DE19829853A1 - Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung - Google Patents
Verfahren zur interspezifischen HybridisierungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Pflanzen, zur Fusion von Protoplasten und zur Herstellung einer Pflanze mit neuen Eigenschaften nach der Fusion von Protoplasten sowie die Verwendung dieser Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung.
Description
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Pflanzen, zur
Fusion von Protoplasten und zur Herstellung einer Pflanze mit neuen Eigenschaften (z. B.
Pilzresistenz) nach der Fusion von Protoplasten sowie die Verwendung dieser Verfahren zur
interspezifischen Hybridisierung.
Die Verwendung nur einer cytoplasmatisch männlichen Sterilität zur Erstellung von Inzuchtlinien
(Leclerq, Amélior. Plantes 99-109, 1969) in der konventionellen Sonnenblumen-Hybridzüchtung
hat die genetische Variabilität der Sonnenblume stark eingeschränkt. Die zahlreichen Helianthus-
Wildarten zeigen hingegen eine große Variabilität für züchterisch interessante Merkmale wie
Fettsäuregehalt und -zusammensetzung (Seiler, Econom. Bot. 271-279, 1994; Christov, FAO
Progr. Rep. Evaluation of wild Helianthus species 31-62, 1994;) Trockentoleranz,
cytoplasmatische männliche Sterilitat sowie Pilz- und Insektenresistenz (Henn et al. Angew. Bot.
5-9, 1997; Seiler, Field Crop Res. 195-230, 1992; Serieys, FAO Progr. Rep. Gentic Evaluation
and use of Helianthus wild species and their use in breeding programs 18-23, 1987). Somit stellen
die Wildarten der Sonnenblume wichtige Genressourcen für die Kulturform dar und konnten auch
in einigen Fällen erfolgreich eingesetzt werden. Die interspezifische Hybridisierung ist jedoch
aufgrund von Inkompatibilität, genetischer Distanz und erhöhter Chromosomenzahl in vielen
Fällen sehr schwierig, wenn nicht unmöglich. H. annuus kann leicht mit anderen diploiden
annuellen Arten gekreuzt werden, bei den perennierenden Arten wird jedoch häufig das Absterben
des Embryos, geringe Befruchtungsrate und Sterilität der F1-Generation (Seiler 1992 s. o.)
beobachtet. Letzterem kann mit Hilfe einer Colchicinbehandlung entgegengewirkt werden (Jan &
Chandler Crop Sci. 643-646, 1988), doch mit bislang unbekannten Konsequenzen für die weiteren
Generationen. Ähnliche Probleme treten auch bei Anwendung der Methode des "embryo rescue"
auf, einem biotechnologischem Verfahren, in dem das nach Befruchtung gebildete Embryo in die
Sterilkultur überführt wird (Kräuter et al. Theor. Appl Genet. 521-525, 1991). Eine weitere
Möglichkeit, Kreuzungsbarrieren zu überwinden, besteht in der somatischen Zellfusion, bei der
zellwandlose Gewebezellen von Donor- und Akzeptor-pflanzen miteinander verschmolzen werden.
Die entstandenen Hybridzellen können anschließend in Kultur genommen und zu Pflanzen
regeneriert werden.
Die in vitro Propagation wird meist im Zierpflanzenanbau eingesetzt zur Produktion von vielen
genetisch identischen Pflanzen auf einer kleinen Produktionsfläche. Die perennierenden Wildarten
der Sonnenblume stellen Zierpflanzen dar, jedoch werden sie nicht über die in vitro Propagation
vermehrt, da sie als mehrjährige Pflanzen über Rhizome verfügen, die unter Einsatz gärtnerischer
Praxis eine leichte Vermehrung der Pflanzen gewährleisten. Über die in vitro Propagation von
Helianthus giganteus berichteten Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 232-235, 1995) jedoch
mit wenigen technischen Details. Genauere Angaben für die sterile Anzucht und Propagation
gaben Imhoff et al. (Angew. Bot. 70, 137-139, 1996) für Helianthus gigankteus, H. x laetiflorus
und H. pauciflorus.
