DE19933346A1 - Stabile radioactively-marked nanoparticles bound to other molecules for use in medical and diagnostic techniques, particularly used for studying phagocyte processes - Google Patents
Stabile radioactively-marked nanoparticles bound to other molecules for use in medical and diagnostic techniques, particularly used for studying phagocyte processesInfo
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- A61K51/1251—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles micro- or nanospheres, micro- or nanobeads, micro- or nanocapsules
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft stabile radioaktiv markierte Nanopartikel, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für medizinische und diagnostische Zwecke.The present invention relates to stable radioactively labeled nanoparticles Process for their preparation and their use for medical and diagnostic purposes.
Bisher sind im Stand der Technik verschiedene Methoden zur Herstellung radioaktiver Partikel beschrieben worden.So far, various methods of manufacture are known in the art radioactive particles have been described.
So wird in Lit. Amer. Ind. Hyg. Ass. J. 1970, 31 (3),349-52 die Herstellung von radioaktiven Partikeln aus radioaktiv markiertem Monomer und anschliessender Emulsionspolymerisation beschrieben. Hierfür wurden Monomere wie z. B. I131 gelabeltes 2,4-iodostyren verwendet. Der Nachteil liegt hier insbesondere in der schwierig zu steuernden Polymerisation, da teilweise eine spontane Polymerisation eintritt und die Partikelgrössen sehr unterschiedlich ausfallen können. Ausserdem müssen alle Syntheseschritte der Monomere und die anschliessende Polymerisation in Radioaktivlabors durchgeführt werden, was aufwendig und gefährlich ist. Desweiteren ist die Charakterisierung von radioaktivem Material (z. B. Partikelgrösse und Verteilung) nicht trivial. Darüberhinaus ist die Herstellung monodisperser Partikel im unteren Nanometerbereich fast unmöglich.For example, in Ref. Amer. Ind. Hyg. Ass. J. 1970, 31 (3), 349-52 the preparation of radioactive particles from radioactively labeled monomer and subsequent Emulsion polymerization described. For this, monomers such as. B. I131 labeled 2,4-iodostyrene used. The disadvantage here is in particular Polymerization difficult to control, since sometimes a spontaneous polymerization occurs and the particle sizes can be very different. Furthermore must all synthesis steps of the monomers and the subsequent polymerization be carried out in radioactive laboratories, which is complex and dangerous. Furthermore, the characterization of radioactive material (e.g. particle size and distribution) not trivial. In addition, the production is monodisperse Particles in the lower nanometer range almost impossible.
Eine weitere Möglichkeit bietet z. B. die Herstellung von nichtradioaktivem Polymer, radioaktive Markierung durch Bestrahlung und anschliessende Herstellung von Nanopartikeln beispielsweise mittels der Spining-disk-Methode. Der Nachteil bei diesem Verfahren besteht darin, daß sich das Polymer durch Bestrahlung teilweise zersetzt und die anfallenden Zersetzungsprodukte entfernt werden müssen. Another possibility offers z. B. the production of non-radioactive polymer, radioactive labeling by irradiation and subsequent production of Nanoparticles, for example, using the spining disk method. The disadvantage with This method is that the polymer is partially irradiated decomposed and the resulting decomposition products must be removed.
Zudem lassen sich mit dieser Methode keine Partikel im Nanometerbereich herstellen (Lit. Ann Occup Hyg. 13, 87-100, 1970).In addition, this method does not allow particles in the nanometer range (Lit. Ann Occup Hyg. 13, 87-100, 1970).
Kommerzielle radioaktiv markierte Mikropartikel aus Styrol und Divinylbenzol sind gelabelt mit einer Reihe von Radionucliden erhältlich. Laut Aussage des Herstellers (NEN) ist eine Produktion von Partikeln im Nanometerbereich jedoch nicht möglich.Commercial radioactive labeled microparticles are made from styrene and divinylbenzene available with a range of radionuclides. According to the manufacturer (NEN), however, it is not possible to produce particles in the nanometer range.
Ebenfalls bekannt ist nachträgliche Labeln von Partikeln mit radioaktivem Iod (US - A-4,010,250). Das hier beschriebene Verfahren betrifft insbesondere die Markierung von Polyvinyllatexpartikeln mit einer Größe von 2,02 und 0,37 µm. Der Nachteil bei den auf diesem Wege hergestellten Partikeln ist, daß die Radioaktivität nicht sehr stabil gebunden ist und die Radioaktivität sich leicht auswaschen läßt (Lit. J Pharm Pharmacol. 1990, 42 : 821-826).Subsequent labeling of particles with radioactive iodine (US - A-4,010,250). The method described here concerns in particular the marking of polyvinyl latex particles with a size of 2.02 and 0.37 µm. The disadvantage with The particle made in this way is that the radioactivity is not very is stably bound and the radioactivity can be washed out easily (Lit. J Pharm Pharmacol. 1990, 42: 821-826).
