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DE19733619C1 - CASE-PCR, ein hochselektives Verfahren zum Nachweis von Onkogenmutationen und Allelvarianten - Google Patents

CASE-PCR, ein hochselektives Verfahren zum Nachweis von Onkogenmutationen und Allelvarianten

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Anreicherungsverfahren zur Detektion Allel-spezifischer und punktgerichteter Mutationen bzw. genetischer Polymorphismen. Das Verfahren basiert auf herkömmlichen Techniken der Polymerasekettenreaktion (PCR), wobei die sequenzspezifische Blockade durch DNA-analoge Peptidnukleinsäuren (PNAs) zur Unterdrückung eines im Überschuß vorhandenen Allelotyps gewählt wird und die Technik der PCR-basierten Polymorphismusanalyse über Restriktionsfragmentlängenänderung (PCR-RFLP) zur qualitativen Bestätigung des angereicherten differenten Alleletyps. Das durch Kombination entstandene neue Verfahren der CASE-PCR (engl. combined allele-specefic enriched polymerase chain reaction) vereint damit eine hochselektive Anreicherung Nukleotid-varianter Allele wie gleichzeitig eine verläßliche Detektion ausreichender und über Fragmentverdau nachweisbarer Mengen unterschüssiger Allelvarianten. DOLLAR A Die Kombination dieser Verfahren bietet eine Sensitivität von bis zu 1 varianten Allel unter 10·3· Wildtyp-Allelen. Durch Limitierung der Anzahl durchlaufender PCR-Zyklen und durch entsprechende Wahl der PNA und DNA-Primer im Sinne einer versetzten PCR wird dabei gleichzeitig ein hohes Maß an diagnostischer Spezifität sichergestellt. Ein weiterer Vorteil besteht in der Möglichkeit, Mutationen in einem mehrere benachbarte Kodons umfassenden Abschnitt zu erfassen, wobei abhängig Kodon-spezifische RFLP-Primer gewählt werden.

Description

Kurzfassung
Die Erfindung betrifft ein auf der Polymearsekettenreaktion (PCR, engl. polymerase chain reaction) basierendes Anreicherungsverfahren zur Detektion allel-spezifischer und punktgerichteter Mutationen bzw. genetischer Polymorphismen. Sie ist eine Verbesserung bisheriger Verfahren (PCR-SSCP = Polymerasekettenreaktion mit anschließendem Polymorphismusnachweis über Einzelstrangkonformationsanalyse (engl. single strand conformational polymorphism), PCR-RFLP = PCR-basierter Nachweis eines Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus, PCR-ASO = PCR mit allelspezifischen Oligonukleotioden, die sich bislang entweder durch mangelnde Sensitivität oder fehlende Spezifität auszeichnen. Das Verfahren der CASE-PCR beruht auf zwei PCR-basierten Techniken, welche eine zusammen eine hochselektive Anreicherung Nukleotid-varianter Allele erlaubt und zwar durch zwei ineinandergreifende, aber voneinander unabhängige Prozesse:
  • 1. Peptidnukleinsäure (PNA, engl. peptide nucleic acid)-vermittelte selektive Blockade der PCR1 (engl. PCR-Clamping) und
  • 2. PCR-RFLP zur Erzeugung eines Restriktionspolymorphismus und Begünstigung restriktionsresistenter Heteroduplex-DNA Fragmente in einem nachfolgenden Restriktionsverdau.
Durch Kombination dieser Verfahren wird eine Sensitivität von bis zu 1 varianten Allel unter 103 Wildtyp-Allelen erreicht. Durch Limitierung der Anzahl durchlaufener PCR- Zyklen und durch entsprechende Wahl der PNA und DNA-Primer im Sinne einer Versatz-PCR (engl. nested PCR) wird dabei gleichzeitig ein hohes Maß an diagnostischer Spezifität sichergestellt. Ein weiterer Vorteil besteht in der Möglichkeit, Mutationen in einem mehrere benachbarte Kodons umfassenden Abschnitt zu erfassen, wobei abhängig Kodon-spezifische RFLP-Primer gewählt werden.
