DE19913640A1

DE19913640A1 - Pharmaceutical composition comprising drug, e.g. anticancer agent, encapsulated in liposomes, containing polymer-lipid conjugate as stabilizer to inhibit liposome aggregation

Info

Publication number: DE19913640A1
Application number: DE1999113640
Authority: DE
Inventors: Jui-Ching Cheng
Original assignee: Taiwan Liposome Co Ltd
Current assignee: Taiwan Liposome Co Ltd
Priority date: 1999-03-25
Filing date: 1999-03-25
Publication date: 2000-09-28

Abstract

In a pharmaceutical composition including an active agent (A) encapsulated in liposomes, aggregation of the liposomes is inhibited using a polymer-lipid conjugate (I), such that the integrity of the liposomes and the storage stability of the composition are improved. An Independent claim is included for the preparation of the compositions.

Description

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Vorbeugung der Aggregation von Liposomen, und insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfassen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass man der Aggregation dieser Liposome durch ein langkettiges Polymer- Lipid-Konjugat vorbeugt, so dass die Integrität dieser Liposome und so auch die Lagerstabilität der Zusammensetzungen erhöht werden können.The invention relates to compositions and methods for Prevention of liposome aggregation, and in particular pharmaceutical compositions, the liposomes, the active ingredients encapsulate, which are characterized in that one the aggregation of these liposomes by a long-chain polymer Prevents lipid conjugate, so the integrity of these liposomes thus increasing the shelf life of the compositions can be.

Liposome können aus vielen verschiedenen Arten von Lipidmolekülen bestehen. Präparate mit unterschiedlicher Zusammensetzung und unterschiedlichen Wirkstoffen können jeweils eigene Eigenschaften aufweisen. Bei einer Verbesserung der Dosisform ist die Auswahl des konstitutiven Moleküls der wichtigste Ausgangspunkt.Liposomes can come from many different types of Lipid molecules exist. Preparations with different Composition and different active ingredients can each have their own properties. With an improvement the dosage form is the selection of the constitutive molecule of the most important starting point.

1965 haben Bangham et al. entdeckt, dass, wenn eine dünne Lipidschicht einer wässrigen Salzlösung zugegeben und geschüttelt wird, das Lipid dann kleine Perlen, die eine Eigenschaft der Durchlässigkeit aufweisen, bildet. 1968 nannten Sessa und Weissmann diese kleinen Perlen Liposome und gaben eine klare Definition, wonach das Liposom eine Mikromizelle ist, die aus einer bis einigen Schichten von Lipiddoppelschichten besteht.In 1965, Bangham et al. discovered that when a thin Lipid layer added to an aqueous salt solution and is shaken, the lipid then small pearls, the one Have property of permeability, forms. 1968 called Sessa and Weissmann gave these little pearls liposomes and gave them a clear definition according to which the liposome is a micromicelle that is from one to a few layers of There are lipid bilayers.

Seit 1970 hat man das Liposom als gute Dosierungsform für den Transport von Wirkstoffen erkannt. Es wird aufgrund der folgenden Charakteristika als guter Wirkstoffeträger angesehen: Erstens ist das Liposom aus Phospholipiden aufgebaut, die eine Zusammensetzung haben, die der einer Zellmembran ähnlich ist und die im Organismus abgebaut werden kann, nicht giftig ist, keine Immunreaktion herbeiführen kann und die mehrfach verwendet werden kann; zweitens können die im Liposom eingekapselten Wirkstoffe langsam und mit einer kontrollierten Rate freigesetzt werden, und die Pharmakokinetik des Wirkstoffes kann variiert werden, um die Wirksamkeit der Wirkstoffebehandlung zu erhöhen; drittens können unerwünschte Nebenwirkungen hochgiftiger Wirkstoffe dadurch verringert werden, dass man diese in das Liposom einkapselt; und viertens besteht eine hohe Flexibilität hinsichtlich der Lipidzusammensetzung, der Partikelgröße, der Struktur, des Herstellungsverfahrens sowie der eingekapselten Wirkstoffe, so dass unterschiedlichen Anforderungen entsprochen werden können.Since 1970 the liposome has been a good dosage form for the Transport of active substances recognized. It is due to the considered the following characteristics as a good active ingredient carrier: First, the liposome is made up of phospholipids, one Have a composition similar to that of a cell membrane and which can be broken down in the organism, is not toxic, can not bring about an immune response and that multiple times can be used; second, those in the liposome encapsulated active ingredients slowly and with a controlled Rate will be released, and the pharmacokinetics of the Active ingredient can be varied to increase the effectiveness of the drug Increase drug treatment; third, can be unwanted This reduces side effects of highly toxic substances be encapsulated in the liposome; and fourth there is a high degree of flexibility with regard to Lipid composition, the particle size, the structure, the Manufacturing process and the encapsulated active ingredients, so that different requirements can be met.

1975 kapselten Gregoriadis et al. Actinomycin D in Liposomen ein und verwendeten es zur Behandlung eines Lymphoms bei Ratten. Dabei wurde festgestellt, dass die Dosierungsform in Liposomenform das Leben dieser Ratten effektiv verlängern konnte. Seit dieser Zeit ist das Liposom nach und nach bei der Einkapselung von Antikrebswirkstoffen, wie zum Beispiel Methotrexat, Doxorubicin, 1-beta-D-Arabinofuranosylcytosin, Cytosinarabinosid, cis-Diamindichlorplatin und dergleichen verwendet worden, und man verwendete Produkte daraus bei Tiermodellen, wobei man als Ergebnisse fand, daß diese die Behandlungseffekte dieser Wirkstoffe erhöhen oder die Nebenwirkungen der Wirkstoffe vermindern konnten.In 1975 Gregoriadis et al. Actinomycin D in liposomes and used it to treat lymphoma Rats. It was found that the dosage form in Liposome form effectively prolong the life of these rats could. Since then, the liposome has been gradually added to the Encapsulation of anti-cancer drugs, such as Methotrexate, doxorubicin, 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, Cytosine arabinoside, cis-diamine dichloroplatinum and the like have been used, and products used therefrom Animal models, the results of which were found to be the Treatment effects of these agents increase or the Could reduce side effects of the active ingredients.

Anfangs konnten bei der Herstellung von Liposomen unter Verwendung von Phospholipiden aufgrund technischer Einschränkungen nur große (einige Mikron große) Liposomen, die aus einer Multilayer von Membranen aufgebaut sind, das heißt ein multilamellares Vesikel (MLV) mit einem Durchmesser von 1-10 Mikron, mittels eines Verfahrens zur Hydratisierung dünner Lipidschichten hergestellt werden. Aufgrund des geringen Wassergehaltes zwischen den Lipiddoppelschichten waren solche Liposomen nicht zur Einkapselung wasserlöslicher Wirkstoffe geeignet und hatten daher nur begrenzte Anwendungsmöglichkeiten.Initially, we were unable to produce liposomes Use of phospholipids due to technical Limitations only large (a few microns) liposomes that are made up of a multilayer of membranes, that is a multilamellar vesicle (MLV) with a diameter of 1-10 microns thinner using a hydration process Lipid layers are produced. Because of the low The water content between the lipid bilayers was such Liposomes not for encapsulating water-soluble active substances suitable and therefore had only limited Possible uses.

