DE19737436A1

DE19737436A1 - Inhibition der Monozyten-Extravasation

Info

Publication number: DE19737436A1
Application number: DE1997137436
Authority: DE
Inventors: Hermann Graf; Helmut Wachtel
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1997-08-21
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 1999-02-25

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von PDE-IV-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Supression der Zytokin-aktivierten Monozytenextravasation sowie deren synergistisch wirkende Kombination mit Prostacyclin- oder Carbacyclinderivaten.

Die Extravasation monozytärer Zellen ist von wesentlicher Bedeutung für Umfang und Verlauf einer Entzündung und zugleich bedeutend für die Einleitung regenerativer Prozesse im Entzündungsgebiet. Sie beinhaltet mehrere Einzelprozesse wie die Wanderung dieser Zellen durch die Barriere des Gefäßendothels und eine bidirectionale Kommunikation zwischen Zellen des peripheren Blutes und Endothelzellen (Übersicht bei H.Nielsen, 1990, Davies et al. 1988). So findet man eine selektiv erhöhte Extravasationsrate von Monozyten beispielsweise bei Vaskulitiden, Artherosklerose und bei Fibrosen.

Im Entzündungsgebiet werden Zytokine und Wachstumsfaktoren freigesetzt, die sowohl zirkulierende Monozyten wie das benachbarte Gefäßendothel aktivieren. Interleukin- 8 und MCP-1 sind selektive Faktoren des aktivierten Gefäßendothels, die vor allem die Rekrutierung und Extravasation von Granulozyten und Monozyten induzieren.

Andere endotheliale Faktoren wie Stickstoffmonoxid (NO), Prostacyklin (PGI₂) und Interleukin-1(Il-1) modulieren den Gefäßtonus, die vaskuläre Permeabilität und die adhäsiven Eigenschaften des Endothels selbst.

Prostacyklin-vermittelte Effekte wurden bisher weitgehend zur Endothel-Thrombozyten- Interaktion berichtet. PGI₂ hemmt die Aggregation von Thrombozyten durch eine Rezeptor-vermittelte Aktivierung der Adenylatzyklase und trägt so zur antithrombotischen Funktion der Gefäßwände bei. Es konnte gezeigt werden, daß PGI₂ auch zur Barrierefunktion des Endothels beiträgt, antiödematös wirkt, die Adhärenz von Neutrophilen an die Gefäßwand inhibiert und die Chemotaxis von Leukozyten verringert. Für alle diese Endothel-abhängigen, PGI₂-vermittelten Effekte wurde cAMP als sekundärer Botenstoff nachgewiesen.

Die direkten Effekte von Prostacyclinen und PDE IV-Inhibitoren auf die Pharmakologie von Monozyten sind nur fragmentarisch untersucht worden. Die Effekte auf die transendotheliale Migration humaner, peripherer Blutmonozyten unter dem Einfluß verschiedener chemotaktischer Stimuli wurde in einem Zwei-Kompartment-System untersucht, in dem postkonfluente Monolayer Rinderendothelzellen auf porösen Polycarbonatmembranen die Barriere für Blutmonozyten bilden. Diese Anordnung erlaubt Untersuchungen zur Rolle von Monozyten kund Endothel bei der transendothelialen Migration unter der Wirkung entzündlicher Mediatoren wie formyl-Methionyl-Leucyl Phenylalamine(fMLP) und Leukotrien B4 (LTB4) und ist so ein Modell für die Extravasation von humanen Blutmonozyten durch das Gehirnendothel. Es wurden hochreine Monozytenpräparationen verwendet, die keine Kontamination durch Thrombozyten aufwiesen.

Es ist bekannt daß das Enzym Phosphodiesterase (PDE) in den cAMP und cGMP- Katabolismus eingreift und daß durch Inhibitoren der PDE der Abbau von cAMP und cGMP innerhalb der Zelle vermindert wird. Durch den gezielten Eingriff in die Signalfunktion dieser bedeutenden intrazellulären Transmitter werden eine Vielfalt biochemischer Reaktionen beeinflußt und es wird die Möglichkeit eröffnet, Verbindungen mit neuem Wirkprofil zu finden. Durch die Identifizierung von mindestens 5 Familien von PDE-Isoenzymen konnte die Selektivität der Stoffe gesteigert werden. Als Folge der intrazellulären cAMP-Erhöhung wird die Synthese und Freisetzung verschiedener Zytokine, welche entzündungsfördernde und zelltoxische Wirkungen ausüben, gehemmt.

