DE19638591A1

DE19638591A1 - Kugelförmige magnetische Partikel

Info

Publication number: DE19638591A1
Application number: DE1996138591
Authority: DE
Inventors: Ralf Dipl Chem Dr Anselmann; Martin Geoffrey Dr Pellatt
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 1998-04-02
Also published as: WO1998012717A1; AU4553297A

Description

Die Erfindung betrifft kugelförmige magnetische Partikel auf der Basis von monodispersen SiO₂-Partikeln Herstellung und ihre Verwendung.

Die Verwendung magnetischer Partikel für die Immobilisierung und Tren nung von biologischen Materialien gewinnt zunehmend an Bedeutung. Im allgemeinen bestehen diese Partikel aus einem magnetischen Kern und einer Schutzschicht aus einem Metalloxid, auf der sich eine Polymer schicht befindet, die eine reversible Bindung des biologischen Materials an die magnetischen Partikel ermöglicht.

US 4 343 901 beschreibt magnetische Partikel für die Immobilisierung von Enzymen, die aus einem anorganischen Oxid und ferromagnetischen Partikeln bestehen, die durch eine Sol-Gel-Technik erhalten werden. Die Oberfläche der kalzinierten Partikel ist mit einem vernetzten Polyamin und Glutaraldehyd imprägniert.

US 4 152 210 beschreibt eine biochemisch aktive Substanz, die aus ferro magnetischen Partikeln und einen daran haftenden Enzym besteht. Die Partikel bestehen entweder aus mit Nickel beschichtetem Eisen oder aus gefälltem Eisenoxid. In beiden Fällen sind sie mit Aminopropyltriethoxy silan und Glutaraldehyd beschichtet. Die Partikel werden zur Abtrennung von biologisch aktivem Material aus Fermentationslösungen eingesetzt.

US 4 280 918 beschreibt eine Dispersion magnetischer Partikel, die durch Mischen einer Dispersion von je Fe₂O₃ oder Kobalt dotiertem Fe₃O₄ mit positiver Ladung mit kolloidalem SiO₂ mit negativer Ladung und nachfol gender Behandlung mit Ultraschall hergestellt wird.

EP 0 343 934 beschreibt magnetische Partikel, die aus einem Kern aus einem magnetischen Material und einer Hülle aus einem anorganischen Oxid bestehen. Die Herstellung erfolgt durch Emulgieren der Lösung eines Salzes oder eines wäßrigen Sols des magnetischen Materials und einer Lösung eines Salzes oder eines wäßrigen Sols des anorganischen Oxids in einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, wobei diskrete Tropfen gebildet werden. Durch Einleiten von Ammoniak werden die Tropfen in eine Gel umgewandelt, anschließend von der flüssigen Phase getrennt, entwässert und kalziniert. Die erhaltenen Partikel haben überwiegend eine kugelförmige Gestalt.

Die aus dem Stand der Technik bekannten magnetischen Partikel haben den Nachteil, daß sie keine einheitliche Größe besitzen, Agglomerate nicht verhindert werden können und das Masseverhältnis zwischen magnetischem Kern und Hüllschicht Schwankungen unterworfen ist. Dadurch zeigen die Partikel kein einheitliches Verhalten im Magnetfeld, was sich negativ auf den Trennprozeß auswirkt.

Aufgabe der Erfindung ist es, monodisperse magnetische Partikel mit einer weitestgehend einheitlichen Größe und einem einstellbaren Ver hältnis zwischen magnetischem Material und übrigen Bestandteilen bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung gelöst durch monodisperse magnetische Partikel einer Teilchengröße von 50 bis 1500 nm, mit einem kugelförmigen Kern aus Siliciumdioxid, der punktuell mit Magnetikpartikeln einer Teilchengröße von maximal 60 nm beschichtet ist und eine Deck schicht aus Siliciumdioxid besitzt. In einer besonderen Ausführungsform sind die magnetischen Partikel in bekannter Weise silanisiert.

