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DE19913640A1 - Zusammensetzungen und Verfahren zur Vorbeugung der Aggregation von Liposomen - Google Patents

Zusammensetzungen und Verfahren zur Vorbeugung der Aggregation von Liposomen

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DE19913640A1
DE19913640A1 DE1999113640 DE19913640A DE19913640A1 DE 19913640 A1 DE19913640 A1 DE 19913640A1 DE 1999113640 DE1999113640 DE 1999113640 DE 19913640 A DE19913640 A DE 19913640A DE 19913640 A1 DE19913640 A1 DE 19913640A1
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Germany
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liposomes
lipid
pharmaceutical composition
glycol
aggregation
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DE1999113640
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Jui-Ching Cheng
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Taiwan Liposome Co Ltd
Original Assignee
Taiwan Liposome Co Ltd
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Publication date
Application filed by Taiwan Liposome Co Ltd filed Critical Taiwan Liposome Co Ltd
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Vorbeugung der Aggregation von Liposomen und insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Liposome mit darin eingeschlossenen Wirkstoffen umfassen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Aggregation dieser Liposome durch langkettige Polymer-Lipid-Konjugate verhindert wird, wodurch die Integrität dieser Liposome und daher auch die Lagerstabilität dieser Zusammensetzungen erhöht werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Vorbeugung der Aggregation von Liposomen, und insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfassen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass man der Aggregation dieser Liposome durch ein langkettiges Polymer- Lipid-Konjugat vorbeugt, so dass die Integrität dieser Liposome und so auch die Lagerstabilität der Zusammensetzungen erhöht werden können.
Liposome können aus vielen verschiedenen Arten von Lipidmolekülen bestehen. Präparate mit unterschiedlicher Zusammensetzung und unterschiedlichen Wirkstoffen können jeweils eigene Eigenschaften aufweisen. Bei einer Verbesserung der Dosisform ist die Auswahl des konstitutiven Moleküls der wichtigste Ausgangspunkt.
1965 haben Bangham et al. entdeckt, dass, wenn eine dünne Lipidschicht einer wässrigen Salzlösung zugegeben und geschüttelt wird, das Lipid dann kleine Perlen, die eine Eigenschaft der Durchlässigkeit aufweisen, bildet. 1968 nannten Sessa und Weissmann diese kleinen Perlen Liposome und gaben eine klare Definition, wonach das Liposom eine Mikromizelle ist, die aus einer bis einigen Schichten von Lipiddoppelschichten besteht.
Seit 1970 hat man das Liposom als gute Dosierungsform für den Transport von Wirkstoffen erkannt. Es wird aufgrund der folgenden Charakteristika als guter Wirkstoffeträger angesehen: Erstens ist das Liposom aus Phospholipiden aufgebaut, die eine Zusammensetzung haben, die der einer Zellmembran ähnlich ist und die im Organismus abgebaut werden kann, nicht giftig ist, keine Immunreaktion herbeiführen kann und die mehrfach verwendet werden kann; zweitens können die im Liposom eingekapselten Wirkstoffe langsam und mit einer kontrollierten Rate freigesetzt werden, und die Pharmakokinetik des Wirkstoffes kann variiert werden, um die Wirksamkeit der Wirkstoffebehandlung zu erhöhen; drittens können unerwünschte Nebenwirkungen hochgiftiger Wirkstoffe dadurch verringert werden, dass man diese in das Liposom einkapselt; und viertens besteht eine hohe Flexibilität hinsichtlich der Lipidzusammensetzung, der Partikelgröße, der Struktur, des Herstellungsverfahrens sowie der eingekapselten Wirkstoffe, so dass unterschiedlichen Anforderungen entsprochen werden können.
1975 kapselten Gregoriadis et al. Actinomycin D in Liposomen ein und verwendeten es zur Behandlung eines Lymphoms bei Ratten. Dabei wurde festgestellt, dass die Dosierungsform in Liposomenform das Leben dieser Ratten effektiv verlängern konnte. Seit dieser Zeit ist das Liposom nach und nach bei der Einkapselung von Antikrebswirkstoffen, wie zum Beispiel Methotrexat, Doxorubicin, 1-beta-D-Arabinofuranosylcytosin, Cytosinarabinosid, cis-Diamindichlorplatin und dergleichen verwendet worden, und man verwendete Produkte daraus bei Tiermodellen, wobei man als Ergebnisse fand, daß diese die Behandlungseffekte dieser Wirkstoffe erhöhen oder die Nebenwirkungen der Wirkstoffe vermindern konnten.
