DE1767390A1

DE1767390A1 - Method for obtaining L-asparaginase

Info

Publication number: DE1767390A1
Application number: DE19681767390
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr Arens; Klaus Dr Bauer; Eckart Dr Irion; Wilfried Dr Kaufmann; Erich Dr Rauenbusch; Otto Dr Wagner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1968-05-06
Filing date: 1968-05-06
Publication date: 1971-09-09
Also published as: AT286911B; SU404277A3

Description

Verfahren zur Gewinnring von L-Asparaginase L-Asparaginase ist bekannt. Sie kommt in Escherichia coli intrazellulär vor l11. A. Camphell, Z. T. Mashburn, E. A. Boyse, L. J: 01d, Biochemistry _6 (1967), Seiten 721 bis 730, hier weitere Literatur% und wurde auf folgende Weise aus der 7e17.mpqse von "4;. col i Bl! = E. coli ATCn 11303 g^ Wonnen: Freisetzen des Enzyms durch Zertrümmerung der Bakterien- zellen mit Ultrascliizill oder Zermahlen mit Aluminiumoxyd, Beseitigung von Zelltrümmern und Nucleinsäuren durch Fäl- lung mit Manganchlorid und anschließendes Zentrifugieren, Aussalzen des Rohenyms aus der überstehenden Lösung mit Ammoniumsulfat, Dialyse und weitere Reinigung durch Chroma- tographie an DEAE-Zellulosesäulen. Die Anzucht der E. coli-Zellen erfolgte in Nährbouillon, Pehtonlösung--n, auf "Trypticase Soy Agar" und in Einer Nähr- lösung der Zusammensetzung "Dehydrated Bacto-Nutrient Broth" 0,8 %, Glucose 1,0 %, Dinatriumhydrogenphospiiat 0,6 % und Kaliumdihydrogenl-)lio.#3phat 0,3 r Z-H. A. Campbell, L. T. Mashburn, E. A. Boyse, L. J. 01d, Biochemistry 6 (1967) Seiten. 720 bis 730; d. Roberts, M. D. Prager, N. ßachyrtsky, Cancer Research ?_6 (1966), Seiten 2213 bis 2C1-17-7-Diese Arbeitsmethoden sind jedoch für eine technische Gewinnung des Enzyms nicht geeignet. Method for the profit ring of L-asparaginase L-asparaginase is known. It occurs in Escherichia coli intracellularly before l11. A. Camphell, ZT Mashburn, EA Boyse, L. J: 01d, Biochemistry_6 (1967), pp. 721 bis 730, here more literature% and was made in the following way from the 7e17.mpqse of "4 ;. col i Bl! = E. coli ATCn 11303 g ^ Delights: Release of the enzyme by breaking up the bacterial cells with Ultrascliizill or grinding with aluminum oxide, Removal of cell debris and nucleic acids by felling treatment with manganese chloride and subsequent centrifugation, Salting out the crude enzyme from the supernatant solution with Ammonium sulfate, dialysis and further purification by chroma tography on DEAE cellulose columns. The E. coli cells were grown in nutrient broth, Pehton solution - n, on "Trypticase Soy Agar" and in a nutrient solution of the composition "Dehydrated Bacto-Nutrient Broth" 0.8%, glucose 1.0%, disodium hydrogen phosphate 0.6% and Potassium dihydrogen () lio. # 3phat 0.3 r ZH. A. Campbell, LT Mashburn, EA Boyse, LJ 01d, Biochemistry 6 (1967) Pages. 720 to 730; d. Roberts, M. D. Prager, N. ßachyrtsky, Cancer Research? _6 (1966), pages 2213 but up 2C1-17-7-This work methods are not suitable for industrial extraction of the enzyme.

