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DE10121201A1 - Photoaktivierbare Polysaccharidderivate für die Immobilisierung von Biomolekülen - Google Patents

Photoaktivierbare Polysaccharidderivate für die Immobilisierung von Biomolekülen

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DE10121201A1
DE10121201A1 DE10121201A DE10121201A DE10121201A1 DE 10121201 A1 DE10121201 A1 DE 10121201A1 DE 10121201 A DE10121201 A DE 10121201A DE 10121201 A DE10121201 A DE 10121201A DE 10121201 A1 DE10121201 A1 DE 10121201A1
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DE
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polysaccharide
substrate
polysaccharide derivative
biomolecules
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Frank Loescher
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Molecular Machines and Industries GmbH
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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharidderivate der Formel (I) DOLLAR F1 wobei DOLLAR A p eine Zahl von 5-100000 ist; A ein O- oder ein NH-Atom/Molekül darstellt; B eine photoaktivierbare Gruppe B¶a¶ und/oder eine Gruppe B¶b¶ darstellt, DOLLAR A wobei B¶b¶ ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiXYZ darstellt, wobei X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-10-Alkyl- oder eine C2-10-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, darstellen; DOLLAR A wobei der Substitutionsgrad DS¶a¶ von B¶a¶ pro Anhydroseeinheit 0,001-2 und der Substitutionsgrad DS¶b¶ von B¶b¶ pro Anhydroseeinheit 1-2,999 beträgt, wobei gilt DS¶a¶ + DS¶b¶ = 3; und wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können. DOLLAR A Die Erfindung stellt zudem ein Beschichtungsverfahren mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharid, ein entsprechend beschichtetes Substrat und ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an dieses Substrat bereit.

Description

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharidderivate, die photoaktivierbar sind, Verfahren zur Beschichtung von Substraten unter Verwendung dieser Verbindungen, die so erhaltenen, beschichteten Substrate sowie deren Verwendung zur Immobilisierung von Biomolekülen.
Die Immobilisierung von Biomolekülen an festen Trägern spielt bei einer Vielzahl moderner Analyse- und Trenntechniken, wie der Affinitätschromatographie, der Bioreaktortechnik und vor allem der analytischen Bio- und Chemosensorik eine entscheidende Rolle. Z. B. erfolgt ein Nachweis in Immuntests und Hybridisierungstests dadurch, dass an eine feste Substratoberfläche adsorbierte Rezeptormoleküle spezifisch mit den zu bestimmenden Spezies reagieren. Insbesondere im Bereich der hochempfindlichen Detektion einzelner DNA-, RNA-, Antigen- bzw. Proteinmoleküle ist es von großer Bedeutung, dass die entsprechenden Moleküle spezifisch und fest an Oberflächen gebunden sind und eine unspezifische Adsorption von Molekülen auf diesen Substratoberflächen unterbunden wird.
DE 197 36 736 beschreibt Polysaccharidderivate, wie Celluloseether, insbesondere Aminoalkyltrialkylsilyl- Cellulosen, die nach Übertrag auf Substratoberflächen mit der Langmuir-Blodgett- und/oder Langmuir-Blodgett-Schäfer-Technik Beschichtungen bereitstellen, an denen eine unkontrollierte Adsorption wie auch eine Oberflächen-induzierte Denaturierung der Biomoleküle weitgehend verhindert wird und die auf beliebige Substrate aufgebracht werden können.
Weiterhin sind Verfahren bekannt, bei denen Biomoleküle an feste Trägeroberflächen nach photochemischer Aktivierung der Oberfläche immobilisiert werden. Die photochemische Immobilisierung weist insbesondere dann Vorteile auf, wenn unterschiedliche Biomoleküle auf der Oberfläche geordnet bzw. in Mustern immobilisiert werden sollen. So beschreibt US 5 847 019 ein Verfahren, bei dem eine Lösung einer Acrylamidverbindung, einer Bisvinylverbindung und einer photoaktivierbaren Verbindung über einem mit Vinylgruppen beschichteten Substrat photoaktiviert wird, wobei eine photoaktivierte und vernetzte Schicht erhalten wird, an die Biomoleküle photochemisch immobilisiert werden können. Dieses Verfahren weist insbesondere den Nachteil auf, dass nur Vinyl-derivatisierte Oberflächen so beschichtet werden können, wodurch die Anwendbarkeit des Verfahrens eingeschränkt ist. Weiterhin kann gemäß US 5 847 019 keine definierte Schichtdicke und keine definierte Anzahl von photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit erhalten werden.