Anfangs konnten bei der Herstellung von Liposomen unter Verwendung von Phospholipiden aufgrund technischer Einschränkungen nur große (einige Mikron große) Liposomen, die aus einer Multilayer von Membranen aufgebaut sind, das heißt ein multilamellares Vesikel (MLV) mit einem Durchmesser von 1-10 Mikron, mittels eines Verfahrens zur Hydratisierung dünner Lipidschichten hergestellt werden. Aufgrund des geringen Wassergehaltes zwischen den Lipiddoppelschichten waren solche Liposomen nicht zur Einkapselung wasserlöslicher Wirkstoffe geeignet und hatten daher nur begrenzte Anwendungsmöglichkeiten.
Einige Jahre später konnten Forscher infolge der Entwicklung der Beschallung, der Lösungsmittelinjektion sowie der Detergensdialyse kleine Liposome (20-200 nm Durchmesser), die aus einer einzigen Lipiddoppelschicht bestehen, herstellen. Ein solch kleines Liposom wurde oft als Modell für Biomembranen ohne Membranprotein oder zum Einkapseln wasserlöslicher Wirkstoffe verwendet. Dessen Partikelgröße war jedoch nicht einheitlich, so daß das die Herstellung medizinischer Wirkstoffe nicht begünstigte.
Da das Herstellungsverfahren verbessert worden ist, können gegenwärtig Liposome, die aus einer einzigen Lipiddoppelschicht bestehen und die eine einheitliche Größe haben, mittels der oben genannten Verfahren in Kombination mit der Filtermembranextrusion, wobei die Partikelgröße von der Porengröße der Filtermembran bestimmt wird, hergestellt werden. Ein solches Verfahren kann in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden und ist für die Massenproduktion geeignet.
Zusätzlich zu Herstellungsverfahren verwendete man bei der anfänglichen Herstellung von Liposomen oft natürliche Lipide als Rohstoffe. Im allgemeinen enthalten natürliche Lipide ein negativ geladenes Phospholipid wie zum Beispiel Phosphatidylinosotol, Phosphatidylserin, Cardiolipin oder dergleichen, die den so hergestellten Liposomen eine negative Ladung verleihen. Solche negativ geladenen Liposome sind dem abgebauten Teilchen, das nach der Apoptose einer Zelle gebildet wird, sehr ähnlich, so daß die in den Blutkreislauf injizierten Liposome von dem mononuklearen phagozytischen System (MPS), das in Organen wie der Leber, der Milz oder dergleichen vorkommt und auch als das Retikuloendothelialsystem (RES) bezeichnet wird, sofort phagozytiert werden.
Anfängliche Liposome konnten folglich Wirkstoffe bis zu den oben genannten Organen bringen, so daß ihre Anwendung auf einen solch kleinen Bereich beschränkt war. Ein solches Liposom konnte Wirkstoffe nur zu Phagozyten wie einem Makrophagen bringen, und die Anwendung beschränkte sich auf die Behandlung solcher Krankheiten wie Leishmaniasis, die nur bis zu Phagozyten infiziert.
Überdies können Lipoproteine hoher Dichte (HDL) das Phospholipid, das sich in den aus natürlichen Lipiden bestehenden Liposomen befindet, entfernen, was die Liposome zusammenstürzen und die in den Liposomen eingekapselten Wirkstoffe weiter ausströmen läßt, so daß die Halbwertszeit der Wirkstoffzirkulation beeinträchtigt wird.
Um den Anwendungsbereich des im Liposom transportierten Wirkstoffes zu erweitern, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung nach langjähriger Untersuchung gefunden, daß die Zirkulationszeit des im Liposom eingekapselten Wirkstoffes im Blut von den folgenden Faktoren beeinflußt werden kann: (1) aus neutralen Lipiden hergestellte Liposome sind gegenüber Entfernung durch das Retikuloendothelialsystem weniger anfällig; (2) Liposome mit kleinerer Partikelgröße sind gegenüber Entfernung weniger anfällig; (3) Liposome, die aus einem Lipid mit einer hohen Übergangstemperatur, wie Distearoylphosphatidylcholin, bestehen und die einen hohen Cholesterinanteil haben, sind stabiler; und (4) Schutz der Oberfläche von Liposomen durch Polyalkylether kann deren Entfernungsrate im Blut verlangsamen. Daher kann die Herstellung von Liposomen, die einen Durchmesser von 20 bis 100 nm haben, und die aus Lipiden, die eine hohe Übergangstemperatur sowie einen hohen Cholesterinanteil (zum Beispiel Distearoylphosphatidylcholin : Cholesterin = 3 : 2 Molverhältnis) haben, bestehen, die Halbwertszeit der Liposome im Blutkreislauf steigern. Außerdem können Liposome von dieser Größe durch die durchlässigen Poren der neonatalen Zellwand des Tumors dringen, so daß sich Liposome, die Antikrebsmittel enthalten, in einer großen Menge im Tumor ansammeln können und somit deren Behandlungseffekt erhöhen.
