DE1767612B - Verfahren zur Herstellung von 5 Dehydroshikimisäure durch aerobes Zuchten von Mikroorganismen - Google Patents

Description

1 .2

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung aminsäure, Alanin und andere) und Vitamine (wie

von 5-Dehydroshikimisäure durch aerobes Züchten z. B. p-Aminobenzoesäure, Biotin, Thiamin, Panto-

von Mikroorganismen in einem flüssigen Nährmedium thensäure u. dgl.) zugesetzt werden. Als nährstoff-

bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Ver- haltige Materialien können auch noch Hefeextrakt,

hältnissen. 5-Dehydroshikimisäure kann sowohl als 5 Sojabohnenmehl-Hydrolysatlösung, Maisquellwasser,

Ausgangsmaterial für die Gewinnung von aromatischen Pepton, Proteinhydrolysat, Fleischextrakt, ein Hy-

Aminosäuren als auch als Medikament verwendet drolysat mikrobieller Zellen, ein Fischeiweißhydrolysat

werden; es wird erwartet, daß ihr Gebrauch in u. dgl. Verwendung finden.

Zukunft stark zunehmen wird. Der Grund hierfür Die 5-Dehydroshikimisäuregärung wird unter aero-

besteht darin, daß 5-Dehydroshikimisäure von leben- io ben Bedingungen durchgeführt. Die Zuchttemperatur

den Körpern als Vorstufe in der Biosynthese von liegt bei 25 bis 40⁰C, vorzugsweise bei 27 bis 37° C. Da

aromatischen Aminosäuren benutzt wird, die in das pH des Nährmediums die Neigung zeigt, während

Proteinen und p-Aminobenzoesäure, die zur Vitamin der Fermentation zu sinken, ist es vorteilhaft, den

B-Gruppe gehört, enthalten sind. pH-Wert mit einem geeigneten Neutralisationsmittel

Frühere Forscher haben berichtet, daß 5-Dehy- 15 auf 5,5 bis 7,2 einzustellen, um eine hohe Ausbeute zu

droshikimisäure durch Züchten von Escherichia coli erzielen.

(J. Am. Chem. Soc, 75, S. 5567 [1953]) und Neu- Als Neutralisationsmittel können Alkalien, wie z. B. rospora (Biochem. J. 68, S. 168 [1958]) gebildet wird. Ammoniak, Natrium- oder Kaliumhydroxid verwen-Es wurde jedoch berichtet, daß Escherichia coli nur det werden. Es ist auch möglich, für diesen Zweck 100 bis 200y/ml dieser Substanz speichern kann; 20 Ammoncarbonat, Calciumcarbonat, Calciumhydroxid, bezogen auf die in das Nährmedium eingebrachte Harnstoff u. dgl. zu verwenden. Nach 3- bis 6tägigem Kohlenstoffquelle entspricht dies einer Ausbeute von Züchten ist 5-Dehydroshikimisäure angehäuft, maximal 4°/₀. Bei der Verwendung von Neurospora Nach dem Züchten werden die mikrobiellen Zellen wurde Dehydroshikimisäure chromatographisch nach- z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren aus dem gewiesen; quantitative Ergebnisse wurden nicht ange- 25 Fermentationsmedium entfernt, und das Filtrat wird geben. nach einer geeigneten Methode behandelt, z. B. durch Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ver- Aktivkohle-Adsorption, Behandlung mit einem Ionenfahren zur Gewinnung von 5-Dehydroshikimisäure mit austauscherharz oder durch organische Lösungsmittelhöherer Ausbeute anzugeben. Extraktion — einfach oder kombiniert —, um eine Ausgehend von der Herstellung von 5-Dehydro- 30 5-Dehydroshikimisäure-Lösung zu erhalten. Die 5-Deshikimisäure durch aerobes Züchten von Mikro- hydroshikimisäure kann durch Konzentration unter erzeugnissen in einem flüssigen Nährmedium bei hier- reduziertem Druck und Kristallisation gewonnen werfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen den. Die Kristalle des gewünschten Produktes werden besteht die Erfindung darin, daß man Corynebac- auf übliche Weise abgetrennt.

terium glutamicum ATCC 21179 als Mikroorganis- 35 Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der

mus einsetzt. Erfindung.

Eine Kultur des erfindungsgemäß einzusetzenden

Mikroorganismus ist ohne Einschränkung der Öffent- Beispiel 1 lichkeit zugänglich gemacht worden in der »American

Type Culture Collection«, in der er als ATCC 21179 4.0 Eine Saatkultur des Corynebacterium glutamicum

identifiziert ist. Wie bereits oben festgestellt wurde, ATCC 21179 wurde erhalten, indem ein Nährmedium,

beträgt die Ausbeute an 5-Dehydroshikimisäure bei welches Pepton (1 g/dl), Fleischextrakt (1 g/dl), Hefe-

der bekannten Verwendung von Escherichia coli extrakt (0,5 g/dl), Natriumchlorid (0,3 g/dl) und GIu-

maximal 4 %. Unter Einsatz von Corynebacterium kose (2 g/dl) enthielt und ein pH von 7,0 aufwies, mit

glutamicum ATCC 21179 wird eine um praktisch 45 diesem Mikroorganismus beimpft und die Züchtung

50 °/₀ erhöhte Ausbeute erzielt. 24 Stunden fortgesetzt wurde.