Weiterhin wird diese Aufgabe gemäß der Erfindung gelöst durch ein Ver fahren zur Herstellung der magnetischen Partikel, indem in einer ersten Stufe Kieselgel-Monospher in vollentsalztem Wasser bei 20°C dispergiert und durch Zugabe einer Lösung aus Eisen(II)-sulfat und Eisen(III)-sulfat mit einer Dosiergeschwindigkeit von 0,05 bis 3 mg Fe₃O₄ pro Min. und pro m² Oberfläche der Monospher, wobei durch gleichzeitige Zugabe einer Base ein pH-Wert von 8 eingehalten wird, mit Fe₃O₄ punktuell beschichtet werden und in einer zweiten Stufe zu der Suspension der beschichteten Monospher eine wäßrige, essigsaure Tetraethylorthosilanlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 5 mg SiO₂ pro Min. und pro m² Oberfläche der unbeschichteten Monospher zudosiert wird, anschließend innerhalb von 30 Min. durch Zugabe einer Base die Suspension auf einen pH-Wert von 9 eingestellt und nachfolgend auf 75°C erwärmt wird und danach die erhaltenen magnetischen Partikel (Monospher-Magnetbeads) abgetrennt, mit Wasser gewaschen und bei 60 bis 100°C, gegebenenfalls im Vakuum, getrocknet werden.

Gegebenenfalls können die erhaltenen Monospher-Magnetbeads in einer dritten Stufe nach bekannten Verfahren silanisiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsge mäßen magnetischen Partikel für die Isolierung von Nucleinsäuren und Biotin sowie biotinylierter Proteine aus wäßrigen Lösungen.

Die als Ausgangsmaterial zu verwendenden kugelförmigen monodis persen SiO₂-Partikel sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt.

Die grundliegenden Reaktionsbedingungen zur Herstellung von SiO₂-Par tikeln durch hydrolytische Polykondensation sind beispielsweise aus den Publikationen von W. Stöber et al. in J. Colloid and Interface Science 26,62 (1968) und 30,568 (1969) sowie dem US-Patent 3,634,588 zu ent nehmen. Die so hergestellten Partikel zeigen aber oft große Standard abweichungen für die Teilchendurchmesser und weisen eine gewisse Porosität auf.

Für die Herstellung von hochmonodispersen, unporösen, kugelförmigen SiO₂-Partikeln, die eine Standardabweichung von nicht mehr als 5% aufweisen, wird auf EP 0 216 278 hingewiesen, die ein entsprechend abgestelltes Herstellungsverfahren auf Basis von hydrolytischer Poly kondensation offenbart. Kern dieses Verfahrens, das für die Herstellung der SiO₂-Partikel gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt wird, ist eine zweistufige Vorgehensweise. Hierbei wird zu nächst durch hydrolytische Polykondensation von Tetraalkoxysilanen in wäßrig-alkalisch-ammonia kalischem Medium ein Sol bzw. eine Suspension von Primärteilchen gebildet, die man daran anschließend durch dosierte Zugabe von weiterem Tetraalkoxysilan auf die gewünschte Endgröße bringt.

Das Verfahren zur Herstellung von hoch monodispersen, unporösen kugelförmigen SiO₂-Partikel erfolgt in zwei Schritten.

In einem ersten Schritt wird zunächst ein Sol von Primärteilchen herge stellt. Hierzu wird das Tetraalkoxysilan in ein wäßrig-alkoholisch-ammo niakalisches Hydrolysegemisch gebracht und innig durchmischt. Als geeignete Tetraalkoxysilane können alle problemlos hydrolysierbaren Kieselsäureorthoester aliphatischer Alkohole eingesetzt werden. In erster Linie kommen hierbei die Ester aliphatischer Alkohole mit 1-5 C-Atomen in Betracht wie etwa von Methanol, Ethanol, n- oder i-Propanol sowie der isomeren Butanole und Pentanole. Diese können einzeln, aber auch im Gemisch eingesetzt werden. Bevorzugt sind die Kieselsäureorthoester der C₁-C₃-Alkohole, insbesondere Tetraethoxysilan. Das Hydrolysegemisch sollte neben aliphatischen Alkoholen einen Gehalt von etwa 0,5 bis etwa 8 mol/l Ammoniak und von etwa 1 bis etwa 15 mol/l Wasser enthalten. Als Alkoholkomponente sind geeignet, aliphatische C₁-C₃-Alkohole, bevorzugt C₁-C₃-Alkohole wie Methanol, Ethanol sowie n- oder i-Propanol. Diese können einzeln, aber auch im Gemisch miteinander im Hydrolysegemisch vorliegen. Die Zugabe des Tetraalkoxysilans zum Hydrolysegemisch erfolgt vorzugsweise in einer Portion, wobei der Reaktand in reiner Form oder auch in Lösung in einem der genannten Alkohole vorliegen kann. Zur Erzeugung der Primärteilchen kann eine Konzentration von Tetraalkoxy silan im Hydrolysegemisch zwischen etwa 0,01 bis etwa 1 mol/l gewählt werden. Nach dem Zusammenbringen der Reaktanden setzt die Reaktion sofort oder nach wenigen Minuten ein, was sich durch eine alsbaldige Opaleszenz bzw. Trübung des Reaktionsgemisches durch die entstehen den Teilchen zeigt. Nach im allgemeinen nicht mehr als 15-30 Minuten, in ungünstigen Spezialfällen auch länger, ist die Reaktion abgelaufen. Je nach Wahl der Reaktanden sowie ihrer Konzentrationen im Reaktions gemisch lassen sich in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren Teil chen mit mittlerem Durchmesser zwischen etwa 0,01 und etwa 2 µm erhalten.