Vor diesem Hintergrund ist es die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe, eine chemische Verbindung bereitzustellen, die als Beschichtung die Vorteile der Beschichtung gemäß DE 197 36 736 zeigt, insbesondere im Hinblick auf die breite Anwendbarkeit und die Vermeidung unkontrollierter Adsorption und Oberflächen-induzierter Denaturierung von Biomolekülen, jedoch eine einfachere, schnellere und damit schonendere Immobilisierung erlaubt und gleichzeitig eine erhöhte Stabilität zeigt.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung eines Polysaccharidderivates der Formel (I):
wobei
p eine Zahl von 5-100000 ist; A O oder NH darstellt, B eine photoaktivierbare Gruppe Ba und eine Gruppe Bb darstellt,
wobei Bb ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiXYZ darstellt, wobei X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-10-Alkyl- oder eine C2-10- Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, darstellen;
wobei B über eine Ether- oder Estergruppe an die Sauerstoffatome oder als Amin-, Amid-, Nitril-, Säureamid-, Diamin- oder Diazogruppe an das Stickstoffatom des Polysaccharidgrundgerüstes verknüpft ist und
wobei der Substitutionsgrad DSa von Ba pro Anhydroseeinheit 0,001-2 und der Substitutionsgrad DSb von Bb pro Anhydroseeinheit 1-2,999 beträgt, wobei gilt DSa + DSb = 3;
und wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können.
Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Beschichtung eines planaren Substrates mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharidderivat, ein entsprechend beschichtetes Substrat und ein Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an dieses beschichtete Substrat bereit.
Die durch die obige Formel (I) dargestellte Struktureinheit des erfindungsgemäßen Polysaccharidderivats kann von jedem beliebigen Polysaccharid mit einem Polymerisationsgrad von 5 bis 100000 abgeleitet sein; bevorzugt werden jedoch Cellulose-, Chitosan- und Dextran-Derivate, insbesondere Cellulose- und Chitosan-Derivate. Der Polymerisationsgrad beträgt vorzugsweise 10 bis 50000, besonders bevorzugt 100 bis 1000, am meisten bevorzugt 140 bis 160.
Beispiele für die geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- oder die geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe schliessen die Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Propenyl-, Butyl- Isobutyl-, Butenyl-, Isobutenyl-, Pentyl-, Pentenyl- usw. ein, die über eine Ether-, Amid- oder Estergruppe in das Polysaccaridderivat eingeführt werden. Diese Gruppen liegen vorzugsweise zu einem Substitutionsgrad von 1 bis 2,9 vor.
Als besonders geeignet haben sich Polysaccharidderivate mit einer Gruppe der Formel -SiXYZ erwiesen, wobei X, Y und Z die gleiche Bedeutung wie oben haben, insbesondere Tri-(C1-C10)- alkylsilylderivate erwiesen. Sie verleihen den Polysaccharidderivaten besonders gute Eigenschaften bezüglich Beschichtbarkeit und unspezifischer Proteinadsorption. Nach erfolgreicher Beschichtung lassen sich die Silylgruppen durch Säurebehandlung wieder abspalten, was die entsprechende Beschichtung gegenüber Lösungsmittel stabilisiert und sie besonders biokompatibel macht. Besonders bevorzugt sind Trimethylsilylderivate. Der Substitutionsgrad der Gruppen - SiXYZ beträgt vorzugsweise 1 bis 2,9 pro Anhydroseeinheit. Die Gruppe Bb kann ganz oder teilweise aus Gruppen der Formel -SiXYZ bestehen.
Die erfindungsgemäßen Polysaccharidderivate sind nicht löslich in Wasser und Ethanol.
Beispiele für die Gruppe Bb sind:
Die erfindungsgemäß verwendete, photoaktivierbare Gruppe Ba ist nicht beschränkt, sofern sie kovalent an das Polysaccharidderivat binden kann. Im Hinblick auf die spätere Immobilisierung von Biomolekülen sind solche photoaktivierbaren Gruppen bevorzugt, die im UV- oder kurzwelligen, sichtbaren Wellenlängenbereich aktiviert werden können. Die Verwendung der in US 4,269,933; G. Sundarababu et al. "Photochemistry and Photobiology", 61, (1995), S. 540-­ 544; T. S. Godovikova, et al. "Bioconjugate Chemistry", 7, (1997), S. 343-348; Claire L. Hypolite, "Bioconjugate Chemistry"; 8, (1997), S. 658-663; L. F. Rozsnyai et al., "Angew. Chem.", 104, Nr. 6, 1992; Chen et al., "Bioconjugate Chemistry", 8, (1997), S. 730-734; Van der Heiden et al., "Macromolecules", 1996, 29, 7012-7015; und US 3,959,078 offenbarten, photoaktivierbaren Gruppen ist erfindungsgemäß bevorzugt.