Um die Mediatorfunktion von cAMP in dieser Anordnung zu belegen, wurde die Wirkung unterschiedlicher Inhibitoren der Zytokin-Aktivierung untersucht.

Es wurde gefunden, daß PDE-IV-Inhibitoren die Endothelbarriere für die Monozyten extravasation erhöhen und die Chemotaxis von Monozyten unterdrücken. Durch Kombination von Prostacyclin- oder Carbacyclinderivaten und PDE-W-Inhibitoren werden die Effekte synergistisch verstärkt. Die Studien zeigen auch, daß humane Blutmonozyten in Abwesenheit von Endothelzellen durch die genannten Substanzen in ihrem Migrationsverhalten nicht beeinflußt werden, jedoch die transendotheliale Migration gehemmt wird.

Monozyten und davon im Parenchym abgeleitete Makrophagen spielen eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Multiplen Sklerose (F.M. Hofman, 1986). Sie reichem sich perivaskulär im Gebiet aktiver Plaques an und sind wahrscheinlich an der Präsentation von Autoantigenen, an der Phagozytose und an der Demyelinisierung von Neuronen in der Plaqueregion verantwortlich. Eine Hemmung der Extravasation von Blutmonozyten durch eine Kombination von cAMP-Mimetika und PDE-IV-Inhibitoren erscheint deshalb als wertvolle therapeutische Strategie für die Behandlung der Multiplen Sklerose.

Erfindungsgemäß geeignet sind Verbindungen, die phosphodiesterasehemmende Eigenschaften besitzen und insbesondere solche Verbindungen die spezifisch PDE-IV hemmen, d. h. Verbindungen, die an PDE IV binden oder diese hemmen (nach der Klassifizierung von J.A. Beavo und D.A. Reifsnyder, Trends Pharmacol. Sci. 11; 150-155, 1990).

Die selektive Inhibition der PDE IV kann nach üblichen Methoden bestimmt werden, wie beispielsweise beschrieben wird in einem Artikel von Nicholson et al., Trends Pharmacol. Sci., 12: 19-27 (1991).

Erfindungsgemäß geeignet sind Verbindungen, die beispielsweise beschrieben sind in: WO 860226, WO 9115451, DE 195 02 049.9; U.S.P. 4.193.926, U.S.P. 4.186.129; EP 247725; U.S.P. 5.064.854; N.A. Saccamono et al., 3. Med, Chem. 34 291-298, P.J. Vinick al.; J. Med. Chem. 34 86-89, 1991; J.A. Lowe et al., 3. Med. Chem. 34 624-628, 1991, 470805, M.J. Ashton et al, J. Med. Chem. 1994. 37, 1696-1703; D.R. Buckle J. Med. Chem. 1994 37, 476-485.

Besonders geeignet sind razemische und optisch aktive Verbindungen der Formel I

worin
R¹ C_1-6-Alkyl, einen Heterocyclus oder OR⁵ und
R⁵ H, C₁-C₆-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, C_2-6-Alkenyl, C_3-7-Alkinyl, C_3-7-Cycloalkyl C_1-2-alkyl, C_7-8-Bicycloalkyl, Aryl, Aralkyl, ein Heterocyclus oder C_1-6-Alkyl substituiert mit einem oder mehreren Halogenen, Hydroxy, Carboxy, C_1-4-Alkoxy, C_1-4-Alkoxycarbonyl, oder einer gegebenenfalls mit Alkyl substituierten Aminogruppe,
R² C_1-4-Alkyl, C_2-4-Alkenyl oder -Alkinyl;
R³ ein Wasserstoffatom, C_1-6-Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Aryl substituiert mit 1 oder 2 Methylgruppen oder C_1-6-Alkanoyl;
R⁴ ein Wasserstoffatom oder C_1-6-Alkyl;
Y eine Direktbindung oder eine CH₂-Gruppe;
X -CH_2-, -CH₂-CH_2-, -NH oder Sauerstoff bedeutet und deren pharmazeutisch anwendbaren Salze.