WO 90/03803 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer radioaktiv markierten Zusammensetzung, welche sich insbesondere zur Lungen-Scintigraphie eignet. Die beschriebene Zusammensetzung enthält radioaktiv markierte Partikel auf der Basis von Silicagel, Aluminiumsilicat oder anderen Silicaten. An der Oberfläche dieser Partikel sind organische Liganden, die beispielsweise Thiol-, Amino-, Alkylamino- oder Dithiocarbamatgruppen enthalten, kovalent gebunden. Die Partikel besitzen einen durchschnittlichen Querschnitt von 1 bis 20 µm. Zur Markierung der Partikel werden vorwiegend Re-186, Re-188, Cu-67, Pb-212, Bi-212, As-77, Y-90, Ag-11 and Pd-109 eingesetzt, die sehr kurze Halbwertszeiten besitzen.WO 90/03803 describes a method for producing a radioactively labeled Composition which is particularly suitable for lung scintigraphy. The described composition contains radioactive labeled particles on the basis of silica gel, aluminum silicate or other silicates. On the surface of this Particles are organic ligands that, for example, thiol, amino, alkylamino or contain dithiocarbamate groups, covalently bonded. The particles have an average cross section of 1 to 20 µm. For marking the particles mainly Re-186, Re-188, Cu-67, Pb-212, Bi-212, As-77, Y-90, Ag-11 and Pd-109 are used, which have very short half-lives.
In nahezu allen Ansätzen lassen sich die Methoden nicht für Partikel im Submikronbereich verwenden, sind nicht monodispers oder sind nur sehr aufwendig herzustellen.In almost all approaches, the methods cannot be used for particles in the Use submicron range, are not monodisperse or are only very complex to manufacture.
Es besteht daher die Aufgabe, stabile radioaktiv markierte Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, bei denen die Radioaktivität fest gebunden ist, d. h. sich im wesentlichen nicht auswaschen läßt und die sich auf einfache und wirtschaftliche Weise herstellen lassen. The task therefore is to provide stable radioactively labeled nanoparticles To make available where the radioactivity is tightly bound, d. H. in essential can not be washed out and the simple and economical Have way made.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe und betrifft radioaktiv markierte Nanopartikel mit einer Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm, insbesondere 10 nm bis 300 nm, besonders bevorzugt 30 nm bis 150 nm, bei denen ein radioaktives Molekül kovalent an ein Nanopartikel gebunden ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Partikel.The present invention solves this problem and relates to radioactively labeled Nanoparticles with a size in the range from 10 to 1000 nm, in particular 10 nm to 300 nm, particularly preferably 30 nm to 150 nm, in which a radioactive Molecule is covalently bound to a nanoparticle, and a method for Production of such particles.
In der Literatur finden sich viele Vorschriften zur Kopplung von Molekülen an modifizierte Polystyrolpartikel. Diese Reaktionen beziehen sich allerdings nur auf größere Moleküle wie Proteine oder Antikörper. Sehr kleine Moleküle lassen sich normalerweise nicht oder nur in geringster Menge an Polystyrolpartikel koppeln. Daher ist es erstaunlich, daß es mit dem vorliegenden Verfahren möglich ist, beispielsweise radioaktiv markiertes Methylamin in rein wäßriger Reaktion an sehr kleine Polystyrolpartikel zu binden und dadurch radioaktive Partikel zu produzieren. Durch die kovalente Bindung eines kleinen Moleküls wie Methylamin an z. B. Carboxyl-modifizierte Polystyrolpartikel wird die Größe und Oberfläche der Partikel nur unwesentlich beeinflusst. Ferner ist die entstehende Amidbindung äußerst resistent gegenüber den verschiedensten Medien so daß die Stabilität der Partikel gewährleistet ist.There are many regulations for coupling molecules in the literature modified polystyrene particles. However, these reactions only refer to larger molecules like proteins or antibodies. Very small molecules can be normally do not couple or only couple to the smallest amount of polystyrene particles. It is therefore astonishing that with the present method it is possible for example, radioactively labeled methylamine in a purely aqueous reaction bind small polystyrene particles and thereby produce radioactive particles. By covalently binding a small molecule such as methylamine to e.g. B. Carboxyl-modified polystyrene particles will change the size and surface area of the particles only marginally influenced. Furthermore, the resulting amide bond is extreme resistant to various media so that the stability of the particles is guaranteed.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedenste Nanopartikel aber auch Mikropartikel nachträglich durch kovalente Anbindung eines radioaktiven Moleküls markiert werden.With the method according to the invention, however, a wide variety of nanoparticles can Microparticles can also be retrofitted by covalently attaching a radioactive Molecule are marked.
Hierzu wird ein Nanopartikel mit einem radioaktiv markierten Molekül in einem
wässrigen Medium umgesetzt, wobei eine kovalente Anbindung des radioaktiv
markierten Moleküls an den Nanopartikel erfolgt.
Der kann z. B. aus einem der folgenden Polymere aufgebaut sein: Polystyrol,
Polyacrylat, Polyalkylmethacrylat, Styrol/Divinylbenzen-Copolymer, Polyvinyltoluol,
Styrol-Butadien Copolymer, Vinylbenzylchlorid, Silica oder Mischungen aus den
genannten Polymeren.For this purpose, a nanoparticle is reacted with a radioactively labeled molecule in an aqueous medium, the radioactively labeled molecule being covalently bound to the nanoparticle.