Die Regeneration von fertilen Pflanzen, ausgehend von H. annuus Protoplasten, wurde bereits mit
verschiedenen Medien sowie Hormonzugaben erreicht. Die Bildung von Sprossen aufgrund von
Embryogenese (Krasnyanski & Menczel, Plant Cell Rep. 12, 260-263, 1993; Barth et al. Bot Acta
106, 220-222, 1993) als auch Organogenese (Binding et al. Zeitschr. f Pflanzenphysiol. 101, 119-130,
1981, Burrris et al. Plant Cell Rep. 10, 161-166, 1991, Fischer et al. Plant Cell Rep. 11, 632-636,
1992) wurde beschrieben. Alle diese Protokolle waren allerdings nur für jeweils wenige
Sonnenblumengenotypen anwendbar. Ein Regenerationsprotokoll, das bei vier getesteten
Sonnenblumensorten, zwar mit unterschiedlicher Effizienz, doch in jedem Fall fertile Pflanzen
ergab, wurde von Wingender et al. (Plant Cell Rep. 15, 742-745, 1996) beschrieben.
Bei Wildarten der Sonnenblume wurde von Protoplasten ausgehende Regeneration von Pflanzen
für H. petiolaris (Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991) und für H. praecox, H.
scaberimus und H. rigidus (Bohorova et al. Plant Cell Rep. 5, 256-258, 1986) berichtet, wobei
letztere keine näheren Angaben zur Kultur machten. Eine hohe Ausbeute an embryogenen Calli
und Pflanzen wurde im Fall von H. giganteus (Krasnyanski et al. Plant Cell Rep. 11, 7-10, 1992)
und H. maximiliani (Polgar & Krasnyanski Plant Sci. 87, 191-197, 1992) erhalten.
Die Regeneration von Hybriden nach Zellfusion von H. annuus und H. giganteus Protoplasten
wurde von Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) beschrieben. Von über
hundert Pflanzen produzierten aber nur zwei nach Selbstung Samen, während alle anderen steril
waren.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue verbesserte Verfahren zur
interspezifischen Hybridisierung von Kultursonnenblume und Wildarten der Sonnenblume
bereitzustellen. Die Lösung dieser Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen und der
nachfolgenden Beschreibung.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein neues Verfahren zur Gewinnung von zellwandlosen Zellen
(Protoplasten) aus Blättern, ein Verfahren zur Fusion von Protoplasten und die Herstellung einer
Pflanze mit neuen Eigenschaften (z. B. Pilzresistenz) nach der Fusion der Protoplasten.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung
von Protoplasten aus Blättern von Wildarten der Sonnenblume (Helianthus ssp.) und zur Fusion
von Protoplasten einer Kultursonnenblume (Helianthus annuus L.) einerseits und einer Wildart
der Sonnenblume (Helianthus ssp.) andererseits und zur Regeneration von einzelnen Hybridzellen
zu voll entwickelten Pflanzen eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern umfaßt die
Inkubation von Streifen der Blätter der obersten zwei bis fünf Nodi in Mesophyll-Enzymlösung,
enthaltend Cellulase, Pectolyase, Macerocym und Driselase über 10-24 Stunden bei 10-24°C, die
Erhöhung der Temperatur auf 16-30°C und die Inkubation unter Schütteln über etwa 30 Minuten
und die nachfolgende Aufreinigung der Protoplasten. Vorzugsweise enthält die Mesophyll-
Enzymlösung 0,05-0,25% Cellulase, 0,01-0,15% Pectolyase, 0,25-1,5% Macerocym und 0,001-0,025%
Driselase. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Gewinnung von Protoplasten stammen die Blätter von einer Helianthus-Wildart.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Fusion von Protoplasten umfaßt das Mischen der
Protoplasten bei einer Dichte von 1-4.4 Millionen Protoplasten/ml, die nachfolgende Zugabe eines
gleichen Volumens einer Fusionslösung, umfassend 10-25% PEG (Polyethylenglycol) und 3-14%
DMSO (Dimethylsulfoxid), die Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur im Licht und
die nachfolgende Zugabe eines Salzpuffers und die Inkubation für 1 bis 3 Stunden bei
Raumtemperatur im Licht. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Fusion von Protoplasten umfaßt die Fusionslösung 10-25% PEG und 6-14%
DMSO, insbesondere 15-20% PEG und 3-7% DMSO. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Fusion der Protoplasten werden
Protoplasten von Helianthus annuus mit Protoplasten einer Helianthus-Wildart fusioniert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Pflanze oder von Reproduktionsmaterial
dieser Pflanze umfaßt die Fusion von Protoplasten gemäß dem vorstehend genannten Verfahren
und die Regenerierung von Pflanzen oder Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen oder von beidem
aus dem Protoplasten und gegebenenfalls das biologische Replizieren der regenerierten Pflanzen
oder des Reproduktionsmaterials von diesen Pflanzen.
Zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Wildarten der Sonnenblume wurde ein von
allen Literaturstellen (Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991; Bohorova et al. Plant Cell
Rep. 5, 256-258, 1986; Krasnyanski et al. Plant Cell Rep. 11, 7-10, 1992; Polgar & Krasnyanski
Plant Sci. 87, 191-197, 1992; Imhoff et al. Angew. Bot. 70, 137-139, 1996) abweichendes
Verfahren entwickelt, das reproduzierbar hohe Ausbeuten vitaler Protoplasten gewährleistet.
Hierbei erwies sich die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zusammensetzung
des Inkubationsmediums, speziell die Konzentration und die Art der eingesetzten Enzyme als
entscheidend. Das erfindungsgemäße Verfahren konnte bei allen bislang getesteten Wildarten der
Sonnenblume eingesetzt werden und erübrigt somit aufwendige Optimierungsschritte für einzelne
Arten. Vor der Weiterverwendung wurden die Protoplasten im Gegensatz zu Chanabe et al. (Plant
Cell Rep. 9, 635-638, 1991), die deutlich längere Inkubationszeiten verwendeten, zwei Stunden
bei Raumtemperatur im Dunklen gelagert, was wesentlich zur Überwindung des
Protoplastierstresses beitrug.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Fusion von Protoplasten gewährleistete bei einer Fusion von
Protoplasten der Kultursorte der Sonnenblume mit denen einer Wildart Fusionsraten von 3-10%.
Abweichend von der üblichen Praxis hierzu nur eine Chemikalie einzusetzen, erwies sich die
Kombination von Polyethylenglykol (PEG) und Dimethylsulfoxid (DMSO) in Konzentrationen
von 10-25% PEG zu 3-14% DMSO als erfolgreich, um die vorstehend genannten Fusionsraten zu
erzielen. Die Verwendung der von Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995)
beschriebenen Methode (25% PEG) brachte in keinem Fall ein zufriedenstellendes Ergebnis.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß das Mischen der Protoplasten bei einer Dichte von 1-
4.4 Millionen Protoplasten/ml, die nachfolgende Zugabe eines gleichen Volumens einer
Fusionslösung, umfassend 10-25% PEG (Polyethylenglycol) und 3-14% DMSO
(Dimethylsulfoxid), die Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur im Licht und die
nachfolgende Zugabe eines Salzpuffers und die Inkubation für 1 bis 3 Stunden bei
Raumtemperatur im Licht zu besonders hohen Fusionsraten führte. Besonders vorteilhaft erwies
sich eine Fusionslösung enthaltend 10-25% PEG und 6-14% DMSO, insbesondere 15-20% PEG
und 3-7% DMSO bei der Fusion von Protoplasten von Helianthus annuus mit Protoplasten einer
Helianthus-Wildart.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Regenerationsverfahren für Hybridzellen,
das den Erhalt von fertilen interspezifischen Hybriden mit den Donorarten H. maximiliani und H.
giganteus gewährleistet. Hierbei war zu beachten, daß die Hybride ein von den jeweiligen
parentalen Genotypen abweichendes Verhalten in der Kultur aufweisen. Es wurden
Einbettungsdichten, Licht- und Temperaturbedingungen sowie die Abfolge des
Phytohormonregimes diesen besonderen Ansprüchen entsprechend entwickelt und eine
Hormonbehandlung zur Bewurzelung eingeführt. Die Regeneration erfolgte in Anlehnung an das
für H. annuus beschriebene Protokoll (Wingender et al. Plant Cell Rep. 742-745, 1996), wobei
jedoch für die Hybride die Zeitspannen der einzelnen Kulturschritte in Abhängigkeit zum
Donorgenotyp modifiziert wurden. Hierbei erwies sich die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-
Behandlung als besonders kritisch, weshalb die Zeitspanne hier auf maximal fünf Tage verkürzt
wurde. Im weiteren Verlauf des Regenerationsprotokolls wurden die Zeitspannen den
Entwicklungszuständen der Mikrokalli und später gebildeten größeren Kalli angepaßt, so daß die
zeitliche Weiterführung der Kulturschritte von Fall zu Fall entschieden wurde. Weiterhin gelang es
erstmalig, die erhaltenen Regenerate mittels einer Auxinbehandlung und weiterer Subkultivierung
auf hormonfreiem Medium zu bewurzeln, wodurch die aufwendige Pfropfung auf eine
Wildunterlage umgangen wurde. Es wurden 125 somatische Hybride zwischen H. annuus und H.