Bevorzugt sind die razemischen und optisch aktiven Verbindungen der Formel I worin
R² Methyl,
R³ Wasserstoff oder C_1-6-Alkanoyl,
R¹ OR⁵;
R⁴ Hydrogen oder C_1-6-Alkyl,
Y eine Direktbindung und
X eine CH₂-Gruppe oder Sauerstoff bedeutet, insbesondere Verbindungen der Formel I, worin R³ Wasserstoff ist.

Ganz besonders geeignet sind die razemischen und optisch aktiven Verbindungen der Formel I, worin X Sauerstoff ist.

Alkyl bedeutet jeweils z. B. geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sek.-Butyl, Isobutyl, tert. -Butyl, Pentyl, 2- Methyl-butyl, 2,2-Dimethylpropyl und Hexyl.

Alkenyl bedeutet jeweils z. B. Vinyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl oder 3-Methyl-2-propenyl und Alkinyl bedeutet z. B. 2-Propinyl.

Unter Cycloalkyl ist beispielsweise Cyclopropyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl zu verstehen.

Aryl oder Aralkyl bedeutet jeweils einen aromatischen Ring oder Ringsystem mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einen Monocyclus wie beispielsweise Phenyl, Benzyl, Phenethyl oder Naphthyl.

Der Ausdruck "Heterocyclus" umfaßt einen 5- oder 6-gliedrigen gesättigten Heterocyclus mit einem Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom wie beispielsweise 2- und 3-Tetra hydropyranyl, 2- und 3-Tetrahydrofuranyl, Dihydropyranyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl, Pipe ridinyl sowie N-Alkyl-Pyrrolidinyl und N-Alkyl-Piperidinyl worin der Alkylrest 1-4 Koh lenstoffatome enthält. Ebenso umfaßt werden Heterocyclen mit mehr als einem Heteroatom wie Morpholin, Piperazin und N-Alkyl-Piperazin.

Unter Halogen ist Chlor, Fluor, Brom und Jod zu verstehen.

Als Bicycloalkyle kommen beispielsweise Bicyclo [2.2.1]hept-2-yl, Bicyclo[2.2.2]oct-2-yl, Bicyclo[3.2.1]oct-3-yl in Betracht.

Die Herstellung der Verbindungen der Formel I, deren Salze und optisch aktiven Verbindungen kann nach den in den oben genannten Referenzen beschriebenen Verfahren oder analog zu den dort beschriebenen Verfahren erfolgen oder nach USP 4.153.713; USP 4.186.129; USP 5.298.628; WO 8602268; EP 02 47 725; USP 4,193,926.

Die Dosierung der PDE IV Inhibitoren wird von 0,005 bis 0,1 mg/kg/Tag beschrieben.

Aus keiner der genannten Publikationen ist ersichtlich, daß PDE Inhibitoren als Inhibitoren der Zytokin-aktivierten Monozytenextravasation verwendet werden können.

Da die Regelfunktion der genannten Zelltypen unter physiologischen Bedingungen nicht beeinflußt wird, sind PDE-Inhibitoren sowie deren synergistische Kombinationen geeignet zur Behandlung von Erkrankungen, die über die Zytokin-aktivierte Monozytenextravasation vermittelt werden. Dies sind insbesondere entzündliche Erkrankungen wie Asthma, ARDS (Akutes Atemnotsyndrom), Arteriosklerose, die Crohn- Krankheit, Enzephalitiden, Glomerulonephritis, Idiophatische pulmonare Fibrose, Insulin abhängiger Diabetes Mellitus, Multiple Sklerose, Myocarditis, Restenose nach Ballonkatheterdilatation sklerotischer Blutgefäße, Rheumatische Arthritis, Vaskulitis, Sklerodermie, systemischer Lupus Erythematosus, Organschädigung nach Reperfusion.

Es ist bekannt, daß Prostacyclin-, Carbacyclin bzw. Isocarbacyclin-Derivaten insbesondere cardiovaskuläre und thrombolytische Wirksamkeit besitzen und in Kombinationen beispielsweise mit β-Blockern zur Prophylaxe und Therapie ischaemischer Attacken im ZNS eingesetzt werden können (EP-00 86 404).