Es wurde nun erfunden, daß man L-Asparaginase in technischem Maßstab und in guter Ausbeute herstellen kann, indem man Escherichia coli-Zellen anzüchtet, die gewachsenen Zellen mit organischen Basen vom Molekulargewicht über 1000 oder deren Salzen ausfällt, die isolierten Zellen mit Aceton aufschließt, die Zellen mit Wasser extrahiert, extrahierte Zellen, Nucleinsäuren und Ballastproteine durch Fällung mit organischen Basen vom Molekulargewicht über 10'J0 oder deren Salzen entfernt und aus der überstehenden Lösung L-Asparaginase mit Aceton ausfällt und isoliert.It has now been invented that one can use L-asparaginase on an industrial scale and can be produced in good yield by culturing Escherichia coli cells, the grown cells with organic bases of molecular weight over 1000 or the salts of which precipitate, the isolated cells are disrupted with acetone, the cells extracted with water, extracted cells, nucleic acids and ballast proteins through Precipitation with organic bases with a molecular weight above 10'0 or their salts removed and precipitated from the supernatant solution L-asparaginase with acetone and isolated.

Als Organismus wurde Escherichia coli ATCC 9E37 verwendet. Es sind jedoch praktisch auch alle anderen Escherichia coli-Stämme geeignet, z. B. Escherichia coli ATCC 4157, 8677, 8739, 972-3, 10536, 10586, 11105, 11126, 12142, 12408, 12911, 13676, 13706, 13762, 14948.Escherichia coli ATCC 9E37 was used as the organism. There are however, practically all other Escherichia coli strains are also suitable, e.g. B. Escherichia coli ATCC 4157, 8677, 8739, 972-3, 10536, 10586, 11105, 11126, 12142, 12408, 12911, 13676, 13706, 13762, 14948.

Versuche mit Schüttelkulturen zeigten, daß die Verwendung von sogenannten "synthetischen" Nährlösungen und der biher für-diesen Zweck bekainten Nährlösungen zu nur schwacher L-Asparaginase-Bildung führt. Dagegen erhält man Bakterienzellen hoher enzymatischer Aktivität mit Nährlösungen, die neben den erforderlichen anorganischen Ionen und Aminosäure- und Peptidgemischen in Form von Zellautolysaten oder Proteinhydrolysaten als N -Quelle geeignete oganische Säuren als C-Quelle enthalten. Maisquellwasscrlösuugen erfüllen diese Anforderungen in hervorragender Weise. Noch bessere Ergebnisse werden erzielt, wenn ntan die in Maisquellwasser vorhandene Konzentration an Milchsäure erhöht und zusätzlich NH4+-Ionen hinzufügt. Anstelle von Milchsäure kann man auch Bernsteinsäure, Fumarsäure oder Z-Äpfelsäure verwenden. Zusätze von durch E. coli vergärbaren Kohlehydraten, z. B. Glucose, Fructose, Mannose, Maltose, Galaktose usw., oder der Aminosäuren DL-Yalin, DL-Serin, L-Cystein, L-Tryptophan und DL-Norvalin bewirken eine Repressioa; Zusätze von L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, DL-Alanin und Glykokoll dagegen eine Fördorung der Synthese von L-Asparaginase.Experiments with shaking cultures showed that the use of so-called "Synthetic" nutrient solutions and the nutrient solutions previously known for this purpose leads to only weak L-asparaginase formation. In contrast, you get bacterial cells high enzymatic activity with nutrient solutions, in addition to the required inorganic Ions and amino acid and peptide mixtures in the form of cell autolysates or protein hydrolysates Organic acids suitable as N source contain as C source. Corn steep liquor solutions meet these requirements in an excellent way. Even better Results are achieved if ntan the concentration of lactic acid present in maize steeping water increases and additionally adds NH4 + ions. Instead of lactic acid you can also Use succinic acid, fumaric acid, or Z-malic acid. Additions of by E. coli fermentable carbohydrates, e.g. B. glucose, fructose, mannose, maltose, galactose etc., or the amino acids DL-Yalin, DL-Serine, L-Cysteine, L-Tryptophan and DL-Norvaline cause repression; Additions of L-glutamic acid, L-aspartic acid, DL-alanine and glycocolla promote the synthesis of L-asparaginase.

Auch Hefeextrakt eignet sich als Basis für die erfindungsgemäßen Nährlösungen.Yeast extract is also suitable as a basis for the nutrient solutions according to the invention.