Stand der Technik Problemstellung
In der Diagnostik maligner Tumore werden zunehmend molekulare Verfahren eingesetzt, welche sich zur Aufgabe machen, umschriebene spezifische DNA- Veränderungen im Bereich bestimmter Onko- und Tumorsuppressorgene nachzuweisen. Zwar bietet die den meisten Methoden zugrundeliegende Technik der Polymerasekettenreaktion (PCR) prinzipiell die Möglichkeit, Analysen aus kleinsten Gewebeproben zu erstellen. Dies gelingt jedoch nur schwierig, wenn die untersuchten Genabschnitte sich nur in einer oder wenigen Basen unterscheiden und zudem die zu untersuchenden Allele in einer mehrere Zehnerpotenzen umfassenden Minderzahl im biologischen Untersuchungsmal vorliegen.
Bisherige methodische Nachweisverfahren PNA-vermitteltes PCR-"Clamping"
Diese Technik basiert auf synthetischen Oligonukleotiden mit DNA-imitierenden Eigenschaften. Neben gewöhnlichen Oligonukleotiden mit Ribose-Phosphat- Grundgerüst sind in den letzten Jahren auch synthetische Oligonukleotide mit einem N- (2-aminoethyl)-Glycin Grundgerüst (sog. Peptidnukleinsäuren, PNAs) verwandt worden. Diese zeichnen sich durch eine sehr hohe Bindungsaffinität aus, welche unabhängig von Salzkonzentrationen ist und selbst unter den hohen Temperaturen der PCR-Bedingungen (72°C) im Falle von 15-meren noch Heteroduplexe formt. Damit eignen sich PNAs unter diesen Bedingungen vornehmlich zur Protektion von DNA- Abschnitten durch sog. "clamping", d. h. Schutz eines betreffenden Genabschnitts vor Replikation durch DNA-Polymerasen, zumal diese anders als DNA-Analoga, nicht als Startermoleküle für eine PCR-Reaktion dienen können (∅rum, H., Nielsen, P. E., Engholm, M., Berg, R. H., Buchardt, O., and Stanley, C. Nucl. Acids Res. 21, 5332- 5336, 1993). Umgekehrt ist die Avidität im Fall einer Punktmutation bereits deutlich reduziert. Dieser Unterschied in der Stabilität der Bindung kann in der Praxis ausgenutzt werden, indem der Einsatz von PNAs mit Wildtyp-Sequenz zusammen mit konventionellen DNA-Primern und zu untersuchender DNA die Bildung definierter Wildtyp-Fragmente in der nachfolgenden PCR-Reaktion unterbindet, jedoch die von mutierten Allelen erlaubt. Um den Schutzeffekt zu verstärken, wird ein zusätzlicher Hybridisierschritt bei höherer Temparatur in das PCR-Programm eingeführt, welcher eine Vorabanlagerung des PNA-Moleküls, nicht jedoch der konventionellen DNA- Primer erlaubt. Eine Variante des Verfahrens benutzt ein PNA, welches mit einem DNA-Primer um die Zielsequenz kompetitiert (engl. PCR clamping by primer exclusion) und erfolgreich zur Detektion umschriebener RAS-Mutationen angewandt wurde (Thiede, C., Bayerdörffer, E., Blasczyk, R., Wittig, B., and Neubauer, A. Nucl. Acids Res. 24, 983-984, 1996). Obwohl das Verfahren relativ einfach durchzuführen ist, besteht jedoch keine Möglichkeit, erhaltene Fragmente als sicher mutierte Fragmente von Normalallelen zu unterscheiden, welche bei unvollständiger Blockade durch PNAs entstehen, abgesehen von der Möglichkeit, diese einzeln zu sequenzieren. Zusätzlich ist die erfolgreiche Detektion von der Stöchiometrie der Ausgangsparameter (Menge eingesetzter DNA, DNA-Primer etc.) abhängig und daher störanfällig, so daß hier häufig falsch positive Fragmente erhalten werden.