The z. B. can be constructed from one of the following polymers: polystyrene, polyacrylate, polyalkyl methacrylate, styrene / divinylbenzene copolymer, polyvinyltoluene, styrene-butadiene copolymer, vinylbenzyl chloride, silica or mixtures of the polymers mentioned.
In den anhängenden Beispielen wurde vorzugsweise ein Copolymer aus Styrol und Acrylsäure verwendet. Die Verwendung hat den Vorteil, daß diese Partikel kommerziell und günstig erhältlich sind. Weiterhin sind sie inert und unlöslich in den meisten Medien, stabil und toxikologisch unbedenklich und die Partikel sind sphärisch.In the attached examples, a copolymer of styrene and Acrylic acid used. The use has the advantage that these particles are commercially available and cheap. Furthermore, they are inert and insoluble in the most media, stable and toxicologically safe and the particles are spherical.
Die Oberfläche des Nanopartikels kann gegebenenfalls mit mindestens einer funktionellen Gruppen, wie z. B. Sulfat (-SO4), Carbonsäure (-COOH), aliphatisches Amin (-CH2-NH2), aromatisches Amin, Aldehyd (-CHO), Hydroxyl (-OH), Sulfonat (- SO3), Chloromethyl (-CH2-Cl), Bromomethyl (-CH2-Br), Iodomethyl (-CH2-I), Hydrazid (-CONH-NH2) oder einer Epoxydgruppe modifiziert sein.The surface of the nanoparticle can optionally be coated with at least one functional groups such as B. sulfate (-SO4), carboxylic acid (-COOH), aliphatic Amine (-CH2-NH2), aromatic amine, aldehyde (-CHO), hydroxyl (-OH), sulfonate (- SO3), chloromethyl (-CH2-Cl), bromomethyl (-CH2-Br), iodomethyl (-CH2-I), Hydrazide (-CONH-NH2) or an epoxy group may be modified.
Die Anbindung des Markers an die Partikel erfolgt durch Kopplung an geeignete funktionelle Gruppen des Nanopartikels. Diese funktionellen Gruppen sind entweder durch Copolymerisation mit entsprechenden Monomeren, die geeignete funktionelle Gruppen tragen, in den Nanopartikel bereits vorhanden oder durch nachträgliche Modifikation dieser funktionellen Gruppen entstanden.The marker is linked to the particles by coupling to suitable ones functional groups of the nanoparticle. These functional groups are either by copolymerization with appropriate monomers, the appropriate functional Wear groups, already present in the nanoparticles or through subsequent ones Modification of these functional groups emerged.
Hier sind beispielsweise folgende Kombinationen von funktionellen Gruppen und
radioaktiv markierten Molekülen zu nennen:
The following combinations of functional groups and radioactively labeled molecules can be mentioned here, for example:
- - primäre oder aliphatische Amine zur Kopplung von radioaktiven Aldehyden, z. B. Formaldehyd, Acetaldehyd oder anderen Aldehyden, oder zur Kopplung von Säuren z. B. Essigsäure. Hierbei ist auch eine optionale nachträgliche Stabilisierung vom Imin zum Amin durch Reduktion eingeschlossen.Primary or aliphatic amines for coupling radioactive aldehydes, e.g. B. formaldehyde, acetaldehyde or other aldehydes, or for coupling of acids e.g. B. acetic acid. There is also an optional retrofit Stabilization from imine to amine included by reduction.
- - Aldehyde zur Bindung von radioaktiven Aminen, insbesondere Methylamin.- Aldehydes for binding radioactive amines, especially methylamine.
- - Chloromethyl (Vinylbenzylchlorid) zur Bindung von radioaktiven Aminen, z. B. Methylamin.- Chloromethyl (vinylbenzyl chloride) for binding radioactive amines, e.g. B. Methylamine.
- - Epoxydgruppen zur Bindung von radioaktiven Aminen, z. B. Methylamin.- Epoxy groups for binding radioactive amines, e.g. B. methylamine.
- - Hydroxylgruppen zur Bindung von radioaktiven Säuren, z. B. Essigsäure, Phosphorsäure- Hydroxyl groups for binding radioactive acids, e.g. B. acetic acid, phosphoric acid
- - Hydrazide zur Bindung von radioaktiven Aldehyden oder Säuren.- Hydrazides for binding radioactive aldehydes or acids.
Ähnliche und weitere Reaktionen sind der Literatur zu entnehmen (Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson, Academic Press, 1996).Similar and further reactions can be found in the literature (Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, 1996).
Je nach Auswahl des radioaktiven Markers können unterschiedliche Markierungen
vorgenommen werden. Als Marker für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich
z. B.
Ag 110, C 14, Cd 109, Cs 137, Ca 47, Cl 36, Cr 51, Co 57, Fe 55, Fe 59, Ga 153, In
111, I 125, I 131, Mn 54, Hg 203, Na 22, Ni 63, P 32, P 33, Rb 86, Ru 106, S 35, Se
75, Sr 85, Tc 99 oder Tritium, insbesondere C 14, Tritium, P 32 und S 35.Depending on the selection of the radioactive marker, different markings can be made. Suitable markers for the method according to the invention are, for. B.