Die Verwendung von Prostacyclinen, Carbacyclinen bzw. Isocarbacyclinen zur Behandlung von Immunantworten wird in verschiedenen Publikationen beschrieben. So wird die Behandlung von antiallergischen Eigenschaften in EP 0 011 591 und EP 0 055 208 beschrieben. In der Publikation von H.J. GRUNDMANN et al. (1992) J. Infect. Dis. 1992 165: 1-5 wird die Verwendung von Iloprost, bei der Behandlung von septischem Schock ausführlich dargelegt. In der deutschen Patentanmeldung DE-OS 41 04 607 A1 wird die Therapie von AIDS und Diabetes mit Hilfe von Prostan-Derivaten erwähnt. Die Publikation K. SLIWA et al. (1991) Infection and Immunity, 59: 3846-3848, befaßt sich mit der Behandlung von zerebraler Malaria mit Iloprost. In der deutschen Offenlegungsschrift DE-OS 42 02 665 wird die Behandlung von multipler Sklerose durch Prostacyclin- und Carbacyclinderivaten beschrieben.

Die für die erfindungsgemäße Kombination geeigneten Prostacyclin-, Carbacyclin- bzw. Isocarbacyclinderivate sind beispielsweise in EP 0 011 591, EP 0 055 208, EP 0 099 538, EP 0 119 949, EP 0 084 856, Prostaglandins 42: 225-237, 1991; Arteriosclerosis and Thrombosis 13: 435-444, 1993; J. Med. Chem. 1993, 36, 3871-3883, J. Med. Chem. 1993, 36, 3884-3903 beschrieben.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Verbindungen der Formel II, IIA oder IIB

worin
R¹ Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl,
n 0, 1, 2 oder 3
X, Y unabhängig voneinander Sauerstoff oder eine CH₂-Gruppe,
Z Wasserstoff, Fluor oder CN,
R³ eine freie oder funktionell abgewandelte Hydroxygruppe,
R⁴ Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl,
A trans -CH=CH-, -C∼C- oder -CH₂-CH₂-,
W eine freie oder funktionell abgewandelte Hydroxymethylengruppe, wobei die Hydroxygruppe α- oder β-ständig sein kann,
D eine geradkettige oder verzweigte C_1-6-Alkylengruppe oder eine Direktverbindung,
E Wasserstoff, -C∼C-R² oder C_5-6-Cycloalkyl,
R² eine geradkettige oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte C_1-4-Alkylgruppe, und falls R¹ Wasserstoff bedeutet deren physiologisch verträgliche Salze mit Basen sowie deren α-, β- oder γ-Cyclodextrin-Clathrate oder deren mit Liposomen verkapselte Form.

Als Alkylgruppen R¹, R², R⁴ und als Alkylengruppe D seien beispielsweise genannt:
Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. Butyl, Pentyl, 2-Methyl-butyl, 2,2- Dimethylpropyl, Hexyl, Methylen, Ethylen, 1- oder 2-Propylen, Ethylethylen, Trimethylen, Tetramethylen, Pentamethylen, 1-Methyldimethylen, 1-Methyl-trimethylen, 1-Methyltetramethylen, 1,2-Dimethylethylen.

Als Cycloalkyle seien Cyclopentyl und Cyclohexyl genannt.

Die Hydroxygruppen in R³ und W können als freie Hydroxygruppen vorliegen, wobei die Hydroxygruppe in W bevorzugt α-ständig ist, oder funktionell abgewandelt sein kann, beispielsweise durch Veretherung oder Veresterung. Freie Hydroxygruppen werden bevorzugt. Als Ether- oder Acylreste kommen die dem Fachmann bekannten Reste in Betracht. Bevorzugt sind leicht spaltbare Etherreste wie beispielsweise Tetrahydropyranyl, Tetrahydrofuranyl, α-Ethoxyethyl, Trimethylsilyl, Dimethyl-tert.-butylsilyl, Diphenyl tert.-butylsilyl oder -Tribenzylsilyl. Als Acylreste seien beispielsweise genannt: Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl oder Benzoyl.

Zur Salzbildung mit den freien Säuren (R¹ = H) sind anorganische und organische Basen geeignet, wie sie dem Fachmann zur Bildung physiologisch verträglicher Salze bekannt sind. Beispielsweise seien genannt: Alkylhydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, Erdalkalihydroxide wie Calciumhydroxid, Ammoniak, Amine wie Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, N-Methylglucamin, Morpholin, Tris(hydroxymethyl) methylamin usw.

