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I Komplex Eisen-hydriertes Dextran und Herstellungsverfahren hierfür.
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Die Erfindung betrifft einen Komplex von Eisen und hydriertem Dextran
("iron hydrogenated dextran") und ein Herstellungsverfahren hierfuri im besonderen
betrifft die Erfindung einen derartigen Eisen-hydriertes Dextran-Komplex mit verhältnismäßig
geringer Toxizität und verhältnismäßig geringem Beiz-bzw.
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Färbevermögen (Nstaining power"), sowie ein Verfahren zur billigen
Herstellung eines derartigen Eisen-hydriertes Dextran-Komplexes.
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In dem US-Patent 3 022 221 der Anmelderin ist ein Komplex von Eisen
und hydriertem Dextran ("iron hydrogenated dextran") beschrieben. Dieser Stoff hat
sowohl auf human-wie auf veterinär-medizinischem Gebiet erhebliche Beachtung und
Anerkennung gewonnen und wird in weitem Umfange zur Behandlung von Eisenmangel-Anamie
bei Mensch und Tier mittels parenteraler Injektion verwendet.
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Der in dem erwähnten Patent 3 022 221 beschriebene Eisenhydriertes
Dextran-Komplex
ist von Nebeneffekten, Schmerzerzeugung und Entzundung an der Injektionsstelle,
und den sonstigen unerwunschten Eigenschaften, wie sie frühere Präparate zur Behandlung
von Eisenmangel-Anämie, wie beispielsweise sacchariertes Eisenoxyd oder Ferrihydroxyd-Dextran-Komplex
aufweisen, praktisch völlig frei. Nichtsdestoweniger besteht bei dem in dem Patent
3 022 221 beschriebenen Komplex Eisen-hydriertes Dextran eine gewisse Tendenz zur
Beizung bzw. Färbung der Injektionsstelle ("to stain at the injection site"), wenngleich
diese Tendenz wesentlich geringer als bei den Ferrihydroxyd-Dextran-Komplex-Präparaten
ist. Außerdem führen die verhältnismäßig geringen Ausbeuten an dem nach dem Verfahren
des Patents 3 022 221 hergestellten Eisen-hydriertes Dextran-Produkt dazu, daß die
daraus bereiteten Eisen-hydriertes Dextran-Präparate ziemlich teuer werden. Da Eisenmangel-Anämie
am stärksten unter den ärmeren Schichten der Bevölkerung und in Länder mit verhältnismäßig
niedrigem Lebensstandard verbreitet ist, stellt dies ein wesentliches Problem dar.
Schließlich besitzt zwar das Eisen-hydriertes Dextran-Komplex-Präparat gemäß Patent
3 022-22-1-eine im Vergleich zu den Ferrihydroxyd-Dextran-Komplexen und zu den zuckersauren
Eisenoxyd-Präparaten äußerst günstige Toxizität, jedoch wäre es selbstverständlich
erwünscht, wenn die Toxizität noch weiter verringert werden könnte.
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Was beispielsweise die Toxizität anlangt, so kann man als allgemeine
Regel davon ausgehen, daß kommerzielle Präparate auf der Basis von sacchariertem
Eisenoxyd bei Tests bezüglich der intravenösen Toxizität in Mauser einen LDS0-Wert
von etwa 300-mg./ mu./ Kilo besitzen, Perrihydroxyd-Dextran-Komplexe einen LDc-Wert
oberhalb
von 600 mg./Kilo, wahrend schließlich die Eisenhydriertes Dextran-Präparate gemäß
dem Patent 3 022 221 der Anmelderin im kommerziellen Vertrieb einen wesentlich geringeren
nichtsdestoweniger wurde Toxizitätswert besitzen ;/beispielsweise eine intravendse
ToxizitEt in Mäusen entsprechend einem LD50-Wert weit über 2000 mg./ Kilo bisher
mit keinem zur Injektion geeigneten Eisenpräparat four dite Behandlung von Eisenmangel-Anamie
auch nur annahernd erreicht.
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Durch die vorliegende Erfindung soll ein Eisen-hydriertes Dextran-Komplex
geschaffen werden, der eine weitaus geringere oxizität als jedes bisherige Eisen-hydriertes
Dextran aufweist.
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Des weiteren soll durch die Erfindung ein Komplex Eisen-hydriertes
Dextran geschaffen werden, iii zur Behandlung von Eisenmangel-Anamie im Wege der
parenteralen Injektion geeignet ist, mit möglichat geringer Einfärbung an der Injektionsstelle
("minimal degree of staining at the site of injection").
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Weiter soll durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren angegeben
werden, nach welchem bei verhältnismäßig niedrigen Kosten verbesserte Prdparate
auf der Basis des Komplexes Eisen-hydriertes Dextran zur Behandlung von Eisenmangel-Anamie
hergestellt werden können.
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Weitere Ziele und Vorteile ergeben sich aus der folgenden Beschreibung
der Erfindung.