Da das Retikuloendothelialsystem Liposome, die eine große Partikelgröße haben, sowie Liposome, die negativ geladen sind, schneller entfernen kann, fördert die Herstellung neutraler Liposome, die eine Partikelgröße von weniger als 100 nm haben, überdies eine Zunahme der Zirkulationszeit für den Wirkstoff im Blut, so daß die Partikelgröße zu einer sehr wichtigen Eigenschaft von Liposomprodukten wird. Neutrale Liposome können aufgrund ihrer Kolloideigenschaft aggregieren, was zu einer Präzipitation von großen Teilchen führt. Änderungen in der Partikelgröße könnten die Pharmakokinetik von Wirkstoffen im Blut und somit den Behandlungseffekt der Wirkstoffe beeinflussen. Darüberhinaus kann die durch Aggregation der Partikel hervorgerufene Präzipitation die Wirkzeit des Wirkstoffes verkürzen.
Die Zugabe einer kleinen Menge von Polyalkyletherlipid zu den Liposomzubereitungen kann die Aggregation der Liposome und somit deren Präzipitationsrate vermindern. Zum Beispiel kann die Zugabe von, von Polyethylenglykol (durchschnittliches Molekulargewicht 5.000) abgeleitetem Distearoylphosphatidyl­ ethanolamin (PEG-DSPE) in einer Menge von mehr als 0,6 Mol.-% der Liposomlipide die Aggregation und Präzipitation der Liposome vollständig verhindern.
Außerdem betraf die US 5013556 die Zugabe von 1-20 Mol.-% Polyalkylether, um die Zirkulationszeit der Liposome im Blut zu erhöhen und somit die Wirkung der Wirkstoffe zu erhöhen. Einige Versuchsdaten haben aber erkennen lassen, daß, wenn Liposome, die einen Durchmesser von 50 bis 100 nm haben und die ein Lipid mit einer hohen Übergangstemperatur sowie mit einem hohen Cholesterinanteil (zum Beispiel Distearoylphosphatidylcholin : Cholesterin = 3 : 2 Molverhältnis) umfassen, verwendet werden, um den Antikrebswirkstoff Doxorubicin einzukapseln, die Verwendung einer großen Menge Polyalkylether, um die Zirkulationszeit des Liposoms im Blut zu erhöhen, die Akkumulation dieses Antikrebswirkstoffes im Bereich des Tumors vermindern kann.
Eine Verringerung des Polyalkyletheranteils (< 1 Mol.-%) ist also wünschenswert und ist darüber hinaus für eine Erhöhung des Behandlungseffektes der Liposomdosierungsform von Antikrebsmitteln vorteilhaft.
Dementsprechend ist es ein Ziel der Erfindung, Liposomen- Zusammensetzungen bereitzustellen, die sich durch gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Zusammensetzungen durch verbesserte Eigenschaften auszeichnen.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch Bereitstellung von Zusammensetzungen und insbesondere von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die wirkstoffeinkapselnde Liposomen umfassen und die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Aggregation dieser Liposome durch langkettige Polymer-Lipid-Konjugate vorgebeugt wird, so daß die Integrität dieser Liposome und also auch die Lagerstabilität der obigen Zusammensetzungen erhöht werden können.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, wobei dieses Verfahren die Schritte umfaßt:
  • 1. Einkapseln der Wirkstoffe in Liposome; und
  • 2. Zugeben von 0,01 bis 1,0 Mol.-% Polyalkyletherlipid mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton zu dem Produkt aus Schritt (1) und Stehenlassen über einen angemessenen Zeitraum, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
  • 1. Herstellen von Liposomen mit Lipid, das 0,01 bis 1,0 Mol.-% eines Polyalkyletherlipids mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton enthält; und
  • 2. Einkapseln von Wirkstoffen in die in Schritt (1) erhaltenen Liposomen, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
  • 1. Zugeben von 0,01 bis 1,0 Mol.-% eines Polyalkyletherlipids mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton nach der Herstellung dieser Liposomen und Stehenlassen über einen angemessenen Zeitraum; und
  • 2. Einkapseln von Wirkstoffen in die in Schritt (1) erhaltenen Liposomen, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung sowie ihre vielen Vorteile können anhand der folgenden ausführlichen Beschreibungen und Zeichnungen besser verstanden werden, wobei:
Fig. 1 den Effekt der Zugabe von Polyalkyletherlipiden in verschiedenen Verhältnissen auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln, über 7 Tage (A), (B) zeigt.