Ag 110, C 14, Cd 109, Cs 137, Ca 47, Cl 36, Cr 51, Co 57, Fe 55, Fe 59, Ga 153, In 111, I 125, I 131, Mn 54, Hg 203, Na 22 , Ni 63, P 32, P 33, Rb 86, Ru 106, S 35, Se 75, Sr 85, Tc 99 or tritium, in particular C 14, tritium, P 32 and S 35.
Besonders geeignet im Sinne der Erfindung sind stabile, langlebige Strahler mit einer physikalischen Mindest-Halbwertszeit von 14 Tagen.Stable, long-life radiators with are particularly suitable in the sense of the invention a minimum physical half-life of 14 days.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Oberfläche des Nanopartikels mit mindestens einer funktionelle Gruppe modifiziert, so daß die Möglichkeit besteht weitere Liganden an den Nanopartikel zu koppeln. Als Beispiel für solche funktionellen Gruppen sind zu nennen: Sulfat- (-SO4) oder Carbonsäuregruppe (-COOH), aliphatische oder aromatische Amingruppe (-CH2- NH2), Amidrest (-CONH2), Aldehydgruppe (-CHO), Hydroxyl- (-OH) oder Sulfonatgruppe (-SO3) oder Vinylbenzylchlorid-, Chloromethyl- (-CH2Cl), Hydrazid- (-CONH-NH2) oder Epoxydreste. Die Anbindung derartiger weiterer Liganden kann vor, nach oder gleichzeitig mit der Anbindung des radioaktiven Moleküls an den Nanopartikel erfolgen.In a preferred embodiment of the method according to the invention Modified surface of the nanoparticle with at least one functional group, so that there is the possibility of coupling additional ligands to the nanoparticle. Examples of such functional groups are: sulfate (-SO4) or Carboxylic acid group (-COOH), aliphatic or aromatic amine group (-CH2- NH2), amide residue (-CONH2), aldehyde group (-CHO), hydroxyl- (-OH) or Sulfonate group (-SO3) or vinylbenzyl chloride-, chloromethyl- (-CH2Cl), hydrazide- (-CONH-NH2) or epoxy residues. Such additional ligands can be bound before, after or simultaneously with the connection of the radioactive molecule to the Nanoparticles are made.
Weitere Moleküle, die auf diese Weise kovalent an den radioaktiv markierten Partikel gebunden werden können sind z. B., um nur einige zu nennen: Antigene, Antikörper, Nucleinsäuren oder Proteine, Enzyme, Arzneistoffe oder Rezeptorliganden. Auf eine explizite Aufzählung aller geeigneter Liganden wird hier verzichtet, da eine derartige Auflistung den Rahmen dieser Anmeldung sprengen würde. Außerdem sind diese dem Fachmann bekannt sind und werden von ihm je nach Anwendung speziell ausgewählt.Other molecules that covalently labeled in this way on the radioactive Particles can be bound for. B. to name just a few: antigens, Antibodies, nucleic acids or proteins, enzymes, drugs or Receptor ligands. An explicit list of all suitable ligands is given here waived, since such a listing is beyond the scope of this application would. In addition, these are known to the person skilled in the art and are used by him specially selected according to application.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die entsprechenden Nanopartikel in eine wässrige Lösung gegeben, in der vorzugsweise ein Überschuß Sulfo-NHS (N- Hydroxysuccinimid-3-Sulfonsäuresalz, Aldrich) gelöst ist. Das Sulfo-NHS dient im vorliegenden Fall als Katalysator und verhindert, daß die Partikel agglomerieren. Der Zusatz dieses Reagenz ist aber nicht zwingend. In den anhängenden Beispielen wurden aus den vorstehend genannten Gründen Polystyrolpartikel, deren Oberflächen mit freien Carboxylgruppen modifiziert waren, verwendet. In the method according to the invention, the corresponding nanoparticles are in given an aqueous solution in which an excess of sulfo-NHS (N- Hydroxysuccinimide-3-sulfonic acid salt, Aldrich) is dissolved. The sulfo-NHS serves in present case as a catalyst and prevents the particles from agglomerating. However, the addition of this reagent is not mandatory. In the attached examples were polystyrene particles whose Surfaces with free carboxyl groups were used.