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Als Ausgangsmaterial für des Präparat gemäß der Erfindung dient
ein
teilweise depolymerisiertes Dextran, das aus Rohdextran erzeugt wird, welches seinerseits
nach bekannten Yerfahren durch Züchtung geeigneter Organismen, insbesondere Leuconostoc
mesenteroides, syn. Betacoccus arabinosaceous, unter sorgfältig. kontrollierten
Temperaturbedingungen in einem geeigneten Nährmedium mit einem hohen Rohrzucker
(Saccharose)-Gehalt gewonnen wird. Es ist weiter bekannt, daß das hochpolymerisierte
Rohdextran bei partieller Degradation, beispielsweise durch Behandlung mit verdünnter
Mineralsäure, zu einfacheren polymeren Formen führt, aus deren wässerigen Ldsungen,
welche polydispers sind, durch Zugabe einer geeigneten mit Wasser vermischbaren
organischen Flüssigkeit, wie beispielsweise Methylalkohol, Äthylalkohol oder Azeton,
Fraktionen von verschiedenem durchschnittlichem Molekular-Gewicht ausgefällt werden
können. Diese Degradationsprodukte bestehen aus polymerisierten Glukoseresten, die
überweigend durch -1:6 und, in geringerem Have, durch -1:4 Bindungen verbunden sind.
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Bine Fraktion dieser Art ist als Ausgangsmaterial fUr die Zwecke der
vorliegenden Erfindung geeignet ; jedoch erfolgt die Wahl des Molekularbereichs
des partiell depolymerisierten Dextrans nach des Gesichtspunkt der physikalischen
Bigenschaften wie beispielsweise der Intrinsic-Viskosität der Losung, welche die
zur Gewährleistung der fortlaufenden Stabilität der parenteralen Eisenlösung erforderliche
Minimalkonzentration an dem Dextran enthält, etatt nach dem Ublichen Gesichtspunkt
der physiologischen Wirkungen des Dextrane selbst, die hier nur von sekundärer Bedeutung
sind.
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Unter"Intrinsic-Viskosität"wird im vorliegenden Zusammenhang der Grenzwert
der spezifischen Viakosität, geteilt durch die Konzentration, fUr unendliche VerdUnnung
verstanden, der nach dem folgenden Verfahren bestimmt wird. Mit einem Ostwald-Viskosimeter
wird die eFlieBdauer" ("flow time") von wenigatens drei Lösungen verschiedener Konzentrationen
(die sämtlich kleiner als 5% w./v. dextran sind) beatimmt. Die Fließdauer der Lösung
dividiert durch die Fließdauer für Wasser gleicher Temperatur ergibt die relative
Viskosität der Zusammensetzung gemäß der Erfindung bei der gegebenen Konzentration.
Die spezifische Viskosität der Zusammensetzung gemäß der Erfindung bei einer gegebenen
Konzentration erhält man, indem man den Betrag 1,0 von dem Wert fUr die relative
Viskosität subtrahiert. FEr jede Konzentration der Zusammensetzung gemäß der Erfindung
wird der Faktor (spezifische Viskositdt dividiert durch die Konzentration) berechnet
und als Funktion der prozentualen Konzentration der Lösung, für welche er berechnet
wurde, aufgetragen. Durch Extrapolation der so erhaltenen Kurve für die Konzentration
Null erhält man den Grenzwert des Faktors (spezifische Viskosität geteilt durch
die Konzentration). Dieser Wert ist als die"Intrinsic-Viskosität"des Materials in
der Lösung bekannt. In Anbetracht der Tatsache, daß die beschriebenen Dextran-Fraktionen
polydispers sind, wird die Bezeichnung durchschnittliche Intrinsic-Viskosität verwendet.
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Um jades mögliche Mißverständnis auezuschließen, bezieht sich der
Ausdruck"durchschnittliche Intrinsic-Viskosität"auf das hydrierte Dextran selbst
und nicht auf eine wässerige Löaung hiervon oder auf eine wässerige Lösung seines
Ferrihydroxyd-Komple=ee..
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Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, daß von Fraktionen von
hydriertem Dextran mit Intrinsic-Viskositäten im Bereich von 0, 03 bis Q, 15, und
optimal von 0,03 bis 0, 08, stabile Eisenlösungen hergestellt werden können. Der
Eisengehalt der therapeutischen Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung soll im
Bereich von ein Gewichtsprozent bis 25 Gewichtsprozent an elementarem Eisen (entsprechend
etwa 2 Gewichtsprozent bis 50 Gewichtsprozent Ferrihydroxyd) liegen. Diese Zusammensetzung
kann vor der Anwendung in den hochkonzentrierten Eisenpräparaten verdunnt werden.
Das Ausmaß der Degradation des hydrierten Dextrans soll so sein, daß es eine Intrinsic-Viskosität
von 0, 03 bis 0, 15 und vorzugsweise zwischen 0,03 bis 0,08 besitzt. Entsprechend
soll bei Verwendung von polymerisiertem hydrierten Dextran der gleiche Bereich von
Intrinsic-Viskositäten verwendet werden.
