DE1767285C3 - Process for the production of a stable, highly effective AHF concentrate and means for the treatment of haemophilia - Google Patents
Process for the production of a stable, highly effective AHF concentrate and means for the treatment of haemophiliaInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und Mittel zum Herstellen eines Konzentrates des antihämophilen Faktors (AHF, Faktor VIII), wie es in den Ansprüchen 1 - 3 im einzelnen gekennzeichnet ist.The invention relates to a method and means for producing a concentrate of the antihemophilic Factor (AHF, Factor VIII), as it is characterized in claims 1-3 in detail.
Der Vorgang der Blutkoagulation ist eine wichtige Funktion, die normales Vollblut unter passsenden Bedingungen auszuführen fähig ist, um unnötige Blutverluste durch offene Wunden oder durch innere Blutungen zu verhüten.The process of blood coagulation is an important function that normal whole blood takes under Conditions capable of avoiding unnecessary blood loss through open wounds or through internal ones Prevent bleeding.
Es ist bekannt, daß normales Vollblut einen Faktor enthält, der abwesend oder in beträchtlichem Maße bei Hämophilie (Bluterkrankheit) fehlend ist. Dieser Faktor wirkt mit der Globulinfraklion des Blutes zusammen und ist als antihämophiler Faktor (AHF, Faktor VIII) bekannt geworden.It is known that normal whole blood contains a factor which is absent or to a considerable extent Haemophilia (blood disease) is absent. This factor interacts with the globulin fraction of the blood and has become known as antihemophilic factor (AHF, factor VIII).
Wissenschaftlern ist seit einiger Zeit etwas über AHF und seine Bedeutung bei der Blutkoagulation bekannt. Die Behandlung der Hämophilie hat bisher im allgimeinen in einer Auffüllungstherapie bestanden, wobei dem Patienten viele Liter frisches Vollblut oder speziell behandeltes Plasma transfundiert wurde.Scientists have been talking about AHF for some time and its importance in blood coagulation is known. The treatment of hemophilia has so far been in the generally consisted of a replenishment therapy, giving the patient many liters of fresh whole blood or specially treated plasma was transfused.
Es ist bekannt, daß jedoch unter üblichen Lagerungsbedingungen Vollblut und flüssiges Plasma seine AHF-Aktivität innerhalb eines Tages oder darum herum verliert. Da es möglich ist, frisches Plasma einzufrieren und zu lagern, hai die AHF-Aktivität in gefrorenem Plasma eine relativ kurze Lebensdauer von einigen Monaten oder darum herum.It is known, however, that under normal storage conditions, whole blood and liquid plasma are used Loses AHF activity within or around a day. Since it is possible to have fresh plasma Freezing and storing AHF activity in frozen plasma has a relatively short lifespan a few months or around.
Es ist auch möglich, während der Lagerung den Verlust an AHF-Aktivität herabzusetzen durch Trocknen frisch gefrorenen Plasmas. Aber bisher ist es nicht möglich gewesen, mit Gewißheit den Gehall an AHF in diesem getrockneten Material mit Sicherheit zu kennen, weil der Gehalt an AHF in normalen Individuen, die das Plasma spenden, außerordentlich von etwa 50% bis etwa 200% des Durchschnitts schwankt.It is also possible to reduce the loss of AHF activity during storage by drying freshly frozen plasma. But so far it has not been possible to determine with certainty the amount of AHF in Knowing this dried material for sure, because the content of AHF in normal individuals who have it Donating plasma varies greatly from about 50% to about 200% of the average.
Die konventionelle Auffüllungstherapie besitzt weitere ernst zu nehmende Nachteile, weil die Hämophilie oft allergische oder der Behandlung trotzende Zustände bei wiederholter Behandlung mit Plasma entwickelt Außerdem neigen die großen Mengen an Plasma dazu, die durch die Hämophilie benötigt werden, ein übergroßes Blutvolumen oder eine Überladung des zirkulatorischen Systems zu bewirken. Solche Überladungen rufen eine Überanstrengung des Herzens hervor und führen beim Patienten zum Herzversagen.Conventional replenishment therapy has other serious disadvantages, because hemophilia often occurs In addition, allergic or treatment-defying conditions developed with repeated treatment with plasma the large amounts of plasma required by hemophilia tend to be an oversized one Cause blood volume or an overload of the circulatory system. Such overloads call you Overexertion of the heart and lead to heart failure in the patient.
Wissenschaftler haben schon verschiedene Methoden für die Isolierung des AHF oder die Herstellung von Plasmafraktionen mit angereichertem AHF aus Humanoder Tierblut vorgeschlagen. In der Praxis haben sich Verfahren bisher als unzuverlässig erwiesen, weil die AHF-Aktivität der Fraktionen während der isolierung verloren zu gehen scheint. AHF ist ein labiles Spurenprotein, welches schwierig vollständig von anderen Plasmaproteinen zu isolieren ist, besonders Fibrinogen und die Ausbeute an AHF aus dem Plasma ist durch diese bisherigen Verfahren nicht hoch gewesen.Scientists already have different methods for the isolation of the AHF or the production of Plasma fractions with enriched AHF from human or animal blood are proposed. In practice, have Method so far proved to be unreliable because of the AHF activity of the fractions during the isolation seems to be getting lost. AHF is a labile trace protein, which is difficult to completely remove other plasma proteins, especially fibrinogen and the yield of AHF from the plasma has not been high through these previous procedures.
Die AHF-Wirkungen der bisher hergestellten Blutfraktionen für die Hämophilie-Therapie sind als gering bekannt und die Kosten der Behandlung sind hoch.The AHF effects of the blood fractions produced so far for hemophilia therapy are known to be low and the cost of treatment is high.