Zu dieser Mischung wird in einem darauffolgenden Schritt das radioaktiv markierte Molekül gegeben, z. B. C14 markiertes Methylamin. Der pH Wert wird mit Phosphatpuffer so eingestellt, daß er im leicht sauren Bereich (pH < 7) liegt. Für den Fall, daß die eingesetzten Nanopartikel freie Carboxylgruppen tragen, wird zu der Reaktionslösung ein in destilliertem Wasser gelöstes Carbodiimid zugegeben. Vorzugsweise wird das Carbodiimid im Überschuß zugesetzt. Bei dieser Reaktion können die gebräuchlichen, dem Fachmann bekannten Carbodiimide, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodimid (EDC), verwendet werden. Nach Abschluß der Reaktion (einige Stunden) werden die Partikel ultrafiltriert und mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis die freie (ungebundene) Radioaktivität herausgewaschen ist.In a subsequent step, the radioactive label is added to this mixture Given molecule, e.g. B. C14 labeled methylamine. The pH value is with Phosphate buffer adjusted so that it is in the slightly acidic range (pH <7). In the event that the nanoparticles used carry free carboxyl groups a carbodiimide dissolved in distilled water to the reaction solution admitted. The carbodiimide is preferably added in excess. At this reaction can be the usual ones known to the person skilled in the art Carbodiimides, e.g. B. dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or 1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodimide (EDC) can be used. After completion of the Reaction (a few hours) the particles are ultrafiltered and distilled with Washed water until the free (unbound) radioactivity is washed out.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man radioaktive Nanopartikel mit einer spezifischen Aktivität von 1 bis 100 µCi/mg. Durch Wahl von geeigneten radioaktiven Markern mit entsprechender Radioaktivität und Wahl der entsprechenden Nanopartikel mit geeigneter Anzahl an freien funktionellen Gruppen, ist es möglich, die spezifische Aktivität der erhaltenen radioaktiv markierten Partikel genau einzustellen.With the method according to the invention, radioactive nanoparticles are also obtained a specific activity of 1 to 100 µCi / mg. By choosing suitable ones radioactive markers with appropriate radioactivity and choice of corresponding nanoparticles with a suitable number of free functional Groups, it is possible to get the specific activity of the radioactive obtained set the marked particles precisely.
Zum Bestimmung der Stabilität wird ein Teil der Partikel für 24 h lang in künstlichem Magensaft (0,1 M HCl) bei 37°C inkubiert, durch Ultrafiltration abgetrennt und die freie Radioaktivität im Filtrat bestimmt. Die freie Radioaktivität der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Partikel beträgt nach diesem Test nur 0,1 bis 2%. Nach Inkubation der Partikel in künstlichem Darmsaft für 24 Stunden liegt die freie Aktivität der radioaktiven Partikel im Bereich von 0,1 bis 2%.To determine the stability, part of the particles are kept in artificial for 24 h Gastric juice (0.1 M HCl) incubated at 37 ° C, separated by ultrafiltration and the free radioactivity determined in the filtrate. The free radioactivity of the with the Particles produced according to the method of the invention is only after this test 0.1 to 2%. After incubation of the particles in artificial intestinal juice for 24 hours the free activity of the radioactive particles is in the range of 0.1 to 2%.
Das vorliegende Verfahren besitzt gegenüber den im Stand der Technik
beschriebenen Verfahren viele Vorteile:
The present method has many advantages over the methods described in the prior art:
- 1. Die Partikel sind schon kommerziell in verschiedensten Grössen und sehr engen Grössenverteilungen oder mit verschiedenen Oberflächenmodifikationen erhältlich, d. h. aufwendige Techniken zur Herstellung entfallen. 1. The particles are already commercially available in various sizes and very narrow Size distributions or with different surface modifications available, d. H. elaborate manufacturing techniques are eliminated.
- 2. Die nicht radioaktiven Partikel können umfassend charakterisiert werden (mit radioaktivem Material ist z. B. eine Messung der Partikelgrössenverteilung mittels Photonen-Korrelations-Spektroskopie schlecht möglich, da dadurch das Gerät kontaminiert werden könnte).2. The non-radioactive particles can be characterized comprehensively (with radioactive material is e.g. B. a measurement of the particle size distribution by means of Photon correlation spectroscopy poorly possible because of this the device could be contaminated).
- 3. Die Oberflächen der Partikel können modifiziert sein (z. B. positiv, negativ oder zwitterionisch geladen sein).3. The surfaces of the particles can be modified (eg positive, negative or be zwitterionic charged).
- 4. Je nach Auswahl des radioaktiven Markers können unterschiedliche Markierungen vorgenommen werden (z. B. C14, Tritium, S35 usw.).4. Depending on the selection of the radioactive marker, different ones Markings can be made (e.g. C14, tritium, S35, etc.).
- 5. Eine weitere Bindung anderer Liganden an die Partikel ist möglich, die Ankopplung an die Partikel kann vorher, nachher oder zusammen mit dem Marker erfolgen.5. Another binding of other ligands to the particles is possible Coupling to the particles can be done before, after or together with the Markers.
- 6. Die Reaktionen sind einfach und können in rein wässrigem Medium ohne Lösungsmittel durchgeführt werden, so lassen sich Agglomerationen vermeiden.6. The reactions are simple and can be done in a purely aqueous medium without Solvents are carried out, so agglomerations can be avoided.
- 7. Durch die kovalente Anbindung des radioaktiven Markers entstehen sehr stabile Partikel, die keine Radioaktivität verlieren.7. The covalent connection of the radioactive marker creates very stable ones Particles that do not lose radioactivity.
- 8. Die Reaktionen können auch auf sehr kleine Partikel im Nanometerbereich angewendet werden.8. The reactions can also take place on very small particles in the nanometer range be applied.