Fig. 2 den Effekt der Zugabe von Polyalkyletherlipiden in verschiedenen Verhältnissen auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Doxorubicin einkapseln, über einen Tag zeigt.
Fig. 3 den Effekt der Zugabe von Polyalkyletherlipiden in verschiedenen Verhältnissen auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Topotecan einkapseln, über drei Tage zeigt.
Wie oben dargelegt wird, werden in der Erfindung Zusammensetzungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, bereitgestellt, die Liposomen, die einen Wirkstoff einkapseln, umfassen und die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Aggregation dieser Liposome durch langkettige Polymer-Lipid-Konjugate vorgebeugt wird, so daß die Integrität dieser Liposome und also auch die Lagerstabilität der obigen Zusammensetzungen erhöht werden können.
Die in der Erfindung verwendeten Konjugate aus langkettigem Polymer-Lipid werden als Polyalkyletherlipid bezeichnet. Obwohl die Verwendung von Polyalkyletherlipiden bei der Herstellung von Arzneimitteln zugelassen ist, ist es noch unklar, ob sie bei einer Langzeitbehandlung zu Nebenwirkungen führen können. Es ist daher ein wichtiger Punkt der Erfindung, daß die Stabilität der Liposome auch bei niedrigem Gehalt an diesen Verbindungen beibehalten werden kann. Aus von mit Polyalkyletherlipiden unterschiedlicher Molekulargewichte erhaltenen Versuchsergebnissen geht hervor, daß die Zugabe nur einer geringen Menge von Polyalkyletherlipiden ausreicht, um die Aggregation und die Präzipitation von Liposomen effektiv zu hemmen, und je höher die verwendete Menge war, umso größer war der Effekt der Inhibierung.
Das Polyalkyletherlipid, das in der Erfindung verwendet wird, umfaßt einen Polyalkyletheranteil sowie einen Lipidanteil. Der Polyalkyletheranteil kann Polyethylenglycol und ähnliche Polymere wie Polymethylethylenglycol, Polypropylenglycol, Polyhydroxylpropylenglycol, Polymethylpropylenglycol, Polyhydroxylpropylenoxid, Polyethylen/Polypropylenglycol und dergleichen mit einem Molekulargewicht von 200 bis 20.000 Dalton einschließen. Der Lipidanteil schließt in umfassender Weise jedes Molekül ein, das kovalent mit dem Polyalkylether binden kann, wobei ein Produkt mit einem hydrophilen Ende und mit einem lipophilen Ende, das sich in die Lipiddoppelschicht einlagern kann, gebildet wird.
In Ausführungsformen der Erfindung wurde anhand von Liposomen, die jeweils Ammoniumsulfat, Doxorubicin oder Topotecan einkapseln, gezeigt worden, daß durch Zugabe einer äußerst geringen Menge, zum Beispiel 0,2 Mol.-%, Polyalkyletherlipide (Derivate mit 2.000 Molekulargewicht), die Geschwindigkeit der Aggregation sowie der Präzipitation der Liposome verringert werden konnte. Wurden Derivate mit einem Molekulargewicht von mehr als 5.000 verwendet, können nur 0,6 Mol.-% davon die Präzipitation über sechs Monate gänzlich verhindern. Demnach wird angenommen, daß eine niedrige Dosierung, z. B. 0,01-1 Mol.-% Polyalkyletherlipid die Stabilität von Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, erhöhen kann und die Haltbarkeit von Liposomprodukten, die Wirkstoffe einkapseln, auf mehr als ein Jahr verlängern kann.
Dies kann anhand der in Abb. 1(A) und Abb. 1(B), sowie in Abb. 2 und Abb. 3 gezeigten Ausführungsformen, deren Verfahren und Daten unten in Beispielen und Tabellen veranschaulicht werden werden, gezeigt werden.