Andere Nachteile bei früheren Versuchen, die bei der Isolierung von AHF festgestellt wurden, sind die Eigenschaften des AHF, daß es sehr leicht durch Hitze, Einfrieren, Auftauen und andauernde Lagerung denaturiert wird.Other drawbacks with previous attempts at the Isolation of AHF have been established, the properties of AHF are that it is very easily exposed to heat, Freezing, thawing and prolonged storage is denatured.
GB-PS 10 06 258 beschriebt die Behandlung mit Polyäthylenglykolen zur Einigung bzw. Fraktionierung von Proteinen in 2 Stufen nur für die Gewinnung von homogenem Gammaglobulin beschrieben ist. Für die Gewinnung von Fibrinogen ist eine Fraktionierung in nur einer Stufe mit Polyäthylenglykol vorgesehen. Da AHF mit Fibrinogen näher verwandt ist als mit Gammaglobulin Am. J. Med. Sei. 250, Dez. 1935, Seite 65/643 wird der Fachmann durch die GB-PS 10 06 258 von der Verwendung von Polyäthylenglykol abgehalten.GB-PS 10 06 258 describes the treatment with polyethylene glycols for unification or fractionation of proteins in 2 stages is only described for the production of homogeneous gamma globulin. For the To obtain fibrinogen, fractionation is provided in just one stage with polyethylene glycol. There AHF is more closely related to fibrinogen than to gamma globulin Am. J. Med. Sci. 250, Dec. 1935, p 65/643, the person skilled in the art is prevented from using polyethylene glycol by GB-PS 10 06 258.
AO Ferner ist zu berücksichtigen, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in völlig unerwarteter Weise das von den vorhergehenden Stufen stammende Polyäthylenglykol nicht bei der Glycinfällung mit AHF ausgefällt wird, sondern in der überstehenden flüssigen Phase verbleibt. Da das Polyäthylenglykol für Patienten schädlich sein kann, wird hierdurch ein besonderer technischer (therapeutischer) Effekt erzielt. AO Further, that in the process of the invention in a completely unexpected manner, the light originating from the preceding stages of polyethylene glycol is not precipitated in the Glycinfällung with AHF, but remains in the supernatant liquid phase to be taken into account. Since polyethylene glycol can be harmful to patients, it has a special technical (therapeutic) effect.
Zu den verschiedenen Verfahren, die bisher für die Isolierung von AHF vorgeschlagen worden sind, gehören Chromatographie, stufenförmige Absorption und Elution und selektive Ausfällung. Verschiedene Ausfällungsmittel, die benutzt worden sind, sind Äthanol, Äthyläther, Ammoniumsulfat, Phosphat-Natriumcitrat, Aminosäuren und Kältefällungsverfahren.Among the various methods that have so far been proposed for the isolation of AHF, include chromatography, step absorption and elution, and selective precipitation. Different Precipitants that have been used are ethanol, ethyl ether, ammonium sulfate, phosphate sodium citrate, Amino acids and cold precipitation processes.
Kürzlich wurde die klinische Verwendung von mit Glycin gefällter AHF-Fraktion des Vollplasmas durch Webster und Mitarbeiter (Amer. J. Med. Sciences, Vol. 250, Nr. 6, Seite 643-650 (1965)) beschrieben. Über klinische Versuche zur AHF-Auffüllungstherapie mit einer kältegefällten Fraktion des Vollplasmas in einem geschlossenen Beutelsystem wurde durch Pool und Mitarbeiter (New England J. Med., VoI. 273, Nr. 27, Seiten 1443-1447 (1965)) ein Bericht veröffentlicht. Keine dieser zuletzt genannten Verfahren hat sich jedoch als eine vollständig befriedigende, auch im Fabrikmaßstab ausführbare Methode zur Isolierung von AHF erwiesen, so daß ein ungelöstes und dringendes Bedürfnis an einem industriell ausführbaren VerfahrenRecently, the clinical use of glycine-precipitated AHF fraction of whole plasma has been introduced Webster et al (Amer. J. Med. Sciences, Vol. 250, No. 6, pp. 643-650 (1965)). Above clinical trials of AHF replenishment therapy with a cold-precipitated fraction of the whole plasma in one closed bag system has been used by Pool and coworkers (New England J. Med., Vol. 273, No. 27, Pages 1443-1447 (1965)) published a report. Neither of these latter procedures has worked however, as a completely satisfactory factory-scale method of isolating AHF proved so that an unresolved and urgent need for an industrially feasible process
zur Gewinnung eines stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrates bestehtto obtain a stable, highly effective AHF concentrate consists
Die vorliegende Erfindung, die sich gegenüber den bisherigen Verfahren auszeichnet, betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrates, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kältefällungskonzentrat aus Human- oderTier-AHF in zwei aufeinanderfolgenden Stufen durch Ausfällung von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 20 000 fraktioniert, wobei in der ersten Stufe mit 3 bis 4 Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das Kältefällungskonzentrat des AHF, in der zweiten Stufe mit 10Gew.-% Polyäthylenglykol bezogen auf das Oberstehende versetzt wird, wonach man die sich ergebende Ausfällung abtrennt und noch Wiederauflösen die Fraktionierung mit einer wässerigen Glycinlösung mit einer Molarität von 1,8 und nachfolgender Isolierung der Ausfällung durchführtThe present invention, which is distinguished from the previous methods, relates to a method for the production of a stable, highly effective AHF concentrate, characterized in that a cold precipitation concentrate from human or animal AHF in two successive stages by precipitation of polyethylene glycol with a molecular weight of 200 to 20,000 fractionated, with 3 to 4 wt .-% polyethylene glycol in the first stage, based on the Cold precipitation concentrate of the AHF, in the second stage with 10% by weight of polyethylene glycol based on the The above is added, after which the resulting precipitate is separated off and still redissolved fractionation with an aqueous glycine solution with a molarity of 1.8 and later Performs isolation of the precipitate
Eine weitere Ausführungsform der vorstehenden Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reinigungsstufe unter Verwendung von triäthanolaminoäthyliertem Celluloseharz anschließt.Another embodiment of the above method is characterized in that one Purification stage using triethanolaminoethylated cellulose resin follows.