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Der pH-Wert der fertigen therapeutischen Zusammensetzung gemäß der
Erfindung soll zwischen 5,0 und 7,0, vorzugsweise in der Größenordnung von etwa
6,5 betragen. Bei Anwendung als Lösungen zur parenteralen Injektion können die Präparate
gemäß der vorliegenden Erfindung bis zu 25 Gewichtsprozent Ferri-Eisen enthalten.
Normalerweise besteht kein Grund, die Ferri-Eisen-Konzentration unter etwa 1 Gewichtsprozent
zu verringern. In den meisten herkömmlichen veterinär-und human-medizinischen Präparaten
wird die Ferri-Eisen-Konzentration in der Größenordnung von 10 bis 15 Gewichtsprozent
liegen, wenn das Präparat zur parenteralen Injektion verwendet wird. Es wurde gefunden,
daß bei Präparaten, in welchen das Material in Form einer Paste verwendet wird,
die
Ferri-Eisen-Konzentration bis zu 30 Gewichtsprozent betragen
kann ; in Fällen, wo das Material im trockenen Zustand verwendet wird, kann die
Ferri-Eisen-Konzentration bis zu 40 Gewichtsprozent betragen.
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Gesaß der Erfindung wurde ferner festgestellt, daß derartige Pasten-und
Feststoffe zur oralen Eingabe verwendet werden können und vorteilhafte Diätzusätze
zur Zufuhr von Eisen daratellen.
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Das Gewichtsverhältnis von hydriertem Dextran zu Ferri-Eisen in den
Präparaten gem§ß der vorliegenden Erfindung soll zwischen einem halben Teil hydriertem
Dextran pro Teil Eisen und zwei Teilen von hydriertem Dextran pro Teil Eisen liegen.
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Der hauptsächliche Fortschritt der vorliegenden Erfindung ist in der
Entdeckung begründet, daß sich eine wesentlich höhere Ausbeute an dem Komplex Eisen-hydriertes
Dextran erzielen läßt, wenn reines Ferrihdroxyd vor der Vermischung mit dem hydrierten
Dextran hergestellt wird; die normalerweise erforderliche Reinigung des Komplexes
ist dann unndtig, und die erhaltene Komplexverbindung besitzt eine außerordentlich
niedrige Toxizität und geringes Beiz-bzw. Verfärbungsvermögen ("low staining attributes").
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Das Ferrihydroxyd wird gemß der vorliegenden Erfindung in saurer Lösung
hergestellt und wird vor der Vermischung mit der Lösung von, hydriertem Dextran
mittels Dialyse hoch gereinigt.
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Der Erfindung liegt die Entdeckung zu grunde, daß bei Herstellung
des hochreinen Ferrihydroxyds vor der Berührung mit des hydrieten
Dextran
sowohl höhere Ausbeuten an der Komplexverbindung al auch eine Komplexverbindung
mit verbesserten Eigenschaften erzielt wird. Es wurde gefunden, daß die Gegenwart
von Alkali, wi beispielsweise Natriumhydroxyd, während der Komplexbildung sowo unnötig
wie auch unerwünscht ist. So verringert die Gegenwart v Alkali oder anderen Elektrolyten
die Ausbeute an dem Komplex.
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Weiter würde die Anwesenheit von Alkali oder sonatigen Elektro@ wEhrend
der Komplexbildung zusätzliche Reinigungsschritte, wie b spieleweise eine Ausfällung
mit Alkohol nach der Komplexbildung notwendig machen. Bei dem Verfahren gem§X der
vorliegenden Erfindung ist eine derartige Reinigung nicht erforderlich.
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Dies ist ein ganz unerwartetes Ergehnis im Lichte der Theorien, wie
sie von den Chemikern, welche sich mit dem Problem befaßt haben, entwickelt wurden
und welche einen Mechanismus mit einer chemischen oder quasi chemischen Kupplung
postulieren. Man muß davon auagehen, daß diese Form einer Kupplung keine geeignete
Grundlage zur Erkldrung der Bildung von Komplexen aus Perrihydr oxyd und hydriertem
Dextran daretellt, im Gegensatz zu Komplex aus Ferrihydroxyd undDextran, da im ersten
Falle keine Aldehyd Keto-oder Karboxyl-Kupplung möglich ist. So ist auch, ungleich
dem Dextran, welches Aldehyd-, Keto-oder Karboxyl-Gruppen besitzt, das hydrierte
Dextran, wie es gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezüglich Somogyi-Reagenz
nicht-reduzi e rend.
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Die vorliegende Erfindung soll zwar durch keinerlei Annahme über irgendeinen
Mechanismus eingeschränkt werden, im Lichte der Erahrungen
des
Erfinders darf jedoch vermutet werden, daß die isen-hydriertes Dextran-Komplexe
gem§ß der vorliegenden Erfinung stable kolloidale Ldeungen darstellen bzw. einen
Schutzberzug eines Kolloids auf einem anderen, wie beispielsweiee des srrihydroxyds
auf dem Komplex Eiaen hydriertes Dextran, oder des omplexes Eisen-hydriertes Dextran
auf d@@ @errihydroxyd.