Die erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Nanopartikeln sind insbesondere dort
anwendbar, wo es auf einheitliche Partikelgrössenverteilung, hohe Sensitivität und
schnelle, simple Auswertung ankommt wie z. B.:
Als Marker für zelluläre Antigene, zur Studie von phagozytotischen Prozessen
Diagnostika, die auf Mikro- oder Nanopartikeln beruhen, z. B. Latex
Agglutinationstests, Partikel Sandwich Tests, Mikroinjizierbare Zellmarker,
Lungenabsorption, Scintigraphie, Aerosolcharakterisierung, Untersuchung des
mucozilitären Transportes, Blutflussuntersuchungen sowie Tumorbehandlungen
(Radiotherapie) und Diagnose.
The radioactively labeled nanoparticles according to the invention can be used in particular where uniform particle size distribution, high sensitivity and fast, simple evaluation are important, such as, for. B .:
As a marker for cellular antigens, for the study of phagocytotic processes, diagnostics based on micro or nanoparticles, e.g. B. latex agglutination tests, particle sandwich tests, micro-injectable cell markers, lung absorption, scintigraphy, aerosol characterization, examination of mucociliary transport, blood flow tests and tumor treatments (radiotherapy) and diagnosis.
1 ml käuflicher 140 nm Polystyrolpartikel, die freie Carboxylgruppen an der Oberfläche tragen, werden mit 8 ml destilliertem Wasser, in dem 200 mg Sulfo-NHS (N-Hydroxysuccinimid-3-Sulfonsäuresalz, Aldrich) gelöst wurde, vermischt. Dazu werden 10 mg C14 radioaktiv markiertes Methylamin (gelöst in 1 ml dest. Wasser) gegeben. Der pH-Wert wird mit Phosphatpuffer auf 6,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wird 1 ml dest. Wasser, in dem 150 mg EDAC (wasserlösliches Carbodiimid, Fluka) gelöst wurden, hinzugefügt und die Suspension über Nacht gerührt. Am nächsten Tag werden die Partikel ultrafiltriert (Amicon-Ultrafiltrationszelle) und mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis die freie (ungebundene) Radioaktivität herausgewaschen ist. Man erhält radioaktive Polystyrolpartikel mit einer spezifischen Aktivität von ca. 8 µCi/mg.1 ml of commercially available 140 nm polystyrene particles that contain free carboxyl groups on the Wear surface with 8 ml of distilled water containing 200 mg of sulfo-NHS (N-hydroxysuccinimide-3-sulfonic acid salt, Aldrich) was mixed. To 10 mg of C14 radioactively labeled methylamine (dissolved in 1 ml of distilled water) given. The pH is adjusted to 6.5 with phosphate buffer. About this solution 1 ml of dist. Water in which 150 mg EDAC (water-soluble carbodiimide, Fluka) were dissolved, added and the suspension stirred overnight. The next Day the particles are ultrafiltered (Amicon ultrafiltration cell) and distilled Washed water until the free (unbound) radioactivity is washed out. Radioactive polystyrene particles are obtained with a specific activity of approx. 8 µCi / mg.
Zum Beweis der Stabilität wird ein Teil der Partikel für 24 h lang in künstlichem Magensaft (0,1 M HCl) bei 37°C inkubiert. Die Partikel werden vom Puffer durch Ultrafiltration abgetrennt und die freie Radioaktivität im Filtrat bestimmt. Nach 24 h betrug die freie Radioaktivität nur 0,2%.To demonstrate stability, part of the particles are kept in artificial for 24 hours Gastric juice (0.1 M HCl) incubated at 37 ° C. The particles are passed through by the buffer Ultrafiltration separated and the free radioactivity in the filtrate determined. After 24 h the free radioactivity was only 0.2%.
Desweiteren wurden die Partikel in künstlichem Darmsaft für 24 h bei 37°C inkubiert. Diesmal betrug die freie Radioaktivität nur 0,4%. Aus der spezifischen Radioaktivität der Partikel sowie einer Bestimmung der freien Carboxylgruppen auf den Partikeln läßt sich berechnen, daß etwa 1/3 der Carboxylgruppen an der Oberfläche des Partikels mit Methylamin reagiert haben und noch 2/3 freie Carboxylgruppen vorliegen.Furthermore, the particles were in artificial intestinal juice for 24 h at 37 ° C incubated. This time the free radioactivity was only 0.4%. From the specific Radioactivity of the particles and a determination of the free carboxyl groups the particles can be calculated that about 1/3 of the carboxyl groups on the Surface of the particle reacted with methylamine and 2/3 free Carboxyl groups are present.
Aus der spezifischen Radioaktivität der Partikel sowie einer Bestimmung der freien Carboxylgruppen auf den Partikeln läßt sich berechnen, daß etwa 1/3 der Carboxylgruppen an der Oberfläche des Partikels mit Methylamin reagiert haben und noch 2/3 freie Carboxylgruppen vorliegen.From the specific radioactivity of the particles and a determination of the free Carboxyl groups on the particles can be calculated to be about 1/3 of the Carboxyl groups on the surface of the particle have reacted with methylamine and 2/3 free carboxyl groups are still present.
