DE19933346A1

DE19933346A1 - Stabile radioaktiv markierte Nanopartikel, Verfahren zur Herstellung und ihrer Verwendung

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Publication number: DE19933346A1
Application number: DE1999133346
Authority: DE
Inventors: Peter Boderke; Jennifer Filbey; Jochen Wermuth; Matthias Ortmueller
Original assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Current assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2001-01-18

Abstract

Stabiler radioaktiver Nanopartikel sowie Verfahren zu seiner Herstellung, wobei ein Nanopartikel mit einem radioaktiv markierten Molekül, insbesondere in einem wässrigen Medium, umgesetzt wird und eine kovalente Anbindung des radioaktiv markierten Moleküls an den Nanopartikel erfolgt. Der Nanopartikel weist üblicherweise eine Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm auf. An den Nanopartikel können weitere Moleküle ausgewählt aus der folgenden Gruppe kovalent gebunden werden: Antigene, Antikörper, Nucleinsäuren oder Proteine, Enzyme, Arzneistoffe oder Rezeptorliganden. DOLLAR A Die erfindungsgemäßen radioaktiven Nanopartikel eignen sich insbesondere für medizinische und diagnostische Zwecke, beispielsweise als Marker für zelluläre Antigene, zur Studie von phagozytotischen Prozessen, als mikroinjezierbarer Zellmarker, zur Scintigraphie, zur Aerosolcharakterisierung, bei der Lungenabsorption, bei Untersuchungen des mucozilitären Transports, bei Blutuntersuchungen oder zur Tumorbehandlung und -diagnose.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft stabile radioaktiv markierte Nanopartikel, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für medizinische und diagnostische Zwecke.

Bisher sind im Stand der Technik verschiedene Methoden zur Herstellung radioaktiver Partikel beschrieben worden.

So wird in Lit. Amer. Ind. Hyg. Ass. J. 1970, 31 (3),349-52 die Herstellung von radioaktiven Partikeln aus radioaktiv markiertem Monomer und anschliessender Emulsionspolymerisation beschrieben. Hierfür wurden Monomere wie z. B. I131 gelabeltes 2,4-iodostyren verwendet. Der Nachteil liegt hier insbesondere in der schwierig zu steuernden Polymerisation, da teilweise eine spontane Polymerisation eintritt und die Partikelgrössen sehr unterschiedlich ausfallen können. Ausserdem müssen alle Syntheseschritte der Monomere und die anschliessende Polymerisation in Radioaktivlabors durchgeführt werden, was aufwendig und gefährlich ist. Desweiteren ist die Charakterisierung von radioaktivem Material (z. B. Partikelgrösse und Verteilung) nicht trivial. Darüberhinaus ist die Herstellung monodisperser Partikel im unteren Nanometerbereich fast unmöglich.

Eine weitere Möglichkeit bietet z. B. die Herstellung von nichtradioaktivem Polymer, radioaktive Markierung durch Bestrahlung und anschliessende Herstellung von Nanopartikeln beispielsweise mittels der Spining-disk-Methode. Der Nachteil bei diesem Verfahren besteht darin, daß sich das Polymer durch Bestrahlung teilweise zersetzt und die anfallenden Zersetzungsprodukte entfernt werden müssen.

Zudem lassen sich mit dieser Methode keine Partikel im Nanometerbereich herstellen (Lit. Ann Occup Hyg. 13, 87-100, 1970).

Kommerzielle radioaktiv markierte Mikropartikel aus Styrol und Divinylbenzol sind gelabelt mit einer Reihe von Radionucliden erhältlich. Laut Aussage des Herstellers (NEN) ist eine Produktion von Partikeln im Nanometerbereich jedoch nicht möglich.

Ebenfalls bekannt ist nachträgliche Labeln von Partikeln mit radioaktivem Iod (US - A-4,010,250). Das hier beschriebene Verfahren betrifft insbesondere die Markierung von Polyvinyllatexpartikeln mit einer Größe von 2,02 und 0,37 µm. Der Nachteil bei den auf diesem Wege hergestellten Partikeln ist, daß die Radioaktivität nicht sehr stabil gebunden ist und die Radioaktivität sich leicht auswaschen läßt (Lit. J Pharm Pharmacol. 1990, 42 : 821-826).