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» @ Ferrihydroxyd wird vorzugsweise aus einer wässerigen Lösung @n
Ferrichlorid hergestellt, und zwar vorzugsweise mit Ammoniumydroxyd als Alkaliagens.
Das Ammoniumhydroxyd soll dem Ferri-@hlorid in einer wässerigen Lösung bis zur Erreichung
eines @H-Werts in der Größenordnung von etwa 2,0 zugegeben werden. Bei @rreichung
dises Punktes soll die gebildete Ferrihydroxydlösung @bgfefiltert und sodann im
fließenden destillierten Wasser bis vollkommenen sur im wswantliohen/Befreiung von
Chloridionen dialysiert werden.
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@ies erfolgt bei einem pH-Wert in der Größenordnung von etwa 1,3 und
vorzugsweise von etwa 4,5 bis 5,5 Das so gereinigte @errihydroxyd wird sodann mit
einer Lösung von hydriertem Dextran ter Rühren bei etwas erhdhten Temperaturen,
etwa in der Grdßenordnung von 50°C bis 90°C und vorzugsweise 75°C bis 85°C, gescht,
bis der Komplex Eisen-hydriertes Dextran gebildet ist.
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@wer kann auch bei Siedetemperatu oder bei einer Temperatur @is zur
Siedetemperautr gearbeitet werden ; besser ist es jedoch, li Bildung des Komplexes
bei derartigen höheren Temperaturen su vermeiden, um einer Hautbildung auf der Oberfläche
der Lösung @orzubeugen.
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Das nach den vorstehend beschriebenen Yerfahren dargestellte
in
: ixa. a~ta ' : q°t e ; spi. tiv : : ^~va rr^nlielz lola. ern F.-h@itsgrad als ds
sogenannte "dialysiste Eiosen", wie es der @eitig im Handel erhältlich ist (und
das normalerweise einen : T. : 3rC Ft ; : , wv) H c : v . fi c normlri ira. . r
Diteratur so bezeichnete "dialysierte Eisen", da dieses eine ..,, PF., 1. zz ucaa
^4°cla. iica. : .. /o'x,, moiuanio. . ethl. t o die Dialyse des Ferrihydroxyds kann
mittels herkömmlicher Dialysemembranen, wie beispeelsweise Kolloidin oder Zellophan,
bzw. unt @er Verwendung herkömmlicher Dialyse-Anlagen erfolgen. po s wurde gefunden,
daß die Komplexbildung normalerweise etwa 2 bis 5 Std. nach der anfänglichen Mischung
erfordert, wobei diese Zeitdauer von der jeweiligen Temperatur, der Beschickungemenge
a. dgl. abhängt. Zum Austreiben von Wasser und zur Konzentration les Präparats.
kann während einer liEngeren Zeitdauer nach der Komplexbildung innerhalb des angegebenen
Temperaturbereichs er-@itzt werden.
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3ei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind die bisler
zur Herstellung einer für die klinische Anwendung geeigneten Disen-hydriertes Dextran-Komplexverbindung
erforderlichen nor-@alen Reinigungeschritte einschließlich einer Ausfällung mit
Lisopropylalkohol oder Kthylalkohol unnötig. Dies ermöglicht eine resentliche Ersparnis.
So hat beispielsweise die Erfahrung ge-@eigt, daß zur Herstellung einer Partie von
100 Gallonen von iisen-hydriertes Dextran-Komplex einer Konzentration von 10 Geichtaprozent
die Anwendung von annähernd 4000 Gallonen Isoproylalkohol zur Reinigung mittels
FEllung erforderlich ist. Zwar
kann ein sehr großer Teil dieses
Isopropylalkohols rüokgdwonnen werden, jedoch erfordert dies eine Destillation und
es treten erhebliche Verluste auf. Daher hat sich denn auch der bisher erforderliche
Reinigungsschritt kommerziell als sehr kostspielig erwiesen.
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Es kann manchmal vorkommen, daß ein nach dem verbesserten Verfahren
gemäß der vorliegenden Erfindung hergestelltes Eisenpräparat zur parenteralen Anwendung
leicht hypotonisch ; so ist die Frierpunktserniedrigung einer kolloidalen Lösung
mit einem Gehalt von etwa 5% elementarem Eisen, wie sie normalerweise für intramuskuläre
Injektion hergestellt wird, häufig kleiner als 0,53°C (der ungefähren Erniedrigung,
wie sie mit isotonischer Salzlösung erhalten wird) : In einem derartigen Fall kann
eine entsprechende Menge einer geeigneten Substanz, wie beispielsweise Natriumchlorid
oder Glukose, zugegeben werden, um den Wert der Frierpunktserniedrigung des Präparats
auf 0, 53°C zu erhöhen und dieses damit im wesentlichen isotonisch mit dem Blut
zu machen.