Bezugnehmend auf Abb. 1(A) wurden von rechts nach links jeweils 0 Mol.-%, 0,2 Mol.-%, 0,6 Mol.-% bzw. 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE zugegeben, während in Abb. 1(B) von rechts nach links jeweils 0 Mol.-%, 0,2 Mol.-%, 0,6 Mol.-% bzw. 0,99 Mol.-% PEG5000-DSPE zugegeben wurden. In Abb. 1(A) wird bei Vergleich der Ergebnisse, die bei Zugabe dreier Liposomgruppen, d. h. 0,2 Mol.-%, 0,6 Mol.-% und 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE, erhalten werden, mit dem ohne Zugabe von PEG2000-DSPE, d. h. 0% PEG-PE, ersichtlich, daß ein Zusatz von kürzerkettigem PEG-DSPE die Aggregation und die Präzipitation von Ammoniumsulfat- einkapselnden Liposomen vermindern kann. Demgegenüber wird in Abb. 1(B) ersichtlich, daß ein Zusatz von PEG5000-DSPE in einer Menge von mehr als 0,6 Mol.-% die Aggregation und Präzipitation Ammoniumsulfat-einkapselnder Liposome gänzlich verhindern kann.
Bezugnehmend auf Abb. 2 wurden von rechts nach links jeweils 0 Mol.-%, 0,2 Mol.-%, 0,6 Mol.-% bzw. 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE zugegeben. Es wird ersichtlich, dass die Zugabe von Liposomen, die das Antikrebsmittel Doxorubicin einkapseln, in einer Menge von mehr als 0,2 Mol.-% PEG2000-DSPE die Aggregation und die Präzipitation der Doxorubicin-einkapselnden Liposomen effektiv verhindern kann.
Bezugnehmend auf Abb. 3 wurden von rechts nach links jeweils 0 Mol.-%, 0,2 Mol.-% PEG2000-DSPE, 0,6 Mol.-% PEG2000-DSPE, 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE, 0,2 Mol.-% PEG5000-DSPE, 0,6 Mol.-% PEG5000-DSPE bzw. 0,99 Mol.-% PEG5000-DSPE zugegeben. Bei den Liposomen, die das Antikrebsmittel Topotecan einkapseln, wurde drei Tage nach Zugabe von PEG-PE nur eine geringe Präzipitation beobachtet, wenn nur jeweils 0,2 Mol.-% und 0,6 Mol.-% PEG2000- DSPE bzw. 0,2 Mol.-% PEG5000-DSPE hinzugegeben wurden, und es wurde keine Aggregation und Präzipitation beobachtet, wenn jeweils 0,99 Mol.-% PEG2000-DSPE, 0,6 Mol.-% PEG5000-DSPE bzw. 0,99 Mol.-% PEG5000-DSPE hinzugegeben wurden.
Bei neutralen Liposomen mit einer Partikelgröße von weniger als 100 nm, die Doxorubicin oder Topotecan einkapseln, konnte die Zugabe von 0,9 Mol.-% PEG5000-DSPE die Aggregation und Präzipitation von Liposomen verhindern, die Stabilität von Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, erhöhen, sowie die effektive Lebensdauer von Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, auf mehr als ein Jahr verlängern.
Die in der Erfindung verwendeten Wirkstoffe sind z. B. 1-beta-D- Arabinofuranosylcytosin, Cytosinarabinosid, cis- Diaminochlorplatin, Platinanaloga, Doxorubicin, Daunorubicin, Vicristin, Vinblastin, Navelbin, Antifolate, Taxol, Topotecan, Mitomycin C oder Camptothecin.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, umfassen, bereitgestellt, wobei dieses Verfahren die Schritte umfaßt:
  • 1. Einkapseln der Wirkstoffe in Liposome; und
  • 2. Zugeben von 0,01 bis 1,0 Mol.-% Polyalkyletherlipid mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton zu dem Produkt aus Schritt (1) und Stehenlassen über einen angemessenen Zeitraum, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfassen, bereitgestellt, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst:
  • 1. Herstellen von Liposomen mit Lipid, das 0,01 bis 1,0 Mol.-% eines Polyalkyletherlipids mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton enthält; und
  • 2. Einkapseln von Wirkstoffen in die in Schritt (1) erhaltenen Liposomen, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfassen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
  • 1. Zugeben von 0,01 bis 1,0 Mol.-% eines Polyalkyletherlipids mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton nach der Herstellung dieser Liposomen und Stehenlassen über einen angemessenen Zeitraum; und
  • 2. Einkapseln von Wirkstoffen in die in Schritt (1) erhaltenen Liposomen, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
Wie erwähnt, kann die Zugabe von Polyalkyletherlipid gemäß der Erfindung sowohl während als auch nach der Herstellung der Liposome als auch nach der Einkapselung der Wirkstoffe in die Liposomen durchgeführt werden.