Einige Jahre später konnten Forscher infolge der Entwicklung der Beschallung, der Lösungsmittelinjektion sowie der Detergensdialyse kleine Liposome (20-200 nm Durchmesser), die aus einer einzigen Lipiddoppelschicht bestehen, herstellen. Ein solch kleines Liposom wurde oft als Modell für Biomembranen ohne Membranprotein oder zum Einkapseln wasserlöslicher Wirkstoffe verwendet. Dessen Partikelgröße war jedoch nicht einheitlich, so daß das die Herstellung medizinischer Wirkstoffe nicht begünstigte.A few years later, researchers were able to follow the development sonication, solvent injection and Detergent dialysis small liposomes (20-200 nm diameter), the consist of a single lipid bilayer. On Such a small liposome was often used as a model for biomembranes without membrane protein or water-soluble for encapsulation Active ingredients used. However, its particle size was not uniform, so that's the manufacture of medical Active substances not favored.

Da das Herstellungsverfahren verbessert worden ist, können gegenwärtig Liposome, die aus einer einzigen Lipiddoppelschicht bestehen und die eine einheitliche Größe haben, mittels der oben genannten Verfahren in Kombination mit der Filtermembranextrusion, wobei die Partikelgröße von der Porengröße der Filtermembran bestimmt wird, hergestellt werden. Ein solches Verfahren kann in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden und ist für die Massenproduktion geeignet.Since the manufacturing process has been improved, currently liposomes consisting of a single lipid bilayer exist and which have a uniform size, by means of which the above method in combination with the Filter membrane extrusion, the particle size of the Pore size of the filter membrane is determined to be produced. Such a process can be found in the pharmaceutical industry can be used and is suitable for mass production.

Zusätzlich zu Herstellungsverfahren verwendete man bei der anfänglichen Herstellung von Liposomen oft natürliche Lipide als Rohstoffe. Im allgemeinen enthalten natürliche Lipide ein negativ geladenes Phospholipid wie zum Beispiel Phosphatidylinosotol, Phosphatidylserin, Cardiolipin oder dergleichen, die den so hergestellten Liposomen eine negative Ladung verleihen. Solche negativ geladenen Liposome sind dem abgebauten Teilchen, das nach der Apoptose einer Zelle gebildet wird, sehr ähnlich, so daß die in den Blutkreislauf injizierten Liposome von dem mononuklearen phagozytischen System (MPS), das in Organen wie der Leber, der Milz oder dergleichen vorkommt und auch als das Retikuloendothelialsystem (RES) bezeichnet wird, sofort phagozytiert werden.In addition to manufacturing processes, the initial production of liposomes often natural lipids as raw materials. Generally they contain natural lipids negatively charged phospholipid such as Phosphatidylinosotol, phosphatidylserine, cardiolipin or the like, the liposomes thus produced a negative Lend charge. Such negatively charged liposomes are degraded particle that is formed after apoptosis of a cell becomes very similar, so that the injected into the bloodstream Liposomes from the mononuclear phagocytic system (MPS) that occurs in organs such as the liver, spleen or the like and also referred to as the reticuloendothelial system (RES) will be phagocytized immediately.

Anfängliche Liposome konnten folglich Wirkstoffe bis zu den oben genannten Organen bringen, so daß ihre Anwendung auf einen solch kleinen Bereich beschränkt war. Ein solches Liposom konnte Wirkstoffe nur zu Phagozyten wie einem Makrophagen bringen, und die Anwendung beschränkte sich auf die Behandlung solcher Krankheiten wie Leishmaniasis, die nur bis zu Phagozyten infiziert.Initial liposomes could consequently reach up to the active ingredients bring the above-mentioned organs so that their application to one such a small area was limited. Such a liposome could only act on phagocytes like a macrophage bring, and the application was limited to the treatment such diseases as leishmaniasis that only up to Phagocytes infected.

Überdies können Lipoproteine hoher Dichte (HDL) das Phospholipid, das sich in den aus natürlichen Lipiden bestehenden Liposomen befindet, entfernen, was die Liposome zusammenstürzen und die in den Liposomen eingekapselten Wirkstoffe weiter ausströmen läßt, so daß die Halbwertszeit der Wirkstoffzirkulation beeinträchtigt wird.In addition, high density lipoproteins (HDL) can Phospholipid, which is made up of natural lipids existing liposomes located, remove what the liposomes collapse and the encapsulated in the liposomes Active substances can flow out, so that the half-life of Drug circulation is impaired.

Um den Anwendungsbereich des im Liposom transportierten Wirkstoffes zu erweitern, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung nach langjähriger Untersuchung gefunden, daß die Zirkulationszeit des im Liposom eingekapselten Wirkstoffes im Blut von den folgenden Faktoren beeinflußt werden kann: (1) aus neutralen Lipiden hergestellte Liposome sind gegenüber Entfernung durch das Retikuloendothelialsystem weniger anfällig; (2) Liposome mit kleinerer Partikelgröße sind gegenüber Entfernung weniger anfällig; (3) Liposome, die aus einem Lipid mit einer hohen Übergangstemperatur, wie Distearoylphosphatidylcholin, bestehen und die einen hohen Cholesterinanteil haben, sind stabiler; und (4) Schutz der Oberfläche von Liposomen durch Polyalkylether kann deren Entfernungsrate im Blut verlangsamen. Daher kann die Herstellung von Liposomen, die einen Durchmesser von 20 bis 100 nm haben, und die aus Lipiden, die eine hohe Übergangstemperatur sowie einen hohen Cholesterinanteil (zum Beispiel Distearoylphosphatidylcholin : Cholesterin = 3 : 2 Molverhältnis) haben, bestehen, die Halbwertszeit der Liposome im Blutkreislauf steigern. Außerdem können Liposome von dieser Größe durch die durchlässigen Poren der neonatalen Zellwand des Tumors dringen, so daß sich Liposome, die Antikrebsmittel enthalten, in einer großen Menge im Tumor ansammeln können und somit deren Behandlungseffekt erhöhen.To the scope of the transported in the liposome The present inventors have expanded the active ingredient Invention after many years of investigation found that the Circulation time of the active substance encapsulated in the liposome Blood can be affected by the following factors: (1) Liposomes made from neutral lipids are opposite Removal through the reticuloendothelial system less susceptible; (2) are liposomes with smaller particle size less susceptible to removal; (3) Liposomes that are made up of a lipid with a high transition temperature, such as Distearoylphosphatidylcholine, consist of a high Cholesterol levels are more stable; and (4) protecting the Surface of liposomes by polyalkyl ethers can Slow removal rate in the blood. Therefore, the Production of liposomes with a diameter of 20 to 100 nm, and those from lipids that have a high Transition temperature and a high cholesterol content (for Example distearoylphosphatidylcholine: cholesterol = 3: 2 Molar ratio) have the half-life of the liposomes increase in blood circulation. It can also remove liposomes from this Size through the permeable pores of the neonatal cell wall of the Tumors penetrate, leaving liposomes, the anti-cancer agents contained, can accumulate in a large amount in the tumor and thus increasing their treatment effect.