Als gut geeignet erwiesen sich folgende Nährlösungen: 1. Maisquellwasser (bezogen auf Trockensubstanz) 3,00 % Natriumlaktat 0,60 % PH 7,0 (Nil 4 )2S04 0920 % 2. Maisquellwasser (bezogen auf Trockensubstanz) 3,00 ö Natriumlaktat 0,30 L-Glutaminsäure-Na 0,15 % pH 7,0 Glykokoll 0,15 (NH4)2504 0,20 % 3. Hefeextrakt 2,00 % Natriumlaktat 1,00 9& pH 7,0 (NH4) 2504 0920 96 Diese Nährlösungen wurden mit Schrägagarkulturen von E. coli ATCC 9637 beimpft und auf der Schüttelmaschine etwa 20 Stunden bei 300C kultiviert. Der pH-Wert der Kulturen stieg in dieser Zeit auf 8,5 bis 8,9 an.The following nutrient solutions have proven to be well suited: 1. Corn steeple (based on dry matter) 3.00% Sodium lactate 0.60% PH 7.0 (Nil 4) 2S04 0920 % 2. Corn steeple (based on dry matter) 3.00 ö Sodium lactate 0.30 L-glutamic acid-Na 0.15% pH 7.0 Glycocolla 0.15 (NH4) 2504 0.20% 3. yeast extract 2.00% Sodium lactate 1.00 9 & pH 7.0 (NH4) 2504 0920 96 These nutrient solutions were inoculated with slant agar cultures of E. coli ATCC 9637 and cultivated on the shaker for about 20 hours at 30 ° C. The pH of the cultures rose to 8.5 to 8.9 during this time.

Die gleichen Resultate wurden bei der Übertragung dieser Arbeitsbedingungen in den technischen Fermentermaßstab erzielt.The same results were obtained when transferring these working conditions achieved in the technical fermenter scale.

Nach beendeter Züchtung wird eine organische Base mit einem Molekulargewicht über 1000 oder deren Salz zur Kulturbrühe gegeben, wodurch die Zellen ausgeflockt und.leicht zentrifugierbar werden. Nach Resuspension der Zellen in Wasser werden diese durch Zugabe von Aceton erneut ausgefällt. Dabei werden die Zellen aufgeschlossen und so verändert, daß sich die gebildete L-Asparaginase im nächsten Schritt mit Wasser herauslösen läßt. Dieser besteht in der nochmsliuE@n Abtrennung durch Zentrifugieren, nochmaliger Resuspensiori und Extraktion mit Wasser. Aus dieser Suspension werden durch Zugabe einer der obengenannten organischen Ba2er die extrahierten Zellen, Nucleinsäuren und Ballastproteine au@>-gefällt und durch Zentrifugieren entfernt. Aus der überstehenden wäßrigen Lösung kann L-Asparaginase durch. Zugabe von viel Aceton gefällt werden. Statt Aceton lassen sich zum AufschluB der Zellen und zur Ausfällung der L-lssparaginase auch andere mit Wasser mischbare oder beschränkt mischbare organische Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropenol, Methyläthylketon, Dimethylsulfoxyd, verwenden.After the completion of the cultivation, it becomes an organic base having a molecular weight over 1000 or their salt added to the culture broth, causing the cells to flocculate and.are easy to centrifuge. After resuspending the cells in water this is precipitated again by adding acetone. The cells are opened up and changed so that the L-asparaginase formed in the next step with Lets water dissolve out. This consists in the nochmsliuE @ n separation by centrifugation, repeated resuspension and extraction with water. From this suspension become the extracted cells by adding one of the above-mentioned organic Ba2er, Nucleic acids and ballast proteins au @> - precipitated and removed by centrifugation. L-asparaginase can pass through from the supernatant aqueous solution. Adding a lot Acetone can be precipitated. Instead of acetone, the cells can be broken down and Precipitation of the L-lssparaginase also other water-miscible or limited Miscible organic solvents such as methanol, ethanol, isopropenol, methyl ethyl ketone, Use dimethyl sulfoxide.