Die Erfindung wird in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen veranschaulicht.
Beispiel 1 Herstellung von Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln
Ein Liposom mit einer einzelnen Schicht wurde mittels eines üblichen Verfahrens zur Hydratisierung dünner Schichten und wiederholter Extrusion hergestellt.
Dipalmitoylphosphatidylcholin, (DPPC), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Cholesterin (Chol) wurden in Chloroform in unterschiedlichen Molverhältnissen aufgelöst, z. B. Distearoylphosphatidylcholin : Cholesterin = 3 : 2, oder Dipalmitoylphosphatidylcholin : Cholesterin = 3 : 2 Molverhältnis. Nach innigem Mischen wurde das Lösungsmittel in einem Trockner bei verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit 150 mM Ammoniumsulfat [(NH4)2SO4] pH 5,0 bei 55°C hydratisiert. Die homogene, gemischte Lösung wurde wiederholt fünfmal mit flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Wasserbad aufgetaut, und wurde dann mittels eines Extruders bei einer Temperatur von unter 60°C jeweils fünfmal mit einer 0,1 µm Polycarbonatmembran und mit einer 0,05 µm Filtermembran gefiltert.
Beispiel 2 Herstellung von Liposomen, die Doxorubicin einkapseln
Das außerhalb der Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln, befindliche Ammoniumsulfat wurde auf Sephadex G-50 (Pharmacia) entfernt. Dann wurde 1 mg Doxorubicin pro 10 µMol Phospholipid zugegeben, auf 60°C erhitzt, und bei 100 UpM für 30 Minuten geschüttelt. Danach wurde für 3 Minuten mit Eis schnell gekühlt. Nach dem Aufwärmen wurde das außerhalb der Liposomen befindliche Doxorubicin auf einer Molekularsiebkolonne durch Eluieren mit 100 mM HEPES, 144 mM NaCl, pH 7,2 oder mit 0,9% NaCl-Lösung entfernt. Um die Herstellung der gewünschten Liposomen zu vervollständigen, wurden die liposomhaltigen Fraktionen gesammelt. Es wird bevorzugt, die so erhaltenen Liposome durch eine 0,22 µm Filtermembran zu filtern und Argon hineinzuleiten, um deren Lagerung zu erleichtern.
Beispiel 3 Herstellung von Liposomen, die Topotecan einkapseln
Das außerhalb der Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln, befindliche Ammoniumsulfat wurde auf Sephadex G-50 (Pharmacia) entfernt. Dann wurde 1 mg Topotecan pro 10 µMol Phospholipid zugegeben, auf 60°C erhitzt und bei 100 UpM für 30 Minuten geschüttelt. Danach wurde für 3 Minuten mit Eis schnell gekühlt. Nach dem Aufwärmen wurde das außerhalb der Liposomen befindliche Topotecan auf einer Molekularsiebkolonne durch Eluieren mit 100 mM HEPES, 144 mM NaCl, pH 7,2 oder mit 0,9% NaCl-Lösung entfernt. Um die Herstellung der gewünschten Liposomen zu vervollständigen, wurden die liposomhaltigen Fraktionen gesammelt. Es wird bevorzugt, die so erhaltenen Liposome durch eine 0,22 µm Filtermembran zu filtern und Argon hineinzuleiten, um deren Lagerung zu erleichtern.
Beispiel 4 Einfluß von Polyalkyletherlipid mit unterschiedlichem Gehalt und mit unterschiedlichem Molekulargewicht auf die Lagerstabilität der Liposome
Zu drei Liposomarten, die Ammoniumsulfat, Doxorubicin und Topotecan einkapseln, wurden jeweils 0, 0,2, 0,6, und 0,99 Mol.-% eines von Polyethylenglycol abgeleitetem Distearoylphosphatidylcholinethanolamins (Derivat des Polyalkyletherteiles mit einem Molekulargewicht von 2.000 oder 5.000, Genzyme, England) zugegeben, und die erhaltenen Lösungen wurden für 24 Stunden bei 37°C und danach bei 4°C gelagert. Danach wurden die Grade der Aggregation und der Präzipitation zu unterschiedlichen Zeitpunkten beobachtet, und die noch nicht abgesetzten Suspensionen wurden zur Bestimmung des jeweiligen Phospholipidrestanteils entfernt.