Besonders bevorzugte Beispiele für die erfindungsgemäß verwendete, photoaktivierbare Gruppe Ba sind:
darstellt, wobei Ar einen beliebigen Aromaten darstellt, der die (4n + 2) π-Elektronenregel befolgt, vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl,
L einen oder mehrere Vertreter von H, NO2, CH3, CF3, OH, NH2, NO, SH, CHO, COOH, CONH2, oder Br, vorzugsweise H, NO2, CH3, OH, NH2, NO, SH, oder CHO darstellt,
M = (CH2)n, NH(CH2)n, (CH2)nNH, NH(CH2)nNH, (CH2)nNH(CH2)n, wobei n = 0-20, vorzugsweise n = 1-10,
K, L und M in ihrer Position am Aromaten frei variabel sind.
Insbesondere bevorzugt sind die Arylazid-, wie z. B. die Phenylazid-, die Diazirin-, die Anthrachinon- und die Benzophenongruppen. Die Arylazidgruppe bildet bei UV- Bestrahlung unter Abspaltung von Stickstoff eine Arylnitrengruppe; Diazirine bilden unter Bestrahlung Carbene; Benzophenone und Anthrachinone hingegen bilden Radikale.
Der Substitutionsgrad DSa von Ba beträgt 0,001 bis 2, vorzugsweise 0,1 bis 1, besonders bevorzugt 0,5 pro Anhydroseeinheit.
Die erfindungsgemäßen Polysaccharidderivate können ausgehend von einem Polysaccharid synthetisiert werden. Das Polysaccharid wird vorzugsweise in einem ersten Schritt mit den Gruppen Bb in einer dem Fachmann geläufigen Art und Weise derivatisiert. Entsprechende Derivatisierungen sind in B. Philip et al., "Das Papier", Heft 2, 1995, S.58; U. Schuldt et al., "Das Papier", Heft 1, 1994, S.3; "Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry", Vol. A5, 2. Auflage, S. 461 ff; Löscher et al. "Proc. SPIE", Vol. 2928, 1996, S. 209-219; und in DE 197 36 736 beschrieben.
Dann erfolgt die Derivatisierung mit der photoaktivierbaren Gruppe. Diese Gruppen lassen sich am einfachsten über eine Veresterung der Säurederivate der photoaktiven Gruppen mit dem Polysaccharid nach der DDC (Dicyclocarbodiimid)-DMAP (Dimethylaminopyridin)-Methode (Klemm et al., "Z. Chem.", 24. Jg., 1984, Heft 2, S.62) einführen
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Beschichtung eines planaren Substrates bereit,
wobei ein erfindungsgemäßes Polysaccharidderivat auf die Oberfläche eines Langmuir-Troges aufgespreitet wird;
der so erhaltene Polysaccharidfilm mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck komprimiert wird, und
der so komprimierte Polysaccharidfilm durch vertikales Tauchen oder durch horizontales Aufsetzen eines Substrates auf dieses Substrat übertragen wird.
Einzige Anforderung an das Substrat ist die Planarität. An das Substratmaterial werden keine besonderen Anforderungen gestellt. Es können z. B. Glas- oder Kunststoffsubstrate verwendet werden, wobei die Wahl des Substratmaterials in erster Linie durch die spätere Verwendung des beschichteten Substrates bedingt ist. Wird beispielsweise das beschichtete Substrat für die Immobilisierung von Biomolekülen für optische Assays verwendet, ist das Substrat vorzugsweise ein Glassubstrat, insbesondere ein Quarzglassubstrat.
Glassubstrate können mit Aminoalkylderivaten der erfindungsgemäßen Polysaccharide direkt ohne vorhergehende Hydrophobisierung mit der Langmuir-Blodgett- oder Langmuir- Blodgett-Schäfer-Technik beschichtet werden, ansonsten führt eine vorhergehende Hydrophobisierung zu einem besseren Übertrag der Schicht auf das Glassubstrat. Entsprechende, erfindungsgemäße Aminoalkyl-Polysaccharidderivate können insbesondere durch Derivatiserung der in DE 197 36 736 offenbarten Aminoalkyltrialkylsilylcellulosen mit einer photoaktivierbaren Gruppe erhalten werden.