Da das Retikuloendothelialsystem Liposome, die eine große Partikelgröße haben, sowie Liposome, die negativ geladen sind, schneller entfernen kann, fördert die Herstellung neutraler Liposome, die eine Partikelgröße von weniger als 100 nm haben, überdies eine Zunahme der Zirkulationszeit für den Wirkstoff im Blut, so daß die Partikelgröße zu einer sehr wichtigen Eigenschaft von Liposomprodukten wird. Neutrale Liposome können aufgrund ihrer Kolloideigenschaft aggregieren, was zu einer Präzipitation von großen Teilchen führt. Änderungen in der Partikelgröße könnten die Pharmakokinetik von Wirkstoffen im Blut und somit den Behandlungseffekt der Wirkstoffe beeinflussen. Darüberhinaus kann die durch Aggregation der Partikel hervorgerufene Präzipitation die Wirkzeit des Wirkstoffes verkürzen.Because the reticuloendothelial liposome, which is a large Have particle size, as well as liposomes that are negatively charged, can remove more quickly, promotes the production of neutral Liposomes with a particle size of less than 100 nm moreover, an increase in the circulation time for the active ingredient in the Blood, so the particle size becomes a very important Property of liposome products. Neutral liposomes can aggregate due to their colloidal properties, resulting in a Precipitation of large particles leads. Changes in the Particle size could affect the pharmacokinetics of drugs in Blood and thus the treatment effect of the active ingredients influence. In addition, the aggregation of Precipitation caused by the particle Shorten active ingredient.

Die Zugabe einer kleinen Menge von Polyalkyletherlipid zu den Liposomzubereitungen kann die Aggregation der Liposome und somit deren Präzipitationsrate vermindern. Zum Beispiel kann die Zugabe von, von Polyethylenglykol (durchschnittliches Molekulargewicht 5.000) abgeleitetem Distearoylphosphatidyl ethanolamin (PEG-DSPE) in einer Menge von mehr als 0,6 Mol.-% der Liposomlipide die Aggregation und Präzipitation der Liposome vollständig verhindern.The addition of a small amount of polyalkyl ether lipid to the Liposome preparations can aggregate liposomes and thus reduce their precipitation rate. For example the addition of, of polyethylene glycol (average Molecular weight 5,000) derived distearoylphosphatidyl ethanolamine (PEG-DSPE) in an amount of more than 0.6 mol% the aggregation and precipitation of the liposome lipids Prevent liposomes completely.

Außerdem betraf die US 5013556 die Zugabe von 1-20 Mol.-% Polyalkylether, um die Zirkulationszeit der Liposome im Blut zu erhöhen und somit die Wirkung der Wirkstoffe zu erhöhen. Einige Versuchsdaten haben aber erkennen lassen, daß, wenn Liposome, die einen Durchmesser von 50 bis 100 nm haben und die ein Lipid mit einer hohen Übergangstemperatur sowie mit einem hohen Cholesterinanteil (zum Beispiel Distearoylphosphatidylcholin : Cholesterin = 3 : 2 Molverhältnis) umfassen, verwendet werden, um den Antikrebswirkstoff Doxorubicin einzukapseln, die Verwendung einer großen Menge Polyalkylether, um die Zirkulationszeit des Liposoms im Blut zu erhöhen, die Akkumulation dieses Antikrebswirkstoffes im Bereich des Tumors vermindern kann.US 5013556 also concerned the addition of 1-20 mol% Polyalkyl ether to increase the circulation time of the liposomes in the blood increase and thus increase the effect of the active ingredients. Some Experimental data have shown, however, that if liposomes, which have a diameter of 50 to 100 nm and which is a lipid with a high transition temperature as well as with a high one Cholesterol content (for example distearoylphosphatidylcholine: Cholesterol = 3: 2 molar ratio) can be used to encapsulate the anti-cancer drug doxorubicin, the use a large amount of polyalkyl ether to increase the circulation time of the Liposomes in the blood increase the accumulation of this Anti-cancer agent in the area of the tumor can decrease.

Eine Verringerung des Polyalkyletheranteils (< 1 Mol.-%) ist also wünschenswert und ist darüber hinaus für eine Erhöhung des Behandlungseffektes der Liposomdosierungsform von Antikrebsmitteln vorteilhaft.A reduction in the proportion of polyalkyl ether (<1 mol%) so desirable and is also for an increase in Treatment effect of the liposome dosage form of Anticancer drugs beneficial.

Dementsprechend ist es ein Ziel der Erfindung, Liposomen- Zusammensetzungen bereitzustellen, die sich durch gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Zusammensetzungen durch verbesserte Eigenschaften auszeichnen.Accordingly, it is an object of the invention to provide liposome To provide compositions that differ from the compositions known from the prior art distinguish improved properties.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch Bereitstellung von Zusammensetzungen und insbesondere von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die wirkstoffeinkapselnde Liposomen umfassen und die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Aggregation dieser Liposome durch langkettige Polymer-Lipid-Konjugate vorgebeugt wird, so daß die Integrität dieser Liposome und also auch die Lagerstabilität der obigen Zusammensetzungen erhöht werden können.The object of the invention is achieved by providing Compositions and in particular pharmaceuticals Compositions comprising drug encapsulating liposomes and which are characterized in that the aggregation of these Liposomes prevented by long-chain polymer-lipid conjugates is so that the integrity of these liposomes and thus the Storage stability of the above compositions can be increased can.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, wobei dieses Verfahren die Schritte umfaßt:
The invention therefore relates to a process for the preparation of a pharmaceutical composition which comprises liposomes which encapsulate active substances, which process comprises the steps:

1. encapsulation of the active ingredients in liposomes; and
2. Add from 0.01 to 1.0 mole percent polyalkyl ether lipid with a molecular weight of 200 to 2000 daltons Product from step (1) and left standing over one reasonable period of time to achieve the effect aggregation and precipitation of the liposomes prevent.

Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
The invention further relates to a method for producing a pharmaceutical composition which comprises liposomes which encapsulate active substances, the method comprising the steps:

1. Prepare liposomes with lipid that is 0.01 to 1.0 Mol .-% of a polyalkyl ether lipid with a Contains molecular weight from 200 to 2000 daltons; and
2. Encapsulation of active ingredients in the in step (1) obtained liposomes to thereby achieve the effect aggregation and precipitation of the liposomes prevent.