Tabelle 1
Einfluß der Zugabe unterschiedlicher Anteile von Polyalkyletherlipid auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass, je größer die Menge des Polyalkyllipid mit einem Polyalkyletherrest mit einem höheren Molekulargewicht für ein Liposom, das Ammoniumsulfat einkapselt, ist, die Aggregation und Präzipitation der Liposome weiter reduziert werden können. Bei Zugaben von 0,6 Mol.-% und 0,99 Mol.-% an PEG5000-DSPE können die so erhaltenen Liposome bei 4°C für mehr als 200 Tage stabil gehalten werden, ohne dass Aggregation oder Präzipitation auftreten.
Tabelle 2
Einfluß der Zugabe unterschiedlicher Anteile von Polyalkyletherlipid auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen, die Doxorubicin einkapseln
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigten, dass die Eigenschaften von Liposomen, die Doxorubicin einkapseln, denen der Liposome, die Ammoniumsulfat einkapseln, ähnlich waren, dass, je größer die Menge des Polyalkyllipids mit einem Polyalkyletherrest mit einem höheren Molekulargewicht ist, die Aggregation und Präzipitation der Liposome weiter reduziert werden können. Bei Zugaben von 0,99 Mol.-% des PEG5000-DSPE können die so erhalte­ nen Liposome bei 4°C für mehr als 90 Tage stabil gehalten werden, ohne dass Aggregation oder Präzipitation auftreten.
Beispiel 5 Bestimmung der Wiederfindung von Liposomen
Da das Material, das bei der Herstellung von Liposomen verwendet wird (DSPC), ein Phospholipid ist und eine einzige Phosphatgruppe pro Molekül besitzt, kann die Bestimmung des Gehaltes an Phosphatgruppen in der Lösung gleichzeitig die Konzentration der Lipide in der Liposomlösung liefern. Wir haben die Phosphatgruppe mittels des Bartlett-Verfahrens (Bartlett, 1959) wie folgt gemessen: Eine geeignete Menge der zu untersuchenden Probe und 0, 20, 40, und 80 µl standardisierter Phosphatlösung (Phosphorstandard, 6,5 mmol/ml, Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) wurden jeweils in Teströhrchen gegeben. In jedes Teströhrchen wurden 400 µl einer 10 N H2SO4 (Merck, NJ, USA) gegeben und innig gemischt. Die Reaktionen wurden in einem Teströhrchentrockenbad bei 170°C für 30 Minuten durchgeführt. Die Teströhrchen wurden entnommen und abgekühlt. In jedes Teströhrchen wurden 100 µl 9% H2O2 gegeben, und erneut im Teströhrchentrockenbad bei 170°C für 30 Minuten umgesetzt. Danach wurden die Teströhrchen entnommen und abgekühlt, gefolgt von der Zugabe von 4,6 ml 0,22% Ammoniummolybdat. Unter Schütteln in einem Vortex wurden 100 µl 15% Ascorbinsäure durch die jeweilige Öffnung des Teströhrchens gegeben und in kochendem Wasser bei 100°C für 10 Minuten gekocht. Nach Entnahme und Abkühlen wurde das Absorptionsvermögen bei 830 nm mit einem Spektralphotometer (Ultraspec III, Pharmacia, Schweden) gemessen. Die so erhaltenen Meßergebnisse wurden mit einer positiven Vergleichsprobe einer linearen Regressionsanalyse unterzogen, um den Phosphoranteil in der zu untersuchenden Probe und daraus abgeleitet die Lipidkonzentration in der Liposomlösung zu bestimmen.
Wiederfindung = (Lipidkonzentration in der untersuchten Probe/Lipidkonzentration vor Ablagerung der Liposome) × 100%.
Tabelle 3
Einfluß der Zugabe verschiedener Anteile an Polyalkyletherlipid auf die Aggregation und Präzipitation von Liposomen und den Prozentsatz nicht abgelagerten Phospholipids (Liposome) zu ursprünglichem Phospholipid nach 3 Tagen
Aus Tabelle 3 geht hervor, dass nach Aggregation und Präzipitation der Liposome die Zahl der in Lösung befindlichen Liposome vermindert wird und die Zugabe von 0,6 Mol.-% und 0,9 Mol.-% PEG5000-DSPE eine vollständige Suspension der Liposome in der Lösung ohne Präzipitation herbeiführen kann.