maximiliani sowie 47 somatische Hybride zwischen H. annuus und H. giganteus erhalten. Im
Gegensatz zu Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) wurden nach Selbstung
von allen Pflanzen Samen erhalten, die auch keimfähig waren. Der Hybridcharakter der Pflanzen
konnte auf genetischer Ebene mittels der RAPD-PCR-Analyse bestätigt werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen.
Zur Isolation der Mesophyllzeliprotoplasten (MCPs) werden Blätter der obersten zwei bis fünf
Nodi von einwöchigen bis fünf vorzugsweise zwei bis drei Wochen alten in vitro propagierten
Pflanzen abgeschnitten, in ca. 1 mm breite Streifen geschnitten und in 10-30, vorzugsweise 15-25,
insbesondere 18-22 ml Mesophyll-Enzymlösung, deren Zusammensetzung in Tabelle 1
angegeben ist, im Dunklen inkubiert.
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die
Lösung sterilfiltriert.
In der beispielsweise 10-24, vorzugsweise 14-22, insbesondere 16-20 stündigen ersten Phase
der Inkubation bei beispielsweise 10-24, insbesondere 14-22, vorzugsweise bei 16-20°C wird
zunächst das Gewebe mit der Lösung infiltriert. Nach Erhöhung der Temperatur auf beispielsweise
16-30, insbesondere 20-28, vorzugsweise 24-27°C und Schütteln bei 60 - 110, vorzugsweise
70-90, insbesondere 75-85 rpm werden nach 1-1,5 h die Protoplasten freigesetzt. Zu deren
Aufreinigung wird der gesamte Ansatz zunächst durch ein Edelstahlsieb mit einer Maschenweiten
von 50 µm filtriert und das Filtrat anschließend 2-8, vorzugsweise 3,5-6,5, insbesondere 4,5-5,5
min bei 30-70, vorzugsweise bei 40-60, insbesondere bei 45-55 g zentrifugiert. Die
pelletierten Protoplasten werden in 8 ml Saccharoselösung (0,3-0,7 M Saccharaose, 0,5-1,5
mM CaCl2, 0,1-0,5 mM MES, pH 4-7) resuspendiert und mit 2 ml Salzpuffer (0,1-0,5 M KCl,
0,005-0,015 M CaCl2, 0,1-5 M MES, pH 4-7) überschichtet. In der Interphase dieses
diskontinuierlichen 2-Phasen Gradienten sammeln sich nach erneuter Zentrifugation bei 30-70g,
vorzugsweise bei 40-60g, insbesondere bei 45-55g, für 2-8 min, die intakten Protoplasten. Die
Anzahl der gereinigten Protoplasten wird im Fuchs-Rosenthal-Hämocytometer bestimmt.
Zur Fusion von H. annuus Hypokotylptrotoplasten mit Mesophyllprotoplasten einer Helianthus-
Wildart wurden diese beispielsweise im Verhältnis 1 : 2 (HCPs : MCPs) gemischt und eine Dichte
von 1-4,4, insbesondere 1,5-3, vorzugsweise von 1,8-2,4 Mio Protoplasten/ml eingestellt. Von
dieser Protoplastenmischung werden 150-350, vorzugsweise 180-330, insbesondere 200-300
µl in die Mitte einer Petrischale (∅ 10 cm) gegeben und vorsichtig mit dem gleichen Volumen der
jeweiligen Fusionslösung gemischt. Die Inkubation erfolgt für 10-30, vorzugsweise bei 15-25,
insbesondere 18-22 min bei RT im Licht. Anschließend werden vorsichtig 10-30, vorzugsweise
15-25, insbesondere 18-22 ml Salzpuffer (s. o.) hinzugegeben und für 1-3 vorzugsweise 1,5-2,5,
insbesondere 1,8-2,2 h bei RT im Licht inkubiert. Die Zusammensetzung der jeweiligen
Fusionslösung in Abhängigkeit von der verwenden Wildart wird in Tabelle 2 angegeben.