PCR-RFLP
Dieses PCR-Verfahren wurde von verschiedenen Autoren publiziert als Möglichkeit der Detektion umschriebener Allelvarianten mittels Restriktionslängenpolymorphismus (Kahn, S. M., Jiang, W., Culbertson, T. A., Weistein, I. B., Williams, G. M., Tomita, N., and Ronai, Z. Oncogene 6, 1079-1083, 1991; Levi, S., Urbano-Ispizua, A., Gill, R., Thomas, D. M., Gilbertson, J., Foster, C., and Marshall, C. J. Cancer Res. 51, 3497- 3502, 1991; Jacobson, D. R. and Mills, N. E. Oncogene 9, 553-563, 1994; Mills, N. E., Fishman-C. L., Scholes, J., Anderson, S. E., Rom, W. N., and Jacobson, D. R. J. Natl. Cancer Inst. 87, 1056-1060, 1995). Da in der Regel die zur Vereinfachung der Detektion notwendige palindromische Sequenz für eine Restriktionsendonuklease in dem zu untersuchenden Abschnitt nicht vorhanden ist, wird eine solche durch punktgerichtete Veränderung eines der beiden Primer (sog. "mismatch" Primer) in das entstehende PCR- Produkt eingeführt. Die einzuführende Schnittstelle wird dabei so gewählt, daß sie das zu untersuchende Kodon mit einschließt und natürliche Mutationen in diesem Abschnitt jeweils eine Änderung des Motivs bewirken. Der nachfolgende Restriktionsendo­ nukleaseverdau spaltet Wildtyp-Fragment, nicht jedoch mutierte Allele. Durch wiederholte PCR-Amplifikation mit nachfolgendem Restriktionsendonuklease-Verdau läßt sich ebenfalls eine hochselektive Anreicherung mutierter Allele erreichen. Diese Prozedur ist jedoch zeitlich relativ aufwendig und mit dem Risiko verbunden, im Rahmen der zusätzlichen Amplifikationen unspezifische Mutationen zu generieren.
PCR ASO
Allelspezifische PCR durch Einsatz allelspeziflscher Oligonukleotide. Die Selektion mutierter Allele erfolgt durch mutationsanaloge komplementäre Primer. Diese werden wie in einer üblichen PCR-Reaktion in einem oder zwei aufeinanderfolgenden PCR- Schritten eingesetzt, wobei die zur Primeranlagerung notwendige Hybridisierungs­ temperatur so gewählt wird, daß eine Heteroduplexbildung möglichst nur mit den die Mutation tragenden varianten Allelen, nicht jedoch mit Normallallelen, erfolgt. Nachteil dieses Verfahrens ist im wesentlichen die geringe Differenz zwischen dem Temperaturoptimum des Wildtyp und des mutierten Allels, wodurch häufig falsch positive Amplifikate entstehen.
Beschreibung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein Kombinationsverfahren, die CASE-PCR = "combined allele­ specific enrichment-PCR", welche für sich eine vereinfachte PCR-Methode zur selektiven Anreicherung und zum spezifischen Nachweis varianter Allele darstellt (schematisch gezeigt in Abbildung 1).
Die Ansprüche beziehen sich nicht auf das eigentliche PCR-Verfahren selbst, so weit es durch das US Patent 4683195 geschützt ist.
Phasenablauf
Das Verfahren besteht aus zwei aufeinanderfolgenden PCR-Verfahren, im ersten Schritt (Anreicherungsschritt) aus einer PCR-Clamping-Reaktion unter Einsatz der folgenden Komponenten:
  • - eines gegensinnigen, den Mutationsbereich abdeckenden PNA-Oligonukleotids von ca. 15 bp Länge,
  • - einem konventionellen Oligodesoxynukleotid-Primerpaar (zwei die 5' bzw. die 3'-Region eines DNA-Abschnitts begrenzende Oligonukleotide = ODNs) zur Amplifikation eines Genfragments von Interesse,
  • - der zu untersuchenden DNA-Probe, welche neben der Normalvariante (= Wildtyp-Allel) Anteile einer sich in einem oder wenigen Basenpaaren unterscheidenden punktmutierten Variante enthält,
  • - Taq-Polymerase,
  • - PCR-Puffer mit allen notwendigen Reaktionskomponenten
Der eigentliche PCR-Reaktionsablauf umfaßt pro Zyklus vier Segmente:
  • 1. Denaturierung bei 94°C
  • 2. PNA-Hybridisierung bei ca. 70-78°C
  • 3. Primer-Hybridisierung bei ca. 56-64°C