1. Add from 0.01 to 1.0 mole% of one Polyalkyl ether lipids with a molecular weight of 200 to 2000 daltons after making these liposomes and Allowing to stand for a reasonable period of time; and
2. Encapsulation of active ingredients in the in step (1) obtained liposomes to thereby achieve the effect aggregation and precipitation of the liposomes prevent.

Brief description of the drawings

Die Erfindung sowie ihre vielen Vorteile können anhand der folgenden ausführlichen Beschreibungen und Zeichnungen besser verstanden werden, wobei:The invention and its many advantages can be seen from the following detailed descriptions and drawings better can be understood, whereby:

Fig. 1 den Effekt der Zugabe von Polyalkyletherlipiden in verschiedenen Verhältnissen auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln, über 7 Tage (A), (B) zeigt. Fig. 1 shows the effect of adding polyalkyl ether lipids in various ratios on the aggregation and precipitation of liposomes encapsulating ammonium sulfate over 7 days (A), (B).

Fig. 2 den Effekt der Zugabe von Polyalkyletherlipiden in verschiedenen Verhältnissen auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Doxorubicin einkapseln, über einen Tag zeigt. Fig. 2 shows the effect of adding polyalkyl ether lipids in various proportions on the aggregation and precipitation of liposomes encapsulating doxorubicin over a day.

Fig. 3 den Effekt der Zugabe von Polyalkyletherlipiden in verschiedenen Verhältnissen auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Topotecan einkapseln, über drei Tage zeigt. Fig. 3 shows the effect of adding polyalkyl ether lipids in various ratios on the aggregation and precipitation of liposomes encapsulating topotecan over three days.

Wie oben dargelegt wird, werden in der Erfindung Zusammensetzungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, bereitgestellt, die Liposomen, die einen Wirkstoff einkapseln, umfassen und die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Aggregation dieser Liposome durch langkettige Polymer-Lipid-Konjugate vorgebeugt wird, so daß die Integrität dieser Liposome und also auch die Lagerstabilität der obigen Zusammensetzungen erhöht werden können.As set forth above, in the invention Compositions, especially pharmaceuticals Compositions provided that contain liposomes Encapsulate the active ingredient, encompass and characterized are that the aggregation of these liposomes by long chain Polymer-lipid conjugate is prevented so that the integrity these liposomes and thus the storage stability of the above Compositions can be increased.

Die in der Erfindung verwendeten Konjugate aus langkettigem Polymer-Lipid werden als Polyalkyletherlipid bezeichnet. Obwohl die Verwendung von Polyalkyletherlipiden bei der Herstellung von Arzneimitteln zugelassen ist, ist es noch unklar, ob sie bei einer Langzeitbehandlung zu Nebenwirkungen führen können. Es ist daher ein wichtiger Punkt der Erfindung, daß die Stabilität der Liposome auch bei niedrigem Gehalt an diesen Verbindungen beibehalten werden kann. Aus von mit Polyalkyletherlipiden unterschiedlicher Molekulargewichte erhaltenen Versuchsergebnissen geht hervor, daß die Zugabe nur einer geringen Menge von Polyalkyletherlipiden ausreicht, um die Aggregation und die Präzipitation von Liposomen effektiv zu hemmen, und je höher die verwendete Menge war, umso größer war der Effekt der Inhibierung.The long chain conjugates used in the invention Polymer lipids are referred to as polyalkyl ether lipids. Even though the use of polyalkyl ether lipids in the manufacture of medicinal products, it is still unclear whether they are long-term treatment can lead to side effects. It is therefore an important point of the invention that the Stability of the liposomes even with a low content of these Connections can be maintained. Out of with Polyalkyl ether lipids of different molecular weights Test results obtained show that the addition only a small amount of polyalkyl ether lipids is sufficient to the aggregation and precipitation of liposomes effectively inhibit, and the higher the amount used, the greater the effect of inhibition.

Das Polyalkyletherlipid, das in der Erfindung verwendet wird, umfaßt einen Polyalkyletheranteil sowie einen Lipidanteil. Der Polyalkyletheranteil kann Polyethylenglycol und ähnliche Polymere wie Polymethylethylenglycol, Polypropylenglycol, Polyhydroxylpropylenglycol, Polymethylpropylenglycol, Polyhydroxylpropylenoxid, Polyethylen/Polypropylenglycol und dergleichen mit einem Molekulargewicht von 200 bis 20.000 Dalton einschließen. Der Lipidanteil schließt in umfassender Weise jedes Molekül ein, das kovalent mit dem Polyalkylether binden kann, wobei ein Produkt mit einem hydrophilen Ende und mit einem lipophilen Ende, das sich in die Lipiddoppelschicht einlagern kann, gebildet wird.The polyalkyl ether lipid used in the invention includes a polyalkyl ether portion and a lipid portion. The Polyalkyl ether portion can be polyethylene glycol and the like Polymers such as polymethylethylene glycol, polypropylene glycol, Polyhydroxy propylene glycol, polymethyl propylene glycol, Polyhydroxyl propylene oxide, polyethylene / polypropylene glycol and the like with a molecular weight of 200 to 20,000 Include Dalton. The lipid content closes in a comprehensive way Assign each molecule that is covalent to the polyalkyl ether can bind, being a product with a hydrophilic end and with a lipophilic end that extends into the lipid bilayer can store, is formed.

In Ausführungsformen der Erfindung wurde anhand von Liposomen, die jeweils Ammoniumsulfat, Doxorubicin oder Topotecan einkapseln, gezeigt worden, daß durch Zugabe einer äußerst geringen Menge, zum Beispiel 0,2 Mol.-%, Polyalkyletherlipide (Derivate mit 2.000 Molekulargewicht), die Geschwindigkeit der Aggregation sowie der Präzipitation der Liposome verringert werden konnte. Wurden Derivate mit einem Molekulargewicht von mehr als 5.000 verwendet, können nur 0,6 Mol.-% davon die Präzipitation über sechs Monate gänzlich verhindern. Demnach wird angenommen, daß eine niedrige Dosierung, z. B. 0,01-1 Mol.-% Polyalkyletherlipid die Stabilität von Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, erhöhen kann und die Haltbarkeit von Liposomprodukten, die Wirkstoffe einkapseln, auf mehr als ein Jahr verlängern kann.In embodiments of the invention using liposomes, each of ammonium sulfate, doxorubicin or topotecan encapsulate, has been shown that by adding an extremely small amount, for example 0.2 mol%, polyalkyl ether lipids (Derivatives with 2,000 molecular weight), the speed of Aggregation and precipitation of the liposomes decreased could be. Were derivatives with a molecular weight of more than 5,000 used, only 0.6 mol% of which can Prevent precipitation completely over six months. Therefore it is believed that a low dosage, e.g. B. 0.01-1 mol% Polyalkyl ether lipid the stability of liposomes Encapsulate active ingredients, can increase and the durability of Liposome products that encapsulate active ingredients on more than one Year can extend.