Bevorzugt wird in diesem ersten Schrift des erfindungsgemäßen Verfah rens mit Reaktionsgemischen gearbeitet, die 3-13 mol/l Wasser, 0,5 bis 4,5 mol/l Ammoniak, 10 bis 25 mol/l Alkohol und 0,1-0,5 mol/l Tetraalk oxysilan enthalten. Man erhält hierbei Primärteilchen mit mittleren Durch messern zwischen 0,01 und 1 µm. In diesem Stadium können dem Sol von Primärteilchen Proben entnommen werden, um die Teilchen beispiels weise mit Hilfe der Elektronenmikroskopie auf ihre Teilchengröße, Form treue und Teilchengrößenverteilung zu untersuchen.

Durch Isolation von Teilchenproben besteht die Möglichkeit, die Porosität der Primärteilchen beispielsweise durch Gasadsorptionsmessung zu bestimmen.

Als vorteilhaft hat sich erwiesen, die Reaktion zur Erzeugung der Primär teilchen bei höherer Temperatur durchzuführen. Günstig sind hierbei Tem peraturen zwischen 35 und 75°C, vorzugsweise zwischen 40 und 65°C. Es zeigte sich, daß bei erhöhter Temperatur die Teilchengrößenstreuung abnimmt, allerdings auch die mittlere Teilchengröße. Bei niedrigeren Tem peraturen, d. h. um Raumtemperatur, erhält man bei sonst gleichen Bedin gungen größere Teilchen mit höherer Größenstreuung. Weiterhin ist hier auch vermehrt unerwünschte Agglomeratbildung zu verzeichnen.

Im zweiten Schritt des Verfahrens erfolgt bei gleichmäßiger Durch mischung ein langsames, kontinuierliches Zudosieren von weiterem Tetra alkoxysilan zu dem Sol von Primärteilchen. Hierbei ist es wesentlich, daß die Geschwindigkeit des Zudosierens so gesteuert wird, daß ein soforti ges, vollständiges Abreagieren mit den im Sol vorliegenden Teilchen er folgt, ohne daß ein Überschuß Tetraalkoxysilan entsteht, aus dem sich Keime für neue Primärteilchen bilden können. Unter dieser Verfahrens maßnahme des nach Maßgabe des Abreagierens kontrollierten Zudosie rens von Tetraalkoxysilan wird ein gesteuertes Nachwachsen der Teilchen im Sol erreicht, wobei sich die letztendlich zu erzielende Teilchengröße nach der Menge des insgesamt zugesetzten Tetraalkoxysilans richtet. Die Menge des insgesamt zuzusetzenden Alkoxysilans ist im Prinzip unkri tisch, solange das Hydrolysegemisch im Übeschuß vorhanden ist, bzw. durch eventuelles Nachgeben von Hydrolysegemisch im Überschuß gehalten wird. Ein zeitliches Limit bei der Zugabe des Tetraalkoxysilans ist nicht gesetzt; die Zugabe kann sich über Stunden bis Tage erstrecken. Auch Unterbrechungen und Wiederaufnahme des Nachwachsens sind möglich, da die Teilchen in allen Stadien ihres Wachstums stabil sind. Auch im Nachwachsvorgang wird bevorzugt bei erhöhter Temperatur, etwa um 40°C, gearbeitet.