WO 90/03803 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer radioaktiv markierten Zusammensetzung, welche sich insbesondere zur Lungen-Scintigraphie eignet. Die beschriebene Zusammensetzung enthält radioaktiv markierte Partikel auf der Basis von Silicagel, Aluminiumsilicat oder anderen Silicaten. An der Oberfläche dieser Partikel sind organische Liganden, die beispielsweise Thiol-, Amino-, Alkylamino- oder Dithiocarbamatgruppen enthalten, kovalent gebunden. Die Partikel besitzen einen durchschnittlichen Querschnitt von 1 bis 20 µm. Zur Markierung der Partikel werden vorwiegend Re-186, Re-188, Cu-67, Pb-212, Bi-212, As-77, Y-90, Ag-11 and Pd-109 eingesetzt, die sehr kurze Halbwertszeiten besitzen.

In nahezu allen Ansätzen lassen sich die Methoden nicht für Partikel im Submikronbereich verwenden, sind nicht monodispers oder sind nur sehr aufwendig herzustellen.

Es besteht daher die Aufgabe, stabile radioaktiv markierte Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, bei denen die Radioaktivität fest gebunden ist, d. h. sich im wesentlichen nicht auswaschen läßt und die sich auf einfache und wirtschaftliche Weise herstellen lassen.

Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe und betrifft radioaktiv markierte Nanopartikel mit einer Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm, insbesondere 10 nm bis 300 nm, besonders bevorzugt 30 nm bis 150 nm, bei denen ein radioaktives Molekül kovalent an ein Nanopartikel gebunden ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Partikel.

In der Literatur finden sich viele Vorschriften zur Kopplung von Molekülen an modifizierte Polystyrolpartikel. Diese Reaktionen beziehen sich allerdings nur auf größere Moleküle wie Proteine oder Antikörper. Sehr kleine Moleküle lassen sich normalerweise nicht oder nur in geringster Menge an Polystyrolpartikel koppeln. Daher ist es erstaunlich, daß es mit dem vorliegenden Verfahren möglich ist, beispielsweise radioaktiv markiertes Methylamin in rein wäßriger Reaktion an sehr kleine Polystyrolpartikel zu binden und dadurch radioaktive Partikel zu produzieren. Durch die kovalente Bindung eines kleinen Moleküls wie Methylamin an z. B. Carboxyl-modifizierte Polystyrolpartikel wird die Größe und Oberfläche der Partikel nur unwesentlich beeinflusst. Ferner ist die entstehende Amidbindung äußerst resistent gegenüber den verschiedensten Medien so daß die Stabilität der Partikel gewährleistet ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedenste Nanopartikel aber auch Mikropartikel nachträglich durch kovalente Anbindung eines radioaktiven Moleküls markiert werden.

Hierzu wird ein Nanopartikel mit einem radioaktiv markierten Molekül in einem wässrigen Medium umgesetzt, wobei eine kovalente Anbindung des radioaktiv markierten Moleküls an den Nanopartikel erfolgt.
Der kann z. B. aus einem der folgenden Polymere aufgebaut sein: Polystyrol, Polyacrylat, Polyalkylmethacrylat, Styrol/Divinylbenzen-Copolymer, Polyvinyltoluol, Styrol-Butadien Copolymer, Vinylbenzylchlorid, Silica oder Mischungen aus den genannten Polymeren.

In den anhängenden Beispielen wurde vorzugsweise ein Copolymer aus Styrol und Acrylsäure verwendet. Die Verwendung hat den Vorteil, daß diese Partikel kommerziell und günstig erhältlich sind. Weiterhin sind sie inert und unlöslich in den meisten Medien, stabil und toxikologisch unbedenklich und die Partikel sind sphärisch.

Die Oberfläche des Nanopartikels kann gegebenenfalls mit mindestens einer funktionellen Gruppen, wie z. B. Sulfat (-SO4), Carbonsäure (-COOH), aliphatisches Amin (-CH2-NH2), aromatisches Amin, Aldehyd (-CHO), Hydroxyl (-OH), Sulfonat (- SO3), Chloromethyl (-CH2-Cl), Bromomethyl (-CH2-Br), Iodomethyl (-CH2-I), Hydrazid (-CONH-NH2) oder einer Epoxydgruppe modifiziert sein.