Dies kann anhand der in Abb. 1(A) und Abb. 1(B), sowie in Abb. 2 und Abb. 3 gezeigten Ausführungsformen, deren Verfahren und Daten unten in Beispielen und Tabellen veranschaulicht werden werden, gezeigt werden.This can be shown by the embodiments shown in Fig. 1 (A) and Fig. 1 (B), as well as in Fig. 2 and Fig. 3, the methods and data of which are illustrated below in examples and tables.

Bezugnehmend auf Abb. 1(A) wurden von rechts nach links jeweils 0 Mol.-%, 0,2 Mol.-%, 0,6 Mol.-% bzw. 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE zugegeben, während in Abb. 1(B) von rechts nach links jeweils 0 Mol.-%, 0,2 Mol.-%, 0,6 Mol.-% bzw. 0,99 Mol.-% PEG5000-DSPE zugegeben wurden. In Abb. 1(A) wird bei Vergleich der Ergebnisse, die bei Zugabe dreier Liposomgruppen, d. h. 0,2 Mol.-%, 0,6 Mol.-% und 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE, erhalten werden, mit dem ohne Zugabe von PEG2000-DSPE, d. h. 0% PEG-PE, ersichtlich, daß ein Zusatz von kürzerkettigem PEG-DSPE die Aggregation und die Präzipitation von Ammoniumsulfat- einkapselnden Liposomen vermindern kann. Demgegenüber wird in Abb. 1(B) ersichtlich, daß ein Zusatz von PEG5000-DSPE in einer Menge von mehr als 0,6 Mol.-% die Aggregation und Präzipitation Ammoniumsulfat-einkapselnder Liposome gänzlich verhindern kann.Referring to Fig. 1 (A), 0 mol%, 0.2 mol%, 0.6 mol% and 0.99 mol% of PEG2000-DSPE were added from right to left, respectively in Fig. 1 (B) 0 mol%, 0.2 mol%, 0.6 mol% and 0.99 mol% of PEG5000-DSPE were added from right to left, respectively. In Fig. 1 (A), when comparing the results obtained by adding three liposome groups, ie 0.2 mol%, 0.6 mol% and 0.99 mol% PEG2000-DSPE, with that without the addition of PEG2000-DSPE, ie 0% PEG-PE, it can be seen that the addition of shorter-chain PEG-DSPE can reduce the aggregation and the precipitation of ammonium sulfate-encapsulating liposomes. In contrast, in Fig. 1 (B) it can be seen that the addition of PEG5000-DSPE in an amount of more than 0.6 mol% can completely prevent the aggregation and precipitation of ammonium sulfate-encapsulating liposomes.

Bezugnehmend auf Abb. 2 wurden von rechts nach links jeweils 0 Mol.-%, 0,2 Mol.-%, 0,6 Mol.-% bzw. 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE zugegeben. Es wird ersichtlich, dass die Zugabe von Liposomen, die das Antikrebsmittel Doxorubicin einkapseln, in einer Menge von mehr als 0,2 Mol.-% PEG2000-DSPE die Aggregation und die Präzipitation der Doxorubicin-einkapselnden Liposomen effektiv verhindern kann.Referring to Fig. 2, 0 mol%, 0.2 mol%, 0.6 mol% and 0.99 mol% of PEG2000-DSPE were added from right to left, respectively. It can be seen that the addition of liposomes encapsulating the anti-cancer agent doxorubicin in an amount of more than 0.2 mol% PEG2000-DSPE can effectively prevent the aggregation and precipitation of the doxorubicin encapsulating liposomes.

Bezugnehmend auf Abb. 3 wurden von rechts nach links jeweils 0 Mol.-%, 0,2 Mol.-% PEG2000-DSPE, 0,6 Mol.-% PEG2000-DSPE, 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE, 0,2 Mol.-% PEG5000-DSPE, 0,6 Mol.-% PEG5000-DSPE bzw. 0,99 Mol.-% PEG5000-DSPE zugegeben. Bei den Liposomen, die das Antikrebsmittel Topotecan einkapseln, wurde drei Tage nach Zugabe von PEG-PE nur eine geringe Präzipitation beobachtet, wenn nur jeweils 0,2 Mol.-% und 0,6 Mol.-% PEG2000- DSPE bzw. 0,2 Mol.-% PEG5000-DSPE hinzugegeben wurden, und es wurde keine Aggregation und Präzipitation beobachtet, wenn jeweils 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE, 0,6 Mol.-% PEG5000-DSPE bzw. 0,99 Mol.-% PEG5000-DSPE hinzugegeben wurden.Referring to Fig. 3, 0 mol%, 0.2 mol% PEG2000-DSPE, 0.6 mol% PEG2000-DSPE, 0.99 mol% PEG2000-DSPE, 0.2 mol% PEG5000-DSPE, 0.6 mol% PEG5000-DSPE or 0.99 mol% PEG5000-DSPE were added. With the liposomes encapsulating the anti-cancer agent topotecan, only little precipitation was observed three days after the addition of PEG-PE, if only 0.2 mol% and 0.6 mol% PEG2000-DSPE or 0, 2 mol% of PEG5000-DSPE was added, and no aggregation and precipitation was observed when 0.99 mol% of PEG2000-DSPE, 0.6 mol% of PEG5000-DSPE and 0.99 mol, respectively. -% PEG5000-DSPE were added.

Bei neutralen Liposomen mit einer Partikelgröße von weniger als 100 nm, die Doxorubicin oder Topotecan einkapseln, konnte die Zugabe von 0,9 Mol.-% PEG5000-DSPE die Aggregation und Präzipitation von Liposomen verhindern, die Stabilität von Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, erhöhen, sowie die effektive Lebensdauer von Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, auf mehr als ein Jahr verlängern.For neutral liposomes with a particle size of less than 100 nm, which encapsulate doxorubicin or topotecan, could Addition of 0.9 mol% PEG5000-DSPE the aggregation and Precipitation of liposomes prevent the stability of Liposomes that encapsulate active ingredients increase, as well as effective lifespan of liposomes that encapsulate active ingredients, extend to more than a year.

Die in der Erfindung verwendeten Wirkstoffe sind z. B. 1-beta-D- Arabinofuranosylcytosin, Cytosinarabinosid, cis- Diaminochlorplatin, Platinanaloga, Doxorubicin, Daunorubicin, Vicristin, Vinblastin, Navelbin, Antifolate, Taxol, Topotecan, Mitomycin C oder Camptothecin.The active ingredients used in the invention are e.g. B. 1-beta-D- Arabinofuranosylcytosine, cytosine arabinoside, cis- Diaminochloroplatinum, platinum analogues, doxorubicin, daunorubicin, Vicristin, Vinblastin, Navelbin, Antifolate, Taxol, Topotecan, Mitomycin C or camptothecin.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, umfassen, bereitgestellt, wobei dieses Verfahren die Schritte umfaßt:
In another embodiment of the invention, there is provided a method of making pharmaceutical compositions comprising liposomes that encapsulate active ingredients, which method comprises the steps of:

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfassen, bereitgestellt, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst:
In a further embodiment of the invention, a method for producing pharmaceutical compositions comprising liposomes that encapsulate active substances is provided, said method comprising the steps:

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfassen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
In a further embodiment of the invention there is provided a process for the preparation of pharmaceutical compositions comprising liposomes that encapsulate active ingredients, the process comprising the steps of:

Wie erwähnt, kann die Zugabe von Polyalkyletherlipid gemäß der Erfindung sowohl während als auch nach der Herstellung der Liposome als auch nach der Einkapselung der Wirkstoffe in die Liposomen durchgeführt werden.As mentioned, the addition of polyalkyl ether lipid according to the Invention both during and after the manufacture of the Liposomes as well as after encapsulating the active ingredients in the Liposomes are performed.