Ferner betrifft die Erfindung das Mittel enthaltender Wirkstoff das nach einem oder mehreren der Verfahrens-Ausführungsformen erhaltene stabilen hochwirksamen AH F-Konzentrat. Dieses kann intravenös oder intramuskulär verabreicht werden zur Behandlung von Hämophilie bei Mensch und Tier.The invention further relates to the agent-containing active ingredient according to one or more of the method embodiments obtained stable, highly effective AH F concentrate. This can be intravenous or administered intramuscularly to treat haemophilia in humans and animals.
Der vorstehend benutzte Ausdruck »Kältefällungskonzentrat aus Human- oder Tier-AHF« bezieht sich auf die Fällung, die beim Behandeln von Human- oder Tierblutplasma bei S4°C erhalten wird und von dem Überstehenden abgetrennt wurde. Bevorzugt wird, daß dieses Kältefällungskonzentrat des AHF durch sehr schnelles Einfrieren von frischem Piasma erhalten wird, aber gelagertes Plasma kann ebenfalls als Ausgangsmaterial bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Weiterhin wird bevorzugt, das Einfrieren in einem Temperaturbereich von etwa -200C bis etwa -400C und folgendem langsamen Tauen auf etwa 4° C durchzuführen.The expression "cold precipitation concentrate from human or animal AHF" used above refers to the precipitation which is obtained when treating human or animal blood plasma at S4 ° C. and which has been separated off from the supernatant. It is preferred that this AHF cryoprecipitation concentrate be obtained by very rapid freezing of fresh plasma, but stored plasma can also be used as a starting material in the practice of the present invention. Furthermore, it is preferable to carry out the freezing in a temperature range of about -20 0 C to about -40 0 C and the following slow thawing at about 4 ° C.
Zusätzlich zu der Stabilität und der hohen Wirksamkeit der AHF-Aktivität, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, bei der das kältegefällte Konzentrat des AHF anstelle des Vollplasmas als Ausgangsmaterial benutzt wird, hat es den großen Vorteil, die Retention von anderen Plasmakomponenten wie Albumin, Gammaglobulin und dergleichen zu gestatten, welche gewöhnlich zerstört werden, wenn das Vollplasma durch die bisher bekannten Verfahren zur Darstellung von AHF-Fraktionen behandelt wird, die zur Behandlung der Hämophilie bestimmt sind.In addition to the stability and high potency of the AHF activity achieved by the method of present invention is obtained in which the cryoprecipitated concentrate of the AHF instead of the full plasma Used as a starting material, it has the great advantage of retaining other plasma components such as albumin, gamma globulin and the like, which are usually destroyed, when the whole plasma is treated by the previously known method for displaying AHF fractions used to treat haemophilia.
Polyäthylenglykole sind hochmolekulare Polymere, die im allgemeinen durch Umsetzen von Äthylenoxyd mit Äthylenglykol oder Wasser hergestellt werden und die folgende StrukturPolyethylene glycols are high molecular weight polymers that are generally produced by reacting ethylene oxide can be made with ethylene glycol or water and have the following structure
HO(C2H4O)nC2H4OHHO (C 2 H 4 O) n C 2 H 4 OH
besitzen, in der η die üurchschnittliche Zahl an Oxyäthylengruppen angibt. Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen die Polyäthylenglykole nicht toxisch sein und können einen Molekulargewichtsbereich von etwa 200 bis etwa 20 000 besitzen.in which η indicates the average number of oxyethylene groups. In accordance with the present invention, the polyethylene glycols are intended to be non-toxic and can range in molecular weight from about 200 to about 20,000.
Der ausgewählte Molekulargewichtsbereich dieser liegt zwischen etwa 400 bis etwa 6000. PEG 4000, welches ein Polyäthylenglykolprodukt mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000 ist, ist besonders geeignete von dieser Gruppe.The selected molecular weight range of these is between about 400 to about 6000. PEG 4000, which is a polyethylene glycol product with an average molecular weight of 4,000 is particular suitable from this group.
In der erfindungsgemäßen Polyäthylenglkyol-Fällungsstufe wird 3 bis 4Gew.-% Polyäthylenglykol, bezogen auf das wieder aufgelöste AH F-Konzentrat unter Einbehaltung des Überstehenden, gefolgt von der Verwendung von etwa 10Gew.-% Polyäthylenglykol des Überstehenden unter Einbehaltung des Niederschlages, verwendet Die letztere Ausfällung wird dann abgetrennt und nach Fraktionierung mit einer wässerigen Glycinlösung mit einer Molarität von 1,8, bevorzugt in mit Citrat versetzter Salzlösung wiedergelöstIn the polyethylene glycol precipitation stage according to the invention is 3 to 4 wt .-% polyethylene glycol, based on the redissolved AH F concentrate with retention of the supernatant, followed by the use of about 10% by weight polyethylene glycol of the supernatant with retention of the precipitate, the latter precipitate is then used separated and after fractionation with an aqueous glycine solution with a molarity of 1.8, preferred redissolved in citrated saline solution
Das erhaltene AHF-Konzentrat kann eingefroren werden und bleibt stabil auch bei der Lyophilisierung und bei der Aufbewahrung unter üblichen Kühllagerungsbedingungen für Zeiten von einem Jahr und langer. Das wiedereingesetzte AHF-Konzentrat hat dann mehr als die dreißigfache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens; die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist weniger als in einem Hundertstel der im Plasma anwensenden Proteine enthalten im Vergleich zu der gleichen AHF-Aktivität im Plasma.The AHF concentrate obtained can be frozen and remains stable even after lyophilization and when stored under normal cold storage conditions for periods of one year or more. The reused AHF concentrate then has more than thirty times the AHF activity of the same Plasma volume; the AHF activity of this concentrate is less than a hundredth of that in plasma Applied proteins contain compared to the same AHF activity in the plasma.