Die Ansätze werden 2-8, vorzugsweise 3,5-6, insbesondere 4,5-5,5 min bei 80-160,
vorzugsweise bei 100-140, insbesondere bei 110-130g zentrifugiert, das Protoplastenpellet mit
150-250, vorzugsweise 190-230, insbesondere mit 185-215 µl Salzpuffer resuspendiert und
die Gesamtzahl an Protoplasten sowie die Fusionsrate im Fuchs-Rosenthal-Hämocytometer
bestimmt.
Die Protoplasten werden in einer Dichte von 2×104-1×105, vorzugsweise 5×104-9×104,
insbesondere 6×104-8×104 ml-1 in 32-40, vorzugsweise 33-38, insbesondere 34-36°C warme
Agarose (0,5%ig in mKM-Medium nach Wingender et al. Plant Cell Rep. 15, 742-745, 1996 oder
KMAR-Medium nach Schemionek, Dissertation Universität Bonn 1995 oder in VKM-Medium
nach Binding & Nehls Z. Pflanzenphysiol. 85, 279-280, 1977 oder in Kultivierungs-Medium nach
Kao & Michayluk Planta 126, 105-110, 1975) gegeben und in Tropfen von 20-80, vorzugsweise
30-70, insbesondere von 40-60 µl in Plastikpetrischalen (∅ 10 cm) verteilt, wobei pro Schale 10-50,
vorzugsweise 15-35, insbesondere 18-25 Tropfen ausplattiert werden. Nach Erstarren der
Agarose werden die Tropfen mit 5-15, vorzugsweise 9,5-14, insbesondere mit 10-12 ml pro
Petrischale Regenerations-Flüssigmedium (400-700, vorzugsweise 450-650, insbesondere, 550-600 mosml)
überschichtet und bei 16-30, vorzugsweise 20-28, insbesondere bei 24-26°C im
Dunkeln inkubiert. Im Verlauf der Kultur wird das Flüssigmedium zwei- bis fünfmal gewechselt,
wobei der Zeitpunkt des Wechsels vom Entwicklungsstadium der Zellen bzw. Mikrokolonien
bestimmt wird. Bei jedem Mediumwechsel wird die Osmolarität des Mediums um 70-140
mosmol verringert und die Hormonzusammensetzung verändert.
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die
Lösung sterilfiltriert.
Schritt 1: Zu Beginn der Kultur werden dem Medium die Phytohormone BAP und NAA
zugesetzt. BAP in einer Konzentration von 1-10 µM, vorzugsweise 2-6 µM, insbesondere 4 µM
und NAA in einer Konzentration von 1-10 µM, vorzugsweise 2-6 µM, insbesondere 5 µM. Je
nach Zellteilungsrate und Entwicklung der eingebetteten Zellen erfolgt der Wechsel des Mediums
nach 4-12, vorzugsweise 6-10, insbesondere 7-8 Tagen. Schritt 2: Das neue Medium enthält
das Phytohormon 2,4-D in einer Konzentration von 2-20, vorzugsweise 5-15, insbesondere 8-12 µM.
Die Dauer der Kultivierung beträgt 2-10, vorzugsweise 4-8, insbesondere 5-7 Tage.
Danach wird das Medium erneut gewechselt. Schritt 3: Dieses enthält BAP und NAA, wobei die
BAP-Konzentration der in Schritt 1 verwendeten entspricht; NAA jedoch in einer Konzentration
von 0.1-1, vorzugsweise 0,3-0,8, insbesondere 0,4-0,6 µM. Die Kultivierungsdauer entspricht
der in Schritt 1 angegebenen. Schritt 4: Es erfolgt ein erneuter Medienwechsel, jedoch keine
Veränderung in der Hormonzugabe. Die Kulturen werden jetzt jedoch bei 16-30, vorzugsweise
20-28, insbesondere bei 24-26°C in einer Lichtperiode von 6-16, vorzugsweise 8-14,
insbesondere 11-13 Stunden weiterkultiviert. Die Kulturdauer richtet sich nach dem
Entwicklungszustand der Kolonien; vor dem nächsten Subkultivierungsschritt müssen sie eine
Mindestgröße von 1 mm Durchmesser erreicht haben. Hierfür werden erfahrungsgemäß 6-14
Tage benötigt. Schritt 5: Die weitere Kultivierung wird auf Festmedium durchgeführt. Hierzu
werden die Kolonien aus den Agarosetropfen mittels geeigneter Maßnahmen wie vorsichtiges
Zerdrücken der Tropfen oder Auflösen der Agarose oder Zerschneiden derselben freigesetzt und
auf Differenzierungsmedium (Tabelle 4) überführt. Pro Petrischale (∅ 10 cm) werden Kolonien
aus 2-12, vorzugsweise 4-10, insbesondere 5-7 Agarosetropfen aufgebracht und wie unter
Schritt 4 angegeben kultiviert.