Die Erfindung wird in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen veranschaulicht.The invention is set out in the following, non-limiting Examples.

example 1 Production of liposomes containing ammonium sulfate encapsulate

Ein Liposom mit einer einzelnen Schicht wurde mittels eines üblichen Verfahrens zur Hydratisierung dünner Schichten und wiederholter Extrusion hergestellt.A single layer liposome was isolated using a usual method for hydrating thin layers and repeated extrusion.

Dipalmitoylphosphatidylcholin, (DPPC), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Cholesterin (Chol) wurden in Chloroform in unterschiedlichen Molverhältnissen aufgelöst, z. B. Distearoylphosphatidylcholin : Cholesterin = 3 : 2, oder Dipalmitoylphosphatidylcholin : Cholesterin = 3 : 2 Molverhältnis. Nach innigem Mischen wurde das Lösungsmittel in einem Trockner bei verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit 150 mM Ammoniumsulfat [(NH₄)₂SO₄] pH 5,0 bei 55°C hydratisiert. Die homogene, gemischte Lösung wurde wiederholt fünfmal mit flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Wasserbad aufgetaut, und wurde dann mittels eines Extruders bei einer Temperatur von unter 60°C jeweils fünfmal mit einer 0,1 µm Polycarbonatmembran und mit einer 0,05 µm Filtermembran gefiltert.Dipalmitoylphosphatidylcholine, (DPPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC) and cholesterol (Chol) were dissolved in chloroform in different molar ratios, e.g. B. Distearoylphosphatidylcholine: cholesterol = 3: 2, or Dipalmitoylphosphatidylcholine: cholesterol = 3: 2 molar ratio. After thorough mixing, the solvent was removed in a dryer under reduced pressure and the residue was hydrated with 150 mM ammonium sulfate [(NH ₄ ) ₂ SO ₄ ] pH 5.0 at 55 ° C. The homogeneous, mixed solution was repeatedly frozen five times with liquid nitrogen and thawed in a water bath, and was then filtered five times with an extruder at a temperature of below 60 ° C. in each case five times with a 0.1 μm polycarbonate membrane and with a 0.05 μm filter membrane .

Example 2 Production of liposomes called doxorubicin encapsulate

Das außerhalb der Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln, befindliche Ammoniumsulfat wurde auf Sephadex G-50 (Pharmacia) entfernt. Dann wurde 1 mg Doxorubicin pro 10 µMol Phospholipid zugegeben, auf 60°C erhitzt, und bei 100 UpM für 30 Minuten geschüttelt. Danach wurde für 3 Minuten mit Eis schnell gekühlt. Nach dem Aufwärmen wurde das außerhalb der Liposomen befindliche Doxorubicin auf einer Molekularsiebkolonne durch Eluieren mit 100 mM HEPES, 144 mM NaCl, pH 7,2 oder mit 0,9% NaCl-Lösung entfernt. Um die Herstellung der gewünschten Liposomen zu vervollständigen, wurden die liposomhaltigen Fraktionen gesammelt. Es wird bevorzugt, die so erhaltenen Liposome durch eine 0,22 µm Filtermembran zu filtern und Argon hineinzuleiten, um deren Lagerung zu erleichtern. The outside of the liposomes that encapsulate ammonium sulfate, ammonium sulfate was on Sephadex G-50 (Pharmacia) away. Then 1 mg of doxorubicin per 10 µmol of phospholipid added, heated to 60 ° C, and at 100 rpm for 30 minutes shaken. After that, ice was quick for 3 minutes chilled. After warming up, it became outside the liposomes located doxorubicin on a molecular sieve column Elute with 100 mM HEPES, 144 mM NaCl, pH 7.2 or with 0.9% NaCl solution removed. To produce the desired one To complete liposomes were the liposome-containing ones Fractions collected. It is preferred to obtain the so obtained Filter liposomes through a 0.22 µm filter membrane and argon in order to facilitate their storage.

Example 3 Production of liposomes that encapsulate topotecan

Das außerhalb der Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln, befindliche Ammoniumsulfat wurde auf Sephadex G-50 (Pharmacia) entfernt. Dann wurde 1 mg Topotecan pro 10 µMol Phospholipid zugegeben, auf 60°C erhitzt und bei 100 UpM für 30 Minuten geschüttelt. Danach wurde für 3 Minuten mit Eis schnell gekühlt. Nach dem Aufwärmen wurde das außerhalb der Liposomen befindliche Topotecan auf einer Molekularsiebkolonne durch Eluieren mit 100 mM HEPES, 144 mM NaCl, pH 7,2 oder mit 0,9% NaCl-Lösung entfernt. Um die Herstellung der gewünschten Liposomen zu vervollständigen, wurden die liposomhaltigen Fraktionen gesammelt. Es wird bevorzugt, die so erhaltenen Liposome durch eine 0,22 µm Filtermembran zu filtern und Argon hineinzuleiten, um deren Lagerung zu erleichtern.The outside of the liposomes that encapsulate ammonium sulfate, ammonium sulfate was on Sephadex G-50 (Pharmacia) away. Then 1 mg topotecan per 10 µmol phospholipid added, heated to 60 ° C and at 100 rpm for 30 minutes shaken. After that, ice was quick for 3 minutes chilled. After warming up, it became outside the liposomes Topotecan located on a molecular sieve column Elute with 100 mM HEPES, 144 mM NaCl, pH 7.2 or with 0.9% NaCl solution removed. To produce the desired one To complete liposomes were the liposome-containing ones Fractions collected. It is preferred to obtain the so obtained Filter liposomes through a 0.22 µm filter membrane and argon in order to facilitate their storage.