Alternativ kann zunächst eine oder mehrere Schichten eines Aminoalkylderivates eines Polysaccharides, beispielsweise wie in DE 197 36 736 offenbart, und anschließend eine oder mehrere Schichten des erfindungsgemäßen, photoreaktiven Polysaccharidderivates auf das Substrat übertragen werden.
Die Übertragung erfolgt nach dem klassischem Langmuir- Blodgett- oder insbesondere für kleine Substrate auch nach der Langmuir-Schäfer-Technik.
Die Polysaccharidderivate werden vorzugsweise in einem leicht flüchtigen Lösungsmittel, wie Chloroform oder Hexan, gelöst und auf die Oberfläche eines Langmuir-Troges aufgespreitet.
Der so erhaltene Polysaccharidfilm wird mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck, der an dem Langmuir-Trog einstellbar ist, komprimiert. Bei bekanntem Substitutionsgrad der Seitenketten, bekannter Ausrichtung der Moleküle und bei bekanntem Polymerisationsgrad ist durch den Beschichtungsdruck ein exakter Wert für die Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit einstellbar. Dieser Umstand kann z. B. für eine erfolgreiche Proteinimmobilisierung von großer Bedeutung sein. Werden beispielsweise einem Antikörper zu viele Gruppen zur kovalenten Bindung angeboten, ist die Bindung an die Oberfläche zwar erfolgreich; aber es kann zu einem deutlichen Aktivitätsverlust durch Entfaltung des Proteins kommen. Oder räumlich zu dicht immobilisierte Oligonukleotide können zu einer sterischen Behinderung während einer Hybridisierungsreaktion führen, was den Erfolg oder die Empfindlichkeit einer solchen Reaktion wesentlich beeinträchtigen kann. Eine Vorschrift zur Berechnung der Anzahl der photoreaktiven Gruppe pro Flächeneinheit ist in Beispiel 4 unten angegeben.
Nach Kompression des Filmes kann dieser durch vertikales Tauchen der Substrate oder durch horizontales Aufsetzen der Substrate (Schäfer-Technik) übertragen werden. Der übertragene Film wird dabei zunächst durch rein adsorptive Wechselwirkungen an das Substrat gebunden; durch die spätere Bestrahlung können die neuen, photochemisch aktiven Substanzen aber anschliessend kovalent an verschiedene Oberflächengruppen der Substrate, wie z. B. an Hydroxylgruppen von Glas zu binden, was zu einer wesentlichen Stabilitätserhöhung der Beschichtung führt.
Die so erhaltenen, erfindungsgemäßen, beschichteten Substrate zeichnen sich durch eine hohe Stabilität, Transparenz (bei transparentem Substrat) und Biokompatibilität bei einer geringen, unspezifischen Proteinadsorption aus.
Nach Beschichtung der Substrate können die gewünschten Biomoleküle immobilisert werden. Hierzu bedarf es nur weniger, naßchemischer Schritte. Durch die schnelle und spezifische Bindung der Biomoleküle an die LB-Filme nach photochemischer Aktivierung kann so mit geringstem Zeit- und Materialaufwand an teuren Proteinen gearbeitet werden. Es bestehen verschiedene Möglichkeiten, um die Aktivierung der Schichten durchzuführen. Sie kann z. B. flächendeckend durch eine Maske oder durch Zeichnen mit fokussiertem Licht erfolgen. Hierdurch können Proteine oder andere Biomoleküle sehr schnell kovalent über Amino-, Sulfid-, Phosphat-, Hydroxy- oder andere aktive Gruppen spezifisch an das erfindungsgemäße Polysaccharidderivat gebunden und somit an dem Substrat immobilisiert werden. In jedem Fall erfolgt die Aktivierung in einem Wellenlängenbereich, in dem die photoaktivierbare Gruppe aktiviert werden kann. Die Bestrahlung erfolgt dabei vorzugsweise sehr kurz und mit einer geringen Energie, um die zu immobilisierenden Moleküle nicht zu beeinflussen. Die flächendeckende Bestrahlung kann beispielsweise nach Einsetzen des planaren, mit der photoaktiven Substanz belegten Substrates in eine UV-durchlässige Durchflußzelle oder in eine nach oben offene Inkubationskammer, in welche die zu immobilisierende Biomoleküllösung transferiert wird, über 5 bis 30 Sekunden erfolgen, um eine homogene Immobilisierung zu erreichen
Bei der Bestrahlung zur Immobilisierung der Biomoleküle erfolgt die bereits oben erwähnte Stabilisierung der Beschichtung, da der Polysaccharidfilm über die photoaktivierbaren Gruppen auch an aktive Gruppen der Oberfläche, wie z. B. OH-Gruppen bei Glas kovalent gebunden wird. So stabilisierte Beschichtungen sind resistenter gegenüber Chemikalien und können für Hybridisierungsreaktionen bei 96°C genutzt werden.