An die noch freien Carboxylgruppen der Partikel können weitere Moleküle (z. B. Antikörper, Antigene, Nucleinsäuren oder Proteine) kovalent gebunden werden. Zudem sind die Partikel durch die negative Oberflächenladung stabilisiert vor Agglomeration und unspezifischer Absorption von Fremdmolekülen.Additional molecules (e.g. Antibodies, antigens, nucleic acids or proteins) are bound covalently. In addition, the particles are stabilized by the negative surface charge Agglomeration and non-specific absorption of foreign molecules.
Zusammensetzung künstlicher Magensaft (USP) für 1 L Lösung:
2,0 g NaCl und 3,2 g Pepsin werden in einer Mischung aus 7,0 ml konzentrierter
Salzsäure und 950 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf 1000 ml aufgefüllt. Diese
Testlösung hat einen pH-Wert von ca. 1, 2.Composition of artificial gastric juice (USP) for 1 L solution:
2.0 g NaCl and 3.2 g pepsin are dissolved in a mixture of 7.0 ml concentrated hydrochloric acid and 950 ml water. The solution is made up to 1000 ml. This test solution has a pH of approx. 1.2.
Zusammensetzung künstlicher Darmsaft (USP) für 1 Liter Lösung:
6,8 g Natriumdihydrogenphosphat werden in 250 ml Wasser gelöst und 380 ml 0,1
N NaOH-Lösung sowie 200 ml Wasser hinzugegeben. Es werden 10,0 g Pankreatin
hinzugefügt, gemischt und die Lösung mit 0,1 N NaOH auf einen pH von 7,5 ±0,1
eingestellt. Es wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.Composition of artificial intestinal juice (USP) for 1 liter of solution:
6.8 g of sodium dihydrogen phosphate are dissolved in 250 ml of water and 380 ml of 0.1 N NaOH solution and 200 ml of water are added. 10.0 g of pancreatin are added, mixed and the solution is adjusted to a pH of 7.5 ± 0.1 with 0.1 N NaOH. Make up to 1000 ml with water.
Dünndarm und Inhalt von 3 frisch getöteten männlichen Ratten wird entnommen und separat in Phosphatpuffer geeigneten pH-Wertes homogenisiert (ca. 3 ml Puffer auf 1 g Gewebe). Etwa 5 ml Aliquot von jedem Homogenisat werden mit 0,5 mg/ml [14C]-Polystyrol-Nanopartikel bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Das verbleibende Homogenisat wird gepoolt, gut durchmischt und weitere 2 Proben zu je 5 ml entnommen. Zu einer der beiden Proben wird [14C]-Methylamin in einer Konzentration gegeben, die der Konzentration in den radioaktiv markierten Nanopartikeln entspricht. Zu der anderen Homogenisat-Probe werden [14C]- Methylamin und nicht-radioaktiv markierte Nanopartikel in einer Konzentration zugegeben, die der Konzentration in den radioaktiv markierten Nanopartikeln entspricht. Zur Kontrolle wird ein Aliquot [14C]-Polystyrol-Nanopartikel entsprechender Konzentration in Phosphatpuffer angesetzt. Jede Probe wird bei 37°C im Schüttelwasserbad für 4 h inkubiert. Nach 1 h und nach 4 h werden 2 ml jeder Probe entnommen, zentrifugiert und der Überstand entnommen. Der Überstand wird ultrafiltriert (Centrifree Micropartition), um die Konzentration an freiem [14C]-Methylamin in jeder Probe zu bestimmen.Small intestine and contents of 3 freshly killed male rats are removed and homogenized separately in phosphate buffer of suitable pH (approx. 3 ml buffer 1 g tissue). Approximately 5 ml aliquot of each homogenate is 0.5 mg / ml [14C] polystyrene nanoparticles incubated at 37 ° C in a shaking water bath. The remaining homogenate is pooled, mixed well and a further 2 samples each 5 ml removed. To one of the two samples, [14C] methylamine is added in one Concentration given that the concentration in the radioactively labeled Corresponds to nanoparticles. For the other homogenate sample, [14C] - Methylamine and non-radioactive labeled nanoparticles in one concentration added that the concentration in the radioactively labeled nanoparticles corresponds. An aliquot of [14C] polystyrene nanoparticles is used as a control appropriate concentration in phosphate buffer. Every sample is at Incubated at 37 ° C in a shaking water bath for 4 h. After 1 h and after 4 h, 2 ml taken from each sample, centrifuged and the supernatant removed. The Supernatant is ultrafiltered (Centrifree Micropartition) to control the concentration Determine free [14C] methylamine in each sample.
Die Radioaktivität wird im Überstand und im resultierenden Pellet für jede Probe ermittelt.The radioactivity is in the supernatant and in the resulting pellet for each sample determined.