Nach diesem Verfahren können monodisperse kugelförmige Kieselsäure- Partikel mit einer Partikelgröße von 50 bis 1500 nm hergestellt werden, wobei eine gewünschte Größe sehr genau einstellbar ist, da die Standard abweichung vom mittleren Teilchendurchmesser nur 2 bis 5% beträgt.

Die punktförmige Beschichtung der Kieselsäure-Monospher mit Magnetit erfolgt durch Ausfällen aus einer Lösung von Eisen(II)- und Eisen(III)-sal zen, bevorzugt aus einer Lösung von Eisen(II)- und Eisen(III)-sulfat. Das Mol-Verhältnis zwischen dem zweiwertigen und dreiwertigen Eisen salz ist 1 : 1. Es ist zu beachten, daß die Fällungslösungen vor Oxidation geschützt werden müssen. Während der Fällung ist die Gegenwart von Oxidations- oder Reduktionsmitteln nicht erforderlich.

Der pH-Wert der Monospherdispersion wird für die Fällung des magneti schen Fe₃O₄ (Magnetit) auf Werte zwischen 7 bis 9, bevorzugt 7,5 bis 8,5 eingestellt. Der pH-Wert wird während der Fällungsreaktion durch Zugabe einer Base konstant gehalten, bevorzugt wird 25%ige wäßrige Ammoniak lösung verwendet. Die Temperatur der Suspension wird auf 0 bis 40°C eingestellt.

Die Dosiergeschwindigkeit der Eisen(II)-Eisen(III)-salzlösung liegt zwi schen 0,05 bis 3 mg Fe₃O₄ pro Min. und pro m² Oberfläche, bevorzugt zwischen 0,2 bis 1 mg Fe₃O₄ pro Min. und pro m² Oberfläche der Mono spher.

Unter den angegebenen Bedingungen erfolgt eine punktförmige Abschei dung des Magnetits auf der Oberfläche der Monospher. Die Größe der Magnetitpartikel beträgt maximal 60 nm.

Die weitere Beschichtung der magnetischen Partikel mit SiO₂ erfolgt durch Hydrolyse von Tetraalkylorthosilanen, bevorzugt Tetraethylorthosilan. Hierfür wird die Suspension der mit Magnetit beschichteten Monospher auf eine Temperatur von 0 bis 40°C, bevorzugt 10 bis 30°C eingestellt und bei einem pH-Wert von 7 bis 9, bevorzugt 7,5 bis 8,5 eine wäßrige, essig saure Lösung von Tetraethylorthosilan zudosiert. Die Konzentration des Silans in der Lösung beträgt 10 bis 50, bevorzugt 20 bis 40 g SiO₂/l. Die Dosiergeschwindigkeit wird auf 0,1 bis 5 mg SiO₂ pro Min. und pro m² Oberfläche der unbeschichteten Monospher, bevorzugt 1 bis 2 g SiO₂ pro Min. und pro m² Oberfläche eingestellt. Nach dem Beenden des Zu dosierens wird die Suspension auf 60 bis 90°C, bevorzugt 70 bis 80°C erwärmt und der pH-Wert innerhalb von 30 Min. auf 8 bis 10 mit 25%iger Ammoniaklösung angehoben und die Suspension 30 Min. bei dieser Tem peratur und bei diesem pH-Wert gehalten. Nach Abkühlen auf Raumtem peratur werden die mit SiO₂ beschichteten magnetischen Partikel abge trennt und mit vollentsalztem Wasser salzfrei gewaschen. Anschließend werden sie in vollentsalztem Wasser redispergiert.

Die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel bestehen aus einem SiO₂-Kern, beschichtet mit 5 bis 60, bevorzugt 20 bis 40 Gew.-% Magnetit, bezogen auf den SiO₂-Kern und einer SiO₂-Nachbeschichtung von 5 bis 30, bevorzugt 10 bis 20 Gew.-% SiO₂, bezogen auf den SiO₂-Kern.

In einer besonderen Ausführungsform kann die Oberfläche der magne tischen Partikel durch kovalent gebundene organische Gruppen modifiziert werden. Die hierfür verwendeten Silane sind so konstruiert, daß sie funk tionelle Gruppen aufweisen, mit denen sich eine reversible Bindung des abzutrennenden Materials an die magnetischen Partikel erreichen läßt. Geeignete Silanisierungsmittel sind Verbindungen der Formel

[R¹R²R³]Si-(CH₂)₁-X-R⁴ (I)

worin
R¹ Cl oder Alkoxy mit 1-6 C-Atomen
R², R³ Alkyl mit 1-6 C-Atomen oder die Bedeutung von R¹
1 die Zahlen 1-6
X eine Einfachbindung, O, NH, CONH, NHCONH
R⁴

mit
Y = CH oder

Z = OR oder zwei Reste Z gemeinsam -O-,

und m, n die Zahlen 0-6,
oder

wobei
X eine Einfachbindung ist,
mit R, R′, R′′ = H oder Alkyl mit 1-6 C-Atomen.

Die auf den magnetischen Partikeln befindliche Deckschicht aus SiO₂ besitzt freie oder hydratisierte Element-O- oder Element-OH-Gruppen an der Oberfläche, die einer chemischen Reaktion mit dem Silanisierungs mittel unter Ausbildung kovalenter Silicium-Sauerstoff-Siliciumverbin dungen zugänglich sind. Die magnetischen Partikel werden in einer wäßrigen-alkoholischen Suspension, wobei das Verhältnis von Wasser zu Ethanol 2,5 : 1,5 beträgt, mit dem Silanisierungsmittel umgesetzt. Einzel heiten der Silanisierung können DE 42 33 396 und DE 43 16 814 ent nommen werden, aus denen auch die obengenannten Silanisierungsmittel bekannt sind.

Die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel können für die Isolierung von Nucleinsäuren aus wäßrigen Lösungen und für die Isolierung und Auf reinigung von Biotin und biotinylierten Proteinen aus wäßrigen Lösungen verwendet werden.

Da Nucleinsäuren direkt an Siliciumdioxid gebunden werden, ist eine Nachbeschichtung der magnetischen Partikel, beispielsweise mit Silanen, nicht erforderlich.

Für die Extraktion von DNA aus Agarose-Gel wird ein Stück des mit Ethi diumbromid behandelten Gels in ein geeignetes Gefäß überführt und ein Silica bindender Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 zugegeben. Das Gel wird resuspendiert und mit magnetischen Partikeln vermischt. Nach Erwär men der Suspension auf 50°C für 10 Min. werden mit Hilfe eines Magne ten die Partikel an die Gefäßwand gezogen und die verbleibende Flüssig keit entfernt. Nach einmaligem Redispergieren und Waschen der magne tischen Partikel mit der obengenannten Pufferlösung wird das Waschen mit einem Ethanol enthaltenden Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 wieder holt. Anschließend werden die magnetischen Partikel getrocknet, in einem Tris-HCl Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 resuspendiert und nach Erwär men auf 50°C für 5 Min. eluiert. Die magnetischen Partikel werden von der Pufferlösung, die die DNA enthält, im Magnetfeld abgetrennt.

Die Pufferlösungen, die für die Abtrennung von DNA aus wäßrigen Lösungen mit Hilfe magnetischer Partikel benötigt werden, werden von der Merck KGaA angeboten. Sie enthalten als wesentlichste Bestandteile NaClO₄, Tris-HCl und EDTA. Dieses Trennverfahren ist von folgenden Autoren näher beschrieben worden: Vogelstein, B.; Gillespie, D. (1979). Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619; Yang, R.C.A.; Lis, J.; Wu, B. (1979). Elution of DNA from agarose gels after electrophoresis; Methods Enzymol, 68, 176-182; Boom, R.; Sol, C.J.A.; Salimans, M.M.M.; Jansen, C.L.; Wertheim-van Dillen, P.M.E.; van der Noordaa, J. (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503.

Für die Isolierung und Aufreinigung von Biotin und biotinylierten Proteinen oder Nucleinsäuren aus wäßrigen Lösungen mit Hilfe von magnetischen Partikeln, an die Streptavidin gekoppelt ist, ist eine Modifizierung der Oberfläche der magnetischen Partikel mit organischen Gruppen notwen dig. Hierfür sind die oben erwähnten Silane, beispielsweise γ-Aminopro pylsilan, geeignet. Die Kopplung von Streptavidin wird noch verbessert, wenn nach der Silanisierung der SiO₂-Oberfläche noch eine Modifikation mit Azlacton erfolgt. Dieses Verfahren für die Gewinnung von Biotin und biotinylierten Proteinen oder Nucleinsäuren aus wäßrigen Lösungen wird von folgenden Autoren näher beschrieben: Hultman T, Stahl S, Hornes E, Uhl´n M. Direct solid phase sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support Nucleic Acids Research 1989; 17(13): 4937-4946; Ahmed ARH, Olivier GWJ, Adams G, Erskine ME, Kinsman RG, Branch SK, Moss SH, Notarianni LJ, Pouton CW. Isolation and partial purification of a melaocyte-stimulating hormone recptor from B16 murine melanoma cells; A novel approach using a cleavable biotiny lated photoactivated ligand and streptavidin-coated-magnetic beads. Biochem J 1992; 286: 377-382; Wahlberg J, Hultman T, Uhl´n M. Solid phase sequencing of PCR products in: McPherson MJ, ed. PCR II - A Practical Approach. Oxford: IRL Press, Oxford University Press, 1994; Danilo A. Tagle, Manju Swaroop, Michael Lovett and Francis S. Collins (1993). Magnetic bead capture of expressed sequences encoded within large genomic segments Nature 361m 751-753.

Mit Streptavidin gekoppelte magnetische Partikel werden von der Merck KGaA unter der Bezeichnung "Bio Beads Streptavidin" angeboten.

Die Bindekapazität der erfindungsgemäßen magnetischen Partikel liegt für DNA bei ca. 5 µg/mg Beads. Für die Streptavidin beschichteten Partikel ist die Bindekapazität sehr stark abhängig von der zu isolierenden Substanz.

Die erfindungsgemäßen kugelförmigen magnetischen Partikel haben den Vorteil, daß sie monodispers, unporös und in verschiedenen Größen her stellbar sind. Die Standardabweichung vom mittleren Durchmesser beträgt weniger als 5%. Das Masseverhältnis zwischen dem magnetischen Mate rial und den übrigen Bestandteilen ist in engen Grenzen einstellbar. Da durch zeigen die Partikel ein gleiches Verhalten im Magnetfeld.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie zu begrenzen.

Beispiel 1

700 g Monospher (bez. auf SiO₂-Gehalt) mit einem mittleren Teilchen durchmesser von 500 nm werden unter Rühren in 1500 g vollentsalztes Wasser eingerührt und das Gemisch eine Stunde mit einem Ultra-Turax dispergiert. Anschließend wird mit 11 800 g vollentsalztem Wasser die Dis persion auf einen SiO₂-Gehalt von 5% eingestellt und auf 20°C tempe riert.

210 g Eisen(II)-sulfat-heptahydrat (Artikel-Nr. von Merck KGaA: 1.03965) und 380 g Eisen(III)-sulfathydrat 80% (Artikel-Nr. von Merck KGaA: 3926) werden unter Rühren in 4500 g vollentsalztem Wasser gelöst und in ein verschließbares Vorratsgefäß gegeben.

Weiterhin wird eine 10%ige wäßrige Ammoniaklösung zur Konstant haltung des pH-Wertes in ein geschlossenes Vorratsgefäß überführt.

Die Eisensulfatlösung wird nun innerhalb von 2 Stunden zu der auf 20°C temperierten Monospherdispersion zudosiert, wobei durch gleichzeitige Zugabe der Ammoniaklösung der pH-Wert auf 7,7 eingestellt wird. Nach einer halben Stunde Nachreaktion wird mit der SiO₂-Beschichtung begon nen.

350 g Tetraethylorthosilan werden unter Rühren in einer geschlossenen Apparatur in einem Gemisch aus 290 g Eisessig und 2275 g vollentsalz tem Wasser innerhalb von 30 Min. gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von 120 ml/Min. der Dispersion der mit Magnetit beschichteten Monospher zudosiert. Danach wird innerhalb von 30 Min. der pH-Wert mit der wäßrigen Ammoniaklösung auf 9,0 angehoben und die Dispersion auf 75°C erwärmt und für 30 Min. auf diesem Wert gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Dispersion aufgearbeitet.

Innerhalb von 8 Stunden wird die Dispersion fünfmal dekantierend mit 6 l vollentsalztem Wasser gewaschen, wobei die Sedimentationsgeschwin digkeit der magnetischen Partikel durch Anlegen eines Magnetfeldes beschleunigt wird. Die erhaltene Dispersion wird auf einen Massegehalt von 20% eingestellt.

Beispiel 2

Zu 400 ml einer nach Beispiel 1 erhaltenen Suspension magnetischer Partikel werden 190 ml Ethanol zugesetzt, um ein Volumenverhältnis von Wasser zu Ethanol von 2,5 : 1,5 einzustellen. Dann wird ein Gemisch von 57,5 g γ-Aminopropyltriethoxysilan in 57,5 g Ethanol zugesetzt. Es wird noch 10 Stunden am Rückfluß gekocht, danach das Lösungsmittel ent fernt, die Partikel mit Ethanol gewaschen und in Wasser redispergiert, wobei der Gehalt an Trockensubstanz auf 20 Gew.-% eingestellt wird. Die magnetischen Partikel besitzen an der Oberfläche gebundene endstän dige Amino-Gruppen. Die weitere Verwendung der magnetischen Partikel erfolgt in Form der wäßrigen Dispersion.

Claims

1. Monodisperse magnetische Partikel einer Teilchengröße von 50 bis 1500 nm mit einem kugelförmigen Kern aus Siliciumdioxid, der punktuell mit Magnetitpartikeln einer Teilchengröße von weniger als 60 nm beschichtet ist und darauf eine Deckschicht aus Siliciumdioxid besitzt.

2. Partikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Verbindung der Formel I [R¹R²R³]Si-(CH₂)₁-X-R⁴ (I)worin
R¹ Cl oder Alkoxy mit 1-6 C-Atomen
R², R³ Alkyl mit 1-6 C-Atomen oder die Bedeutung von R¹
1 die Zahlen 1-6
X eine Einfachbindung, O, NH, CONH, NHCONH
R⁴ mit
Y = CH oder Z = OR oder zwei Reste Z gemeinsam -O-, und m, n die Zahlen 0-6,
oder wobei
X eine Einfachbindung ist,
mit R, R′, R′′ = H oder Alkyl mit 1-6 C-Atomen modifiziert sind.

3. Verfahren zur Herstellung monodisperser magnetischer Partikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einer ersten Stufe Kieselgel-Monospher in vollentsalztem Wasser bei 20°C dispergiert und durch Zugabe einer Lösung von Eisen(II)-sulfat und Eisen(III)-sul fat mit einer Dosiergeschwindigkeit von 0,05 bis 3 mg Fe₃O₄ pro Min. und pro m² Oberfläche der Monospher, wobei durch Zugabe einer Base ein pH-Wert von 8 eingehalten wird, mit Fe₃O₄ punktuell beschichtet werden und in einer zweiten Stufe zu der Suspension der beschichteten Monospher eine wäßrige, essigsaure Tetraalkylortho silanlösung mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 5 mg SiO₂ pro Min. und pro m² Oberfläche der unbeschichteten Monospher zudosiert wird, anschließend die Suspension auf 75°C erwärmt und innerhalb von 30 Min. durch Zugabe einer Base auf einen pH-Wert von 9 ein gestellt wird und danach die erhaltenen magnetischen Partikel abge trennt, mit Wasser gewaschen und in vollentsalztem Wasser redis pergiert werden.

4. Verfahren zur Herstellung monodisperser magnetischer Partikel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zu der Dispersion der magnetischen Partikel Ethanol in einer Menge zugegeben wird, bis ein Volumenverhältnis von Wasser zu Ethanol von 2 : 1,5 erreicht ist und anschließend in einer ethanolischen Lösung eine Verbindung der Formel I [R¹R²R³]Si-(CH₂)₁-X-R⁴ (I)worin
R¹ Cl oder Alkoxy mit 1-6 C-Atomen
R², R³ Alkyl mit 1-6 C-Atomen oder die Bedeutung von R¹
1 die Zahlen 1-6
X eine Einfachbindung, O, NH, CONH, NHCONH
R⁴ mit
Y = CH oder Z = OR oder zwei Reste Z gemeinsam -O-, und m, n die Zahlen 0-6,
oder wobei
X eine Einfachbindung ist,
mit R, R′, R′′ = H oder Alkyl mit 1-6 C-Atomen, zugegeben wird und nach Kochen am Rückfluß für 5 bis 24 Stunden die modifizierten magnetischen Partikel abgetrennt, gewaschen und in vollentsalztem Wasser redispergiert werden.

5. Verwendung der magnetischen Partikel nach den Ansprüchen 1 oder 2 für die Isolierung von Nucleinsäuren und Biotin sowie biotinylierter Proteine aus wäßrigen Lösungen.