Die Clathrate mit α-, β- oder γ-Cyclodextrin werden analog der Vorschrift WO 87/05294 erhalten. Bevorzugte Clathrate sind die mit β-Cyclodextrin.

Liposomen werden z. B. nach dem in "Pharmazie in unserer Zeit 11, 98 (1982)" beschriebenen Verfahren hergestellt.

Bevorzugt sind die Verbindungen der Formel I, worin
Z Wasserstoff,
X -CH₂-,
R⁴ Wasserstoff,
A trans-CH=CH- oder -C∼C-,
n 1 oder 3,
D geradkettiges oder verzweigtes C_{3 ä5}-Alkylen,
E Wasserstoff oder -C∼C-R² und
R² C_1-2-Alkyl bedeutet sowie
Beraprost, und deren Salze, Cyclodextrinclathrate und mit Liposomen verkapselte Form.

Als bevorzugte Verbindungen seien Cicaprost, Eptaloprost, Ciprosten, Beraprost und Iloprost genannt. Die Herstellung der geeigneten Prostacyclin-, Carbacyclin- bzw. Isocarbacyclin-Derivate ist in den oben genannten Patentanmeldungen, Patentschriften, und Publikationen beschrieben oder erfolgt analog zu den dort beschriebenen Verfahren.

Die Dosierung der Prostacyclin- und Carbacyclinderivate beträgt je nach Art und Schwere der Erkrankung und Alter und Gewicht des Patienten 1-1500 µkg/Tag. Die Dosierung einer i.v. Verabreichung als Dauerinfusion in üblichen wäßrigen Lösungsmitteln, z. B. 0,9%iger NaCl-Lösung, erfolgt vorzugsweise in Dosierungen zwischen 0,1 ng/kg/min und 0,1 µg/kg/min.

Von besonderer Bedeutung ist die Verwendung von Iloprost oder Cicaprost in dem Kombinationspräparat.

Durch Kombination von PDE IV-Inhibitoren mit Prostacyclin- und Carbacyclinderivaten werden unterschiedliche pathobiochemische Prozesse beeinflußt und durch synergistische und additive Effekte die Dosierung der einzelnen Komponenten so verringert, daß ein maximaler Therapieerfolg bei geringeren Nebenwirkungen erzielt wird. Ein weiterer Vorteil der Kombination liegt darin, daß bei Dauermedikation neben der Prevention und der Verhinderung einer weiteren Progression der Erkrankung auch eine Restitution des betroffenen Hirnareals hinsichtlich Struktur und Funktion möglich erscheint.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der Kombination zur Prävention der MS und/oder zur Verbesserung der Krankheitssymptome und/oder Verzögerung oder Verhinderung der Krankheitsschübe und/oder zur Unterdrückung der Autoimmunantwort.

Erfindungsgemäß können mit dem Kombinationspräparat entzündliche Prozesse des ZNS behandelt werden wie MS und Formen der MS wie Neuromyelitis Optica (Decic's Disease), Diffuse Sklerosis, Akute Dissem. Encephalomyelitis, Optische Neuritis, aber auch Guillain-Barre's Syndrom, virus-, bakterielle- oder parasitäre Demyelinierung oder andere degenerative Hirnerkrankungen wie Encephalopathien durch HIV-, Meningococcen oder Toxoplasma-Infektionen, Cerebrale Malaria, Lyme's Disease u. a..

Durch die erfindungsgemäße Kombination wird neben der symptomatischen Verbesse rung auch das Einsetzen der akuten Entzündungsphase blockiert oder reduziert und die Permeationsbarriere der Blut-Hirn-Schranke normalisiert und die Freisetzung cytotoxi scher Mediatoren aus Zellen des Immunsystems, Endothel- bzw. Gliazellen supprimiert und Zellen regeneriert.

Die Komponenten der Kombination können in einer pharmazeutischen Zubereitung oder in getrennten pharmazeutischen Zubereitungen gleichzeitig, getrennt oder zeitlich abgestuft verabreicht werden.