Das kältegefällte Konzentrat des AHF, welches fraktioniert worden ist, kann zur Reinigung weiter mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt werden. Diese Reinigung kann durch Säulen- oder absatzweise Ladungsverfahren ausgeführt werden. Das nach diesem Verfahren gereinigte Konzentrat besitzt den zusätzlichen Vorteil, daß es sowohl intramuskulär wie auch intravenös verabreicht werden kann, wobei letztere Methode allgemein verwendet wird für solche AHF-Konzentrate, die nicht mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt worden sind. Das AHF-Konzentrat, welches mit ECTEOLA-Celluloseharz gereinigt worden ist ist frei von Fibrogen durch Zugabe von Thrombin und durch Immuno-Elektrophorese gefunden worden.The cold-precipitated concentrate of the AHF, which has been fractionated, can be further used for cleaning ECTEOLA cellulose resin. This purification can be done by column or batch Charge procedures are carried out. The concentrate purified by this process has the additional The advantage that it can be administered intramuscularly as well as intravenously, with the latter Method commonly used for those AHF concentrates that are not made with ECTEOLA cellulose resin have been treated. The AHF concentrate, which has been cleaned with ECTEOLA cellulose resin found free of fibrogen by addition of thrombin and by immunoelectrophoresis.
Der hier benutzte Ausdruck »ECTEOLA-Celluloseharz« bezieht sich auf eine modifizierte Cellulose, die aktive basische Substituenten enthält, die in das Cellulosemolekül durch Reaktion mit Epichlorhydrin und Triäthanolamin eingeführt wurden. Verfahren zur Herstellung von ECTEOLA-Celluloseharzen sind allgemein von Sober und Peterson (J. Am. Chem. Soc'y, Vol. 76, Seiten 1711-12 (1956; a. a. O. Vol. 78, Seite 751 -55 (1956); Vol.78, Seiten 756-63 (1956); und Peterson und Sober, (Biochem. Preparations, Vol. 8, Seiten 43 — 44 (1961)) beschrieben worden.The term "ECTEOLA cellulose resin" used here refers to a modified cellulose that Contains active basic substituents that are introduced into the cellulose molecule by reacting with epichlorohydrin and triethanolamine were introduced. Methods for making ECTEOLA cellulosic resins are general von Sober and Peterson (J. Am. Chem. Soc'y, Vol. 76, pp. 1711-12 (1956; op. cit. Vol. 78, pp. 751-55 (1956); Vol. 78, pp. 756-63 (1956); and Peterson and Sober, (Biochem. Preparations, Vol. 8, pages 43-44 (1961)).
ECTEOLA-Celluloseharze sind im Handel erhältlich. Es wurde jedoch gefunden, daß es vorteilhaft ist, eingangs diese Harze einer Natriumhydroxyd-Behandlung und Wiederauswaschung zu unterziehen, bevor diese in der schon beschriebenen Reinigungsstufe eingesetzt werden.ECTEOLA cellulose resins are commercially available. However, it has been found to be advantageous Initially, these resins should be subjected to a sodium hydroxide treatment and rewashing before these can be used in the cleaning stage already described.
In der Reinigungsstufe mit ECTEOLA-Celluloseharz wird das Harz vorzugsweise erst mit einer Chloridpufferlösung, die eine Konzentration von etwa 0,8 Gew.-°/o Natriumchlorid besitzt, in das Gleichgewicht gebracht und dann in die Chromatographieglassäule eingefüllt Das AHF-Konzentrat, welches gereinigt werden soll, wird zu der Säule gegeben und schließlich mit einer Chloridpufferlösung, die eine Molarität von etwa 0,5 besitzt, eluiert.In the cleaning stage with ECTEOLA cellulose resin, the resin is preferably first mixed with a chloride buffer solution, which has a concentration of about 0.8% by weight sodium chloride, brought into equilibrium and then filled into the chromatography glass column The AHF concentrate to be purified is added to the column and finally with a chloride buffer solution that has a molarity of about 0.5 owns, elutes.
Andere Methoden zur Reinigung der AHF-Konzentrate der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet gegenwärtig sein.Other methods of purifying the AHF concentrates of the present invention will be apparent to those of ordinary skill in the art be present in this field.
Die Herstellung, klinische Erprobung am Menschen und die Verwertbarkeit und die dabei erhaltenen Effekte der nicht nach Anspruch 3 gereinigten stabilen, hochwirksamen AHF-Konzentrate am Menschen sindThe manufacture, clinical testing on humans and the usability and the resulting Effects of the stable, highly effective AHF concentrates not purified according to claim 3 on humans
1010
1515th
2020th
vom Erfinder und Mitarbeitern in der Fachzeitschrift: »Journal of the American Medical Association« vorn 26. August 1968, Seiten 613-617 in der Arbeit mit dem Titel »A New High-Potency Glycine Precipitated Antihemophilie Factor (AHF) Concentrate« beschrieben worden.by the inventor and co-workers in the journal: "Journal of the American Medical Association" at the front of the 26th. August 1968, pages 613-617 in the work entitled "A New High-Potency Glycine Precipitated Antihemophilia Factor (AHF) Concentrate «has been described.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung weiter. Auch ist die Erfindung nicht auf diese spezifischen Beispiele beschränkt, die lediglich zum Zwecke der Verdeutlichung und nicht zwecks Beschränkung angegeben sind. Alle Teile und Prozentangaben beziehen sich auf die Gewichtsbasis, es sei denn, daß eine andere spezifische Angabe erfolgt ist.The following examples further illustrate the invention. Nor is the invention based on this Specific examples are limited, for the purpose of illustration and not of limitation are specified. All parts and percentages are on a weight basis unless that another specific indication has been made.