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die
Lösung autoklaviert. Sterilfiltrierte Vitamine und Hormone werden anschließend zugesetzt. Die
Konzentration an BAP entspricht der unter Schritt 4 angegebenen während NAA in einer
Endkonzentration von 0,05-0,4, vorzugsweise 0,08-0,2, insbesondere 0,09-0,12 µM zugesetzt
wird. Schritt 6: Sobald die Kalli grüne, organogene Strukturen aufweisen, werden 1-10,
insbesondere 3-7, vorzugsweise 4-6 Kalli in Petrischalen (∅ 5 cm), die Sproßmedium (Tabelle
5) enthalten, umgesetzt.
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die
Lösung autoklaviert. Die Vitamine werden nach dem Autoklavieren hinzugegeben. Im weiteren
Verlauf der Kultur entwickeln sich kleine Sprosse, die von umgebenden Kallusgewebe befreit
werden und anschließend jeweils auf Sproßmedium subkultiviert werden. Da häufig neuer
Wundkallus gebildet wird, muß dieser Vorgang des Entfernens von Kallus und Subkultivierung auf
frischem Medium meist mehrfach wiederholt werden. Hierbei wird graduell die Wahl des
Kultivierungsgefässes der Streckung der Sprosse angepaßt. Schritt 7: Haben die Sprosse eine
Lange von 0,5-2, vorzugsweise von 0,8-1,8, insbesondere von 1-1,5 cm erreicht, so werden sie
an der Basis abgeschnitten und diese für kurze Zeit in 2-10, vorzugsweise 4- 8, insbesondere 5-
5,5 M NAA-Lösung getaucht. Die weitere Kultivierung erfolgt auf modifiziertem Sproßmedium
(Tabelle 6).
Der pH wird auf 4,0-7,0, vorzugsweise auf 5,0-6,5, insbesondere auf 5,5-5,8 eingestellt und die
Lösung autoklaviert. Die Vitamine werden nach dem Autoklavieren hinzugegeben. Im weiteren
Verlauf bewurzeln sich die Sprosse und bilden kleine Pflanzen. Sprosse, die Wundkallus bilden,
müssen erneut abgeschnitten und die NAA-Behandlung wiederholt werden. Die Pflanzen werden
nachdem sie eine Größe von 4-5 cm erreicht haben, in steriles Substrat aus Erde und Vermiculite
bzw. Sand überführt und im Gewächshaus weiterkultiviert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolation von Protoplasten konnten Ausbeuten an
Protoplasten zwischen 2×106 (H. maximiliani, H. nuttallii) - 3×106 (H. giganteus) g-1
Frischgewicht und Teilungsraten (als Maß der Vitalität) nach einer Woche Kultur von 60-70%
für alle Genotypen erzielt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Fusion der Protoplasten konnten Fusionsraten von 8-10%
für verschiedene Genotypen und Teilungsraten nach einer Woche Kultur von 40-50% erzielt
werden, wobei nur ein sehr geringer Verlust durch Absterben der Protoplasten aufgrund der
Fusionslösungen zu beobachten war.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Regeneration von interspezifischen Hybriden mit neuen
Eigenschaften (z. B. Pilzresistenz) weist die folgenden Vorteile auf:
- - Bewurzelung der Regenerate durch kurze Hormonbehandlung, keine Pfropfung notwendig
- - Erhalt von zum größten Teil (80%) fertilen Pflanzen
- - Einbringung von Wildartgenom in die Kultursonnenblume unter Umgehung der Kreuzungsbarriere zwischen den Arten, zum Zwecke des Erhaltens von Pflanzen mit neuen Eigenschaften (z. B. Pilzresistenz).