Die Anbindung des Markers an die Partikel erfolgt durch Kopplung an geeignete funktionelle Gruppen des Nanopartikels. Diese funktionellen Gruppen sind entweder durch Copolymerisation mit entsprechenden Monomeren, die geeignete funktionelle Gruppen tragen, in den Nanopartikel bereits vorhanden oder durch nachträgliche Modifikation dieser funktionellen Gruppen entstanden.

Hier sind beispielsweise folgende Kombinationen von funktionellen Gruppen und radioaktiv markierten Molekülen zu nennen:

- primäre oder aliphatische Amine zur Kopplung von radioaktiven Aldehyden, z. B. Formaldehyd, Acetaldehyd oder anderen Aldehyden, oder zur Kopplung von Säuren z. B. Essigsäure. Hierbei ist auch eine optionale nachträgliche Stabilisierung vom Imin zum Amin durch Reduktion eingeschlossen.
- Aldehyde zur Bindung von radioaktiven Aminen, insbesondere Methylamin.
- Chloromethyl (Vinylbenzylchlorid) zur Bindung von radioaktiven Aminen, z. B. Methylamin.
- Epoxydgruppen zur Bindung von radioaktiven Aminen, z. B. Methylamin.
- Hydroxylgruppen zur Bindung von radioaktiven Säuren, z. B. Essigsäure, Phosphorsäure
- Hydrazide zur Bindung von radioaktiven Aldehyden oder Säuren.

Ähnliche und weitere Reaktionen sind der Literatur zu entnehmen (Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson, Academic Press, 1996).

Je nach Auswahl des radioaktiven Markers können unterschiedliche Markierungen vorgenommen werden. Als Marker für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich z. B.
Ag 110, C 14, Cd 109, Cs 137, Ca 47, Cl 36, Cr 51, Co 57, Fe 55, Fe 59, Ga 153, In 111, I 125, I 131, Mn 54, Hg 203, Na 22, Ni 63, P 32, P 33, Rb 86, Ru 106, S 35, Se 75, Sr 85, Tc 99 oder Tritium, insbesondere C 14, Tritium, P 32 und S 35.

Besonders geeignet im Sinne der Erfindung sind stabile, langlebige Strahler mit einer physikalischen Mindest-Halbwertszeit von 14 Tagen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Oberfläche des Nanopartikels mit mindestens einer funktionelle Gruppe modifiziert, so daß die Möglichkeit besteht weitere Liganden an den Nanopartikel zu koppeln. Als Beispiel für solche funktionellen Gruppen sind zu nennen: Sulfat- (-SO4) oder Carbonsäuregruppe (-COOH), aliphatische oder aromatische Amingruppe (-CH2- NH2), Amidrest (-CONH2), Aldehydgruppe (-CHO), Hydroxyl- (-OH) oder Sulfonatgruppe (-SO3) oder Vinylbenzylchlorid-, Chloromethyl- (-CH2Cl), Hydrazid- (-CONH-NH2) oder Epoxydreste. Die Anbindung derartiger weiterer Liganden kann vor, nach oder gleichzeitig mit der Anbindung des radioaktiven Moleküls an den Nanopartikel erfolgen.

Weitere Moleküle, die auf diese Weise kovalent an den radioaktiv markierten Partikel gebunden werden können sind z. B., um nur einige zu nennen: Antigene, Antikörper, Nucleinsäuren oder Proteine, Enzyme, Arzneistoffe oder Rezeptorliganden. Auf eine explizite Aufzählung aller geeigneter Liganden wird hier verzichtet, da eine derartige Auflistung den Rahmen dieser Anmeldung sprengen würde. Außerdem sind diese dem Fachmann bekannt sind und werden von ihm je nach Anwendung speziell ausgewählt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die entsprechenden Nanopartikel in eine wässrige Lösung gegeben, in der vorzugsweise ein Überschuß Sulfo-NHS (N- Hydroxysuccinimid-3-Sulfonsäuresalz, Aldrich) gelöst ist. Das Sulfo-NHS dient im vorliegenden Fall als Katalysator und verhindert, daß die Partikel agglomerieren. Der Zusatz dieses Reagenz ist aber nicht zwingend. In den anhängenden Beispielen wurden aus den vorstehend genannten Gründen Polystyrolpartikel, deren Oberflächen mit freien Carboxylgruppen modifiziert waren, verwendet.