Ein stabiles Human-AHF-Konzentrat mit hoher Wirksamkeit wird durch die aufeinanderfolgende Fraktionierung des Humanblutplasmas hergestellt, zuerst durch Kältefällung und dann djch Polyäthylengiykol- und Glycinfällung in folgender Weise:A stable human AHF concentrate with high potency is created by the successive Fractionation of human blood plasma produced, first by cold precipitation and then by polyethylene glycol and glycine precipitation in the following way:
Reagenzien
Mit Citrat versetzte SalzlösungReagents
Salt solution mixed with citrate
Ein Teil 0,1 molares Natriumcitral auf vier Gewichtsteile 0,9% Salz.One part of 0.1 molar sodium citral to four parts by weight 0.9% salt.
Glycin mit Citrat versetzte SalzlösungGlycine with citrated saline solution
Das erforderliche Glycin wird zu der mit Citrat versetzten Salzlösung gegeben, um in bezug auf das Glycin eine 0,1 molare Lösung zu erhalten.The required glycine is added to the citrated saline solution in order to be related to the Glycine to obtain a 0.1 molar solution.
Gepuffertes WaschwassserBuffered wash water
Zu destilliertem Wasser wird 1/100 Volumen gepufferte Citratlösung zugefügt, welche durch Einstellen 0,5 molaren Natriumeitrats mit 0,5 molarer Citronensäure auf pH 6,88 hergestellt worden ist.1/100 volume of buffered citrate solution is added to distilled water, which can be adjusted by adjusting 0.5 molar sodium citrate has been prepared with 0.5 molar citric acid to pH 6.88.
Essigsäureacetic acid
Man stellt 1,0 normale und 0,1 normale wäßrige Lösungen her.Prepare 1.0 normal and 0.1 normal aqueous solutions.
GlycinGlycine
Man stellt eine 1,8 molare wäßrige Lösung her.
ArbeitsweiseA 1.8 molar aqueous solution is prepared.
Way of working
Humanblutplasma wird tiefgekühlt (S 4° C) aus einem Spenderzentrum erhalten. Das Plasma wird in Pfaudlerkessel eingetaucht und auf einer Temperatur unter 4°C gehalten. Es wird im kontinuierlichen Fluß oder durch Einzelgefäßzentrifugierung zentrifugiert. Die erhaltene Kälteausfällung wird gesammelt und für weitere Fraktionierung gemäß der vorliegerden Erfindung verwendet.Human blood plasma is obtained frozen (S 4 ° C) from a donor center. The plasma is in Pfaudler's cauldron immersed and kept at a temperature below 4 ° C. It is in continuous flow or through Single tube centrifugation centrifuged. The resulting cold precipitate is collected and used for further Fractionation used in accordance with the present invention.
Zu der Kälteausfällung wird Glycin- mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt. Die Menge beträgt ein Zehntel des Plasmavolumens, aus dem die Kälteausfällung stammt. Die Auflösung wird d'irch Mischen der Kälteausfällung einer warmen Umgebung (Raumtemperatur, aber nicht 300C übersteigend) bewirkt.Glycine salt solution mixed with citrate is added to the cold precipitate. The amount is one tenth of the plasma volume from which the cold precipitate originates. The resolution is d (but not exceeding room temperature 30 0 C) causes irch mixing the cryoprecipitate a warm environment.
Wenn die Kälteausfällung sich aufgelöst hat, kann diese, falls erforderlich, (in Abhängigkeit von der anwesenden Menge an roten Blutkörperchen und anwesenden denaturiertem Protein) durch weiteres Zentrifugieren und/oder Filtration geklärt werden.When the cold precipitate has dissolved, it can, if necessary, (depending on the present amount of red blood cells and present denatured protein) by further Centrifugation and / or filtration to be clarified.
Die aufgelöste Kältefällung wird dann auf pH 6,5 mit 0,1 normaler Essigsäure eingestellt.The dissolved cold precipitation is then adjusted to pH 6.5 with 0.1 normal acetic acid.
Es wird Polyäthylenglykol 4000 zugefügt bis dessenIt is added to polyethylene glycol 4000 until its
3030th
3535
5050
5555
6060
65 Konzentration 3,5% beträgt Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert Das Oberstehende wird dekantiert und mit 0,1 normaler Natriumhydroxydlösung auf pH 6,88 eingestellt Es wird zusätzliches Polyäthylenglykol 4000 zu der Lösung zugefügt bis die Polyäthylenglykolkonzentration 10% erreicht Das Gemifch wird milde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und eine halbe Stunde bei 5000 Umdrehungen zentrifugiert Das Oberstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in kaltem Wasser (2° C) gewaschen. Das Schleuderwaschen wird durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minute bei einer Temperatur bei —4° C durchgeführt Das Oberstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst 65 concentration is 3.5%. The mixture is gently stirred at room temperature for 10 minutes and then centrifuged for 15 minutes at 5000 revolutions / minutes. The above is decanted and adjusted to pH 6.88 with 0.1 normal sodium hydroxide solution. Additional polyethylene glycol 4000 is added added to the solution until the polyethylene glycol concentration reaches 10%. The mixture is stirred gently at room temperature for 30 minutes and centrifuged at 5000 revolutions for half an hour. The above is decanted and the precipitate is washed in cold water (2 ° C). Spin washing is carried out by centrifugation for 5 minutes at 5000 revolutions / minute at a temperature of -4 ° C. The above is decanted and the precipitate is dissolved in citrated saline
Der wiederaufgelöste Niederschlag wird durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure auf pH 6,88 eingestellt. Durch geeignete Mittel (beispielsweise Benutzung eines Kühlschrankes oder Verwendung eines Isopropanol-Trockeneisbades) wird die Lösung auf eine Temperatur von 6 bis 10" C abgekühlt. Zu der gekühlten Lösung wird die erforderliche Menge 1,8 Molare Glycin gegeben, um die Lösung in bezug auf Glycin 1,2 molar zu erhalten. Die Mischung wird sanft 45 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von 2° C bis 10° C gerührt und dann im kontinuierlichen Fluß oder gefäßweise zentrifugiert Die sich ergebende Glycinausfällung wird gesammelt und vorsichtig gewaschen mit gepuffertem Wasser bei einer Temperatur zwischen 00C bis 4° C.The redissolved precipitate is adjusted to pH 6.88 by adding 0.1 normal acetic acid. By suitable means (for example use of a refrigerator or use of an isopropanol dry ice bath) the solution is cooled to a temperature of 6 to 10 "C. To the cooled solution the required amount of 1.8 molar glycine is added to make the solution with respect to Glycine 1.2 molar The mixture is stirred gently for 45 to 60 minutes at a temperature of 2 ° C to 10 ° C and then centrifuged in continuous flow or vessel-wise Temperature between 0 0 C to 4 ° C.
Zu der Glycinausfällung wird mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt, die Menge beträgt ein Zwanzigstel des Plasmavolumens, dem die Glycinausfällung entstammt. Die Auflösung wird durch Mischen der Glycinausfällung und der mit Citrat versetzten Salzlösung in einer warmen Umgebung (Raumtemperatur aber nicht 300C übersteigend) bewirkt.Salt solution mixed with citrate is added to the glycine precipitate; the amount is one twentieth of the plasma volume from which the glycine precipitate originates. The resolution is (but not room temperature 30 0 C for rising) caused by mixing the Glycinausfällung and citrated saline in a warm environment.
Wenn sich die Glycinausfällung aufgelöst hat, wird es bevorzugt, die Lösung durch Zentrifugieren und/oder Filtration unter Verwendung eines 293 mm Milliporefilters (benutzte Membrane: 1,2 μίτι, 0,45 μπι und 0,3 μπι) zu klären. Das Konzentrat, nach diesem vorliegenden Beispiel hergestellt, besitzt eine über 30fache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens und die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist in weniger als einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteinmenge anwesend und zeigt einen gleichen Zahlenwert an AHF-AktivitätWhen the glycine precipitate has dissolved, it is preferred to centrifuge and / or remove the solution Filtration using a 293 mm Millipore filter (membrane used: 1.2 μίτι, 0.45 μπι and 0.3 μπι) to clarify. The concentrate, prepared according to this example, has a 30-fold AHF activity an equal volume of plasma and the AHF activity of this concentrate is less than one One hundredth of the amount of protein present in the plasma is present and shows the same numerical value AHF activity
Beispiel 1 wird wiederholt einschließlich der zusätzlichen Reinigungsstufe der AHF-Fraktion mit ECTEO-LA-Celluloseharz in der folgenden Weise.Example 1 is repeated including the additional purification step of the AHF fraction with ECTEO-LA cellulose resin in the following way.
Reagenzien
ECTEOLA-Celluloseha-.-zReagents
ECTEOLA-Celluloseha -.- z
1. Man mitscht 60 g Natriumhydroxyd mit 150 ml Wasser.1. 60 g of sodium hydroxide are mixed with 150 ml of water.
2. Man läßt die Mischung abkühlen.2. Allow the mixture to cool.
3. Man gibt 60 g Cellulose (Whatman Cellulose Pulver CF 11) in einen Becher und vermischt sorgfältig mit der vorstehend genannten Natriumhydroxydlösung. 3. Place 60 g of cellulose (Whatman Cellulose Powder CF 11) in a beaker and mix carefully with it the above-mentioned sodium hydroxide solution.
4. Man läßt die Mischung über Nacht (12 Stunden) stehen.4. The mixture is left to stand overnight (12 hours).
5. Am nächsten Tage wird eine Lösung von 35 ml5. The next day a solution of 35 ml
Triäthanolamin und 60 ml Epichlorhydrin hergestellt. Man mischt gut unter einem Abzug.Triethanolamine and 60 ml epichlorohydrin. Mix well under a hood.
6. Man gießt diese Lösung schnell zu der vorstehend genannten Cellulose und durchmischt gut. Das Reaktionsgefäß wird aus der Zugrichtung genommen. (Die Reaktion ist exotherm und die Temperatur steigt auf £twa 1000C. Das Gemisch wird braun in ein bis zwei Stunden.6. This solution is quickly poured into the cellulose mentioned above and mixed well. The reaction vessel is removed from the direction of pull. (The reaction is exothermic and the temperature rises to £ twa 100 0 C. The mixture is brown in one to two hours.
7. Man kühlt das Gemisch auf Raumtemperatur unter dem Abzug.7. Cool the mixture to room temperature under the hood.
8. In kleinen Anteilen gibt man 350 ml 2 molare Kochsalzlösung zu.8. 350 ml of 2 molar saline solution are added in small portions.
9. Diese Mischung wird durch ein grobkörnig gesintertes Glasfilter filtriert.9. This mixture is filtered through a coarse-grained sintered glass filter.
10. Der Niederschlag wird zweimal mit 500 ml 1 N Natriumhydroxydlösung gewaschen. (Dies entfernt die starke Verfärbung).10. The precipitate is washed twice with 500 ml of 1 N sodium hydroxide solution. (This removed the strong discoloration).
11. Man suspendiert den Niederschlag in 350 ml 1 N Salzsäure in der Filternutsche. Man legt Vakuum an.11. The precipitate is suspended in 350 ml of 1N hydrochloric acid in the suction filter. You put a vacuum at.