Beispiel 6 Analyse der Teilchencrrößen der Liposomen
Die Analyse der Teilchengrößen der Liposomen wurde mit einem Teilchengrößenanalysator (N4 Plus, COULTER, USA) durchgeführt, der die Teilchengrößenverteilung der Liposomen auf Basis des Prinzips der Laserlichtstreuung bestimmt. Da sich jedes Liposom in einem Zustand freier Bewegung befindet, wenn es in Lösung suspendiert ist, wobei dieses Phänomen als Brownsche Bewegung bezeichnet wird, kann bei Bestrahlung mit Laserlicht das von Liposomen gestreute Licht vom Analysator nachgewiesen und danach in digitale Daten umgewandelt werden, die von einem Computer verarbeitet werden können, um dadurch die Verteilung und den Durchschnittswert der Teilchengröße der Liposomen zu erhalten.
Tabelle 4
Einfluß der Zugabe verschiedener Anteile von Polyalkyletherlipid auf den Durchmesser von Liposomen, die Ammoniumsulfat einkapseln
Es ist aus Tabelle 4 ersichtlich, dass die Zugabe verschiedener Anteile an Polyalkyletherlipid mit unterschiedlicher Länge die Teilchengröße der Liposomen beeinflussen kann und dass der Durchmesser der Liposomen umso mehr steigt, je größer der zugegebene Anteil an Polyalkylether mit größerer Länge wird, was auf den Einschub von Polyalkylether in das Liposom hinweist.
Erfindungsgemäß kann die Stabilität von Liposomen, die Wirkstoffe einkapseln, gesteigert werden und die effektive Lebensdauer von Liposomen auf mehr als ein Jahr verlängert werden.

Claims (9)

1. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Aggregation dieser Liposomen durch ein langkettiges Polymer-Lipid-Konjugat wirksam verhindert wird und dadurch die Integrität dieser Liposomen und so die Lagerstabilität dieser Zusammensetzung erhöht werden kann.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Konjugat aus langkettigem Polymer-Lipid ein Polyalkyletherlipid ist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyalkyletherlipid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Polyethylenglykol, Polymethylethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyhydroxypropylenglykol, Polymethylpropylenglykol, Polyhydroxypropylenoxid und Polyethylen/Polypropylenglykol besteht.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus 1-beta-D-Arabinofuranosylcytosin, Arabinosid, cis-Diaminochlorplatin, Platinanaloga, Doxorubicin, Daunorubicin, Vicristin, Vinblastin, Navelbin, Antifolate, Taxol, Topotecan, Mitomycin C und Camptothecin besteht.
5. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, wobei dieses Verfahren die Schritte umfaßt:
  • 1. Einkapseln der Wirkstoffe in Liposome; und
  • 2. Zugeben von 0,01 bis 1,0 Mol.-% Polyalkyletherlipid mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton zu dem Produkt aus Schritt (1) und Stehenlassen über einen angemessenen Zeitraum, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
6. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
  • 1. Herstellen von Liposomen mit Lipid, das 0,01 bis 1,0 Mol.-% eines Polyalkyletherlipids mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton enthält; und
  • 2. Einkapseln von Wirkstoffen in die in Schritt (1) erhaltenen Liposomen, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
7. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Liposome, die Wirkstoffe einkapseln, umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
  • 1. Zugeben von 0,01 bis 1,0 Mol.-% eines Polyalkyletherlipids mit einem Molekulargewicht von 200 bis 2000 Dalton nach der Herstellung dieser Liposomen und Stehenlassen über einen angemessenen Zeitraum; und
  • 2. Einkapseln von Wirkstoffen in die in Schritt (1) erhaltenen Liposomen, um dadurch den Effekt zu erzielen, die Aggregation und Präzipitation der Liposomen zu verhindern.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Polyalkyletherlipid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Polyethylenglykol, Polymethylethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyhydroxypropylenglykol, Polymethylpropylenglykol, Polyhydroxypropylenoxid und Polyethylen/Polypropylenglykol besteht.
9. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus 1-beta-D- Arabinofuranosylcytosin, Arabinosid, cis-Diaminochlorplatin, Platinanaloga, Doxorubicin, Daunorubicin, Vicristin, Vinblastin, Navelbin, Antifolate, Taxol, Topotecan, Mitomycin C und Camptothecin besteht.
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