Zu dieser Mischung wird in einem darauffolgenden Schritt das radioaktiv markierte Molekül gegeben, z. B. C14 markiertes Methylamin. Der pH Wert wird mit Phosphatpuffer so eingestellt, daß er im leicht sauren Bereich (pH < 7) liegt. Für den Fall, daß die eingesetzten Nanopartikel freie Carboxylgruppen tragen, wird zu der Reaktionslösung ein in destilliertem Wasser gelöstes Carbodiimid zugegeben. Vorzugsweise wird das Carbodiimid im Überschuß zugesetzt. Bei dieser Reaktion können die gebräuchlichen, dem Fachmann bekannten Carbodiimide, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodimid (EDC), verwendet werden. Nach Abschluß der Reaktion (einige Stunden) werden die Partikel ultrafiltriert und mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis die freie (ungebundene) Radioaktivität herausgewaschen ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man radioaktive Nanopartikel mit einer spezifischen Aktivität von 1 bis 100 µCi/mg. Durch Wahl von geeigneten radioaktiven Markern mit entsprechender Radioaktivität und Wahl der entsprechenden Nanopartikel mit geeigneter Anzahl an freien funktionellen Gruppen, ist es möglich, die spezifische Aktivität der erhaltenen radioaktiv markierten Partikel genau einzustellen.

Zum Bestimmung der Stabilität wird ein Teil der Partikel für 24 h lang in künstlichem Magensaft (0,1 M HCl) bei 37°C inkubiert, durch Ultrafiltration abgetrennt und die freie Radioaktivität im Filtrat bestimmt. Die freie Radioaktivität der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Partikel beträgt nach diesem Test nur 0,1 bis 2%. Nach Inkubation der Partikel in künstlichem Darmsaft für 24 Stunden liegt die freie Aktivität der radioaktiven Partikel im Bereich von 0,1 bis 2%.

Das vorliegende Verfahren besitzt gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren viele Vorteile:

1. Die Partikel sind schon kommerziell in verschiedensten Grössen und sehr engen Grössenverteilungen oder mit verschiedenen Oberflächenmodifikationen erhältlich, d. h. aufwendige Techniken zur Herstellung entfallen.
2. Die nicht radioaktiven Partikel können umfassend charakterisiert werden (mit radioaktivem Material ist z. B. eine Messung der Partikelgrössenverteilung mittels Photonen-Korrelations-Spektroskopie schlecht möglich, da dadurch das Gerät kontaminiert werden könnte).
3. Die Oberflächen der Partikel können modifiziert sein (z. B. positiv, negativ oder zwitterionisch geladen sein).
4. Je nach Auswahl des radioaktiven Markers können unterschiedliche Markierungen vorgenommen werden (z. B. C14, Tritium, S35 usw.).
5. Eine weitere Bindung anderer Liganden an die Partikel ist möglich, die Ankopplung an die Partikel kann vorher, nachher oder zusammen mit dem Marker erfolgen.
6. Die Reaktionen sind einfach und können in rein wässrigem Medium ohne Lösungsmittel durchgeführt werden, so lassen sich Agglomerationen vermeiden.
7. Durch die kovalente Anbindung des radioaktiven Markers entstehen sehr stabile Partikel, die keine Radioaktivität verlieren.
8. Die Reaktionen können auch auf sehr kleine Partikel im Nanometerbereich angewendet werden.

Die erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Nanopartikeln sind insbesondere dort anwendbar, wo es auf einheitliche Partikelgrössenverteilung, hohe Sensitivität und schnelle, simple Auswertung ankommt wie z. B.:
Als Marker für zelluläre Antigene, zur Studie von phagozytotischen Prozessen Diagnostika, die auf Mikro- oder Nanopartikeln beruhen, z. B. Latex Agglutinationstests, Partikel Sandwich Tests, Mikroinjizierbare Zellmarker, Lungenabsorption, Scintigraphie, Aerosolcharakterisierung, Untersuchung des mucozilitären Transportes, Blutflussuntersuchungen sowie Tumorbehandlungen (Radiotherapie) und Diagnose.