Example 4 Influence of polyalkyl ether lipid with different salary and with different Molecular weight on the storage stability of the liposomes

Zu drei Liposomarten, die Ammoniumsulfat, Doxorubicin und Topotecan einkapseln, wurden jeweils 0, 0,2, 0,6, und 0,99 Mol.-% eines von Polyethylenglycol abgeleitetem Distearoylphosphatidylcholinethanolamins (Derivat des Polyalkyletherteiles mit einem Molekulargewicht von 2.000 oder 5.000, Genzyme, England) zugegeben, und die erhaltenen Lösungen wurden für 24 Stunden bei 37°C und danach bei 4°C gelagert. Danach wurden die Grade der Aggregation und der Präzipitation zu unterschiedlichen Zeitpunkten beobachtet, und die noch nicht abgesetzten Suspensionen wurden zur Bestimmung des jeweiligen Phospholipidrestanteils entfernt. To three types of liposomes, the ammonium sulfate, and doxorubicin Encapsulating Topotecan was 0, 0.2, 0.6, and 0.99, respectively Mol .-% of a derived from polyethylene glycol Distearoylphosphatidylcholineethanolamine (derivative of the Polyalkyl ether part with a molecular weight of 2,000 or 5,000, Genzyme, England) and the solutions obtained were stored at 37 ° C for 24 hours and then at 4 ° C. After that, the degrees of aggregation and precipitation observed at different times, and not yet Suspended suspensions were used to determine each Removed phospholipid portion.

Tabelle 1 Table 1

Einfluß der Zugabe unterschiedlicher Anteile von Polyalkyletherlipid auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln Influence of the addition of different proportions of polyalkyl ether lipid on the aggregation and precipitation of liposomes encapsulating ammonium sulfate

Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass, je größer die Menge des Polyalkyllipid mit einem Polyalkyletherrest mit einem höheren Molekulargewicht für ein Liposom, das Ammoniumsulfat einkapselt, ist, die Aggregation und Präzipitation der Liposome weiter reduziert werden können. Bei Zugaben von 0,6 Mol.-% und 0,99 Mol.-% an PEG5000-DSPE können die so erhaltenen Liposome bei 4°C für mehr als 200 Tage stabil gehalten werden, ohne dass Aggregation oder Präzipitation auftreten. The results in Table 1 show that the larger the amount of the polyalkyl lipid with a polyalkyl ether residue with a higher molecular weight for a liposome, the ammonium sulfate encapsulates, is the aggregation and precipitation of the liposomes can be further reduced. With additions of 0.6 mol% and 0.99 mol% of PEG5000-DSPE can the liposomes thus obtained kept stable at 4 ° C for more than 200 days without Aggregation or precipitation occur.

Tabelle 2 Table 2

Einfluß der Zugabe unterschiedlicher Anteile von Polyalkyletherlipid auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Doxorubicin einkapseln Influence of the addition of different proportions of polyalkyl ether lipid on the aggregation and precipitation of liposomes encapsulating doxorubicin

Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigten, dass die Eigenschaften von Liposomen, die Doxorubicin einkapseln, denen der Liposome, die Ammoniumsulfat einkapseln, ähnlich waren, dass, je größer die Menge des Polyalkyllipids mit einem Polyalkyletherrest mit einem höheren Molekulargewicht ist, die Aggregation und Präzipitation der Liposome weiter reduziert werden können. Bei Zugaben von 0,99 Mol.-% des PEG5000-DSPE können die so erhalte nen Liposome bei 4°C für mehr als 90 Tage stabil gehalten werden, ohne dass Aggregation oder Präzipitation auftreten.The results in Table 2 showed that the properties of Liposomes that encapsulate doxorubicin, those of liposomes that Encapsulate ammonium sulfate, similar were that the larger the Amount of polyalkyl lipid with a polyalkyl ether residue is a higher molecular weight, the aggregation and Precipitation of the liposomes can be further reduced. At Additions of 0.99 mol% of the PEG5000-DSPE can be obtained in this way NEN liposomes kept stable at 4 ° C for more than 90 days without aggregation or precipitation.

Example 5 Determination of the recovery of liposomes

Da das Material, das bei der Herstellung von Liposomen verwendet wird (DSPC), ein Phospholipid ist und eine einzige Phosphatgruppe pro Molekül besitzt, kann die Bestimmung des Gehaltes an Phosphatgruppen in der Lösung gleichzeitig die Konzentration der Lipide in der Liposomlösung liefern. Wir haben die Phosphatgruppe mittels des Bartlett-Verfahrens (Bartlett, 1959) wie folgt gemessen: Eine geeignete Menge der zu untersuchenden Probe und 0, 20, 40, und 80 µl standardisierter Phosphatlösung (Phosphorstandard, 6,5 mmol/ml, Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) wurden jeweils in Teströhrchen gegeben. In jedes Teströhrchen wurden 400 µl einer 10 N H₂SO₄ (Merck, NJ, USA) gegeben und innig gemischt. Die Reaktionen wurden in einem Teströhrchentrockenbad bei 170°C für 30 Minuten durchgeführt. Die Teströhrchen wurden entnommen und abgekühlt. In jedes Teströhrchen wurden 100 µl 9% H₂O₂ gegeben, und erneut im Teströhrchentrockenbad bei 170°C für 30 Minuten umgesetzt. Danach wurden die Teströhrchen entnommen und abgekühlt, gefolgt von der Zugabe von 4,6 ml 0,22% Ammoniummolybdat. Unter Schütteln in einem Vortex wurden 100 µl 15% Ascorbinsäure durch die jeweilige Öffnung des Teströhrchens gegeben und in kochendem Wasser bei 100°C für 10 Minuten gekocht. Nach Entnahme und Abkühlen wurde das Absorptionsvermögen bei 830 nm mit einem Spektralphotometer (Ultraspec III, Pharmacia, Schweden) gemessen. Die so erhaltenen Meßergebnisse wurden mit einer positiven Vergleichsprobe einer linearen Regressionsanalyse unterzogen, um den Phosphoranteil in der zu untersuchenden Probe und daraus abgeleitet die Lipidkonzentration in der Liposomlösung zu bestimmen.
Since the material used in the manufacture of liposomes (DSPC) is a phospholipid and has a single phosphate group per molecule, the determination of the content of phosphate groups in the solution can simultaneously provide the concentration of the lipids in the liposome solution. We measured the phosphate group using the Bartlett method (Bartlett, 1959) as follows: A suitable amount of the sample to be examined and 0, 20, 40 and 80 μl of standardized phosphate solution (phosphorus standard, 6.5 mmol / ml, Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) were each placed in test tubes. 400 μl of a 10 NH ₂ SO ₄ (Merck, NJ, USA) were added to each test tube and mixed intimately. The reactions were carried out in a test tube dry bath at 170 ° C for 30 minutes. The test tubes were removed and cooled. 100 .mu.l of 9% H ₂ O _{2 were} added to each test tube and reacted again in the test tube dry bath at 170.degree. C. for 30 minutes. Thereafter, the test tubes were removed and cooled, followed by the addition of 4.6 ml of 0.22% ammonium molybdate. While shaking in a vortex, 100 µl of 15% ascorbic acid was passed through the respective opening of the test tube and boiled in boiling water at 100 ° C for 10 minutes. After removal and cooling, the absorbance at 830 nm was measured with a spectrophotometer (Ultraspec III, Pharmacia, Sweden). The measurement results obtained in this way were subjected to a linear regression analysis with a positive comparison sample in order to determine the phosphorus content in the sample to be examined and, from this, to determine the lipid concentration in the liposome solution.