Fünf männliche Ratten erhalten eine intravenöse Einzelgabe von 2 mg/kg [14C]-
Polystyrol-Nanopartikel in 0,9% (m/V) Kochsalzlösung. Die Testtiere werden einzeln
in einen Metabolismuskäfig aus Glas gesetzt. Etwa 4 h vor und nach der
Nanopartikelgabe erhalten die Tiere keine Nahrung. Urin und Faeces wird für
vorher festgelegte Zeitabschnitte quantitativ gesammelt. Die Käfige werden bei
jeder Faeces-Entnahme ausgewaschen und das Waschwasser aufgehoben. Die
ausgeatmetete Atemluft von 3 Tieren wird in einer absorbierende Lösung von
Ethanolamin: Ethandiol = 3 : 7 aufgefangen. Nach Abschluß der Probennahmen
werden die Ratten getötet, eine letzte Blutprobe (5-10 ml) entnommen und die Tiere
in folgende Gewebefraktionen aufgeteilt:
Blut, Magen, Dünn- und Dickdarm, Leber, Lunge, Nieren, Milz, Muskelgewebe,
Lymphknoten und restlicher Tierkörper.Five male rats receive a single intravenous dose of 2 mg / kg [14C] polystyrene nanoparticles in 0.9% (m / V) saline. The test animals are placed individually in a metabolism cage made of glass. The animals were given no food about 4 hours before and after the nanoparticle administration. Urine and faeces are collected quantitatively for predetermined periods. The cages are washed out each time the faeces are removed and the washing water is saved. The exhaled air from 3 animals is collected in an absorbing solution of ethanolamine: ethanediol = 3: 7. After sampling is complete, the rats are sacrificed, a last blood sample (5-10 ml) is taken and the animals are divided into the following tissue fractions:
Blood, stomach, small and large intestine, liver, lungs, kidneys, spleen, muscle tissue, lymph nodes and the rest of the animal body.
Inhalt von Magen, Dünn- und Dickdarm werden getrennt und durch fünfmaliges Waschen mit Phosphatpufferlösung ausgespült.The contents of the stomach, small intestine and colon are separated and by five times Wash rinsed with phosphate buffer solution.
In jeder einzelnen der o. g. Proben wird die Menge an Radioaktivität bestimmt. In each of the above The amount of radioactivity is determined in samples.
Fünf männliche Ratten (Gruppe 1) erhalten je eine orale Einzelgabe von 20 mg/kg [14C]-Polystyrol-Nanopartikel als Suspension in Phosphatpuffer pH 7,5. Etwa 4 h vor und nach der Nanopartikelgabe erhalten die Tiere keine Nahrung. Die Testtiere werden einzeln in einen Metabolismuskäfig aus Glas gesetzt, die Probennahme erfolgt nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Schema. Auf die Messung der Radioaktivität in der Atemluft wurde verzichtet, da der vorangegangene Versuch (Beispiel 4) gezeigt hatte, daß die Partikel so stabil radioaktiv markiert sind, daß keine nennenswerten Mengen an Radioaktivität abgeatmet werden.Five male rats (group 1) each received a single oral dose of 20 mg / kg [14C] polystyrene nanoparticles as a suspension in phosphate buffer pH 7.5. About 4 hours The animals are given no food before and after the nanoparticle administration. The test animals are individually placed in a glass metabolism cage, the sampling takes place according to the scheme described in Example 4. On measuring the Radioactivity in the air we breathe has been omitted since the previous attempt (Example 4) had shown that the particles are so stably radioactively labeled that no significant amounts of radioactivity are exhaled.
In jeder einzelnen der o. g. Proben wird die Menge an Radioaktivität bestimmt. Zusätzlich erhalten weitere sechs männliche Ratten erhalten je eine orale Einzelgabe von 20 mg/kg [14C]-Polystyrol-Nanopartikel als Suspension in Phosphatpuffer pH 7,5. Die Testtiere werden einzeln in einen Metabolismuskäfig aus Polypropylen und rostfreiem Stahl gesetzt. 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h und 24 h nach Nanopartikelgabe wird je ein Tier duch CO2-Narkose getötet, Blut und Gewebe gesammelt und die Menge an Radioaktivität in den Proben bestimmt. The amount of radioactivity is determined in each of the above samples. In addition, a further six male rats were given an oral single dose of 20 mg / kg of [14C] polystyrene nanoparticles as a suspension in phosphate buffer pH 7.5. The test animals are placed individually in a metabolism cage made of polypropylene and stainless steel. 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h and 24 h after administration of nanoparticles, one animal is killed by CO 2 anesthesia, blood and tissue are collected and the amount of radioactivity in the samples is determined.
Claims (13)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1999133346 DE19933346A1 (en) | 1999-07-16 | 1999-07-16 | Stabile radioactively-marked nanoparticles bound to other molecules for use in medical and diagnostic techniques, particularly used for studying phagocyte processes |
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| PCT/EP2000/004973 WO2000078362A2 (en) | 1999-06-22 | 2000-05-31 | Stable, radioactively marked nanoparticles, method for the production and utilization thereof |
Applications Claiming Priority (1)
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| DE1999133346 DE19933346A1 (en) | 1999-07-16 | 1999-07-16 | Stabile radioactively-marked nanoparticles bound to other molecules for use in medical and diagnostic techniques, particularly used for studying phagocyte processes |
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ID=7914992
Family Applications (1)
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Cited By (1)
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-
1999
- 1999-07-16 DE DE1999133346 patent/DE19933346A1/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007010211A1 (en) * | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Ge Healthcare Limited | Radiolabelled nanoparticles |
| CN101222943B (en) * | 2005-07-15 | 2013-04-10 | 通用电气健康护理有限公司 | Radiolabelled nanoparticles |
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