Unter Verwendung von Masken können gleiche, aber auch verschiedenste Biomoleküle in definierten Strukturen immobilisiert werden.
Die strukturierte Immobilisierung von ein und derselben Substanz erfolgt über eine Maske unter Vorhandensein dieser Substanz. Während der Bestrahlung bindet die Substanz an die exponierten Stellen. Nach einem kurzem Spülschritt erfolgt die Deaktivierung nicht exponierter Stellen durch Bestrahlung des ganzen Substrates in der Gegenwart von Wasser oder eines beliebigen Blockierungsreagenz, z. B. Aminoethanol oder Polyethylenglycol.
Die Immobilisierung von Arrays verschiedener Substanzen kann auf verschiedene Weise erfolgen. Im allgemeinen wird hierbei ein bestimmter Bereich der erfindungsgemäßen Beschichtung selektiv, beispielsweise durch eine Maske oder durch fokussiertes (Laser-)Licht in Anwesenheit der zu immobilisierenden Substanz bestrahlt; dann wird die Substanz durch die nächste zu immobilisierende Substanz ausgetauscht, und die selektive Bestrahlung wird wiederholt. Durch ein solches Vorgehen können beliebige Muster an verschiedenen Substanzen an der erfindungsgemäßen Beschichtung gebildet werden.
Ein anderer Weg ist die Aktivierung der Schicht durch einen gebündelten Lichtstrahl. Durch vertikale Verschiebung des Lichtfokus gegenüber dem Substrat kann jede beliebige Struktur "gezeichnet" werden. Durch die Steuerung der Konzentration an Biomolekülen und/oder der Anzahl der photoaktivierbaren Gruppen in der Fläche des Lichtfokus ist die Immobilisierungsdichte und die immobilisierungsfläche frei variabel. Für die Immobilisierung weniger oder gar einzelner Proteinmoleküle wird ein Laser im unteren, sichtbaren oder UV-Bereich auf eine Größe zwischen der Größe der Laserwellenlänge (< 1 µm) bis 100 µm zur Aktivierung auf die beschichtete Substratoberfläche fokussiert. Bei einer geringen Dichte von photoreaktiven Gruppen, beispielsweise 1 bis 10 photoreaktive Gruppen auf eine Oberfläche, die dem Laserfokus entspricht, wird erfindungsgemäß somit erstmals ein Verfahren bereitgestellt, das die gezielte Immobilisierung einzelner bzw. weniger Moleküle ermöglicht. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
  • a) Einstellen der Dichte photoreaktiver Gruppen auf einer Substratoberfläche;
  • b) Überschichten der Substratoberfläche mit Biomolekülen, und
  • c) Fokussieren eines Laserstrahls auf die Substratoberfläche, wobei die photoreaktiven Gruppen für die Immobilisierung der Biomoleküle aktiviert werden.
Die Konzentration der Biomoleküle beträgt vorzugsweise weniger als 10-12 mol/l bei diesem Verfahren. Ein rechnergesteuerter X-Y-Tisch ermöglicht die Immobilisierung von einzelnen Biomolekülen an bestimmten X-Y-Koordinaten oder in gezielte Strukturen durch Bewegung des Substrates über den Laserfokus. Die Dosierung der Biomoleküllösung kann hierbei über einen Microdispensor oder über eine Durchflusszelle erfolgen. Wird ein entsprechender Aufbau mit einer Einzelmoleküldetektion kombiniert, so kann der Erfolg der Immobilisierung online überprüft werden. Nicht bestrahlte Bereiche werden anschließend mit geeigneten Blocklösungen, wie z. B. inaktiven Proteinen, Aminoethanol, PEG, Wasser usw., blockiert.