Die Mittel werden nach üblichen Verfahren hergestellt, indem man den Wirkstoff mit geeigneten Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen in die Form eines pharmazeutischen Präparates bringt, das für die enterale oder parenterale Applikation geeignet ist. Die Applikation kann oral oder sublingual als Feststoff in Form von Kapseln oder Tabletten oder als Flüssigkeit in Form von Lösungen, Suspensionen, Elexieren, Aerosolen oder Emulsionen oder rektal in Form von Suppositorien oder in Form von gegebenenfalls auch subcutan anwendbaren Injektionslösungen oder topisch oder intrathekal erfolgen. Als Hilfsstoffe für die gewünschte Arzneimittelformulierung sind die dem Fachmann bekannten inerten organischen und anorganischen Trägermaterialien geeignet wie z. B. Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Polyalkylenglykole usw. Gegebenenfalls können darüberhinaus Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel, Emulgatoren oder Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffer enthalten sein.

Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Suppositoren, Kapseln oder in flüssiger Form z. B. als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.

Als Trägersysteme können auch grenzflächennahe Hilfsstoffe wie Salze, Gallensäuren oder tierische oder pflanzliche Phospholipide, aber auch Mischungen davon sowie Liposome oder deren Bestandteile verwendet werden.

Für die orale Anwendung sind insbesondere Tabletten, Dragees oder Kapseln mit Talkum und/oder Kohlenwasserstoffträger oder -binder, wie z. B. Lactose, Mais- oder Kartoffelstärke, geeignet. Die Anwendung kann auch in flüssiger Form erfolgen, wie z. B. als Saft, dem gegebenenfalls Süßstoff beigefügt wird.

Für die parenterale Anwendung sind insbesondere Injektionslösungen oder Suspensionen, insbesondere wäßrige Lösungen der aktiven Verbindungen in polyhydroxyethoxyliertem Rizinusöl, geeignet oder auch implantierte Minipumpen mit verzögerter Wirkstoff freigabe.

Das pharmazeutische Erzeugnis kann in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosierungen z. B. 2, 3 oder 4 mal pro Tag verabreicht werden oder durch eine osmotische Pumpe, die eine kontinuierliche Applikation ermöglichen. Die Wirkstoffe können gleichzeitig in einer einzigen oder getrennten Dosierung oder zu unterschiedlichen Zeiten beispielsweise abwechselnd verabreicht werden.

Die Dosierung der jeweiligen Einzelkomponenten oder der Kombination kann je nach Art der Anwendung, Alter und Gewicht des Patienten, Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung variieren.

Im allgemeinen ist jedoch die Dosierung geringer als bei einem rein additiven Effekt zu erwarten ist. Beispielsweise beträgt die wirksame Dosis des Prostacyclin-, Carbacyclin oder Isocarbacyclindenvates von 0,01 µg/kg/Tag bis 100 µg/kg/Tag und des PDE IV Inhibitors von 0,1 µg/kg/Tag bis 0,1 mg/kg/Tag.

Methoden Monozytenpräparatioon

300 ml venöses Blut von gesunden männlichen Probanden wurde mit mit EDTA in steriler physiologische Kochsalzlösung anticoaguliert (0,27%w/v final). Nycodenz® wurde bis zu einer Dichte von 1.077 zugesetzt und diese Suspension bei 1500 × g 30 Minuten zentrifugiert. Periphere Blutmonozyten wurden mit Hilfe einer Sanderson- Kammer in einer Beckinan-JE5 Zentrifuge durch Gegenstromzentrifugation isoliert. Hierzu wurde der lenkozytenreiche Überstand bei einer Geschwindigkeit von 2300 UpM bei 10°C und einem Fluß von 10 ml/min in die Kammer eingebracht. Erythrozyten, Thrombozyten und Lymphozyten wurden durch stufenweise Erhöhung der Flußrate entfernt. Monozyten wurden bei einer Flußrate von 15 ml/mon und einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 1800 UpM eluiert. Die so erhaltenen Präparationen bestanden auf 92-97% Monozyten nachgewiesen durch die Größenverteilung in einem elektronischen Zellanalysator (Casy-1, Schärfe, Tübingen, FRG und durch FACS-Analyse (FACScan, Becton-Dickinson, FRG) Monozyten-spezifischer Oberflächenantigene. Die Präparationen sind frei von Thrombozyten und Erythrozyten.