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Wie erwähnt, soll der pH-Wert der therapeutischen Zusammensetzung
gemäß der vorliegenden Erfindung im Bereich von 5,0 bis 7,0 liegen. Der pH-Wert
kann vor der Sterilisierung mit Säure oder mit Alkali eingestellt werden, derart,
daB gewährleistet ist, daß der pH-Wert innerhalb dieser Grenzen zu liegen kommt.
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Die Sterilisierung der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten
Präparate kann durch Autoklavenbehandlung dieser Präparate
in
ihren endgUltigen Behältern, beispielsweise Ampullen, wdhrend 30 Minuten bei einem
Dampfdruck von 10 (amerikanischen) Pfund pro Quadratzoll entsprechend einer Temperatur
von 115°C vorgenommen werden. Da jedoch eine mögliche Degradation des hydrierten
Dextrans oder Ausfällung des Ferrioxyds infolge übermäßiger W§rme vermieden werden
soll, ist die Sterilisierung im Wege der Filtration durch Pasteur-Rohren, Millipore-Filter,
Sterilisierkissen od. dgl. vorzuziehen.
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Durch Dehydrierung der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten
kolloidalen Lösungen, beispielsweise im Wege der Verdampfung unter verringertem
Druck oder alternativ durch Abtrennung und nachfolgende. Deeikkation des durch Fällung
des Kolloids mittel Zugabe eines geeigneten mit Wasser vermischbaren Lösungsmittels,
wie beispielsweise Methylalkehol, Xthylalkohol oder Azeton erhaltenen Produkts,
lassen sich fente Präparate erhalten, die sich zur sofortigen Heretellung von zur
Injektion geeigneten kolloidalen Eisenlösung durch bloße Zugabe von destilliertem
Wasser eignen.
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Die therapeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung
genügt den folgenden Anforderungen, die sich als wünschenswert für einw Eisenlösung,
die zur intramuskulären Injektion bei der Behandlung von Eisenmangel-Anämie bestimmt
ist, ergeben habend (a) Keine Auswirkung auf den pH-Wert der Körperflüssigkeiten;
(b) Isotonizität mit der Gewebeflüssigkeit; (c) Beständigkeit (Stabilität) in Gegenwart
von Protein und d Elektrolyten ;
(d) Gute YerfAgbarkeit bei der
Hämoglobin-Synthese; (e) rasche Absorption in Verbindung mit geringer Aussoheidungsgeachwindigkeit
; (f) möglichst hoher Bisengehalt in möglimchst geringem Volumen ; (g) geringe Toxizität;
(h) Reproduzierbarkeit ; (i) Lagerungsbeatändigkeit.
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Das in den therapeutisch anwendbaren Zusammensetzungen gemäß der @
Erfindung verwendete hydrierte Dextran besitzt eine durchschnittliche Intrinsio-Viakosität
von 0, 03 bis 0,15 und vorzugsweise zwischen 0,03 und 0,08. Dies ist ein Bereich
unterhalb der durchschnittlichen Intrinsic-Viskositat von hydrierten Dextranen,
wie sie in der Literatur mitgeteilt wurden, beispielsweise in der US-Patentehrift
2 807 610. Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendeten hydrierten
Dextrane werden daher aus Dextranen gewonnen, welche eine merklich niedrigere durchschnittliche
Intrinsic-Viskosität besitzen als die in den Beispielen des US-Patents 2 807 610
beschriebenen Dextrane. Während bisher, in der US-Patentschrift 2 807 610, die Hydrierung
von Dextranen mit durchschnittlichem Molekulargewicht 75. 000 oder mit durchschnittliohem
Molekulargewicht im Bereich zwischen 50. 000 bis 100.000 vorgeschlagen wurde, liegt
der optimale Bereich von Dextranen zur Herstellun der hydrierten Dextrane, welche
zur Verwendung in den therapeutisch anwendbaren Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
bestimmt sind, im Molekulargewichtsbereich von 2.000 bis etwa 10.000, nämlich entsprechend
einer mittleren Intrinsic-Viskosi tät von 0, 03 bis 0,08. Ungeachtet des verhältnismäßig
hohen Depolymeriaationagradea der fUr die hydrierten Dextrane der vorliegenden
Erfindung
verwendeten Dextrane wurde jedoch gefunden, daß das in Beispiel III des erwahnten
US-Patents 2 807 610 beschriebene Verfahren mit Erfolg mit den niedrigmolekularen
Dextranen gemäß dem vorerwahnten Molekulargewichtsbereich zur Herstellung der hydrierten
Dextrane mit den erwahnten mittleren Intrinsic-Viskositäten ausgeführt werden kann.
Die hydrierten Dextrane, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
verhalten sich gegenüber dem Somogyi-Reagenz im wesentlichen nicht-reduzierend.
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Zur Erläuterung eines Verfahrens zur Herstellung von hydriertem Dextran,
das für die therapeutisch wirkenden Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung
geeignet ist, dient das Folgende : BEISPIEL A.
