DE19829853A1 - Interspecific hybridization method - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Pflanzen, zur Fusion von Protoplasten und zur Herstellung einer Pflanze mit neuen Eigenschaften (z. B. Pilzresistenz) nach der Fusion von Protoplasten sowie die Verwendung dieser Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung.The invention relates to methods for obtaining protoplasts from leaves of plants for Fusion of protoplasts and to produce a plant with new properties (e.g. Fungal resistance) after the fusion of protoplasts and the use of these methods for interspecific hybridization.
Die Verwendung nur einer cytoplasmatisch männlichen Sterilität zur Erstellung von Inzuchtlinien (Leclerq, Amélior. Plantes 99-109, 1969) in der konventionellen Sonnenblumen-Hybridzüchtung hat die genetische Variabilität der Sonnenblume stark eingeschränkt. Die zahlreichen Helianthus- Wildarten zeigen hingegen eine große Variabilität für züchterisch interessante Merkmale wie Fettsäuregehalt und -zusammensetzung (Seiler, Econom. Bot. 271-279, 1994; Christov, FAO Progr. Rep. Evaluation of wild Helianthus species 31-62, 1994;) Trockentoleranz, cytoplasmatische männliche Sterilitat sowie Pilz- und Insektenresistenz (Henn et al. Angew. Bot. 5-9, 1997; Seiler, Field Crop Res. 195-230, 1992; Serieys, FAO Progr. Rep. Gentic Evaluation and use of Helianthus wild species and their use in breeding programs 18-23, 1987). Somit stellen die Wildarten der Sonnenblume wichtige Genressourcen für die Kulturform dar und konnten auch in einigen Fällen erfolgreich eingesetzt werden. Die interspezifische Hybridisierung ist jedoch aufgrund von Inkompatibilität, genetischer Distanz und erhöhter Chromosomenzahl in vielen Fällen sehr schwierig, wenn nicht unmöglich. H. annuus kann leicht mit anderen diploiden annuellen Arten gekreuzt werden, bei den perennierenden Arten wird jedoch häufig das Absterben des Embryos, geringe Befruchtungsrate und Sterilität der F1-Generation (Seiler 1992 s. o.) beobachtet. Letzterem kann mit Hilfe einer Colchicinbehandlung entgegengewirkt werden (Jan & Chandler Crop Sci. 643-646, 1988), doch mit bislang unbekannten Konsequenzen für die weiteren Generationen. Ähnliche Probleme treten auch bei Anwendung der Methode des "embryo rescue" auf, einem biotechnologischem Verfahren, in dem das nach Befruchtung gebildete Embryo in die Sterilkultur überführt wird (Kräuter et al. Theor. Appl Genet. 521-525, 1991). Eine weitere Möglichkeit, Kreuzungsbarrieren zu überwinden, besteht in der somatischen Zellfusion, bei der zellwandlose Gewebezellen von Donor- und Akzeptor-pflanzen miteinander verschmolzen werden. Die entstandenen Hybridzellen können anschließend in Kultur genommen und zu Pflanzen regeneriert werden.The use of only cytoplasmic male sterility to create inbred lines (Leclerq, Amélior. Plantes 99-109, 1969) in conventional sunflower hybrid breeding has severely restricted the genetic variability of the sunflower. The numerous Helianthus Game species, on the other hand, show great variability for breeding interesting traits like Fatty acid content and composition (Seiler, Econom. Bot. 271-279, 1994; Christov, FAO Progr. Rep. Evaluation of wild Helianthus species 31-62, 1994;) drought tolerance, cytoplasmic male sterility as well as resistance to fungi and insects (Henn et al. Angew. Bot. 5-9, 1997; Seiler, Field Crop Res. 195-230, 1992; Serieys, FAO Progr. Rep. Gentic Evaluation and use of Helianthus wild species and their use in breeding programs 18-23, 1987). So pose The wild species of the sunflower represent important genetic resources for the culture form and could also successfully used in some cases. However, the interspecific hybridization is due to incompatibility, genetic distance and increased number of chromosomes in many Cases very difficult, if not impossible. H. annuus can easily with other diploids annual species are crossed, but perennial species often die of the embryo, low fertilization rate and sterility of the F1 generation (Seiler 1992 see above) observed. The latter can be counteracted with the help of colchicine treatment (Jan & Chandler Crop Sci. 643-646, 1988), but with previously unknown consequences for the others Generations. Similar problems also occur when using the "embryo rescue" method on, a biotechnological process in which the embryo formed after fertilization into the Sterile culture is transferred (Krauter et al. Theor. Appl Genet. 521-525, 1991). Another One way to overcome crossing barriers is by somatic cell fusion, in which Tissue-free tissue cells from donor and acceptor plants are fused together. The resulting hybrid cells can then be cultivated and planted be regenerated.
Die in vitro Propagation wird meist im Zierpflanzenanbau eingesetzt zur Produktion von vielen genetisch identischen Pflanzen auf einer kleinen Produktionsfläche. Die perennierenden Wildarten der Sonnenblume stellen Zierpflanzen dar, jedoch werden sie nicht über die in vitro Propagation vermehrt, da sie als mehrjährige Pflanzen über Rhizome verfügen, die unter Einsatz gärtnerischer Praxis eine leichte Vermehrung der Pflanzen gewährleisten. Über die in vitro Propagation von Helianthus giganteus berichteten Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 232-235, 1995) jedoch mit wenigen technischen Details. Genauere Angaben für die sterile Anzucht und Propagation gaben Imhoff et al. (Angew. Bot. 70, 137-139, 1996) für Helianthus gigankteus, H. x laetiflorus und H. pauciflorus.In vitro propagation is mostly used in the cultivation of ornamental plants for the production of many genetically identical plants in a small production area. The perennial game species The sunflower are ornamental plants, however they are not propagated in vitro increased, since they have rhizomes as perennial plants that use horticultural Practice ensure easy propagation of plants. About the in vitro propagation of However, Helianthus giganteus reported Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 232-235, 1995) with few technical details. More precise information for sterile cultivation and propagation Imhoff et al. (Angew. Bot. 70, 137-139, 1996) for Helianthus gigankteus, H. x laetiflorus and H. pauciflorus.