Gegenüber den bisher bekannten Verfahren hat das erfindungsgemäße Verfahren überraschenderweise den großen Vorteil, L-Asparaginase in praktisch pyrogenfreiem Zustand zu liefern. Bestimmung der relativen L-Asparaginase-Aktivität der aus Kulturlösungen isolierten Bakteni_enzellen 15,0 ccm Kulturlösung werden zentrifugiert. Die überstehen- de Lösung wird verworfen. Die Bakterienzellen würden zu einem Volumon von 15,0 ccm in 1120 bidestillierv rE:siispen- diert. 3,0 ccm bzw. 5,0 ccm dieser Zellsuspen:,'Lon werden mit 12,0 ccm bzw. 10,0 ccm bidestillierten Wa:ser verdünnt und mit 15,0 ccm 2-; iger L-Asparaginlösun" in 1/10 mola.rer Phosphatpufferlösung von pH 7,0 versetzt. Es folgt dann ein Zusatz von 0,2 ccm Toluol. Das so hergeBtellte Reaktionsgemisch, welches nun 1,0 ,°l L-Asparagin und 1/10 bzw. 1/6 der ursprünglich in der Kulturlösung vorliegenden Bakterienzellkonzentration (= 1/10 (ILd)ormal bzw. 1/6 (N)ormal) eri@htilt, wird unter Gummistopfenverschluß 3 Stiinderi hei 30°c. e:@r@@@@ trgl t. _ Nach Ablauf dieser Zeit wird das Gem> sch 5 Minnten auf 100°C erhitzt, wieder abgekühlt und klarzentrifugiert. Die überstehende Lösung wird zur kolorinetrischen tIH3- Stickstoffbestimmung mit Nesslers Reagens gegen Aa:imonium- sulfat-Standardlösungen verwendet. Unter diesen Testbe- dingungen entstand durch in Nährlösung 1 gew2@ch:3erle Dak- terienzellen 0,025 bis 0,04 %, durch in :i@ihx@ösun; 2 ge- wachsene Zellen 0,035 bis 0,065 % und durch in 21@@.tirlö@i.@ng 3 gewachsene Zellen 0,0,1 % N. (Maximal abspaltbarcr id hei 1 , 0 % L-Asparagin i in Reaktionsgemisch = 0,106 ;'j 1;) . Um ein Maß für die relative h-A:3par agim;::e-AktivitC-it der E. coli-Zcllen zu erhalten, multipliziert man die kolori-- metrisch beitirnri'te N-Konzentration mit dem Verdünnurigs- faktor der im Testreakt:iorisgeniisc)i vor-H--gen en I?,ikterier;.- zellkonzentration. So beträgt die relative Aktivität cIer in ldährlö:3u.ng 1 Zellen 0,G-5 bi;, 0,04 x 10 = 0,25 bis 0,4, die der in Nährlösung @ gewachse- ner. Zellen 0,035 bis 0,06; x 10 = 0,35 bis 0.65 und die der in Nä!irlösung 3 gewachsenen Zellen 0,04 x 6 = 0924- Die Z-Aspa7-agina^e-Besti.mmurig der Roh-Z-A; paraginase er- folgte nach vier Methode aus Cancer Research 26 (1966), Seiten 2013 bis 2017. Die erfindungsgemäß gewoiifie@ie h--Asparagiriasc soll als Arz- neimittel. gegen solche Tumoren verwendet werden, die zu ihrem Wachstum L-Asparagin als Wuchsstoff benötigen. Vor einer solchen Verwendung ist es zweckmäßig, die erfindungs- gemäß gewonnen(,L-Aspar@igi_üase weiter anzui eichern bzw. zu reinigen. J3 c: :i s _i. e 1 Bei der iw.. nachstehende. als "Rase" bezeichneten Verbindung har:delt es sich un eiri }lochmolekulares Produkt der allgemei- nen Formel: milk. einem Molek u7 argewich i. über 1000, die durch Umsetzung von i@i-( 3-ämitiu-ii-propy l )-me R;hyl _@rnin mit Epicülorhydrin entsteht. Arheitsgm@; 1 (bezogen. auf `frockensiii):; tari2 ) wird uii_t 2 n Kalilauge auf pli 7,0 eingeGtc:zlt, 20 Minuten auf 120°C erhi i,zt uud nach Abkühlung in der Uberlaufzentri - fuge oder durch Seit2-Filtration geklärt. 30 Liter dieser klaren Naisquellwasserlösung werden mit 170 Litern Leitungs- wasser verdünnt. Zur Herstellung der obenbeschriebenen Nähr- lösung 1 werden 1,2 kg Natriumlaktat und 0,4 kg Amzionium- sulfat, zur Herstellung der Nährlösung .' 016 kg riatrium- laktat, 0,3 kg 1.1-Glutaminsäure-Na, 0,3 kg Glykokoll und 014 kg Antmoni_ü17@S Ulf at zugesetzt. Die erhaltene 1dährlösung wird in- einem Fermenter 40 Miauten bei 1100C sterilisiert, anschließend abgekühlt und dann mit 500 ccin einer 18 Stunden bei 3000 gewachsenen Schüttelkul- tur von Escherichia coli ATCC 9637 in eitaer Pährlö sung, be- stehend aus 1,5 ;b Iiefc:extrakt und 095 % Natriumlaktat, pH 7,0, beimpft. Der f@@ri:c@t@tationsansatz wird bei 300C mit 80 Litern Luft/fjjnutt150 Umdre:hungc:n des Rührwerkes pro Minute belüftet. ArbeitsL#ani; 2 Nach einer Waclistum:zeit von 16 bis 18 Stunden - wenn der pIi der Kultur auf etwa 8,E3 angestiegen ist - wird die Kul- turbrühe auf et@-ra 200C abgekühlt. Die Bakterien, welche L-Asparaginase ecithalten, werden durch einen Zusatz von 1,0 Liter 2,5-dgiger "Base"-Lösung ausgeflockt, in der Überlaufzentrifuge abgetrennt und zu einem Volumen von 20 Litern mit Leitungswasser resuspendiert. Arbeitsgang 3 In die in Arbeitsgang 2 erhaltene Zellsuspenoion läBt man unter Rühren 80 Liter Aceton einlaufen, setzt 20 ccm 2,5-%ige "Basel'-Lösung hinzu, trennt die ausgefällten Bakterien in der Überlaufzentrifupe ab und resuspendiert die Zellmasse wiederum zu 20 Litern mit Leitungswasser. Arbeitsgang 4 Zur Extraktion der h-Asparaginase aus den Bakterienzellen wird die in Arbeitsgang 3 hergestellte Suspension 4,5 Stunden bei 300C gerührt. Während dieser Zeit wird der ph durch Zusätze von 1 n Natronlauge bzw. 10-%il;er Essigaäurc bei pli 7,5 bis 7,8 gehalten. Anschließend wird auf etwa 200C abgekühlt.In comparison with the previously known processes, the process according to the invention surprisingly has the great advantage of delivering L-asparaginase in a practically pyrogen-free state. Determination of the relative L-asparaginase activity of the Bacteni cells isolated from culture solutions n 15.0 cc of culture solution are centrifuged. The survive de solution is discarded. The bacterial cells would too a volume of 15.0 ccm in 1120 double-distilled rE: siispen- dated. 