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Zu einer 10% igen wässerigen Losung, welche 10 (amerikanische) Pfund
Dextran mit einer mittleren Intrinsic-Viskosität von 0, 05 enthält, werden 200 g
Natriumborhydrid, in Wasser gelöst, gegeben. Man n läßt das Gemisch bei Zimmertemperatur
5 Stunden lang unter gelegentlichem Umrühren stehen und säuert es sodann mit 30%
iger Essigsäure an. Das angesduerte Gemisch wird sodann durch Durchfluß eine Säule
eines Katinn-Austauscherharzea geleitet ; der
aus der Säule wird sodann durch eine Anion-Austauscherharz-Säule geleitet. Der in
dieser Weise entionisierten Lösung wird Methyialkohol zugesetzt, derart, daß eine
Lösung mit einem Methylalkoholgehalt von 80 Volumprozent erhalten wird. Man läßt
24 Stunden bei 25°C abstehen und dekantiert sodann die Uberstehende Flüssigkeit
von dem ausgefällten reduzierten Dextran. Das so erhaltene Produkt wird bei 100°C
und Atmospharendruck eine Stunde lang und
sodann bei 100°C im Vakuum
zwei Stunden lang getrocknet. Das so erhaltene Produkt verhält sich gegenüber Somogyi-Reagenz
nichtreduzierend. Bei Verarbeitung verschiedener Chargen von Dextran sind vorangehende
Tests ratsam, um sicherzustellen, daß das.
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Natrumborhydrid in angemessener Menge vorliegt in dem beßchriebenen
Beispiel liegt das Natriumborhydrid in tberschuB über die erforderliche Mindestmenge
vor.
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Zur Erläuterung eines Verfahrens zur Herstellung von hydriertem Dextran
vom polymerisierten Typ dient das Polgende : BEISPIEL B Nach dem in Beispiel 1 der
US-Patentschrift 2 660 551 beschriebenen Verfahren wird mittels Leuconostoc mesenteroides
NRRL B-512 Dextransucrase erzeugt.
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Diese Dextransucrase dient zur Herstellung von polymerisiertem Dextran
aus einem wässerigen Gemisch, welches 80 Gewichtsprozent Sucrose und 5 Gewichtsprozent
Dextran von niedrigem Molekulargewicht aus einer vorhergehenden Charge enthält.
Der pH-Wert des Gemisches wird auf 5,2 eingestellt und die Temperatur auf 25°C gehalten,
bis die Umwandlung der Sucrose zum Dextran, wie sie durch die Erzeugung von Fructose
gemessen werden kann, aufgehört hat.
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Das Dextran wird sodann aus dem Gemisch ausgefällt, indem Methylalkohol
bis zu einer 90%igen Lösung zugegeben wird. Der gummil artige Niederschlag wird
sodann in eine 5% ige wässerige Lösung
überführt und durch fortschreitende
Zugabe von Methylalkohol fraktioniert, wobei diese Fraktionierung vier 8tufen mit
einer jeweils zunehmenden Methylalkoholkonzentration umfaßt, nämlich sine Methylalkoholfraktionierung
innerhalb der Bereichsgrenzen (in % v./v.) von 0-40,40-50,50-60 und 60-70. Das aus
den beiden letzten Fraktionen erhaltene Dextran besitzt ein Molekulargewicht in
der aröBenordnung, wie sie zur Verwendung bei der Herstellung der Komplexe Ferrihydroxyd-hydriertes
Dextran gemäß der Erfindung geeignet ist.
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Das aus den beiden letzten Fraktionierungen gewonnone Dextran wird
abgetrennt und nach dem folgenden Yerfahren hydrierts Zu einer 10%igen wässerigen
Lösung von 10 (amerikanischen) Pound des erwihnten Dextrans werden 200 g Natriumborhydrid,
in Wasser gelöst, zugegeben. Man läßt das Gemisch bei Zimmertemperatur 5 Stunden
lang unter gelegentlichem UmrUhren abrtehen und säuwrt sodann mit 30%iger Essigsäure
an. Das angesäuerte Gemisch wird durch eine Kation-Austauscherharz-Säule, der Abfluß
aus dieser sodann durch eine Anion-Austauscherharz-8gule geleitet.
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Der so entionisierten Lösung wird Methylalkohol unter Rühren zugegeben,
bis eine Lösung mit 60 Volumprozent Methylalkoholgehalt entsteht. Man lEßt 24 Stunden
bei 25°C abatehen und dekantiert t sodann die überstehende Lösung von dem auagefdllten
reduzierten Dextran. Das Produkt wird bei 1000 und Atmosphärendruck eine Stunde
lang, sodann bei 100°C in Vakuum zwei Stunden lang getrocknet. Dan so erhaltene
hydrierte Dextran verhält sich
gegenUber Somogyi-Reagenz nicht-reduzierend.
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Zur SrlOuterung der Komplexe von Ferrihydroxyd-hydriertem Dextran
gemEß der Erfindung und des Verfahrens zu ihrer Heratellung dienen 'die folgenden
Beispiele.