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen, 1. die reproduzierbare Isolierung von
Protoplasten zum Beispiel aus Wildarten der Sonnenblume, 2. deren effiziente und gleichzeitig
schonende Fusion mit Protoplasten zum Beispiel aus der Kultursonnenblume und 3. die
Regeneration von interspezifischen, fertilen Hybriden der Arten mit neuen Eigenschaften. Diese
Verfahren dienen dazu, die Kreuzungsbarriere zum Beispiel zwischen Kultursonnenblume und
deren perennierenden Wildarten zu umgehen und so die in den Wildarten vorhandenen
agronomisch interessanten genetischen Eigenschaften zum Beispiel für die Sonnenblumenzüchtung
zugänglich zu machen.
Claims (9)
1. Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern umfassend
die Inkubation von Streifen der Blätter der obersten zwei bis fünf Nodi in Mesophyll- Enzymlösung, enthaltend Cellulase, Pectolyase, Macerocym und Driselase über 10-24 Stunden bei 10-24°C,
die Erhöhung der Temperatur auf 16-30°C und die Inkubation unter Schütteln über etwa 30 Minuten und
nachfolgender Aufreinigung der Protoplasten.
die Inkubation von Streifen der Blätter der obersten zwei bis fünf Nodi in Mesophyll- Enzymlösung, enthaltend Cellulase, Pectolyase, Macerocym und Driselase über 10-24 Stunden bei 10-24°C,
die Erhöhung der Temperatur auf 16-30°C und die Inkubation unter Schütteln über etwa 30 Minuten und
nachfolgender Aufreinigung der Protoplasten.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mesophyll-Enzymlösung
0,05-0,25% Cellulase, 0,01-0,15% Pectolyase, 0,25-1,5% Macerocym und 0,001-0,025%
Driselase enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Blätter von einer
Helianthus-Wildart stammen.
4. Verfahren zur Fusion von Protoplasten durch
Mischen der Protoplasten bei einer Dichte von 1-4.4 Millionen Protoplasten/ml,
nachfolgender Zugabe eines gleichen Volumens einer Fusionslösung, umfassend 10-25%
PEG und 3-14% DMSO, Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur im Licht und
nachfolgender Zugabe eines Salzpuffers und Inkubation für 1 bis 3 Stunden bei
Raumtemperatur im Licht.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fusionslösung
10-25% PEG
70-110 mM Mannit
40-80 mM CaCl2
20-30 mM Glycin
3-14% DMSO
umfaßt.
70-110 mM Mannit
40-80 mM CaCl2
20-30 mM Glycin
3-14% DMSO
umfaßt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß Protoplasten von
Helianthus annuus mit Protoplasten einer Helianthus-Wildart gemischt werden, um Pflanzen
mit neuen Eigenschaften zu erhalten.
7. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze oder von Reproduktionsmaterial dieser Pflanze,
wobei das Verfahren umfaßt,
die Fusion von Protoplasten gemäß einem der Ansprüche 4-6,
die Regenerierung von Pflanzen oder Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen oder von beidem aus dem Protoplasten und
gegebenenfalls das biologische Replizieren der regenerierten Pflanzen oder des Reproduktionsmaterials von diesen Pflanzen.
wobei das Verfahren umfaßt,
die Fusion von Protoplasten gemäß einem der Ansprüche 4-6,
die Regenerierung von Pflanzen oder Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen oder von beidem aus dem Protoplasten und
gegebenenfalls das biologische Replizieren der regenerierten Pflanzen oder des Reproduktionsmaterials von diesen Pflanzen.
8. Pflanzen erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 7.
9. Pflanzenzellen erhältlich durch die Fusion der Protoplasten gemäß einem der Ansprüche 4-6.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998129853 DE19829853A1 (de) | 1998-07-03 | 1998-07-03 | Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung |
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| AU58480/99A AU5848099A (en) | 1998-07-03 | 1999-07-05 | Methods for interspecific hybridization |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998129853 DE19829853A1 (de) | 1998-07-03 | 1998-07-03 | Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| DE19829853A1 true DE19829853A1 (de) | 2000-01-05 |
Family
ID=7872937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1998129853 Withdrawn DE19829853A1 (de) | 1998-07-03 | 1998-07-03 | Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung |
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- 1998-07-03 DE DE1998129853 patent/DE19829853A1/de not_active Withdrawn
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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