3.0 cc or 5.0 cc of these cell musps: 'Lon will be diluted with 12.0 ccm or 10.0 ccm of double-distilled water and with 15.0 ccm 2-; iger L-asparagine solution "in 1/10 mola.rer Phosphate buffer solution of pH 7.0 added. It then follows an addition of 0.2 cc of toluene. The reaction mixture produced in this way, which now contains 1.0 L-asparagine and 1/10 or 1/6 of that originally in the Culture solution present bacterial cell concentration (= 1/10 (ILd) ormal or 1/6 (N) ormal) eri @ htilt, is under Rubber stopper 3 Stiinderi at 30 ° C. e: @r @@@@ trgl t. _ After this time has elapsed, the vegetables will open for 5 minutes Heated to 100 ° C, cooled again and centrifuged until clear. The supernatant solution becomes the colorinetric tIH 3- Determination of nitrogen with Nessler's reagent against Aa: imonium- sulfate standard solutions used. Under these test conditions conditions resulted from in nutrient solution 1 gew2 @ ch: 3erle Dak- serial cells 0.025 to 0.04%, by in: i @ ihx @ ösun; 2 ge grown cells 0.035 to 0.065 % and through in 21 @@. tirlö @ i. @ ng 3 Grown cells 0.0.1% N. (maximum cleavable cr id hot 1.0% L-asparagine i in reaction mixture = 0.106; 'j 1;). To be a measure of the relative hA: 3par agim; :: e-AktivitC-it der E. coli cells are obtained by multiplying the color- metrically increased N concentration with the diluent factor in the test reaction: iorisgeniisc) i vor-H - gen en I?, icterier; .- cell concentration. So the relative Activity cIer in ldahrlö: 3u.ng 1 cells 0, G-5 bi ;, 0.04 x 10 = 0.25 to 0.4, that of the growth in nutrient solution @ ner. Cells 0.035 to 0.06; x 10 = 0.35 to 0.65 and that of the 3 cells grown in sewing solution 0.04 x 6 = 0924- The Z-Aspa7-agina ^ e-Besti.mmurig der Roh-ZA; paraginase followed four methods from Cancer Research 26 (1966), Pages 2013 to 2 017. The according to the invention Gewoiifie @ ie h - Asparagiriasc is intended as a medicament neimittel. used against such tumors that too need L-asparagine as a growth substance for their growth. before such a use, it is expedient to use the invention according to won (, L-Aspar @ igi_üase further to assimilate or to clean. J3 c:: is _i. e 1 At the iw .. below. compound called "Rase" har: delt it un eiri} hole molecular product of the general a formula: milk. one molecule is heavily weighted i. over 1000 made by implementation from i @ i- (3-ämitiu-ii-propy l) -me R; hyl _ @ rnin with epicülorhydrin arises. Arheitsg m @; 1 (related to `frockensiii) :; tari2) uii_t 2 n potassium hydroxide solution is adjusted to pli 7.0: zlt, 20 minutes heated to 120 ° C, partly after cooling in the overflow center joint or clarified by Seit2 filtration. 30 liters of this clear Nais spring water solution are supplied with 170 liters of water diluted. For the production of the above-described nutrients solution 1, 1.2 kg sodium lactate and 0.4 kg ammonium sulphate, for the preparation of the nutrient solution. ' 016 kg riatric lactate, 0.3 kg 1.1-glutamic acid Na, 0.3 kg glycocolla and 014 kg Antmoni_ü17 @ S Ulf at added. The nutrient solution obtained is meowed for 40 in a fermenter sterilized at 1100C, then cooled and then with 500 ccin of a shaking culture grown for 18 hours at 3000 ture of Escherichia coli ATCC 9637 in a single pair solution, consisting of 1.5 ; b Iiefc: extract and 095 % sodium lactate, pH 7.0, inoculated. The f @@ ri: c @ t @ tation approach is used at 300C with 80 liters of air / fjjnutt150 rev: hungc: n of the agitator ventilated per minute. ArbeitsL # ani; 2 According to a Waclistum: time from 16 to 18 hours - if the pIi of the culture has risen to about 8, E3 - the culture tur broth cooled to et @ -ra 200C. The bacteria which L-asparaginase are retained by adding 1.0 liter of 2.5-dgiger "base" solution flocculated in the Overflow centrifuge separated and made to a volume of Resuspended 20 liters with tap water. Step 3 The cell suspension obtained in operation 2 is allowed to enter pour in 80 liters of acetone with stirring, 20 cc Adding 2.5% "Basel" solution separates the precipitated Bacteria in the overflow centrifupe and resuspend the cell mass again to 20 liters with tap water. Operation 4 To extract the h-asparaginase from the bacterial cells, the suspension produced in operation 3 is stirred for 4.5 hours at 30 ° C. During this time the pH is kept at 7.5 to 7.8 by adding 1N sodium hydroxide solution or 10% of acetic acid. It is then cooled to about 200C.