Das Nährmedium enthält eine Kohlenstoff- und Die Fermentation wurde ausgeführt unter Verwen-

eine Stickstoffquelle, anorganische Substanzen und dung eines Fermentationsmediums, das Glukose

verschiedene andere Nährstoffe. (10 g/di), Ammonchlorid (0,5 g/dl), Ammonsulfat

Als Kohlenstoffquelle wird im Nährmedium bevor- 50 (1,5 g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05 g/dl),

zugt Glukose verwendet, aber auch andere ähnliche MgSO₄ · 7 H₂O (0,05 g/dl), FeSO₄ ■ 7 H₂O (0,002 g/dl),

Kohlenstoffquellen, wie z. B. Fruktose, Mannose, MnSO₄ · 4 H₂O (0,002 g/dl), Phenylalanin (200 y/ml),

Galaktose, Maltose, Saccharose, Stärkehydrolysat, Biotin (30 y/1) und CaCO₃ (2 g/dl) enthielt. Portionen

Melasse, Glycerin, Essigsäure u. dgl. können allein von je 20 ml des so hergestellten Mediums wurden in

oder im Gemisch verwendet werden. 55 getrennte 500-ml-Sakaguci-Kolben eingebracht, und

Als Stickstoff quelle können sowohl organische als jeder Kolben wurde sterilisiert. Das sterile Fermen-

auch anorganische Verbindungen, wie z. B.Ammoniak. tationsmedium in jedem der Kolben wurde mit 1 ml

Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, der Saatkultur beimpft. Die Fermentation wurde in

Ammoniumacetat, Ammoniumsalze verschiedener 4 Tagen unter Schütteln bei 28⁰C durchgeführt. In

anderer organischer Säuren u. dgl. Verwendung finden. 60 jedem Kolben wurde im Medium durchschnittlich

Anorganische Substanzen, welche in dem Nähr- 4,13 mg 5-Dehydroshikimisäure/ml angesammelt. Die

medium enthalten sein können, sind verschiedene Fermentationsmedien wurden dann vereinigt (11

Salze des Eisens, Mangans, Magnesiums, Kobalts, insgesamt) und zur Entfernung der mikrobiellen Zellen

Zinks, Nickels, Chroms u. dgl. ebenso wie verschie- filtriert. Das Filtrat wurde mit HCl auf ein pH von

dene Phosphorsäureverbindungen. 65 3,0 eingestellt. Es wurden 500 g Aktivkohle zugesetzt, Als weitere Nährstoffe können dem Nährmedium und es wurde gerührt, um so 5-Dehydroshikimisäure

auch wenigstens eine Aminosäure (z.B. Cystin, zu adsorbieren. Die adsorbierte 5-Dehydroshikimisäure Cystein, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Glut- wurde mit 98°/₀igem Äthanol eluiert, und das Eluat

wurde unter reduziertem Druck bei etwa 45° C konzentriert.

Der konzentrierte Sirup wurde mit 100 ml 98°/_oigem Äthanol versetzt und der dabei entstehende Niederschlag durch Filtration abgetrennt. Nachdem das Äthanol abgedampft war, wurde der entstandene Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und eine kleine Menge 98°/_oiges Äthanol zugefügt. Durch Stehenlassen ließ man die erhaltene Lösung abkühlen und erhielt 1,83 g Rohkristalle von 5-Dehydroshikimisäure. Der Schmelzpunkt des umkristallisierten Produktes lag bei 150 bis 151,5° C. Das UV-Adsorptionsspektrum und der Rf-Wert bei der Papier-Chromatographie waren identisch mit denen, die bei den ersten Berichten genannt waren. Reduktion von ammoniakalischem Silbernitrat und Fehling-Reagens sowie die Bildung von 2,4-Dinitrophenyl-hydrazon wurden ebenfalls beobachtet. Die Bildung von Protecatechusäure wurde durch Lösen in konzentriertem HCl bei einer Konzentration von 1 g/dl und Erhitzen auf 100° C beobachtet.

Beispiel2

Wiederholte Vergärungen wurden in ähnlicher Weise ausgeführt wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei jedoch das Fermentationsmedium Glukose (10 g/dl), Ammonsulfat (1,5 g/dl), Ammonchlorid (0,5 g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05 g/dl), MgSO₄ · 7H₂O (0,05 g/dl), FeSO₄ ■ 7 H₂O (0,002 g/dl), MnSO₄ · 4H₂O (0,002 g/dl), Biotin (3Oy/!) und CaCO₃ (2 g/dl) und außerdem Hefeextrakt, Fleischextrakt, NZ-Amin, Mieki oder Pepton enthielt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt:

Tabelle

Zusatzstoff 10	Zugesetzte Menge (g/dl)	Menge an erzeugter 5-Dehydro- shikimisäure (mg/ml)
Hefeextrakt Fleischextrakt NZ-Amin*) 15 Mieki**) ............ Pepton kein	1,0 2,0 0,25 1,5 0,25	5,82 4,83 2,31 4,92 5,12 1,8

*) NZ-Amin ist ein handelsübliches Caseinhydrolysat.
**) Mieki ist ein handelsübliches Produkt, welches aus der Rückstandslösung eines Glutans oder eines Sojabohnenmehlhydrolysats besteht, aus welchem die Glutaminsäure extrahiert worden ist.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 5-Dehydroshikimisäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem flüssigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium glutamicum ATCC 21179 einsetzt.