Endothelzellen

Endothelzellen wurden unter sterilen Bedingungen von Rinder-Pulmonalarterien gewonnen. Hierzu wurde die Innenseite der Arterien mit Collagenase VII (Sigma Chemical Co., Deisenhofen, FRG) für 20 Minuten bei 37°C behandelt und die so erhaltene Zellsuspension bei 100xg für 10 Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), versetzt mit Penicillin/Streptomycin, Palymyxine, L-Glutamin, Na-Pyruvat und hitzeinaktiviertes foetalem Kalberserum, resuspendiert und in 25 mL Zellkulturflaschen (Nunc, Kopenhagen, Denmark) gegeben. Nach 1 Stunde wurden nichtadhärente Zellen entfernt und die adhärenten Zellen in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert. Die Passagierung der Endothelzellen erfolgte alle 7 Tage durch abschaben und Neuaussaat bei einer Splittingrate von 1 : 3. Für die Migrationsassays wurden Endothelzellen der Passagen 3-17 verwendet.

Endothelmonolayer auf Polycarbonatmembranen

Transwell-Membranen (Nucleopore, Tübingen, FRG) wurden mit CollagenG (0,3 mg/mL) bei Raumtemperatur gecoated, zweifach mit Medium gewaschen und hierauf Endothelzellen bei einer Dichte von 1×10⁴ Zellen/Membran ausgesät. Die Endothelzellen wurden für 7 Tage in einem Inkubator bei 37°C und 7,5% CO₂ kultiviert.

Assay der Transendothelialen Migration

Die auf Transwell-Membranen gewachsenen Endothelzellen wurden in einen 24-Well- Cluster (Nucleopore, Tübingen, FRG) verbracht und bei 37°C, 7,5% CO₂ inkubiert. Als chemotaktischer Stimulus wurde fMLP in einer Konzentration von 10 nmol/L in das untere Kompartment gegeben. Das obere Kompartment enthielt 1×10⁵ gereinigte Monozyten in An- bzw. Abwesenheit von Cicaprost, PDEIV-Inhibitoren oder der Kombination beider Substanzen in unterschiedlichen Kombinationen. CollagenG-gecoatete Transwell-Membranen ohne Endothelzellen dienten zur Bestimmung der endothelunabhängigen Migrationsfähigkeit von Monozyten. Monozyten wandern unter chemotaktischen Bedingungen (fMLP) zeitabhängig in das untere Kompartment des 24- well-Clusters und können dort mit 2 mmol/L EDTA in isotoner Kochsalzlösung abgelöst werden. Die Zahl der so migrierten Zellen wurde mit Hilfe eines elektronischen Zellanalysators (Casy-1, Schärfe, Tübigen, FRG) bestimmt. Die Ergebnisse wurden als mittlere Prozentzahl der migrierten Zellen aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten Dreifach-Ansätzen dargestellt.

Bestimmung von zyklischem 3',5' AMP(cAMP)

cAMP wurde parallel zur Migration bestimmt. Intrazelluläre cAMP-Spiegel wurden mit einem kommerziellen cAMP[125I] Radioimmunoassay Kit gemessen (Amersham, London, UK). Hierzu wurden 1×10⁵-1×10⁶ Monozyten in Medium bei 37°C in An- und Abwesenheit von Cicaprost und/oder PDEIV-Inhibitoren für 2 Minuten inkubiert, danach mit eiskaltem Ethanol (70% v/v, final) die Reaktion gestoppt, zentrifugiert und die Überstände der lysierten Zellen gefriergetrocknet. Der Assay für cAMP wurde nach Anweisung des Herstellers mit azetylierten Proben durchgeführt.

Der hier angewendete Migrationstest für die transendotheliale Migration von Monozyten erlaubt die Quantifizierung aller Zellen die in der Lage sind, durch das Endothel und/oder die poröse Trägermembran zu wandern und im unteren Kompartment eines Transwell- Clusters isoliert werden können.

Die durch fMLP erzeugte chemotaktische Stimulation der transendothelialen Migration von Blutmonozyten ist abhängig von der fMLP-Konzentration im unteren Kompartment, maximale Stimulation wird bei 10 nmol/L fMLP erreicht.

Der Endothelmonolayer auf porösen Trägermembranen bildet eine Barriere für chemotaktisch stimulierte Monozyten, die transendotheliale Migration beeinflußt nicht die Integrität des Endothelmonolayers.

Die fMLP-abhängige transendotheliale Migration von Blutmonozyten wird synergistisch durch PDE-IV-Inhibitoren und Prostazyklinanaloga wie Cicaprost gehemmt.