Die so erhaltenen, definierte Biomolekülschichten tragenden Substrate sind in einer Vielzahl von biologischen, chemischen oder medizinischen Nachweismethoden einsetzbar und sind mit minimalstem Zeit- und Materialaufwand industriell fertigbar.
Beispiele Beispiel 1 Darstellung von Trimethylsilylethercellulosen (TMSC)
2,0 g Cellulose (12,2 mmol; Lehmann & Voss, Avicell 301) werden in einem 500-ml-Zweihalsrundkolben mit Rückflusskühler in 200 ml DMA und 20,0 g wasserfreiem LiCl aufgelöst. Die klare Lösung wird auf 70°C erhitzt, und 20,0 ml Hexamethyldisilazan (15,48 g, 95,91 mmol) werden aus einem 25-ml- Tropftrichter in einen Zeitraum von 30 min zugetropft. Nach weiteren 30 min läßt man die Reaktionslösung ohne Rühren auf Raumtemperatur langsam abkühlen und über Nacht 12 h stehen. Die immer noch klare Reaktionsmischung wird in einem 2000-ml-Erlenmeyerkolben überführt und in einem Eisbad mit 1 l 2%iger NaHCO3 Lsg. ausgefällt. Das milchig weiße, geklumpte Rohprodukt wird über einem Büchnertrichter abgesaugt und in einem Exsikkator über P2O5 getrocknet.
1 g TMSC-Rohprodukt wird in einem 1000-ml-Erlenmeyerkolben in 100 ml THF in Lösung gebracht. Unter Kühlung in einem Eisbad und Rühren gibt man 750 ml 2% NaHCO3 in kleinen Portionen zu. Der sofort beginnende, weiße, in großen Flocken ausfallende Niederschlag wird über einem Büchnertrichter abgesaugt und 48 h im Exsikkator getrocknet.
Beispiel 2 Darstellung von Azidonitrobenzoesäureestertrimethylsilylethercellulosen (ANBTMSC)
0,55 g TMSC und 0,413 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) werden in einem mit Alufolie verdunkelten 100 ml Zweihalsrundkolben mit Rückflusskühler in 25 ml THF gelöst. Die Lösung wird auf 40°C erhitzt, und 0,333 g 5-Azido-2- nitrobenzoesäure wird zugegeben. Nach 15 min gibt man katalytische Mengen an Dimethylaminopyridin zu. Die Reaktionzeit beträgt 20 Std. Anschließend wird aus dem auf Raumtemperatur abgekühlten Reaktionsgemisch der seiden schimmernde Dicyclohexylharnstoffniederschlag über einen Büchnertrichter abgesaugt und zweimal mit je 10 ml THF gewaschen. Das orangegelbe Filtrat wird auf 20 ml eingeengt. Aus diesem wird mit 2% NaHCO3 Lsg. in MeOH (1 : 30, v/v, 2% NaHCO3/MeOH) das gelbbeige Rohprodukt ausgefällt.
0,15 g Rohprodukt werden in 20 ml THF gelöst, verbleibende Feststoffanteile über einen Büchnertrichter filtriert und zweimal mit je 5 ml THF gewaschen. Das Filtrat wird auf 20 ml einrotiert und das Produkt durch Zugabe von 75 ml MeOH in kleinen Portionen unter Schwenken ausgefällt, über einen Büchnertrichter filtriert, mit zweimal 25 ml MeOH gewaschen und im Exsikkator über P2O5 getrocknet.
Das so erhaltene Produkt weist einen Substitutionsgrad der photoreaktiven Gruppen von durchschnittlich 0,2 pro Anhydreseeinheit auf. Über diese Kochvorschrift können alle organischen Gruppen, die einen Säurerest enthalten, an Alkylsilylethercellulosen gekoppelt werden.
Beispiel 3 Beschichtung und Proteinimmobilisierung
  • - Eine Monolage der Photocellulosederivate wird mit einer Langmuir-Filmwaage (Nima Typ 622; GB) im Dunklen bei einem Beschichtungsdruck von 10 mN/m und einer Tauchgeschwindigkeit von 5 mm/min übertragen (der Übertrag erfolgt ausschließlich beim Austauchschritt).
  • - Die beschichteten Substrate werden im Dunkeln in ein nach oben offenen Gefäß mit der Schichtseite nach oben überführt und mit der zu immobiliserenden Proteinlösung (optimal in einer Konzentration von 2 × 10-7 mol/l) 5 mm überschichtet.