Die Regeneration von fertilen Pflanzen, ausgehend von H. annuus Protoplasten, wurde bereits mit verschiedenen Medien sowie Hormonzugaben erreicht. Die Bildung von Sprossen aufgrund von Embryogenese (Krasnyanski & Menczel, Plant Cell Rep. 12, 260-263, 1993; Barth et al. Bot Acta 106, 220-222, 1993) als auch Organogenese (Binding et al. Zeitschr. f Pflanzenphysiol. 101, 119-130, 1981, Burrris et al. Plant Cell Rep. 10, 161-166, 1991, Fischer et al. Plant Cell Rep. 11, 632-636, 1992) wurde beschrieben. Alle diese Protokolle waren allerdings nur für jeweils wenige Sonnenblumengenotypen anwendbar. Ein Regenerationsprotokoll, das bei vier getesteten Sonnenblumensorten, zwar mit unterschiedlicher Effizienz, doch in jedem Fall fertile Pflanzen ergab, wurde von Wingender et al. (Plant Cell Rep. 15, 742-745, 1996) beschrieben.The regeneration of fertile plants, starting from H. annuus protoplasts, was already involved various media and hormone additions achieved. The formation of sprouts due to Embryogenesis (Krasnyanski & Menczel, Plant Cell Rep. 12, 260-263, 1993; Barth et al. Bot Acta 106, 220-222, 1993) as well as organogenesis (Binding et al. Zeitschr. F Pflanzenphysiol. 101, 119-130, 1981, Burrris et al. Plant Cell Rep. 10, 161-166, 1991, Fischer et al. Plant Cell Rep. 11, 632-636, 1992) has been described. However, all of these protocols were only for a few Sunflower genotypes applicable. A regeneration protocol that was tested on four Sunflower varieties, with different efficiency, but in any case fertile plants was found by Wingender et al. (Plant Cell Rep. 15, 742-745, 1996).
Bei Wildarten der Sonnenblume wurde von Protoplasten ausgehende Regeneration von Pflanzen für H. petiolaris (Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991) und für H. praecox, H. scaberimus und H. rigidus (Bohorova et al. Plant Cell Rep. 5, 256-258, 1986) berichtet, wobei letztere keine näheren Angaben zur Kultur machten. Eine hohe Ausbeute an embryogenen Calli und Pflanzen wurde im Fall von H. giganteus (Krasnyanski et al. Plant Cell Rep. 11, 7-10, 1992) und H. maximiliani (Polgar & Krasnyanski Plant Sci. 87, 191-197, 1992) erhalten. In wild species of sunflower, regeneration of plants originated from protoplasts for H. petiolaris (Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991) and for H. praecox, H. scaberimus and H. rigidus (Bohorova et al. Plant Cell Rep. 5, 256-258, 1986) the latter made no further details about the culture. A high yield of embryogenic calli and plants in the case of H. giganteus (Krasnyanski et al. Plant Cell Rep. 11, 7-10, 1992) and H. maximiliani (Polgar & Krasnyanski Plant Sci. 87, 191-197, 1992).
Die Regeneration von Hybriden nach Zellfusion von H. annuus und H. giganteus Protoplasten wurde von Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) beschrieben. Von über hundert Pflanzen produzierten aber nur zwei nach Selbstung Samen, während alle anderen steril waren.Regeneration of hybrids after cell fusion of H. annuus and H. giganteus protoplasts has been described by Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995). From above A hundred plants produced only two seeds after selfing, while all others were sterile were.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue verbesserte Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung von Kultursonnenblume und Wildarten der Sonnenblume bereitzustellen. Die Lösung dieser Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.It was therefore an object of the present invention to develop new improved methods for interspecific hybridization of cultivated sunflower and wild species of sunflower to provide. The solution to this problem results from the claims and the following description.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein neues Verfahren zur Gewinnung von zellwandlosen Zellen (Protoplasten) aus Blättern, ein Verfahren zur Fusion von Protoplasten und die Herstellung einer Pflanze mit neuen Eigenschaften (z. B. Pilzresistenz) nach der Fusion der Protoplasten.The subject of the invention is therefore a new method for the production of cell wallless cells (Protoplasts) from leaves, a process for the fusion of protoplasts and the production of a Plant with new properties (e.g. fungal resistance) after the fusion of the protoplasts.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Wildarten der Sonnenblume (Helianthus ssp.) und zur Fusion von Protoplasten einer Kultursonnenblume (Helianthus annuus L.) einerseits und einer Wildart der Sonnenblume (Helianthus ssp.) andererseits und zur Regeneration von einzelnen Hybridzellen zu voll entwickelten Pflanzen eingesetzt.In a preferred embodiment, the methods according to the invention for the extraction of protoplasts from leaves of wild species of sunflower (Helianthus ssp.) and for fusion of protoplasts of a culture sunflower (Helianthus annuus L.) on the one hand and a wild species the sunflower (Helianthus ssp.) on the other hand and for the regeneration of individual hybrid cells used for fully developed plants.