Arbeitsgang 5 In die nach Arbeitsgang 4 extrahierte ZellauspenSion läßt man unter Rühren 2,5 Liter 2,5-%ige "Basel'-Lösung einlauft-r. ui,d tretiii-L derl entstandenen a harken ueraus extrahierten Baktcrien und unlöslicliern "Base"-Nucleinsäure-Proteinkomplex besteht, in der Überlaufzentrifuge ab. Der Niederschlag wird verworfen. Man erhält etwa 17 Liter einer klaren Lösung, in der sich neben anderen Zellinhaltsstoffen die h-Asparaginase befindet.Operation 5 Into the cell expulsion extracted after operation 4 2.5 liters of 2.5% "Basel" solution are allowed to run in with stirring-r. ui, d tretiii-L the resultant rake from extracted bacteria and insoluble "base" nucleic acid-protein complex consists in the overflow centrifuge. The precipitate is discarded. You get about 17 liters of a clear solution that contains other cellular substances the h-asparaginase is located.

Arbeitsgang 6 Aus der in Arbeitsgang 5 gewonnenen Lösung wird Roh-h-Asparaginase durch Zusatz von 68 Litern Aceton ausgefällt. Die entstandene Fällung wird isoliert, mit Aceton nachgewaschen und im Vakuum bei 25 bis 300C getrocknet. Man erhält etwa 100 g Roh-h-Asparaginase mit einer h-Asparaginase-Aktivität von etwa 3,3 (bei Verwendung von Nährlösung 1) bzw. 4,0 bis 4,5 internationalen Einheiten pro mg (bei Verwendung von Nährlösung 2). Bei Verwendung von Nährlösung 3 enthält die Roh-h-Asparaginane etwa 2,5 internationale Einheiten pro mg. Operation 6 Crude h-asparaginase is precipitated from the solution obtained in operation 5 by adding 68 liters of acetone. The resulting precipitate is isolated, washed with acetone and dried in vacuo at 25 to 30 ° C. About 100 g of crude h-asparaginase are obtained with an h-asparaginase activity of about 3.3 (when using nutrient solution 1) or 4.0 to 4.5 international units per mg (when using nutrient solution 2). When using nutrient solution 3, the raw h-asparaginane contains about 2.5 international units per mg.