Dieser Synergismus konnte auch am cAMP-Spiegel von Monozyten gezeigt werden: Cicaprost und PDEIV-Inhibitoren steigern synergistisch die Bildung von zyklischem 3',5' AMP in peripheren Blutmonozyten.

Die Untersuchungen zeigen, daß durch Gabe von PDE IV Inhibitoren bzw. Prostazyklinanaloga wie Cicaprost der verwendeten Strukturen eine Extravasation von Blutmonozyten inhibiert werden kann. Die Kombination der genannten Wirkstoffe kann als therapeutisches Prinzip bei Multipler Sklerose genutzt werden, da Monozyten als essentieller Bestandteil der Autoimmunreaktion bei MS angesehen werden.

Claims

1. Verwendung von PDE IV-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Suppression der Zytokin-aktivierten Monozytenextravasation.

2. Verwendung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß eine optisch aktive oder razemische Verbindung der Formel I
worin
R¹ C_1-6-Alkyl, einen Heterocyclus oder OR⁵ und
R⁵ H, C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl, C_2-6-Alkenyl, C_3-7-Alklnyl, C_3-7-Cycloalkyl, C_1-2-alkyl, C_7-8-Bicycloalkyl, Aryl, Aralkyl, ein Heterocyclus oder C_1-6-Alkyl substituiert mit einem oder mehreren Halogenen, Hydroxy, Carboxy, C_1-4-Alkoxy, C_1-4Alkoxycarbonyl, oder einer gegebenenfalls mit Alkyl substituierten Aminogruppe,
R² C_1-4-Alkyl, C_2-4-Alkenyl oder -Alkinyl;
R³ ein Wasserstoffatom, C_1-6-Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Aryl substituiert mit 1 oder 2 Methylgruppen oder C_1-6-Alkanoyl;
R⁴ ein Wasserstoffatom oder C_1-6-Alkyl;
Y eine Direktbindung oder eine CH₂-Gruppe;
X -CH_2-, -CH₂-CH_2-, -NH oder Sauerstoff bedeutet,
verwendet wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1-2 dadurch gekennzeichnet, daß R¹ OR⁵ bedeutet.

4. Verwendung nach Anspruch 1-3 dadurch gekennzeichnet, daß Y eine Direktbindung und R³ Wasserstoff ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß R² Methyl und X Sauerstoff ist.

6. Verwendung einer Kombination enthaltend ein Prostacyclin- oder Carbacyclinderivat oder dessen physiologisch verträgliches Salz, Cyclodextrinclathrat oder mit Liposomen verkapselte Form und (2) einen Phosphodiesterase IV-Inhibitor oder dessen Racemat oder optisch aktive Verbindung zur gleichzeitigen getrennten oder zeitlich abgestuften Anwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Suppression der Zytokin- aktivierten Monozytenextravasation.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (1) eine Verbindung der Formel II, IIA oder IIB ist
worin
R¹ Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl,
n 0, 1, 2 oder 3
X, Y unabhängig voneinander Sauerstoff oder eine -CH₂-Gruppe
Z Wasserstoff, Fluor oder CN,
R³ eine freie oder funktionell abgewandelte Hydroxygruppe
R⁴ Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl,
A trans -CH=CH-, -C∼C- oder -CH₂-CH₂-,
W eine freie oder funktionell abgewandelte Hydroxymethylengruppe, wobei die Hydroxygruppe α- oder β-ständig sein kann,
D eine geradkettige oder verzweigte C_1-6-Alkylengruppe oder eine Direktverbindung,
E Wasserstoff, -C∼C-R² oder C_5-6-Cycloalkyl,
R² eine geradkettige oder verzweigte gesättigte oder ungesättigte C_1-4-Alkyl gruppe,
und falls R¹ Wasserstoff bedeutet deren physiologisch verträgliche Salze mit Basen sowie deren α-, β- oder γ-Cyclodextrin-Clathrate oder deren mit Liposomen verkapselte Form oder ein Prostacyclin-Mimetika.

8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7 enthaltend als Komponente (1) Iloprost, Cicaprost, Eptaloprost, Ciprosten oder Beraprost

9. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (2) eine Verbindung nach Anspruch 2-5 ist.

10. Verwendung nach Anspruch 1 oder 6 dadurch gekennzeichnet, daß Restenose nach Ballonkatheterdilatation sklerotischer Blutgefäßte oder Vaskulitis behandelt werden.