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern umfaßt die Inkubation von Streifen der Blätter der obersten zwei bis fünf Nodi in Mesophyll-Enzymlösung, enthaltend Cellulase, Pectolyase, Macerocym und Driselase über 10-24 Stunden bei 10-24°C, die Erhöhung der Temperatur auf 16-30°C und die Inkubation unter Schütteln über etwa 30 Minuten und die nachfolgende Aufreinigung der Protoplasten. Vorzugsweise enthält die Mesophyll- Enzymlösung 0,05-0,25% Cellulase, 0,01-0,15% Pectolyase, 0,25-1,5% Macerocym und 0,001-0,025% Driselase. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von Protoplasten stammen die Blätter von einer Helianthus-Wildart. The method according to the invention for the production of protoplasts from leaves comprises the Incubation of strips of the leaves of the top two to five nodes in mesophyll enzyme solution, containing cellulase, pectolyase, macerocym and driselase for 10-24 hours at 10-24 ° C, the Increase the temperature to 16-30 ° C and incubate with shaking for about 30 minutes and the subsequent purification of the protoplasts. The mesophyll preferably contains Enzyme solution 0.05-0.25% cellulase, 0.01-0.15% pectolyase, 0.25-1.5% macerocym and 0.001-0.025% Driselase. In a particularly preferred embodiment of the invention In the process for obtaining protoplasts, the leaves come from a Helianthus wild species.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Fusion von Protoplasten umfaßt das Mischen der Protoplasten bei einer Dichte von 1-4.4 Millionen Protoplasten/ml, die nachfolgende Zugabe eines gleichen Volumens einer Fusionslösung, umfassend 10-25% PEG (Polyethylenglycol) und 3-14% DMSO (Dimethylsulfoxid), die Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur im Licht und die nachfolgende Zugabe eines Salzpuffers und die Inkubation für 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur im Licht. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Fusion von Protoplasten umfaßt die Fusionslösung 10-25% PEG und 6-14% DMSO, insbesondere 15-20% PEG und 3-7% DMSO. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Fusion der Protoplasten werden Protoplasten von Helianthus annuus mit Protoplasten einer Helianthus-Wildart fusioniert.The inventive method for the fusion of protoplasts comprises mixing the Protoplasts at a density of 1-4.4 million protoplasts / ml, the subsequent addition of a equal volume of a fusion solution comprising 10-25% PEG (polyethylene glycol) and 3-14% DMSO (dimethyl sulfoxide), incubation for 10-30 minutes at room temperature in the light and the subsequent addition of a salt buffer and incubation for 1 to 3 hours Room temperature in the light. In a preferred embodiment of the invention Protoplast fusion process includes 10-25% PEG and 6-14% fusion solution DMSO, especially 15-20% PEG and 3-7% DMSO. In a particularly preferred Embodiment of the method according to the invention for the fusion of the protoplasts Protoplasts from Helianthus annuus fused with protoplasts from a Helianthus wild species.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Pflanze oder von Reproduktionsmaterial dieser Pflanze umfaßt die Fusion von Protoplasten gemäß dem vorstehend genannten Verfahren und die Regenerierung von Pflanzen oder Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen oder von beidem aus dem Protoplasten und gegebenenfalls das biologische Replizieren der regenerierten Pflanzen oder des Reproduktionsmaterials von diesen Pflanzen.The method according to the invention for the production of a plant or of reproductive material this plant comprises the fusion of protoplasts according to the above method and the regeneration of plants or reproductive material from these plants, or both from the protoplast and, if necessary, the biological replication of the regenerated plants or the reproductive material from these plants.
Zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Wildarten der Sonnenblume wurde ein von allen Literaturstellen (Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991; Bohorova et al. Plant Cell Rep. 5, 256-258, 1986; Krasnyanski et al. Plant Cell Rep. 11, 7-10, 1992; Polgar & Krasnyanski Plant Sci. 87, 191-197, 1992; Imhoff et al. Angew. Bot. 70, 137-139, 1996) abweichendes Verfahren entwickelt, das reproduzierbar hohe Ausbeuten vitaler Protoplasten gewährleistet.To obtain protoplasts from leaves of wild species of sunflower, one of all references (Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991; Bohorova et al. Plant Cell Rep. 5, 256-258, 1986; Krasnyanski et al. Plant Cell Rep. 11, 7-10, 1992; Polgar & Krasnyanski Plant Sci. 87, 191-197, 1992; Imhoff et al. Appl. Bot. 70, 137-139, 1996) Process developed that guarantees reproducibly high yields of vital protoplasts.
