargestellt. Eine Kombination von 200 µL Calciumphosphat-Suspension mit 8-maligem Einsaugen und Ausstoßen erwies sich als optimal für die Maximierung der Transfektionsausbeute des verwendeten Systems.

Beispiel 7 Transfektion von CHO-Zellen mit DNA unter Verwendung von Calciumphosphat und Ultraschall, Optimierung der Beschallungszeiten

Unter serumfreien Bedingungen kultivierte CHO-Zellen werden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und auf eine Zelldichte von 2 × 10⁶ Zellen/mL gebracht. Die Herstellung des Zusatzstoffes erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben. Anschließend werden 10 µg pCSEAP mit 10 µL Calciumphosphat-Suspension gemischt und zu 1 mL Zellsuspension gegeben. Die Zellsuspension wird mit 70% Leistung bei verschiedenen Beschallungszeiten beschallt (s. Tabelle 6). Nach 20 h Inkubation werden 50 µL des 10 min bei 65°C hitzeinaktivierten Kulturmediums entnommen und eine SEAP-Aktivitätstest durchgeführt. In diesem Fall wurde die Absorption bei 405 nm nach 2 h Inkubation bei 37°C bestimmt. Tabelle 6 zeigt eine Zusammenstellung der durchgeführten Experimente.

Tabelle 6

Die Ergebnisse der in Tabelle 6 aufgeführten Experimente sind in Abb. 8 dargestellt. wie aus Abb. 8 ersichtlich, erzeugt für das verwendete System bei 70% (Schall-) Leistung eine Beschallungszeit von 0,5 s maximale Transfektionsausbeuten.

Beispiel 8 Transfektion im Durchflußverfahren

Es wird ein Transfektionsansatz analog zu Beispiel 5 angesetzt, wobei ein Volumen von 35 ml Zellsuspension eingesetzt wird. Die verwendeten CHO-Suspensionszellen stammten aus einer Spinnerkultur. Die Zellen werden mit frischem Medium auf eine Zelldichte von 2 × 10⁶ Zellen/mL eingestellt und mit dem Transfektionsagens gemischt. Die Mischung wird mittels einer Schlauchpumpe durch die Reservoirkammer, die eine 6 mm Ultraschallspitze enthält, geleitet. Die Flußrate wird auf 30 mL/min eingestellt, die Schalleistung wird auf 40% der Maximalamplitude eingestellt. Die Pulsdauer beträgt 0,1 s, wobei diese durch Pausen von 0,9 s unterbrochen werden. Im Mittel erhält so jeder mL Zellsuspension zwei Pulse von 0,1 s Dauer. Sechs mittlere Fraktionen von je 1 mL werden separat gesammelt und 100 µL davon nach 40 h Inkubation bzw. Expression entnommen. Anschließend wird die SEAP-Aktivität nach dem genannten Standardverfahren bestimmt.

Die Ergebnisse der o. g. Experimente sind in Abb. 9 dargestellt, die die Aktivität von 6 entnommenen Fraktionen zu je 1 mL zeigt. Die erreichten Transfektionsraten im erfindungsgemäß durchgeführten Transfektionsverfahren im Durchfluß sind demzufolge ähnlich hoch wie die in den stationären Ansätzen erzielten und zeigen, daß bei im Durchflußverfahren transfizierten Zellen ein konstant hohes Expressionsniveau erreicht wird.

Claims

1. Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen, das folgende Schritte umfaßt:

a) Mischen der Zellen in Suspension mit einem Transfektionsagens, das die einzubringende Nukleinsäure oder das einzubringende Protein oder Peptid sowie einen Calcium und Phosphat umfassenden Zusatzstoff enthält,
b) Behandlung des in Schritt i) erhaltenen Gemisches mit Ultraschall oder Scherkräften.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Schritt ii) und gegebenenfalls auch der Schritt i) in einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei es sich bei der einzubringenden Nukleinsäure um ein Oligo- oder Polynukleotid, ssRNA, dsRNA, ssDNA oder dsDNA handelt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das einzubringende Protein ein Prion oder ein Fragment eines Proteins ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die verwendeten Zellen adhärente Zellen sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei die verwendeten Zellen nicht- adhärente Zellen sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei die Ultraschallexposition in Schritt ii) in Zyklen durchgeführt wird.

8. Mit Proteinen oder Nukleinsäuren transfizierte Zellen, erhältlich bzw. erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7.

9. Verfahren zur Herstellung eines Calcium und Phosphat umfassenden Zusatzstoffes für ein Transfektionsagens zum Einbringen von Nukleinsäuren oder Proteinen und Peptiden in eukaryontische Zellen, welches folgende Schritte umfaßt:

10. Verfahren zur Herstellung eines Transfektionsagens zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen, umfassend:

a) Mischen einer Ca²⁺-Ionen enthaltenden Lösung mit einer P_i und gegebenenfalls X enthaltenden Lösung, so daß in der Mischung ein Präzipitat entsteht, wobei P_i Phosphat, Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat oder Phosphorsäure ist und X Cl^-, F^- oder OH^- ist, und Inkubieren des Gemisches zur Bildung eines Calcium und Phosphat enthaltenden Präzipitats;
b) Abtrennen des entstandenen Präzipitats aus dem Gemisch von Schritt a) und Verwerfen des Überstandes;
c) Resuspendieren des in Schritt b) erhaltenen Präzipitats mit einer die Nukleinsäure oder das Protein oder Peptid enthaltenden Lösung und gegebenenfalls Abtrennen und Verwerfen des Präzipitats; oder
d) Resuspendieren des in Schritt b) erhaltenen Präzipitats, sowie anschließendes Mischen des resuspendierten Präzipitats mit einer die Nukleinsäure oder das Protein oder Peptid enthaltenden Lösung und gegebenenfalls Abtrennen und Verwerfen des Präzipitats.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, bei dem der Zusatzstoff bzw. das Transfektionsagens nach einem Verfahren gemäß Anspruch 10 bzw. 11 herstellbar ist.

12. Zusatzstoff, der die Aufnahme von Nukleinsäuren oder Proteinen und Peptiden in eukaryontische Zellen fördert, oder Transfektionsagens zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10.

13. Verwendung des Zusatzstoffes oder des Transfektionsagens gemäß Anspruch 13 in einem Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen.

14. Vorrichtung zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen, die folgende Komponenten umfaßt:

a) eine Ultraschallkammer mit einer Ultraschallquelle
b) einen Abfluß und einen Zufluß, die jeweils mit der Ultraschallkammer verbunden sind
c) eine an den Zufluß angeschlossene Reservoirkammer, die gegebenenfalls ein Gemisch aus eukaryontischen Zellen mit einem Transfektionsagens, wie in Anspruch 1 definiert, enthält.

15. Vorrichtung gemäß Anspruch 15, bei der die Ultraschallquelle eine Metallspitze ist.

16. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, bei der die Reservoirkammer über den Abfluß mit einem Kulturgefäß oder Bioreaktor verbunden ist.

17. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14-16, bei der die Reservoirkammer einen Abfluß und einen Zufluß aufweist.

18. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14-17, bei der der Abfluß und der Zufluß durch Pumpen geregelt werden.

19. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14-18, bei der die Ultraschallkammer ein Ultraschallbad ist.

20. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14-19 in einem Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren und Proteinen oder Peptiden in eukaryontische Zellen.