Claims

Claims 1. Method of obtaining L-asparaginase, thereby characterized in that one cultivates Escherichia coli cells, the grown cells with organic breezes from the molecular weight over 1000 or their salts precipitate, the isolated Disrupt cells with acetone, the cells with water extra- hiert, extracted cells, nucleic acids and ballast proteins by precipitation with organic bases of molecular weight above 1000 or their salts removed, and from the supernatant Solution L-asparaginase precipitated with acetone and isolated. 2. The method according to claim 1, characterized in t, that the cultivation is carried out in a nutrient solution that Corn steep water and / or yeast extract and salts of orE, ani- common acids, such as lactic acid, succinic acid, fumaric acid or Z-malic acid, and ammonium ions and largely free from E. coli. fermentable carbohydrates is. 3. Method according to Ans priich 1 and 2, thereby geitennzeich- advised that cultivation in a nutrient solution should be done first except for the components mentioned in claim 2 h-glutamine acid, L-Aspar @ agzn ^ aure or DL-Alanine or Glykocoll or Salts of this Alriizio: @ äur (: contains n and largely free of E. coli fermentable carbohydrates Method according to Anai) ruch 1, thereby; el: cnnzc: ictinei ,, that cells from ash: richia coli A`1GC fj6? 7 vert: eiidf: t.

5. Verf # method according to spoke 1, characterized in that one uses to disrupt the cells and to Aup-precipitation of the Asparagi_nase instead of acetone aridere water-wipeable or limited miscible organic solvents.