Wiederfindung = (Lipidkonzentration in der untersuchten Probe/Lipidkonzentration vor Ablagerung der Liposome) × 100%. Recovery = (lipid concentration in the examined Sample / lipid concentration before deposition of the liposomes) × 100%.

Tabelle 3 Table 3

Einfluß der Zugabe verschiedener Anteile an Polyalkyletherlipid auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen und den Prozentsatz nicht abgelagerten Phospholipids (Liposome) zu ursprünglichem Phospholipid nach 3 Tagen Influence of the addition of various proportions of polyalkyl ether lipid on the aggregation and precipitation of liposomes and the percentage of non-deposited phospholipids (liposomes) to the original phospholipid after 3 days

Aus Tabelle 3 geht hervor, dass nach Aggregation und Präzipitation der Liposome die Zahl der in Lösung befindlichen Liposome vermindert wird und die Zugabe von 0,6 Mol.-% und 0,9 Mol.-% PEG5000-DSPE eine vollständige Suspension der Liposome in der Lösung ohne Präzipitation herbeiführen kann.Table 3 shows that after aggregation and Precipitation of the liposomes the number of those in solution Liposomes is reduced and the addition of 0.6 mol% and 0.9 Mol .-% PEG5000-DSPE a complete suspension of the liposomes can bring about in the solution without precipitation.

Example 6 Analysis of the particle sizes of the liposomes

Die Analyse der Teilchengrößen der Liposomen wurde mit einem Teilchengrößenanalysator (N4 Plus, COULTER, USA) durchgeführt, der die Teilchengrößenverteilung der Liposomen auf Basis des Prinzips der Laserlichtstreuung bestimmt. Da sich jedes Liposom in einem Zustand freier Bewegung befindet, wenn es in Lösung suspendiert ist, wobei dieses Phänomen als Brownsche Bewegung bezeichnet wird, kann bei Bestrahlung mit Laserlicht das von Liposomen gestreute Licht vom Analysator nachgewiesen und danach in digitale Daten umgewandelt werden, die von einem Computer verarbeitet werden können, um dadurch die Verteilung und den Durchschnittswert der Teilchengröße der Liposomen zu erhalten. The analysis of the particle sizes of the liposomes was carried out with a Particle size analyzer (N4 Plus, COULTER, USA) carried out, which the particle size distribution of the liposomes based on the Principle of laser light scattering determined. Since every liposome is in a state of free movement when in solution is suspended, this phenomenon as Brownian motion is called, when irradiated with laser light that of Liposomes detected and scattered light from the analyzer then converted into digital data by a Computers can be processed, thereby reducing the distribution and the average value of the particle size of the liposomes receive.

Tabelle 4 Table 4

Einfluß der Zugabe verschiedener Anteile von Polyalkyletherlipid auf den Durchmesser von Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln Influence of the addition of different proportions of polyalkyl ether lipid on the diameter of liposomes encapsulating ammonium sulfate

Es ist aus Tabelle 4 ersichtlich, dass die Zugabe verschiedener Anteile an Polyalkyletherlipid mit unterschiedlicher Länge die Teilchengröße der Liposomen beeinflussen kann und dass der Durchmesser der Liposomen umso mehr steigt, je größer der zugegebene Anteil an Polyalkylether mit größerer Länge wird, was auf den Einschub von Polyalkylether in das Liposom hinweist.It can be seen from Table 4 that the addition of various Proportions of polyalkyl ether lipid with different lengths Particle size of the liposomes can affect and that the The larger the diameter of the liposomes, the more it increases added portion of polyalkyl ether of greater length, indicating the insertion of polyalkyl ether into the liposome indicates.

Erfindungsgemäß kann die Stabilität von Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, gesteigert werden und die effektive Lebensdauer von Liposomen auf mehr als ein Jahr verlängert werden.According to the invention, the stability of liposomes Encapsulate active ingredients, be increased and the effective Liposome lifespan extended to more than one year become.

Claims

1. A pharmaceutical composition comprising liposomes that encapsulate active ingredients, characterized in that the aggregation of these liposomes is effectively prevented by a long-chain polymer-lipid conjugate and the integrity of these liposomes and thus the storage stability of this composition can be increased.

2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the long-chain polymer-lipid conjugate Is polyalkyl ether lipid.

3. Pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the polyalkyl ether lipid is selected from the group which is made of polyethylene glycol, polymethylethylene glycol, Polypropylene glycol, polyhydroxypropylene glycol, Polymethylpropylene glycol, polyhydroxypropylene oxide and Polyethylene / polypropylene glycol.

4. Pharmaceutical composition according to one of the Claims 1 to 3, wherein the active ingredient from the group is selected from 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, Arabinoside, cis-diaminochloroplatinum, platinum analogues, doxorubicin, Daunorubicin, Vicristin, Vinblastin, Navelbin, Antifolate, Taxol, Topotecan, Mitomycin C and Camptothecin exist.

5. A process for the preparation of a pharmaceutical composition comprising liposomes encapsulating active ingredients, said process comprising the steps of:

1. encapsulation of the active ingredients in liposomes; and
2. Add 0.01 to 1.0 mole percent polyalkyl ether lipid having a molecular weight of 200 to 2000 daltons to the product of step (1) and let stand for an appropriate period of time to thereby achieve the effect of aggregation and precipitation to prevent the liposomes.

6. A method of making a pharmaceutical composition comprising liposomes encapsulating active ingredients, the method comprising the steps of:

1. Preparation of liposomes with lipid containing 0.01 to 1.0 mol% of a polyalkyl ether lipid with a molecular weight of 200 to 2000 daltons; and
2. Encapsulation of active substances in the liposomes obtained in step (1), in order to achieve the effect of preventing the aggregation and precipitation of the liposomes.

7. A method of making a pharmaceutical composition comprising liposomes encapsulating active ingredients, the method comprising the steps of:

1. Add from 0.01 to 1.0 mole percent of a polyalkyl ether lipid having a molecular weight of 200 to 2000 daltons after making these liposomes and allowing them to stand for a reasonable period of time; and
2. Encapsulation of active substances in the liposomes obtained in step (1), in order to achieve the effect of preventing the aggregation and precipitation of the liposomes.

8. The method according to any one of claims 5 to 7, wherein the Polyalkyl ether lipid is selected from the group consisting of Polyethylene glycol, polymethylethylene glycol, Polypropylene glycol, polyhydroxypropylene glycol, Polymethylpropylene glycol, polyhydroxypropylene oxide and Polyethylene / polypropylene glycol.

9. A method according to any one of claims 5 to 7, wherein the active ingredient is selected from the group consisting of 1-beta-D- Arabinofuranosylcytosine, arabinoside, cis-diaminochloroplatinum, Platinum analogs, doxorubicin, daunorubicin, vicristine, Vinblastine, Navelbin, Antifolate, Taxol, Topotecan, Mitomycin C and camptothecin.