  • 4. Elongationsschritt bei 72°C
Nach Abschluß von 25-35 Zyklen wird eine Probemenge des PCR-Ansatzes (2 µl von 25 bzw. 50 µl) für die nachfolgende PCR-RFLP-Reaktion verwendet (diagnostischer Schritt) Diese besteht aus:
  • - einem Fehlbasen-Primer, der komplementär zum mutationstragenden Abschnitt ist und einen Restriktionspolymorphismus im Bereich des zu untersuchenden Kodons generiert
  • - einem zugehörigen 3'-Primer (kann identisch mit 3'-Primer der ersten PCR- Reaktion sein)
  • - die zu untersuchende DNA-Probe aus der ersten PCR-Clamping-Reaktion, Taq- Polymerase,
  • - PCR-Puffer mit allen notwendigen Reaktionskomponenten
Der eigentliche PCR-Reaktionsablauf umfaßt pro Zyklus drei Segmente:
  • 1. Denaturierung bei 94°C
  • 2. Primer-Hybridisierung bei ca. 56-64°C
  • 3. Elongationsschritt bei 72°C
Nach Durchlaufen von ca. 25 Amplifikationszyklen wird eine Probemenge (10 µl) mit dem jeweils zum generierten Palindrom zugehörigen Restriktionsenzym verdaut. Der Reaktionsansatz hierfür enthält:
  • - Reaktionspuffer mit für das Enzym spezifischer Salzkonzentration,
  • - Probemenge des erhaltenen DNA-Fragments (ca. 1 µg),
  • - 10-30 Einheiten der jeweiligen Restriktionsendonuklease
Die Inkubation erfolgt bei 37°C für jeweils 1-3 h in einem entsprechenden Heizblock. Nach erfolgtem Verdau werden die erhaltenen PCR-Fragmente durch Gelelektrophorese in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, mittels Ethidiumbromidfärbung unter UV- Anregung sichtbar gemacht, anschließend photodokumentiert.
Vorteile und Neuheiten des Verfahrens
Diese ergeben sich aus der stark-selektiven Allelanreicherung über PCR-Clamping verbunden mit der nur gering selektiven (über Bevorzugung sog. Heteroduplex- Fragmente), aber diagnostisch eindeutigen PCR-RFLP. Durch die Kombination beider Schritte läßt sich die zur Detektion notwendige DNA-Amplifikation in einem Vorgang mit der notwendigen Allel-Anreicherung in nur ca. 50-60 PCR-Zyklen erreichen, die Wahl zweier konventioneller Primerpaare ergibt darüberhinaus die notwendige Sicherheit einer PCR mit versetzten Primern, indem in jedem Schritt das Entstehen unspezifischer Fragmente durch unabhängig hybridisierende Oligonukleotide unterbunden wird. Damit lassen sich die Qualitätsmerkmale wie folgt zusammenfassen:
  • - hochselektive Allelspezifische Anreicherung,
  • - eindeutige diagnostische Aussage über die Generierung eines Kodonbezogenen Restriktionspolymorphismus mit Trennung des mutierten Allelanteils von residualem Wildtypfragment in der nachfolgenden Gelanalyse,
  • - Beschränkung auf eine relativ geringe Zahl von PCR-Zyklen, dadurch weitgehendes Vermeiden von artifiziellen in vitro-Mutationen durch die Taq- Polymerase selbst,
  • - ausschließliche Amplifikation spezifischer Fragmente durch Einsatz von "nested"-Primern, dadurch zusätzliche diagnostische Sicherheit
  • - weitgehende Unabhängigkeit von der exakten DNA-Menge des Untersuchungs­ materials sowie von definierten PNA- und DNA-Primerverhältnissen.
5. Anwendungsbeispiele 5.1 DNA-basierte CASE-PCR
Diese stützt sich auf umschriebene, meist nur ein Nukleotid umfassende Mutationen im Bereich eines Gens. Hierunter fallen u. a. "hot spot"-Mutationen einer Reihe von Onko- oder Tumorsuppressorgenen. Beispiele hierfür sind (entnommen aus C. Wagener, Einführung in die Molekulare Onkologie, Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1996):
RAS: Kodon 12, 13, 61 (für die N-, H-, und K-ras-Gene)
p53: Kodon 175, 245, 248, 249, 273, 282
FAP: Kodon 1309, 1378, 1450, 1464, 1487-90
ARP: Kodon 50
RET: Kodon 908 (Mulligan et al., Germ-line mutations of the RET proto-oncogene in multiple endocrine neoplasia type 2A, Nature 363 (1993), 458-461).