Beispiel 1 Herstellung radioaktiv markierter Polystyrol-Nanopartikel

1 ml käuflicher 140 nm Polystyrolpartikel, die freie Carboxylgruppen an der Oberfläche tragen, werden mit 8 ml destilliertem Wasser, in dem 200 mg Sulfo-NHS (N-Hydroxysuccinimid-3-Sulfonsäuresalz, Aldrich) gelöst wurde, vermischt. Dazu werden 10 mg C14 radioaktiv markiertes Methylamin (gelöst in 1 ml dest. Wasser) gegeben. Der pH-Wert wird mit Phosphatpuffer auf 6,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wird 1 ml dest. Wasser, in dem 150 mg EDAC (wasserlösliches Carbodiimid, Fluka) gelöst wurden, hinzugefügt und die Suspension über Nacht gerührt. Am nächsten Tag werden die Partikel ultrafiltriert (Amicon-Ultrafiltrationszelle) und mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis die freie (ungebundene) Radioaktivität herausgewaschen ist. Man erhält radioaktive Polystyrolpartikel mit einer spezifischen Aktivität von ca. 8 µCi/mg.

Beispiel 2 Stabilität radioaktiv markierter [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in künstlichem Magen- und Darmsaft

Zum Beweis der Stabilität wird ein Teil der Partikel für 24 h lang in künstlichem Magensaft (0,1 M HCl) bei 37°C inkubiert. Die Partikel werden vom Puffer durch Ultrafiltration abgetrennt und die freie Radioaktivität im Filtrat bestimmt. Nach 24 h betrug die freie Radioaktivität nur 0,2%.

Desweiteren wurden die Partikel in künstlichem Darmsaft für 24 h bei 37°C inkubiert. Diesmal betrug die freie Radioaktivität nur 0,4%. Aus der spezifischen Radioaktivität der Partikel sowie einer Bestimmung der freien Carboxylgruppen auf den Partikeln läßt sich berechnen, daß etwa 1/3 der Carboxylgruppen an der Oberfläche des Partikels mit Methylamin reagiert haben und noch 2/3 freie Carboxylgruppen vorliegen.

Aus der spezifischen Radioaktivität der Partikel sowie einer Bestimmung der freien Carboxylgruppen auf den Partikeln läßt sich berechnen, daß etwa 1/3 der Carboxylgruppen an der Oberfläche des Partikels mit Methylamin reagiert haben und noch 2/3 freie Carboxylgruppen vorliegen.

An die noch freien Carboxylgruppen der Partikel können weitere Moleküle (z. B. Antikörper, Antigene, Nucleinsäuren oder Proteine) kovalent gebunden werden. Zudem sind die Partikel durch die negative Oberflächenladung stabilisiert vor Agglomeration und unspezifischer Absorption von Fremdmolekülen.

Zusammensetzung künstlicher Magensaft (USP) für 1 L Lösung:
2,0 g NaCl und 3,2 g Pepsin werden in einer Mischung aus 7,0 ml konzentrierter Salzsäure und 950 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf 1000 ml aufgefüllt. Diese Testlösung hat einen pH-Wert von ca. 1, 2.

Zusammensetzung künstlicher Darmsaft (USP) für 1 Liter Lösung:
6,8 g Natriumdihydrogenphosphat werden in 250 ml Wasser gelöst und 380 ml 0,1 N NaOH-Lösung sowie 200 ml Wasser hinzugegeben. Es werden 10,0 g Pankreatin hinzugefügt, gemischt und die Lösung mit 0,1 N NaOH auf einen pH von 7,5 ±0,1 eingestellt. Es wird mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

Beispiel 3 Stabilität radioaktiv markierter [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in Darmhomogenisat