  • - Das Substrat wird 10 s bei den Azidderivaten und 20 s bei den Benzophenonderivaten mit einer 500-W-UV-Handlampe (Delo)(240-380 nm) in Gegenwart der zu immobilisierenden Proteinlösung im Abstand von 10 cm bestrahlt und anschließend für weitere 15 min ohne Bestrahlung in der Lösung belassen.
  • - Nach einem kurzen Waschschritt ist das Substrat einsatzbereit.
  • - Nach diesem Protokoll wurde Streptavidin immobilisiert. Das so hergestellte Substrat wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Biotin-Cy5 und purem Cy5 als Negativtest inkubiert und mit zwei verschiedenen Fluoreszenzsystemen vermessen (Axon Genpix 2500, und MMI LB8-Reader). Während das Biotin-Cy5 deutlich bis zur Nachweisgrenze der Systeme gemessen werden konnte, war bei Cy5 pur eine Unspezifität von weniger als 1% nachweisbar.
  • - Um sicher zu stellen, daß die Immobiliserung photochemisch erfolgt ist, wurde das Substrat in Gegenwart von BSA- Blocklösung bestrahlt und anschließend eine halbe Stunde mit Streptavidinlösung inkubiert. Hier waren bei Biotin- Cy5 auf beiden Systemen weniger als 3% der Positivsignale des vorherigen Experimentes auszumachen.
Beispiel 4 Bestimmung der Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit
Die Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit kann durch die folgende Gleichung ausgedrückt werden:
wobei
Naktiv: Anzahl der photoreaktiven Gruppen
A: Flächeneinheit
NAHE: Anzahl der Anhydroseeinheiten pro Länge l360
DS: Substitutionsgrad der photoreaktiven Gruppe pro Anhydroseeinheit
bp: Breite eines Moleküls in der Schicht bei einem definierten Druck p
l360: Länge einer kompletten Umdrehung von 360° des spiralförmigen Cellulosemoleküls
Durch Bestimmung der Parameter NAHE, bp, DS und l360 kann somit die Anzahl der photoreaktiven Gruppen pro Flächeneinheit bestimmt werden:
  • a) Der Substitutionsgrad DS kann durch Variation der Eduktkonzentration und der Reaktionsverhältnisse eingestellt und mittels 1H-NMR-Spektren und C,H- Analysen überprüft werden.
  • b) Die Parameter NAHE und l360 können durch Berechnung der Konformation des Cellulosederivates ermittelt werden, beispielsweise mit Hilfe von "Molecular-Modelling"- Programmen, wie Hyperchem (Hypercube, Canada) oder Chem3D-Ultra (CambridgeSoft, USA). Haar-Stab-Polymere, wie die erfindungsgemäßen Cellulosederivate, liegen in einer Spiralstruktur vor, wobei die Spirale von den Anhydroseeinheiten gebildet wird. Die Länge der Spiralstruktur, die einer kompletten Drehung um 360° entspricht, wird als l360 definiert. Eine komplette Drehung um 360° liegt dann vor, wenn - in Längsrichtung des Polymers betrachtet - der durch die Anhydroseeinheiten gebildete Kreis sich schließt. Die Anzahl der Anhydroseeinheiten, die für eine solche Umdrehung um 360° notwendig ist, gibt den Parameter NAHE an. Beide Parameter NAHE und l360 hängen von den Arten der Substituenten wie auch deren Substitutionsgrad ab und können entsprechend variieren.
  • c) Über das Messmenü eines Langmuir-Blodgett-Troges (Nima Typ 622; GB) kann bei bekannter Molmasse der durchschnittliche Flächenbedarf eines einzelnen Moleküls bestimmt werden. Sowohl die Anzahl der Moleküle wie auch die Fläche auf dem Trog, die die Monolage-Moleküle einnimmt, sind bekannt. Die Fläche wird durch den Komprimierungsdruck bestimmt. Somit kann der durchschnittliche Flächenbedarf bei einem bestimmten Komprimierungsdruck in [Å2/mN] und damit die Breite bp des Moleküls bei diesem Komprimierungsdruck gemessen werden.