DNA-basierte CASE-PCR bietet hier alle Vorteile der DNA-basierten PCR-Diagnostik von Zytomaterial:
  • - Unabhängigkeit von der zytologischen Qualität
  • - Bestimmung aus geringen Probenmengen
  • - keine weitere Probenaufbereitung, Kühlkette oder Lagerungsprobleme
5.2 RNA-basierte CASE-PCR
Diese umfaßt die Erfassung definierter Deletionen in einem RNA-Abschnitt bzw. der Expression eines alternativen Exons in einer prozentual unterschiedlich zusammengesetzten RNA-Population. Hierzu wird das Zellmaterial zunächst unter Kühlung zentrifugiert und das Pellet einer RNA-Extraktionsprozedur unterzogen. Ebenfalls nach Standardprotokollen erfolgt die Umschreibung in reverse cDNA. Ein zum Deletionsbereich bzw. Bereich des zusätzlichen Exons homologes PNA- Oligonukleotid supprimiert weitgehend eine über externe DNA-Primer gesteuerte Amplifikation eines cDNA-Abschnitts. Durch Einsatz eines zweiten DNA-Primerpaares und Ausnutzung eines natürlichen oder neu-generierten Polymorphismus in diesem Bereich lassen sich Wildtyp-Fragmente von Varianten einfach unterscheiden.
5.3 CASE-PCR in der Diagnostik maligner Erkrankungen
Die Notwendigkeit einer effizienten Tumordiagnostik ergibt sich in Verbindung mit der klinischen Fragestellung auf Vorhandensein maligner Zellen in Flüssigkeits-, Zytologie- oder Gewebeproben. Da der Anteil mutierter Onko- und Suppressorgene in soliden Tumoren aller Entitäten gewöhnlicherweise relativ hoch ist, ließe sich ein entsprechend sensitives PCR-Verfahren, welches den Nachweis spezifischer Läsionen aufzeigt, auf einen großen Bereich der Tumordiagnostik anwenden. Dies betrifft vor allem die frühzeitige Erkennung im Fall von
  • - gastrointestinalen Tumoren (Kolorektaltumoren, Pankreaskarzinome, Gallengangs,-blasenkarzinome)
  • - Tumoren des Oropharynxbereiches, v. a. von Bronchialkarzinomen
  • - Karzinomen der ableitenden Harnwege
  • - Uterus- und Zervixkarzinomen
Diese Tumoren zeichnen sich dadurch aus, daß sie in der Regel Anschluß an natürliche Ableitungswege besitzen, so daß eine Bestimmung aus Exfoliativmaterial ohne invasive Eingriffe möglich ist. Daneben ist die Bestimmung genomischer Mutationen auch aus Zellmaterial von diagnostischen Punktionen, insbesondere von Pleura- und Ascitespunktionen, ferner auch von Knochenmarksbiopsaten möglich.
Weitere Anwendungen
Kontaminationsprobleme mit homologer DNA aus Zellmaterial (z. B. Zellseparate etc.) Allel- und individualspezifischer Nachweis durch Anreicherung aus DNA- und/oder Zellmischproben
Weiterentwicklung des Verfahrens
Folgende Weiterentwicklungen, v. a. in Hinblick auf eine Kommerzialisierung, sind im Rahmen der CASE-PCR-Technik möglich:
  • - Weiterentwicklung im Sinne der "multiplex" PCR durch simultanen Einsatz verschiedener PNA- und DNA-Oligonukleotide zur Analyse multipler Mutationen
  • - Standardisierung von Reagentien, Oligonukleotiden, Reaktionsablauf und -temperaturen zur Vereinfachung des Verfahrens
  • - Entwicklung eines Festphasentests etwa in Analogie zu PCR-ELISA-Verfahren
Abbildungen
Abb. 1: Darstellung des CASE-PCR Verfahrens mit den zwei Anreicherungsschritten und Verifikation durch Restriktionsendonukleaseverdau
Abb. 2: Temperaturprofil während der PCR-Clamping und der PCR-RFLP Reaktion

Claims (2)

1. Allelspezifische Anreicherungsverfahren zur Detektion von Genmutationen bzw. Allelvarianten, welche in nur wenigen Basenpaaren differieren, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) ein komplementäres Wildtyp-analoges PNA-Oligonukleptid zur Suppression der Amplifikation überschüssiger Wildtypallele zusammen mit einem Oligodesoxynukleotid-Primerpaar (ODNs) in der PCR-Reaktion eingesetzt wird und
  • b) die Mutationen oder Allelvarianten mit Hilfe eines PCR-RFLP Schrittes mit allelvarianten und eine Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme tragenden Oligodesoxyaukleotiden identifiziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß festphasengekoppelte Primer und/oder PNA-Moleküle verwendet werden oder Mehrfach­ kombinationen von Primern im Sinne einer Multiplex-PCR.
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