Dünndarm und Inhalt von 3 frisch getöteten männlichen Ratten wird entnommen und separat in Phosphatpuffer geeigneten pH-Wertes homogenisiert (ca. 3 ml Puffer auf 1 g Gewebe). Etwa 5 ml Aliquot von jedem Homogenisat werden mit 0,5 mg/ml [14C]-Polystyrol-Nanopartikel bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Das verbleibende Homogenisat wird gepoolt, gut durchmischt und weitere 2 Proben zu je 5 ml entnommen. Zu einer der beiden Proben wird [14C]-Methylamin in einer Konzentration gegeben, die der Konzentration in den radioaktiv markierten Nanopartikeln entspricht. Zu der anderen Homogenisat-Probe werden [14C]- Methylamin und nicht-radioaktiv markierte Nanopartikel in einer Konzentration zugegeben, die der Konzentration in den radioaktiv markierten Nanopartikeln entspricht. Zur Kontrolle wird ein Aliquot [14C]-Polystyrol-Nanopartikel entsprechender Konzentration in Phosphatpuffer angesetzt. Jede Probe wird bei 37°C im Schüttelwasserbad für 4 h inkubiert. Nach 1 h und nach 4 h werden 2 ml jeder Probe entnommen, zentrifugiert und der Überstand entnommen. Der Überstand wird ultrafiltriert (Centrifree Micropartition), um die Konzentration an freiem [14C]-Methylamin in jeder Probe zu bestimmen.

Die Radioaktivität wird im Überstand und im resultierenden Pellet für jede Probe ermittelt.

Tabelle 1

Stabilität von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in Darmhomogenisat

Tabelle 2

Stabilität von [14C]-Methylamin in Darmhomogenisat

Tabelle 3

Stabilität von [14C]-Methylamin und Polystyrol-Nanopartikel in Darmhomogenisat

Beispiel 4 Ausscheidungsverhalten von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel nach intravenöser Gabe

Fünf männliche Ratten erhalten eine intravenöse Einzelgabe von 2 mg/kg [14C]- Polystyrol-Nanopartikel in 0,9% (m/V) Kochsalzlösung. Die Testtiere werden einzeln in einen Metabolismuskäfig aus Glas gesetzt. Etwa 4 h vor und nach der Nanopartikelgabe erhalten die Tiere keine Nahrung. Urin und Faeces wird für vorher festgelegte Zeitabschnitte quantitativ gesammelt. Die Käfige werden bei jeder Faeces-Entnahme ausgewaschen und das Waschwasser aufgehoben. Die ausgeatmetete Atemluft von 3 Tieren wird in einer absorbierende Lösung von Ethanolamin: Ethandiol = 3 : 7 aufgefangen. Nach Abschluß der Probennahmen werden die Ratten getötet, eine letzte Blutprobe (5-10 ml) entnommen und die Tiere in folgende Gewebefraktionen aufgeteilt:
Blut, Magen, Dünn- und Dickdarm, Leber, Lunge, Nieren, Milz, Muskelgewebe, Lymphknoten und restlicher Tierkörper.

Inhalt von Magen, Dünn- und Dickdarm werden getrennt und durch fünfmaliges Waschen mit Phosphatpufferlösung ausgespült.

In jeder einzelnen der o. g. Proben wird die Menge an Radioaktivität bestimmt.

Tabelle 4

Kumulative Wiederfindung der totalen Radioaktivität nach einer intravenösen Einzelgabe von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in Ratten (in % der applizierten Dosis)

Beispiel 5 Ausscheidungsverhalten von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel nach oraler Gabe

Fünf männliche Ratten (Gruppe 1) erhalten je eine orale Einzelgabe von 20 mg/kg [14C]-Polystyrol-Nanopartikel als Suspension in Phosphatpuffer pH 7,5. Etwa 4 h vor und nach der Nanopartikelgabe erhalten die Tiere keine Nahrung. Die Testtiere werden einzeln in einen Metabolismuskäfig aus Glas gesetzt, die Probennahme erfolgt nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Schema. Auf die Messung der Radioaktivität in der Atemluft wurde verzichtet, da der vorangegangene Versuch (Beispiel 4) gezeigt hatte, daß die Partikel so stabil radioaktiv markiert sind, daß keine nennenswerten Mengen an Radioaktivität abgeatmet werden.

In jeder einzelnen der o. g. Proben wird die Menge an Radioaktivität bestimmt. Zusätzlich erhalten weitere sechs männliche Ratten erhalten je eine orale Einzelgabe von 20 mg/kg [14C]-Polystyrol-Nanopartikel als Suspension in Phosphatpuffer pH 7,5. Die Testtiere werden einzeln in einen Metabolismuskäfig aus Polypropylen und rostfreiem Stahl gesetzt. 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h und 24 h nach Nanopartikelgabe wird je ein Tier duch CO₂-Narkose getötet, Blut und Gewebe gesammelt und die Menge an Radioaktivität in den Proben bestimmt.

Tabelle 5

Kumulative Wiederfindung der totalen Radioaktivität nach einer oralen Einzelgabe von [14C]-Polystyrol-Nanopartikel in Ratten der Gruppe 1 (in % der applizierten Dosis)

Tabelle 6

Kumulative Wiederfindung der totalen Radioaktivität (in % der applizierten Dosis) zu bestimmten Zeitpunkten nach einer oralen Einzelgabe von [14C]-Polystyrol- Nanopartikel in Ratten der Gruppe 2

Claims

1. Verfahren zur Herstellung stabiler radioaktiver Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nanopartikel mit einem radioaktiv markierten Molekül, wobei eine kovalente Anbindung des radioaktiv markierten Moleküls an den Nanopartikel erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nanopartikel eine Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm aufweist.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Molekül mit einem Strahler markiert ist, der aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Ag 110, C 14, Cd 109, Cs 137, Ca 47, Cl 36, Cr 51, Co 57, Fe 55, Fe 59, Ga 153, In 111, I 125, I 131, Mn 54, Hg 203, Na 22, Ni 63, P 32, P 33, Rb 86, Ru 106, S 35, Se 75, Sr 85, Tc 99.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der radioaktive Marker eine Halbwertszeit im Bereich von mindestens 14 Tagen besitzt

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Nanopartikel aus mindestens einem der folgenden Polymeren aufgebaut ist: Polystyrol, Polyacrylat, Polyalkylmethacrylat, Styrol/Divinylbenzen-Copolymer, Polyvinyltoluol, Styrol-Butadien-Copolymer, Silica.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Nanopartikels mit mindestens einer funktionellen Gruppen der Art: Sulfat- (-SO₄) oder Carbonsäuregruppe (- COOH), aliphatische oder aromatische Amingruppe (-CH₂-NH₂), Amidrest (- CONH₂), Aldehydgruppe (-CHO), Hydroxyl- (-OH) oder Sulfonatgruppe (-SO₃) oder Vinylbenzylchlorid-, Chloromethyl- (-CH₂Cl), Hydrazid- (-CONH-NH₂) oder Epoxydreste modifiziert ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß weitere Liganden an den Nanopartikel angekoppelt werden, wobei die Anbindung der Liganden vor, nach oder gleichzeitig mit der Anbindung an das radioaktive Molekül erfolgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem wässrigen Medium erfolgt.

9. Radioaktive Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel eine Größe im Bereich von 10 bis 1000 nm besitzen.

10. Radioaktiver Partikel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß an ihm weitere Moleküle ausgewählt aus der folgenden Gruppe kovalent gebunden sind: Antigene, Antikörper, Nucleinsäuren oder Proteine, Enzyme, Arzneistoffe oder Rezeptorliganden.

11. Radioaktiver Partikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er nach 24 h bei 37°C in 0,1 M HCl, sowie in künstlichem Darmsaft USP nicht mehr als 2,0% seiner Radioaktivität freigesetzt hat.

12. Verwendung eines radioaktiven Nanopartikel gemäß einer der Ansprüche 9 bis 11 für medizinische und diagnostische Zwecke.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der radioaktive Nanopartikel als Marker für zelluläre Antigene, zur Studie von phagozytotischen Prozessen, als mikroinjizierbarer Zellmarker, zur Scintigraphie, zur Aerosolcharakterisierung, bei der Lungenabsorption, bei Untersuchungen des mucozilitären Transports, bei Blutuntersuchungen oder zur Tumorbehandlung und -diagnose eingesetzt wird.