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BEISPIEL I Zu einer Ammoniumhydroxydldsung von 15 Gewichtsprozent
wird eine 40 gewichtsprozentige Ferrichloridlösung (auf der Basis von FeCl3 6H20)
zugegeben, bis ein pH-Wert von etwa 2,0 erhalten wird. Die so erhaltene Lösung wird
sodann zur Entfernung jeglichen. Niederschlags durch Nylon filtriert und das Filtrat
in eine Zellophan-Dialyse-Röhre geleitet. Die Zellophan-Dialyse-Röhre wird sodann
in fließendes destilliertes Wasser gebracht.
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Dabei wird Ammoniumchlorid fortschreitend aus der Röhre in das flieBende
destillierte Wasser austreten. Gleichzeitig wird der pH-Wert der Lösung innerhalb
der Röhre ansteigen, wobei das Ferrihydroxyd (oder Hydro-Ferrioxyd, das im folgenden
als Ferrihydroxyd bizeichnet wird) in kolloidaler Suspension verbleibt.
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Es soll keine Ausfällung des Ferrihydroxyds auftreten. Diese Auawaschung
wird fortgesetzt, bis die Lösung im wesentlichen frei von Chloridionen ist. Dies
wird im allgemeinen bei einem pH-Wert von etwa 4, 5 bis 5,5 der Fall sein ; dieser
Punkt bezeichnet die Erreichung einer dialysierten Ferrihydroxydlösung hoher Reinheit.
Diese Ferrihydroxydlösung enthält zwischen etwa 3 1/2 bis 4 Gewichtsprozent Ferri-Ionen.
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Bine 20 gew. prozentige Lösung von hydriertem Dextran mit einem
Molekulargewicht
von etwa 5000, das nach dem Verfahren gemäß Beispiel A hergestellt wurde, wird sodann
der Ferrihydroxydlösung zugesetzt. Die zugegebene Menge ist so gewählt, daß gewichtsmäßig
ebensoviel hydriertes Dextran wie Ferrieisen vorliegen. Enthält beispielsweise die
kolloidale Lösung 10 Gewichtsteile Ferrieisen, so werden 10 Gewichtsteile hydriertes
Dextran zugegeben.
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Das Gemisch aus dem kolloidalen Ferrihydroxyd und der Lösung von hydriertem
Dextran wird sodann unter Rühren bei 80°C innig vermengt, bis ein stabiler Komplex
erhalten wird.
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Die erhaltene Komplexverbindung wird sodann gefiltert.
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Sodann wird die Eisenkonzentratioh auf einen Wert von-10 Gewichtsprozent
und der pH-Wert der Lösung auf 6,5 eingestellt (in vielen Fällen wird der pH-Wert
bereits in dem Bereich liegen, der zur Verwendung als Präparat zur parenteralen
Anwendung geeignet ist),, die Lösung wird sodann filtriert und die kolloidale Lösung
durch Filtration sterilisiert. Alternativ kann die Lösung vor der Einstellung des
pH-Wertes auf 6,5, falls eine derartige Einstellung vorgenommen wird, sterilisiert
werden.
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Was die für die Durchfiihrung der Dialyse erforderliche Zeitdauer
anlangt, so hängt diese von der Größe und dem Wirkungsgrad des Dialyse-Apparates
ab. Mit Zellophanröhren wurde mit einer Zeitdauer von etwa 20 Stunden in fließendem
destillierten Wasser gearbeitet. Entsprechend wird die für das Umrühren der kolloidalen
Ferrihydroxydlösung mit der Lösung von hydriertem Dextran zur
Bildung
des Komplexes erforderliche Zeitdauer von der Größe der Charge, der Intensität des
Umrührens usw. abhängen. Für eine maximaie Ausbeute sollte jedoch bei 80°C wenigstens
mehrere Stunden lang gerührt werden. Nach dem Verfahren gemEß der vorliegenden Erfindung
lassen sich Ausbeuten ir der Größenordnung von 90 Gew.
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Prozent besogen auf das hydrierte Dextren erzielen. Somit geht nur
eine Menge in der Größenordnung von 10 Gewichtsprozent des hydrierten Dextrans verloren.
Bei den bekannten Verfahren ging wenigstens 50 Gewichtsprozent des hydrierten Dextrans
verloren.
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Wenngleich der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung durch keinerlei
Theorie eingeengt werden soll, darf angenommen werden, daß bei den vorliegenden
Verfahren gemäß der Erfindung eine vollständigere Komplexbindung zwischen dem Ferrihydroxyd
und dem hydrierten Dextran erreicht wird, als dies bisher möglich war.
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BEISPIEL II Es wird nach dem Verfahren geräß Beispiel I gearbeitet
mit der Ausnahme, daß an Stelle des durch eine Degradation des Dextrans nach des
Verfahren gemäß Beispiel A erhaltenen hydrierten Dextrans das nach dem synthetischen
Verfahren gemäß Beispiel B erhaltene hydrierte Dextran verwendet wird.