12. Man wiederholt Stufe 11 mit 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung. 12. Repeat step 11 with 250 ml of 1 N sodium hydroxide solution.
13. Man wiederholt die Stufe 11 mit 250ml IN Salzsäure.13. Repeat step 11 with 250ml IN Hydrochloric acid.
14. Man wiederholt Stufe 11 mit 250 ml 1 N Natriumhydroxylösung. 14. Repeat step 11 with 250 ml of 1N sodium hydroxide solution.
15. Man füllt den Niederschlag in einen 3 Literbecher.15. The precipitate is filled into a 3 liter beaker.
16. Man fügt 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung zu und mischt.16. Add 250 ml of 1N sodium hydroxide solution and mix.
17. Man fügt destilliertes Wasser zu der Mischung, um den Becher zu füllen; man mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.17. Add distilled water to the mixture to fill the beaker; you mix, cover and leave stand overnight.
18. Man dekantiert das Überstehende.18. The excess is decanted.
19. Man setzt Wasser zu dem Niederschlag, um den Becher zu füllen und mischt.19. Add water to precipitate to fill beaker and mix.
20. Man wäscht die Mischung auf dem Filter mit Wasser (vier Liter oder mehr, bis ein negativer Test für Alkali mit l°/oiger alkoholischer Phenolphthaleinlösung erhalten wird).20. Wash the mixture on the filter with water (four liters or more until a negative test for alkali is obtained with 1% alcoholic phenolphthalein solution).
21. Man führt eine Schlußwaschung mit zwei 250 ml Portionen absoluten Alkohols durch.21. A final wash is carried out with two 250 ml portions of absolute alcohol.
22. Man breitet das Produkt auf Filterpapier aus. Man zerdrückt und breitet das Produkt aus, um es über Nacht zu trocknen.22. Spread the product on filter paper. One crushes the product and spreads it over To dry overnight.
Chloridpuffer:Chloride buffer:
0,80/0 NaCl (8 g/L)0.80 / 0 NaCl (8 g / L)
0.02MImidazol(l,36g/L)0.02MImidazole (l, 36g / L)
Man stellt auf pH 6,9 mit 1 N Salzsäure ein.The pH is adjusted to 6.9 with 1N hydrochloric acid.
Eluierpuffer:
0.5 M NaClElution buffer:
0.5 M NaCl
0.02 M Imidazol(l,36 g/L)
Man stellt auf pH 6,9 mit 1 N Salzsäure ein.0.02 M imidazole (1.36 g / L)
The pH is adjusted to 6.9 with 1N hydrochloric acid.
Ein im Handel erhältliches ECTEOLA-Celluloseharz, welches erst mit NaOH behandelt worden und ausgewaschen worden ist, beispielsweise wie in der folgenden Weise, kann an Stelle des vorstehend hergestellten ECTEOLA-Celluloseharzes verwendet werden.A commercially available ECTEOLA cellulose resin, which has only been treated with NaOH and washed out, for example as in the following manner, may be used in place of the ECTEOLA cellulose resin prepared above will.
Auswaschungscyclus von im Handel erhältlichem ECTEOLA-Celluloseharz:Leach cycle of commercially available ECTEOLA cellulose resin:
1. Man mischt 60 g handelsübliches ECTEOLA-Celluloseharz mit 350 ml 2 M Kochsalzlösung.1. Mix 60 g of commercially available ECTEOLA cellulose resin with 350 ml of 2 M saline solution.
2. Man filtriert dieses Gemisch durch ein grobkörniges gesintertes Glasfilter.2. This mixture is filtered through a coarse-grained sintered glass filter.
3. Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 ml 1 N Natriumhydroxydlösung.3. Wash the precipitate twice with 500 ml of 1N sodium hydroxide solution.
4. Man wäscht einmal mit 350 ml 1 N Salzsäure.4. Wash once with 350 ml of 1N hydrochloric acid.
5. Man wäscht einmal mit 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung. 5. Wash once with 250 ml of 1N sodium hydroxide solution.
6. Man wäscht einmal mit 250 ml 1 N Salzsäure.6. Wash once with 250 ml of 1N hydrochloric acid.
7. Man wäscht einmal mit 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung. 7. Wash once with 250 ml of 1N sodium hydroxide solution.
8. Man überführt den Niederschlag in einen 3 !θ Literbecher, fügt 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung zu und mischt.8. The precipitate is transferred to a 3 liter beaker, and 250 ml of 1 N sodium hydroxide solution are added to and mix.
9. Man fügt destilliertes Wasser zu dem Gemisch, um den Becher zu füllen, mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.9. Add distilled water to the mixture to fill the beaker, mix, cover, and leave Standing at night.
10. Man dekantiert die Flüssigkeit ab, fügt 3 Liter Wasser zum Niederschlag, mischt und filtriert.10. The liquid is decanted off, 3 liters of water are added to the precipitate, mixed and filtered.
11. Man wäscht den Niederschlag mit Wasser bis der Phenophthaleintest negativ ist.11. Wash the precipitate with water until the Phenophthalein test is negative.
12. Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 ml absolutem Äthylalkohol.12. The precipitate is washed twice with 500 ml of absolute ethyl alcohol.
13. Man breitet den Niederschlag zur Lufttrocknung auf Filterpapier aus.13. Spread the precipitate on filter paper to air dry.