  • d) Es stehen jedoch nicht alle photoreaktiven Gruppen für eine Ankopplung zur Verfügung, sondern nur diejenigen, die - nach Auftragung auf eine Substratoberfläche - für die anzukoppelnden Moleküle zugänglich sind. Der Prozentsatz liegt somit in jedem Fall unter 50% und ist druckabhängig: je enger die Moleküle in Kontakt kommen, desto stärker wechselwirken benachbarte Polymerketten und desto weniger photoreaktive Gruppen stehen für die Ankopplung zur Verfügung. Bei gängigen Komprimierungsdrücken wird der Prozentsatz der photoreaktiven Gruppen, an die immobilisiert werden kann, auf 25% abgeschätzt. Hieraus ergibt sich in obiger Formel der Faktor ¼.

Claims (14)

1. Polysaccharidderivate der Formel (I):
wobei
p eine Zahl von 5-100000 ist; A ein O oder NH-Atom/Molekül darstellt, B eine photoaktivierbare Gruppe Ba und/oder eine Gruppe Bb darstellt;
wobei Bb ein Wasserstoffatom, eine geradkettige oder verzweigte C1-12-Alkyl- und/oder eine geradkettige oder verzweigte C2-12-Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, und/oder eine Gruppe der Formel -SiXYZ darstellt;
wobei X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom, eine C1-10-Alkyl- oder eine C2-10- Alkylengruppe, die wahlweise mit einer Aminogruppe substituiert sein können, darstellen;
wobei B über eine Ether- oder Estergruppe an die Sauerstoffatome oder über eine Amin-, Amid-, Nitril-, Säureamid-, Diamin- oder Diazogruppe an das Stickstoffatom des Polysaccharidgrundgerüstes verknüpft ist, und
wobei der Substitutionsgrad DSa von Ba pro Anhydroseeinheit 0,001-2 und der Substitutionsgrad DSb von Bb pro Anhydroseeinheit 1-2, 999 beträgt;
wobei gilt DSa + DSb = 3, und
wobei die Anhydroseeinheiten beliebig glykosidisch verknüpft sein können.
2. Polysaccharidderivat gemäß Anspruch 1, wobei die photoaktivierbare Gruppe ausgewählt wird aus einer der folgenden Gruppen,
wobei Ba:
darstellt,
wobei K:
darstellt, Ar einen beliebigen Aromaten darstellt, der die (4n + 2) π-Elektronenregel befolgt,
L einen oder mehrere Vertreter von H, NO2, CH3, CF3, OH, NH2, NO, SH, CHO, COOH, CONH2, oder Br darstellt,
M = (CH2)n, NH(CH2)n, (CH2)nNH, NH(CH2)nNH, (CH2)nNH (CH2)n,
wobei n = 0-20,
K, L und M in ihrer Position am Aromaten frei variabel sind.
3. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei p eine Zahl von 10-50000 ist.
4. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Substitutionsgrad DSa von Ba pro Anhydroseeinheit 0,1-1 beträgt.
5. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
wobei die Gruppe Bb ganz oder teilweise SiXYZ darstellt,
wobei X, Y und Z jeweils wie in Anspruch 1 definiert sind.
6. Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polysaccharidderivat als Gruppe Bb eine mit einer Aminogruppe substituierte C1-12- Alkyl- oder C2-12-Alkylengruppe trägt.
7. Verfahren zur Beschichtung eines planaren Substrates, wobei:
ein Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 auf die Oberfläche eines Langmuir- Troges aufgespreitet wird;
der so erhaltene Polysaccharidfilm mit einem vorbestimmten Beschichtungsdruck komprimiert wird, wobei ein komprimierter Polysaccharidfilm erhalten wird, und
der so komprimierte Polysaccharidfilm durch vertikales Tauchen oder durch horizontales Aufsetzen eines Substrates auf dieses Substrat übertragen wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Substrat ein Glassubstrat ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das Substrat vor dem Beschichten mit dem Polysaccharidderivat gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 mit einer oder mehreren Schichten eines mit Aminoalkylgruppen derivatisierten Polysaccharidderivates beschichtet wird.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das Polysaccharidderivat ein Polysaccharidderivat gemäß Anspruch 6 ist.
11. Beschichtetes Substrat, erhältlich gemäß einem der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10.
12. Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen, wobei ein beschichtetes Substrat gemäß Anspruch 11 mit einer Lösung von Biomolekülen überschichtet und dann bei einer Wellenlänge bestrahlt wird, bei der die photoaktivierbaren Gruppen Ba aktiviert werden.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Bestrahlung durch eine Maske erfolgt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Bestrahlung mit einem auf einen Durchmesser von 1 bis 100 µm fokussierten Laserstrahl erfolgt.
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