Hierbei erwies sich die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zusammensetzung des Inkubationsmediums, speziell die Konzentration und die Art der eingesetzten Enzyme als entscheidend. Das erfindungsgemäße Verfahren konnte bei allen bislang getesteten Wildarten der Sonnenblume eingesetzt werden und erübrigt somit aufwendige Optimierungsschritte für einzelne Arten. Vor der Weiterverwendung wurden die Protoplasten im Gegensatz zu Chanabe et al. (Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991), die deutlich längere Inkubationszeiten verwendeten, zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen gelagert, was wesentlich zur Überwindung des Protoplastierstresses beitrug. The composition used in the process according to the invention proved to be the case of the incubation medium, especially the concentration and type of enzymes used crucial. The method according to the invention could be used in all game species tested so far Sunflower are used and thus eliminates time-consuming optimization steps for individuals Species. In contrast to Chanabe et al. (Plans Cell Rep. 9, 635-638, 1991), who used significantly longer incubation times, two hours stored at room temperature in the dark, which is essential to overcome the Protoplastierstresses contributed.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Fusion von Protoplasten gewährleistete bei einer Fusion von Protoplasten der Kultursorte der Sonnenblume mit denen einer Wildart Fusionsraten von 3-10%. Abweichend von der üblichen Praxis hierzu nur eine Chemikalie einzusetzen, erwies sich die Kombination von Polyethylenglykol (PEG) und Dimethylsulfoxid (DMSO) in Konzentrationen von 10-25% PEG zu 3-14% DMSO als erfolgreich, um die vorstehend genannten Fusionsraten zu erzielen. Die Verwendung der von Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) beschriebenen Methode (25% PEG) brachte in keinem Fall ein zufriedenstellendes Ergebnis.The method according to the invention for the fusion of protoplasts ensured with a fusion of Protoplasts of the cultivar of the sunflower with those of a wild species fusion rates of 3-10%. In contrast to the usual practice of using only one chemical for this purpose, it proved Combination of polyethylene glycol (PEG) and dimethyl sulfoxide (DMSO) in concentrations from 10-25% PEG to 3-14% DMSO as successful to achieve the above fusion rates achieve. The use of Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) The method described (25% PEG) never gave a satisfactory result.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß das Mischen der Protoplasten bei einer Dichte von 1- 4.4 Millionen Protoplasten/ml, die nachfolgende Zugabe eines gleichen Volumens einer Fusionslösung, umfassend 10-25% PEG (Polyethylenglycol) und 3-14% DMSO (Dimethylsulfoxid), die Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur im Licht und die nachfolgende Zugabe eines Salzpuffers und die Inkubation für 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur im Licht zu besonders hohen Fusionsraten führte. Besonders vorteilhaft erwies sich eine Fusionslösung enthaltend 10-25% PEG und 6-14% DMSO, insbesondere 15-20% PEG und 3-7% DMSO bei der Fusion von Protoplasten von Helianthus annuus mit Protoplasten einer Helianthus-Wildart.Surprisingly, it was found that the mixing of the protoplasts at a density of 1- 4.4 million protoplasts / ml, the subsequent addition of an equal volume of one Fusion solution comprising 10-25% PEG (polyethylene glycol) and 3-14% DMSO (Dimethyl sulfoxide), the incubation for 10-30 minutes at room temperature in the light and the Subsequent addition of a salt buffer and incubation for 1 to 3 hours Room temperature in light led to particularly high fusion rates. Proved particularly advantageous a fusion solution containing 10-25% PEG and 6-14% DMSO, in particular 15-20% PEG and 3-7% DMSO in the fusion of Helianthus annuus protoplasts with protoplasts one Helianthus game species.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Regenerationsverfahren für Hybridzellen, das den Erhalt von fertilen interspezifischen Hybriden mit den Donorarten H. maximiliani und H. giganteus gewährleistet. Hierbei war zu beachten, daß die Hybride ein von den jeweiligen parentalen Genotypen abweichendes Verhalten in der Kultur aufweisen. Es wurden Einbettungsdichten, Licht- und Temperaturbedingungen sowie die Abfolge des Phytohormonregimes diesen besonderen Ansprüchen entsprechend entwickelt und eine Hormonbehandlung zur Bewurzelung eingeführt. Die Regeneration erfolgte in Anlehnung an das für H. annuus beschriebene Protokoll (Wingender et al. Plant Cell Rep. 742-745, 1996), wobei jedoch für die Hybride die Zeitspannen der einzelnen Kulturschritte in Abhängigkeit zum Donorgenotyp modifiziert wurden. Hierbei erwies sich die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure- Behandlung als besonders kritisch, weshalb die Zeitspanne hier auf maximal fünf Tage verkürzt wurde. Im weiteren Verlauf des Regenerationsprotokolls wurden die Zeitspannen den Entwicklungszuständen der Mikrokalli und später gebildeten größeren Kalli angepaßt, so daß die zeitliche Weiterführung der Kulturschritte von Fall zu Fall entschieden wurde. Weiterhin gelang es erstmalig, die erhaltenen Regenerate mittels einer Auxinbehandlung und weiterer Subkultivierung auf hormonfreiem Medium zu bewurzeln, wodurch die aufwendige Pfropfung auf eine Wildunterlage umgangen wurde. Es wurden 125 somatische Hybride zwischen H. annuus und H. maximiliani sowie 47 somatische Hybride zwischen H. annuus und H. giganteus erhalten. Im Gegensatz zu Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) wurden nach Selbstung von allen Pflanzen Samen erhalten, die auch keimfähig waren. Der Hybridcharakter der Pflanzen konnte auf genetischer Ebene mittels der RAPD-PCR-Analyse bestätigt werden.Another embodiment of the invention relates to a regeneration method for hybrid cells, the preservation of fertile interspecific hybrids with the donor species H. maximiliani and H. giganteus guarantees. It was important to note that the hybrid was one of the respective parental genotypes show different behavior in culture. There were Embedding densities, light and temperature conditions as well as the sequence of the Phytohormone regimes developed according to these special requirements and a Hormone treatment for rooting introduced. The regeneration was based on the protocol described for H. annuus (Wingender et al. Plant Cell Rep. 742-745, 1996), wherein however for the hybrids the time periods of the individual culture steps depending on the Donor type were modified. The 2,4-dichlorophenoxyacetic acid Treatment as particularly critical, which is why the time span here is reduced to a maximum of five days has been. In the further course of the regeneration protocol, the time periods became Developmental states of the micro calli and later formed larger calli adapted so that the continuation of the cultural steps was decided on a case-by-case basis. Furthermore it succeeded for the first time, the regenerates obtained by means of auxin treatment and further subcultivation to root on hormone-free medium, which means that the complex grafting onto a Game pad was bypassed. 125 somatic hybrids between H. annuus and H. maximiliani and 47 somatic hybrids between H. annuus and H. giganteus preserved. in the Contrary to Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) were after selfung received seeds from all plants that were also capable of germination. The hybrid character of the plants could be confirmed at the genetic level using the RAPD-PCR analysis.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen.The following examples illustrate the invention and are not to be interpreted as restrictive.
Zur Isolation der Mesophyllzeliprotoplasten (MCPs) werden Blätter der obersten zwei bis fünf Nodi von einwöchigen bis fünf vorzugsweise zwei bis drei Wochen alten in vitro propagierten Pflanzen abgeschnitten, in ca. 1 mm breite Streifen geschnitten und in 10-30, vorzugsweise 15-25, insbesondere 18-22 ml Mesophyll-Enzymlösung, deren Zusammensetzung in Tabelle 1 angegeben ist, im Dunklen inkubiert.Leaves from the top two to five are used to isolate the mesophyll cell protoplasts (MCPs) Nodi from one week to five, preferably two to three weeks old, propagated in vitro Plants cut off, cut into strips about 1 mm wide and in 10-30, preferably 15-25, in particular 18-22 ml mesophyll enzyme solution, the composition of which is shown in Table 1 is incubated in the dark.
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert. The pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8 and the Sterile filtered solution.
In der beispielsweise 10-24, vorzugsweise 14-22, insbesondere 16-20 stündigen ersten Phase der Inkubation bei beispielsweise 10-24, insbesondere 14-22, vorzugsweise bei 16-20°C wird zunächst das Gewebe mit der Lösung infiltriert. Nach Erhöhung der Temperatur auf beispielsweise 16-30, insbesondere 20-28, vorzugsweise 24-27°C und Schütteln bei 60 - 110, vorzugsweise 70-90, insbesondere 75-85 rpm werden nach 1-1,5 h die Protoplasten freigesetzt. Zu deren Aufreinigung wird der gesamte Ansatz zunächst durch ein Edelstahlsieb mit einer Maschenweiten von 50 µm filtriert und das Filtrat anschließend 2-8, vorzugsweise 3,5-6,5, insbesondere 4,5-5,5 min bei 30-70, vorzugsweise bei 40-60, insbesondere bei 45-55 g zentrifugiert. Die pelletierten Protoplasten werden in 8 ml Saccharoselösung (0,3-0,7 M Saccharaose, 0,5-1,5 mM CaCl2, 0,1-0,5 mM MES, pH 4-7) resuspendiert und mit 2 ml Salzpuffer (0,1-0,5 M KCl, 0,005-0,015 M CaCl2, 0,1-5 M MES, pH 4-7) überschichtet. In der Interphase dieses diskontinuierlichen 2-Phasen Gradienten sammeln sich nach erneuter Zentrifugation bei 30-70g, vorzugsweise bei 40-60g, insbesondere bei 45-55g, für 2-8 min, die intakten Protoplasten. Die Anzahl der gereinigten Protoplasten wird im Fuchs-Rosenthal-Hämocytometer bestimmt.In the first phase of the incubation, for example 10-24, preferably 14-22, in particular 16-20, at for example 10-24, in particular 14-22, preferably at 16-20 ° C., the tissue is first infiltrated with the solution. After increasing the temperature to, for example, 16-30, in particular 20-28, preferably 24-27 ° C. and shaking at 60-110, preferably 70-90, in particular 75-85 rpm, the protoplasts are released after 1-1.5 h. To purify them, the entire batch is first filtered through a stainless steel sieve with a mesh size of 50 μm and the filtrate is then 2-8, preferably 3.5-6.5, in particular 4.5-5.5 min at 30-70, preferably centrifuged at 40-60, especially at 45-55 g. The pelleted protoplasts are resuspended in 8 ml sucrose solution (0.3-0.7 M saccharose, 0.5-1.5 mM CaCl 2 , 0.1-0.5 mM MES, pH 4-7) and with 2 ml Salt buffer (0.1-0.5 M KCl, 0.005-0.015 M CaCl 2 , 0.1-5 M MES, pH 4-7) overlayed. In the interphase of this discontinuous 2-phase gradient, after renewed centrifugation at 30-70g, preferably at 40-60g, in particular at 45-55g, the intact protoplasts collect for 2-8 min. The number of purified protoplasts is determined in the Fuchs-Rosenthal hemocytometer.
Zur Fusion von H. annuus Hypokotylptrotoplasten mit Mesophyllprotoplasten einer Helianthus- Wildart wurden diese beispielsweise im Verhältnis 1 : 2 (HCPs : MCPs) gemischt und eine Dichte von 1-4,4, insbesondere 1,5-3, vorzugsweise von 1,8-2,4 Mio Protoplasten/ml eingestellt. Von dieser Protoplastenmischung werden 150-350, vorzugsweise 180-330, insbesondere 200-300 µl in die Mitte einer Petrischale (∅ 10 cm) gegeben und vorsichtig mit dem gleichen Volumen der jeweiligen Fusionslösung gemischt. Die Inkubation erfolgt für 10-30, vorzugsweise bei 15-25, insbesondere 18-22 min bei RT im Licht. Anschließend werden vorsichtig 10-30, vorzugsweise 15-25, insbesondere 18-22 ml Salzpuffer (s. o.) hinzugegeben und für 1-3 vorzugsweise 1,5-2,5, insbesondere 1,8-2,2 h bei RT im Licht inkubiert. Die Zusammensetzung der jeweiligen Fusionslösung in Abhängigkeit von der verwenden Wildart wird in Tabelle 2 angegeben. For the fusion of H. annuus hypocotyltrotoplasts with mesophyll protoplasts of a Helianthus Wild species were mixed for example in a ratio of 1: 2 (HCPs: MCPs) and a density from 1-4.4, in particular 1.5-3, preferably from 1.8-2.4 million protoplasts / ml. Of This protoplast mixture is 150-350, preferably 180-330, in particular 200-300 Place µl in the middle of a Petri dish (∅ 10 cm) and carefully with the same volume of respective fusion solution mixed. Incubation is for 10-30, preferably 15-25, especially 18-22 min at RT in the light. Then be careful 10-30, preferably 15-25, especially 18-22 ml of salt buffer (see above) are added and for 1-3 preferably 1.5-2.5, incubated in particular at RT for 1.8-2.2 h in the light. The composition of each Fusion solution depending on the game species used is given in Table 2.