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BEISPIEL III Es wird nach dem Verfahren gemäß Beispeil I gearbeitet
mit der Ausnahme, daß hydriertes Dextran in einer Menge verwendet wird, die der
Hälfte der Menge (in Gewichtsteilen) an Ferrieisen in der Lösung entspricht. Es
wurde eine Ausboute in der Größenordnung von 90 Gewichtsprozent bezogen auf das
hydrierte Dextran erreicht.
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BEISPIEL IV Es wird nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel I
gearbeitet. mit der Ausnahme, daß hydriertes Dextran in der doppelten Menge bezogen
auf die Gewichtsmenge des Ferrieisens in der LUsung verwendet wird. Das Verfahren
nach diesem Beispiel IV ergibt zwar ein Produkt mit besonders niedriger Toxizität,
jedoch wird es normalerweise im kommerziellen Maßstab wegen der Vergeudung an hydriertem
Dextran, das wesentlich teuerer als das Ferrieisen in der Lösung ist, nicht angewendet
werden.
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Die therapeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung
sind im wesentlichen praktisch frei von Eisenionen und können daher als nicht-ionisch
bezeichnet werden. Lagerungsteste haben ergeben, daß diese Zusammensetzungen bei
Lagerung hußerat stabil sind.
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Die Eisen-hydriertes Dextrari-Komplex-Präparate gemäß der vorliegenden
Erfindung kbnnon infolge der hohen Ausbeuten, die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung erzielt werden, zu wesentlich geringeren Kosten hergestellt werden als
Eisen-hydriertes Dextran nach irgendeinem der bisher bekannten Verfahren.
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Ferner ist die Beiz-bzw. Färbwirkung an der Injektionsstelle bei den
Präparaten gemäß der vorliegenden Erfindung wesentlich geringer als bei irgendwelchen
bisher bekannten Eisen-hydriertes Dextran-Präparaten oder einem der bekannten Eiaen-Dextran-PrEparate.
Endlich ist auch die Boxizität der Eisen-hydriertes Dextran-Komplex-Präparate gemäß
der vorliegenden Erfindung erheblich geringer-als die bisher bekannter Präparate.
So haben die PrEparate
gemäB der vorliegenden Erfindung bei Tests
hinsichtlich der intravenösen Toxizität an M§usen einen LD50-Wert von wesentlich
über der Größenordnung von 2000 mg./Kilo. Diese geringe Toxizität war bisher mit
keinem zur Injektion geeigneten Eisenpräparat fUr die Behandlung von Eisenmangel-Anämie
auch nur annähernd erreichbar.
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Zwar soll der Sohutzumfang der vorliegenden Erfindung durch Theorien
Aber den Grund fUr die geringe ToxizitAt des Eisenhydriertes Dextran-Komplexes gemäß
der vorliegenden Erfindung in koiner Weise eingeschränkt werden ; es darf jedoch
angenommen werden, daß infolge der Bildung des Komplexes in Abwesenheit von Blektrolyten,
wie etwa Alkali oder sonstigen Salzen, die Möglichkeit einer Kontamination durch
Spurenmetalle ausgeschlossen wird.
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Es darf angenommen werden, daB die Möglichkeit besteht, daB hydriertes
Dextran Spurenmetall-Verunreinigungen, welche in dem Alkali oder in dem Blektrolyten
vorliegen kUnnen, einfingt (einschließt) oder möglicherweise sogar einen Komplex
mit ihnen bildet. Es besteht Grund zur Annahme, daß diees Spurenmetall-Verunreinigungen
suzgeprEgt zur Toxizität beitragen. So besteht beispielsweise die Möglichkeit, da$
Arsen als Spurenmetall-Verunreinigung in Eisensalzen vorliegt. Wenngleich hierüber
noch keine vollständige Gewißheit besteht, nimmt der Erfinder derzeit an, daß der
Grund fUr die Erzielung einer viel größeren Ausbouto bei der Verfahren gemäß der
vorliegenden Erfindung als bisher möglich war in der Verwendung von hoch gereinigtem
Ferrihydroxyd bei der Herstellung der nicht-ionischen kolloidalen Ferrihydroxyd-hydrierte
Dextran-Komplex-Verbindung zu sehen ist; hierdurch wird au Konkurrenz zwischen bisher
gegebene/
hydrierten Dextran'
und Alkali vermieden. Bei dem in der US-Patentschrift
3 022 221 der Anmelderin beschriebenen Verfahren zur Heratellung von Ferrihydroxyd-hydriertes
Dextran-Komplex bestand eine Koukurrenz zwisc xn dem Alkali und dem hydrierten Dextran
bezuglich der Ferriionen, mit entsprechendem Verlust an hydriertem Dextran. Der
Mechanismus dieses Verlustes ist bisher nicht aufgeklärt.
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Die beschriebenen Ausführungsbeispiele können selbstverständlich in
mannifgacher Weise abgewandelt werden, ohne ds8 dadurch der Rahmen der vorliegenden
Erfindung verlassen wurde.
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Patentansprüche: