DE1770167C3

DE1770167C3 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure

Info

Publication number: DE1770167C3
Application number: DE1770167A
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Haruo Miachida Tanaka (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-04-18
Filing date: 1968-04-09
Publication date: 1975-10-16
Also published as: GB1196076A; FR1565801A; US3560342A; DE1770167B2; DE1770167A1

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure durch Züchten von Mikroorganismen.

Orotidylsäure, auch als Orotidin-5'-phosphorsäure bezeichnet, hat die folgende Struktur

HO—P-O-CH₂
OH

C-COOH

35

40

45

Sie stellt ein wichtiges Zwischenprodukt bei der Synthese von Nucleinsäuren dar und ist außerdem ein wertvolles biochemisches Reagens.

Orotidylsäure kann auf fermentativem oder chemischem Wege hergestellt werden (vgl. »Journal of Biological Chemistry«, Bd. 215, S. 403 [1955], und Bd. 235, S. 2379 [ 1960], bzw. »Journal of the American Chemical Society«, Bd. 85, S. 1118 bis 1123 [1963]). Diese bekannten Verfahren eignen sich jedoch nicht für die großtechnische Herstellung von Orotidylsäure. weil die dafür erforderlichen Ausgangsmaterialien schwer zugänglich und teuer und die dabei erzielbarcn Ausbeuten niedrig sind.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Orotidylsäuren anzusehen mit dessen Hilfe es möglich ist, diese wichtige Verbindung auf verhältnismäßig einfache und wirtschaftliche Weise im Rahmen eines großtechnisch durchführbaren Verfahrens herzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure durch Züchten von Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Corynebacterium sp. ATCC 21084, Arthrobacter sp. ATCC 21085 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15932 in einem wäßrigen Nährmedium. das außer den üblichen Bestandteilen 6-Azauracil, 5-Hydroxyuracil oder deren Riboside in einer Konzentration von etwa 10 bis 2000 μΒ/ΐηΙ, bezogen auf die entsprechende Base, enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 4O⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9.5 züchtet und die im Zücbtungsmedium angereicherte Orotidylsäure in an sich bekannter Weise abtrennt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Orotidylsäure auf fermentativem Wege in technisch einfacher und wirtschaftlicher Weise im Rahmen eines großtechnischen Verfahrens in hoher Ausbeute herzustellen.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignet sich sowohl ein synthetisches Nährmedium als auch ein natürliches Nährmedium, sofern es die für das Wachstum des eingesetzten Mikroorganismen-Stammes wesentlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt. Zu ihnen gehören beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen.

Geeignete Kohlenstoffquellen sind z. B. Kohlenhydrate, wie Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate und Melassen oder organische Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure und Glutaminsäure. Diese Substanzen können entweder allein oder in Mischung aus zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Geeignete Stickstoffquellen sind Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat; außerdem lassen sich Naturstoffe, die Stickstoff enthalten, verwenden, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt. Fleischextrakt. Pepton, Fischmehl, Fleischbrühe, Kascinhydrolysale. Casaminosäure, lösliche Fischbestandteile und Reiskleieextrakt. Auch diese Substanzen können entweder allein oder in Mischung aus zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Anorganische Verbindungen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, sind z. B. Magnesiumsulfat. Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, KaIiummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zinksulfat.

Bei der Züchtung der verwendeten Mikroorganismen-Stämme wird dem Nährmedium außerdem Biotin zugesetzt.

Erfindungsgemäß werden 6-Azauracil, 5-Hydroxyuracil oder deren Riboside oder Mischungen dieser Verbindungen auf einmal oder in Abständen während des Verlaufs der Fermentation zugesetzt Das 6-Azauracil und das 5-Hydro>>yuracil können dem Nährmedium in Form der entsprechenden Salze, beispielsweise in Form der Sulfate oder Hydrochloride, zugesetzt werden.

Die zugesetzte Menge an 6-Azauracil. 5-Hydroxyuracil oder deren Ribosiden liegt zwischen etwa

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10 jig/ml und etwa 2000 ug/ml, bezogen auf die ent- wonnen, indem das Filtrat, das beim Abzentrifugieren

sprechende Base. der Mikroorganismenzellen vcn der Kuiturbrühe er-

Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter halten worden war, durch eine mit einem stark basi-

aeroben Bedingungen durchgerührt, z. B. durch aero- sehen Anionenaustauscherharz (Polystyrol-Ameisen-

bes Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Be- s säure-Typ) gefüllte Säule geleitet wurde. In dieser

lüften einer Submerskultur be· einer Temperatur von Säule wurde die Orotidylsäure adsorbiert. Die Säule

etwa 20 bis etwa 4OC sowie bei einem pH von etwa wurde anschließend mit einer wäßrigen Ammonium-

4,0 bis etwa 9,5. Nach etwa 2- bis 8tägiger Züchtung formiatlösung eluiert. Die Fraktionen, welche die

unter diesen Bedingungen haben sich merkliche Men- Orolidylsäure enthielten, wurden zur Trockne einge-

gen an Orotidylsäure gebildet, die sich in dem Züch- io dampft. Die Ausbeute betrug 0,7 g aus 2 1 Züchtungs-

tungsmedium anreichern. medium.

Nach Beendigung der Züchtung kann die Orotidyl- Beispiel ~>
säure von dem Züchtungsmedium nach üblichen

Methoden abgetrennt werden, beispielsweise durch Die Züchtung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt.

Behandlung mit einem lonenaust^uscherharz. durch 15 jedoch mit der Ausnahme, daß 5-Hydroxyuracil dem

Ausfällung, durch Adsorption oder Chromatographie. Medium 72 Stunden nach Beginn des Züchtens in

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. einer Menge von 1000 ng/ml zugesetzt wurde. Das

Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich die Züchten wurde dann weitere 24 Stunden lang fortge-

Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser. setzt. Dabei wurde Orotidylsäure in einer Konzen-

_R . 20 tration von 0,4 mg/ml in dem Züchtungsmedium ange-

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wurde Beispiel 3
als Impfstamm verwendet. Er wurde in einem Impfkulturmedium, das 2% Glukose, 1% Pepton, 1% Die Züchtung wurde wie im Beispiel 1 durchge-Hefeextrakt, 0,3% NaCl und 30 μg/l Biotin enthielt, 25 führt, jedoch mit der Ausnahme, daß Corynebacterium bei 30⁰C 24 Stunden lang gezüchtet. sp. ATCC 21084 als Impfmikroorganismus eingesetzt

2 ml der erhaltenen Impfkultur wurden in einen wurde. Die Menge an Örotidylsäure. die ni dem erkonischen 250-ml-Kolben. der 20 ml eines Nähr- haltenen Züchtungsmedium erzeugt wurde, betrug mediums enthielt, das durch lOminütige Behandlung 1,0 mg/ml.

in einem Autoklav unter einem Druck von 1 kg/cm² 30 B e i s ρ i e 1 4
sterilisiert worden war, überimpft. Das verwendete

Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung: Die Züchtung wurde wiederum wie im Beispiel 1

_r, . _inn durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß Arthro-

Harnstoff 6 - ^h'^dC{^ ^SP; ^{ATCC 21} °^{85 als Im}P^fstamm verwendet

■r j_j pQ J₀^ 35 wurde. Die Menge an Orotidylsäure, die in dem er-

_K HPO⁴ 10^ haltenen Züchtungsmedium erzeugt wurde, betrug

MgSo₄ ⁴ 7h\'o' ;;■.;■.:'.'.;'.'.; ■.■.■.:::: ίο g °>⁴² ^m&^/ml·

CaCl₂ ■ 2 H₂O 0,1g Beispiel5

K" _r.,wi Sf 40 Micrococcus sodonensis ATCC 15932 wurde als

mg lmpfmikroorganismus an Stelle von Brevibacterium

Das Nährmedium wurde dadurch hergestellt, daß ammoniagenes ATCC 6872 verwendet. Die Züchtung

diese Bestandteile in 1 1 Wasser gelöst wurden und der wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt. Die Menge an

pH-Wert mittels NaOH auf 8,0 eingestellt wurde. Orotidylsäure, die in dem Züchtungsmedium erzeugt

Das Züchten wurde dann unter aerobem Schütteln 45 wurde, betrug 0,69 mg/ml,

der Kultur bei 30^eC durchgeführt. 24 Stunden nach Beispiel 6
Beginn des Züchtens wurde 6-Azauracil dem Medium

in einer Konzentration von 1000 [xg/ml zugesetzt. Das Die Züchtung wurde wie im Beispiel 1 durchgc-

Züchten wurde weitere 72 Stunden lang fortgesetzt. führt, jedoch mit der Ausnahme, daß 6-Azauridin in

Nach einer gesamten Züchtungszeit von 96 Stunden 50 einer Konzentration von 1500 iJLg/ml dem Medium

reicherte sich die Orotidylsäure in einer Konzentration zugesetzt wurde. Die Menge an Orotidylsäure, die in

von 0,98 mg/ml in dem Züchtungsmedium an. dem erhaltenen Züchtungsmedium anfiel, betrug

Die Orotidylsäure wurde als Ammoniumsalz ge- 0,69 mg/ml.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure durch Züchten von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Corynebacterium sp. ATCC 21084, Arthrobacter sp. ATCC 21085 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15932 in einem wäßrigen Nährmedium, das außer den üblichen Bestandteilen 6-Azauracil, 5-Hydroxyuracil oder deren Riboside in einer Konzentration von etwa 10 bis 2000 μg/ml, bezogen auf die entsprechende Base, enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9,5 züchtet und die im Züchtungsmedium angereicherte Orotidylsäure in an sich bekannter Weise abtrennt.