Die Ansätze werden 2-8, vorzugsweise 3,5-6, insbesondere 4,5-5,5 min bei 80-160, vorzugsweise bei 100-140, insbesondere bei 110-130g zentrifugiert, das Protoplastenpellet mit 150-250, vorzugsweise 190-230, insbesondere mit 185-215 µl Salzpuffer resuspendiert und die Gesamtzahl an Protoplasten sowie die Fusionsrate im Fuchs-Rosenthal-Hämocytometer bestimmt.The batches are 2-8, preferably 3.5-6, in particular 4.5-5.5 min at 80-160, centrifuged preferably at 100-140, in particular at 110-130g, the protoplast pellet with 150-250, preferably 190-230, in particular resuspended with 185-215 ul salt buffer and the total number of protoplasts and the fusion rate in the Fuchs-Rosenthal hemocytometer certainly.
Die Protoplasten werden in einer Dichte von 2×104-1×105, vorzugsweise 5×104-9×104, insbesondere 6×104-8×104 ml-1 in 32-40, vorzugsweise 33-38, insbesondere 34-36°C warme Agarose (0,5%ig in mKM-Medium nach Wingender et al. Plant Cell Rep. 15, 742-745, 1996 oder KMAR-Medium nach Schemionek, Dissertation Universität Bonn 1995 oder in VKM-Medium nach Binding & Nehls Z. Pflanzenphysiol. 85, 279-280, 1977 oder in Kultivierungs-Medium nach Kao & Michayluk Planta 126, 105-110, 1975) gegeben und in Tropfen von 20-80, vorzugsweise 30-70, insbesondere von 40-60 µl in Plastikpetrischalen (∅ 10 cm) verteilt, wobei pro Schale 10-50, vorzugsweise 15-35, insbesondere 18-25 Tropfen ausplattiert werden. Nach Erstarren der Agarose werden die Tropfen mit 5-15, vorzugsweise 9,5-14, insbesondere mit 10-12 ml pro Petrischale Regenerations-Flüssigmedium (400-700, vorzugsweise 450-650, insbesondere, 550-600 mosml) überschichtet und bei 16-30, vorzugsweise 20-28, insbesondere bei 24-26°C im Dunkeln inkubiert. Im Verlauf der Kultur wird das Flüssigmedium zwei- bis fünfmal gewechselt, wobei der Zeitpunkt des Wechsels vom Entwicklungsstadium der Zellen bzw. Mikrokolonien bestimmt wird. Bei jedem Mediumwechsel wird die Osmolarität des Mediums um 70-140 mosmol verringert und die Hormonzusammensetzung verändert. The protoplasts are in a density of 2 × 10 4 -1 × 10 5 , preferably 5 × 10 4 -9 × 10 4 , in particular 6 × 10 4 -8 × 10 4 ml -1 in 32-40, preferably 33-38 , in particular 34-36 ° C warm agarose (0.5% in mKM medium according to Wingender et al. Plant Cell Rep. 15, 742-745, 1996 or KMAR medium according to Schemionek, dissertation University of Bonn 1995 or in VKM- Medium according to Binding & Nehls Z. Pflanzenphysiol. 85, 279-280, 1977 or in cultivation medium according to Kao & Michayluk Planta 126, 105-110, 1975) and in drops of 20-80, preferably 30-70, in particular of 40-60 µl in plastic petri dishes (∅ 10 cm) distributed, 10-50, preferably 15-35, in particular 18-25 drops are plated out per dish. After the agarose has solidified, the drops are overlaid with 5-15, preferably 9.5-14, in particular 10-12 ml per petri dish regeneration liquid medium (400-700, preferably 450-650, in particular, 550-600 mosml) and at Incubated 16-30, preferably 20-28, especially at 24-26 ° C in the dark. In the course of the culture, the liquid medium is changed two to five times, the time of the change being determined by the stage of development of the cells or microcolonies. Each time the medium is changed, the osmolarity of the medium is reduced by 70-140 mosmol and the hormone composition is changed.
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert.The pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8 and the Sterile filtered solution.
Schritt 1: Zu Beginn der Kultur werden dem Medium die Phytohormone BAP und NAA zugesetzt. BAP in einer Konzentration von 1-10 µM, vorzugsweise 2-6 µM, insbesondere 4 µM und NAA in einer Konzentration von 1-10 µM, vorzugsweise 2-6 µM, insbesondere 5 µM. Je nach Zellteilungsrate und Entwicklung der eingebetteten Zellen erfolgt der Wechsel des Mediums nach 4-12, vorzugsweise 6-10, insbesondere 7-8 Tagen. Schritt 2: Das neue Medium enthält das Phytohormon 2,4-D in einer Konzentration von 2-20, vorzugsweise 5-15, insbesondere 8-12 µM. Die Dauer der Kultivierung beträgt 2-10, vorzugsweise 4-8, insbesondere 5-7 Tage. Danach wird das Medium erneut gewechselt. Schritt 3: Dieses enthält BAP und NAA, wobei die BAP-Konzentration der in Schritt 1 verwendeten entspricht; NAA jedoch in einer Konzentration von 0.1-1, vorzugsweise 0,3-0,8, insbesondere 0,4-0,6 µM. Die Kultivierungsdauer entspricht der in Schritt 1 angegebenen. Schritt 4: Es erfolgt ein erneuter Medienwechsel, jedoch keine Veränderung in der Hormonzugabe. Die Kulturen werden jetzt jedoch bei 16-30, vorzugsweise 20-28, insbesondere bei 24-26°C in einer Lichtperiode von 6-16, vorzugsweise 8-14, insbesondere 11-13 Stunden weiterkultiviert. Die Kulturdauer richtet sich nach dem Entwicklungszustand der Kolonien; vor dem nächsten Subkultivierungsschritt müssen sie eine Mindestgröße von 1 mm Durchmesser erreicht haben. Hierfür werden erfahrungsgemäß 6-14 Tage benötigt. Schritt 5: Die weitere Kultivierung wird auf Festmedium durchgeführt. Hierzu werden die Kolonien aus den Agarosetropfen mittels geeigneter Maßnahmen wie vorsichtiges Zerdrücken der Tropfen oder Auflösen der Agarose oder Zerschneiden derselben freigesetzt und auf Differenzierungsmedium (Tabelle 4) überführt. Pro Petrischale (∅ 10 cm) werden Kolonien aus 2-12, vorzugsweise 4-10, insbesondere 5-7 Agarosetropfen aufgebracht und wie unter Schritt 4 angegeben kultiviert. Step 1: At the beginning of the culture, the phytohormones BAP and NAA are added to the medium added. BAP in a concentration of 1-10 µM, preferably 2-6 µM, especially 4 µM and NAA in a concentration of 1-10 µM, preferably 2-6 µM, in particular 5 µM. Each the medium changes after the cell division rate and development of the embedded cells after 4-12, preferably 6-10, especially 7-8 days. Step 2: The new medium contains the phytohormone 2,4-D in a concentration of 2-20, preferably 5-15, in particular 8-12 µM. The duration of the cultivation is 2-10, preferably 4-8, especially 5-7 days. The medium is then changed again. Step 3: This contains BAP and NAA, with the BAP concentration corresponds to that used in step 1; However, NAA in a concentration from 0.1-1, preferably 0.3-0.8, in particular 0.4-0.6 µM. The cultivation period corresponds to the one specified in step 1. Step 4: The media is changed again, but none Change in hormone addition. However, the cultures are now preferred at 16-30 20-28, especially at 24-26 ° C in a light period of 6-16, preferably 8-14, especially cultivated for 11-13 hours. The duration of the culture depends on the State of development of the colonies; before the next sub-cultivation step, you have to do one Have reached a minimum size of 1 mm in diameter. Experience has shown that 6-14 Days needed. Step 5: The further cultivation is carried out on solid medium. For this the colonies from the agarose drops using appropriate measures such as careful Crushing the drops or dissolving or cutting up the agarose released and transferred to differentiation medium (Table 4). Colonies are made per Petri dish (∅ 10 cm) from 2-12, preferably 4-10, in particular 5-7 drops of agarose applied and as under Step 4 indicated cultivated.
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die Lösung autoklaviert. Sterilfiltrierte Vitamine und Hormone werden anschließend zugesetzt. Die Konzentration an BAP entspricht der unter Schritt 4 angegebenen während NAA in einer Endkonzentration von 0,05-0,4, vorzugsweise 0,08-0,2, insbesondere 0,09-0,12 µM zugesetzt wird. Schritt 6: Sobald die Kalli grüne, organogene Strukturen aufweisen, werden 1-10, insbesondere 3-7, vorzugsweise 4-6 Kalli in Petrischalen (∅ 5 cm), die Sproßmedium (Tabelle 5) enthalten, umgesetzt.The pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8 and the Solution autoclaved. Sterile-filtered vitamins and hormones are then added. The Concentration of BAP corresponds to that given in step 4 during NAA in one Final concentration of 0.05-0.4, preferably 0.08-0.2, in particular 0.09-0.12 µM added becomes. Step 6: As soon as the calli have green, organogenic structures, 1-10, especially 3-7, preferably 4-6 calli in petri dishes (∅ 5 cm), the shoot medium (Table 5) included, implemented.
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die Lösung autoklaviert. Die Vitamine werden nach dem Autoklavieren hinzugegeben. Im weiteren Verlauf der Kultur entwickeln sich kleine Sprosse, die von umgebenden Kallusgewebe befreit werden und anschließend jeweils auf Sproßmedium subkultiviert werden. Da häufig neuer Wundkallus gebildet wird, muß dieser Vorgang des Entfernens von Kallus und Subkultivierung auf frischem Medium meist mehrfach wiederholt werden. Hierbei wird graduell die Wahl des Kultivierungsgefässes der Streckung der Sprosse angepaßt. Schritt 7: Haben die Sprosse eine Lange von 0,5-2, vorzugsweise von 0,8-1,8, insbesondere von 1-1,5 cm erreicht, so werden sie an der Basis abgeschnitten und diese für kurze Zeit in 2-10, vorzugsweise 4- 8, insbesondere 5- 5,5 M NAA-Lösung getaucht. Die weitere Kultivierung erfolgt auf modifiziertem Sproßmedium (Tabelle 6).The pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8 and the Solution autoclaved. The vitamins are added after autoclaving. In the further In the course of the culture, small shoots develop that clear the surrounding callus tissue are and then each subcultivated on shoot medium. Because often new Wound callus is formed, this process of removing callus and subculturing has to be done fresh medium are usually repeated several times. Here, the choice of the Cultivation vessel adapted to the extension of the rung. Step 7: have the rung one Long of 0.5-2, preferably 0.8-1.8, especially 1-1.5 cm, they will be cut off at the base and this for a short time in 2-10, preferably 4-8, especially 5- 5.5 M NAA solution dipped. Further cultivation takes place on modified shoot medium (Table 6).
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die Lösung autoklaviert. Die Vitamine werden nach dem Autoklavieren hinzugegeben. Im weiteren Verlauf bewurzeln sich die Sprosse und bilden kleine Pflanzen. Sprosse, die Wundkallus bilden, müssen erneut abgeschnitten und die NAA-Behandlung wiederholt werden. Die Pflanzen werden nachdem sie eine Größe von 4-5 cm erreicht haben, in steriles Substrat aus Erde und Vermiculite bzw. Sand überführt und im Gewächshaus weiterkultiviert. The pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8 and the Solution autoclaved. The vitamins are added after autoclaving. In the further In the course, the shoots root and form small plants. Rungs that form wound calluses, must be cut again and the NAA treatment repeated. The plants will after reaching a size of 4-5 cm, in sterile soil and vermiculite substrate or sand transferred and cultivated further in the greenhouse.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolation von Protoplasten konnten Ausbeuten an Protoplasten zwischen 2×106 (H. maximiliani, H. nuttallii) - 3×106 (H. giganteus) g-1 Frischgewicht und Teilungsraten (als Maß der Vitalität) nach einer Woche Kultur von 60-70% für alle Genotypen erzielt werden.In the method according to the invention for the isolation of protoplasts, yields of protoplasts between 2 × 10 6 (H. maximiliani, H. nuttallii) - 3 × 10 6 (H. giganteus) g -1 fresh weight and division rates (as a measure of vitality) after one Week culture of 60-70% can be achieved for all genotypes.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Fusion der Protoplasten konnten Fusionsraten von 8-10% für verschiedene Genotypen und Teilungsraten nach einer Woche Kultur von 40-50% erzielt werden, wobei nur ein sehr geringer Verlust durch Absterben der Protoplasten aufgrund der Fusionslösungen zu beobachten war.In the process according to the invention for the fusion of the protoplasts, fusion rates of 8-10% achieved for different genotypes and division rates after a week of culture of 40-50% be, with very little loss due to protoplast death due to Fusion solutions were observed.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Regeneration von interspezifischen Hybriden mit neuen
Eigenschaften (z. B. Pilzresistenz) weist die folgenden Vorteile auf:
The method according to the invention for the regeneration of interspecific hybrids with new properties (e.g. fungal resistance) has the following advantages:
- - Bewurzelung der Regenerate durch kurze Hormonbehandlung, keine Pfropfung notwendig- Roots of the regenerate through short hormone treatment, no grafting necessary
- - Erhalt von zum größten Teil (80%) fertilen Pflanzen- Maintaining fertile plants for the most part (80%)
- - Einbringung von Wildartgenom in die Kultursonnenblume unter Umgehung der Kreuzungsbarriere zwischen den Arten, zum Zwecke des Erhaltens von Pflanzen mit neuen Eigenschaften (z. B. Pilzresistenz).- Introduction of wild species genome into the culture sunflower bypassing the Crossing barrier between species, for the purpose of preserving plants with new ones Properties (e.g. fungal resistance).
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen, 1. die reproduzierbare Isolierung von Protoplasten zum Beispiel aus Wildarten der Sonnenblume, 2. deren effiziente und gleichzeitig schonende Fusion mit Protoplasten zum Beispiel aus der Kultursonnenblume und 3. die Regeneration von interspezifischen, fertilen Hybriden der Arten mit neuen Eigenschaften. Diese Verfahren dienen dazu, die Kreuzungsbarriere zum Beispiel zwischen Kultursonnenblume und deren perennierenden Wildarten zu umgehen und so die in den Wildarten vorhandenen agronomisch interessanten genetischen Eigenschaften zum Beispiel für die Sonnenblumenzüchtung zugänglich zu machen.The methods according to the invention enable 1. the reproducible isolation of Protoplasts, for example, from wild species of sunflower, 2. their efficient and at the same time gentle fusion with protoplasts, for example from the cultivated sunflower and 3. the Regeneration of interspecific, fertile hybrids of the species with new properties. This Processes serve to cross the barrier, for example, between cultivated sunflower and to bypass their perennial game species and thus those present in the game species agronomically interesting genetic properties, for example for sunflower breeding to make it accessible.
Claims (9)
die Inkubation von Streifen der Blätter der obersten zwei bis fünf Nodi in Mesophyll- Enzymlösung, enthaltend Cellulase, Pectolyase, Macerocym und Driselase über 10-24 Stunden bei 10-24°C,
die Erhöhung der Temperatur auf 16-30°C und die Inkubation unter Schütteln über etwa 30 Minuten und
nachfolgender Aufreinigung der Protoplasten.1. A method for obtaining protoplasts from leaves comprising
the incubation of strips of the leaves of the top two to five nodes in mesophyll enzyme solution containing cellulase, pectolyase, macerocym and driselase for 10-24 hours at 10-24 ° C.,
raising the temperature to 16-30 ° C and incubating with shaking for about 30 minutes and
subsequent purification of the protoplasts.
70-110 mM Mannit
40-80 mM CaCl2
20-30 mM Glycin
3-14% DMSO
umfaßt.5. The method according to claim 4, characterized in that the fusion solution 10-25% PEG
70-110 mM mannitol
40-80 mM CaCl 2
20-30 mM glycine
3-14% DMSO
includes.
wobei das Verfahren umfaßt,
die Fusion von Protoplasten gemäß einem der Ansprüche 4-6,
die Regenerierung von Pflanzen oder Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen oder von beidem aus dem Protoplasten und
gegebenenfalls das biologische Replizieren der regenerierten Pflanzen oder des Reproduktionsmaterials von diesen Pflanzen.7. Process for the production of a plant or of reproductive material of this plant,
the method comprising
the fusion of protoplasts according to any one of claims 4-6,
the regeneration of plants or reproductive material from these plants or both from the protoplast and
optionally, the biological replication of the regenerated plants or the reproductive material from these plants.
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