Das ECTEOLA-Celluloseharz wird über Nacht (12 Stunden) in einem 5°C Schrank im Gemisch mit Chloridpuffer im Verhältnis 15 g Harz zu 600 ml Puffer behandelt. Der erhaltene Harzbrei wird in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,54 cm bis 3,81 cm Durchmesser und 45,72 cm Höhe eingefüllt. Nachdem der Puffer sich bis zu dem Spiegel des Harzes abgesenkt hat, wird die AHF-Fraktion auf 2'/2 ml pro Minute eingestellt und die Menge der AHF-Fraktion, die zu einer Einzelsäule gegeben wird, enthält 1000 bis 2500 Einheiten AHF. (Eine Einheit AHF entspricht der AHF-Aktivität in einem cm3 des normalen Humanblutplasmas). Nachdem das AHF in die Säule gegeben worden ist, wird das Harz mit 200 bis 500 ml Chloridpuffer ausgewaschen. Wenn der Chloridpuffer bis zu dem Spiegel des Harzes sich abgesenkt hat, wird der Eluierpuffer in die Säule gegeben. Das Eluat wird in Zehn-ml-Portionen gesammelt und auf Protein-Fibrogen- und AHF-Aktivität geprüftThe ECTEOLA cellulose resin is treated overnight (12 hours) in a 5 ° C. cabinet in a mixture with chloride buffer in a ratio of 15 g resin to 600 ml buffer. The resulting resin slurry is filled into a column 2.54 cm to 3.81 cm in diameter and 45.72 cm in height. After the buffer has lowered to the level of the resin, the AHF fraction is adjusted to 2 '/ 2 ml per minute and the amount of the AHF fraction added to a single column contains 1000 to 2500 units of AHF. (One unit of AHF corresponds to the AHF activity in one cm 3 of normal human blood plasma). After the AHF has been added to the column, the resin is washed out with 200 to 500 ml of chloride buffer. When the chloride buffer has lowered to the level of the resin, the elution buffer is added to the column. The eluate is collected in ten ml portions and checked for protein, fibrogen and AHF activity
Die F.luatteile, die die größte wirksame AHF-Aktivität besitzen, werden zurückbehalten und durch die Zugabe von 1% Albumin stabilisiert Die stabilisierte Lösung wird dann unter Benutzung eines 293 mm Milliporefilters, wie im Beispiel 1 beschrieben, filtriert. Ein Silberfilter der gleichen Größe kann anstelle des Milliporefilters benutzt werden. Das endgültige flüssige Produkt wird dann verschlossen eingefroren und dann in einem Schnellgefrieren noch mindestens 3 Stunden aufbewahrt und unter gewöhnlichen Kühlbedingungen in der Art des Endproduktes gemäß Beispiel 1 aufbewahrtThe F.lu parts that have the greatest effective AHF activity are retained and used by the Addition of 1% stabilized albumin. The stabilized solution is then made using a 293 mm Millipore filter, as described in Example 1, filtered. A silver filter of the same size can be used in place of the Millipore filters can be used. The final liquid product is then sealed and then frozen kept in a quick freezer for at least 3 hours and under normal refrigeration conditions stored in the manner of the end product according to Example 1
Beispiel 1 wird wiederholt und zwar bis .zu der Arbeitsstufe, bei der die sich ergebende Glycinausfällung in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst wird. Die aufgelöste Glycinausfällung wird auf pH 63 durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure eingestellt Es wird Polyäthylenglykol 4000 zugefügt bis dessen Konzentration 3,5% beträgt Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert Das Überstehende wird dekantiert und mit 0,1 normaler Natriumhydroxydlösung auf pH 6,88 eingestellt Es wird zusätzliches Polyäthylenglykol 4000 zu der Lösung zugefügt bis die Polyäthylenglykolkonzen-Example 1 is repeated up to .zu the stage in which the resulting glycine precipitation is dissolved in citrated saline solution. The dissolved glycine precipitate is brought to pH 63 adjusted by adding 0.1 normal acetic acid. Polyethylene glycol 4000 is added until its Concentration is 3.5%. The mixture is stirred gently at room temperature for 10 minutes and then Centrifuged for 15 minutes at 5000 revolutions / minutes. The supernatant is decanted and made with 0.1 normal sodium hydroxide solution adjusted to pH 6.88. Additional polyethylene glycol 4000 is added added to the solution until the polyethylene glycol concentrate
tration 10% erreicht Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und eine halbe Stunde bei 500 Umdrehungen zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in kaltem Wasser (20C) gewaschen. Das Schleuderwaschen wird durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minute bei einer Temperatur bei -4°C durchgeführt. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst.tration 10% reached The mixture is gently stirred at room temperature for 30 minutes and centrifuged for half an hour at 500 revolutions. The supernatant is decanted and the precipitate is washed in cold water (2 ° C.). The spin washing is carried out by centrifugation for 5 minutes at 5000 revolutions / minute at a temperature of -4 ° C. The supernatant is decanted and the precipitate is dissolved in sodium chloride solution mixed with citrate.
Der wiederaufgelöüte Niederschlag wird durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure auf pH 6,88 eingestellt und dann mit Glycin gemäß dem Arbeitsverfahren des Beispiels 1 ausgefällt. Die GlycinausfällungThe redissolved precipitate is brought to pH 6.88 by adding 0.1 normal acetic acid adjusted and then precipitated with glycine according to the procedure of Example 1. The glycine precipitation
wird gewaschen und geklärt und dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, eingefroren.is washed and clarified and then, as described in Example 1, frozen.
Das AHF-Konzentrat, hergestellt nach dem Verfahren dieses Beispiels, enthält weniger als 0,05% (allgemein um etwa 0,01%) zurückgebliebenes PoIyäthylenglykol. The AHF concentrate made according to the procedure of this example contains less than 0.05% (generally by about 0.01%) remaining polyethylene glycol.
Das Konzentrat, nach diesem vorliegenden Beispiel hergestellt, besitzt eine über 30fache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens und die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist in weniger als einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteinmenge anwesend und zeigt einen gleichen Zahlenwert an AHF-Aktivität. The concentrate, prepared according to this example, has a 30-fold AHF activity an equal plasma volume and the AHF activity of this concentrate is less than a hundredth the amount of protein present in the plasma and shows an equal numerical value for AHF activity.
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