DE10113550A1

DE10113550A1 - Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung

Info

Publication number: DE10113550A1
Application number: DE10113550A
Authority: DE
Inventors: Johannes R Luyken; Franz Hofmann
Original assignee: Infineon Technologies AG
Current assignee: Infineon Technologies AG
Priority date: 2001-03-20
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2002-10-02
Also published as: US20040096866A1; WO2002074985A3; EP1377685A2; JP2004524534A; WO2002074985A2

Abstract

Bei dem Verfahren wird eine Elektrodenanordnung eingesetzt, die eine erste und eine zweite Elektrode aufweist. DOLLAR A Bei dem Verfahren wird eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. In einem anderen Schritt wird eine zu untersuchende Lösung mit der Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht, wobei die Lösung die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. In einem weiteren Schritt werden in der zu untersuchenden Lösung enthaltene zu erfassende makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen auf der ersten und der zweiten Elektrode gebunden und die Elektrodenanordnung wird in Kontakt gebracht mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine elektrische Leitfähigkeit verleiht. Anschließend wird eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt und die makromolekularen Biopolymere werden abhängig von dem Vergleich der Ergebnisse der zwei elektrischen Messungen an den Elektroden erfasst.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung.

Aus [1] bis [6] sind Verfahren zum Erfassen von DNA-Molekülen bekannt, bei denen zur Erfassung Elektroden bzw. bestimmte Elektrodenanordnungen eingesetzt werden.

Fig. 1a und Fig. 1b zeigen einen solchen (Bio)-Sensor, wie er in [2] beschrieben ist. Der Sensor 100 weist zwei Elektroden 101, 102 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 103 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die Elektroden 101, 102 sind Elektroden-Anschlüsse 104, 105 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 101, 102 anliegende elektrische Potential abgegriffen werden kann. Die Elektroden 101, 102 sind dabei als Planarelektroden angeordnet. Auf jeder Elektrode 101, 102 sind DNA-Sondenmoleküle 106 immobilisiert (vgl. Fig. 1a). Die Immobilisierung erfolgt gemäß der sogenannten Gold-Schwefel-Kopplung. Auf den Elektroden 101, 102 ist der zu untersuchende Analyt, beispielsweise ein Elektrolyt 107, aufgebracht.

Sind in dem Elektrolyten 107 DNA-Stränge 108 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle komplementär ist, so hybridisieren diese DNA-Stränge 108 mit den DNA-Sondenmolekülen 106 (Fig. 1b).

Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenmoleküls 106 und eines DNA-Strangs 108 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 106 und des entsprechenden DNA- Strangs 108 zueinander komplementär sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt. Somit ist ein DNA-Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d. h. zu hybridisieren.

Durch die Hybridisierung verändert sich bei dem vorstehend beschriebenen Sensor die Kapazität zwischen den Elektroden. Diese Änderung der Kapazität wird als Messgröße für die Erfassung von DNA-Molekülen herangezogen.

Aus [7] ist eine weitere Vorgehensweise zum Untersuchen des Elektrolyten hinsichtlich der Existenz eines DNA-Strangs mit vorgegebener Sequenz bekannt. Bei dieser Vorgehensweise werden die DNA-Stränge mit der gewünschten Sequenz markiert und deren Existenz wird aufgrund der Reflexionseigenschaften der markierten Moleküle bestimmt. Hierzu wird Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich auf den Elektrolyten gestrahlt und das von dem Elektrolyten, insbesondere von dem nachzuweisenden DNA-Strang, reflektierte Licht wird erfasst. Aufgrund des Reflexionsverhaltens, d. h. insbesondere aufgrund der erfassten, reflektierten Lichtstrahlen wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz in dem Elektrolyten enthalten ist oder nicht.

Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, da eine sehr genaue Kenntnis über das Reflexionsverhalten des entsprechenden markierten DNA-Strangs erforderlich ist und weiterhin eine Markierung der DNA-Stränge vor Beginn des Verfahrens notwendig ist.

Weiterhin ist eine sehr genaue Justierung des Erfassungsmittels zum Erfassen der reflektierten Lichtstrahlen erforderlich, damit die reflektierten Lichtstrahlen überhaupt erfasst werden können.

Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.

Ferner ist es aus der Affinitätschromatographie (vgl. [8]) bekannt, immobilisierte niedermolekulare Moleküle, insbesondere Liganden hoher Spezifität und Affinität, zu verwenden, um Peptide und Proteine, z. B. Enzyme, im Analyt spezifisch zu binden.

Schließlich ist aus [9] bekannt, DNA als Vorlage (Template) für die Ausbildung eines leitenden Silberdrahts zwischen zwei Elektroden zu verwenden, indem Silber-Ionen an der DNA angelagert und anschließend zu metallischem Silber reduziert werden.

Die vorstehend aus [1] bis [8] bekannten Nachweisverfahren haben den Nachteil, dass sie relativ große Mengen an nachzuweisenden makromolekularen Biopolymeren benötigen, d. h. dass ihre Nachweisempfindlichkeit relativ gering ist.

Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein alternatives Verfahren zum Erfassen makromolekularer Biopolymere anzugeben, das einfach konzipiert ist und eine hohe Nachweisempfindlichkeit besitzt.

Das Problem wird durch das Verfahren mit den Merkmalen gemäß dem unabhängigen Patentanspruch gelöst.

Bei einem Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren wird eine Elektrodenanordnung eingesetzt, die eine erste und eine zweite Elektrode aufweist.

Dabei wird sowohl die erste Elektrode als auch die zweite Elektrode mit Fängermolekülen versehen, die makromolekulare Biopolymere binden können.

Bei dem Verfahren wird ferner eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. In einem weiteren Schritt wird eine zu untersuchende Lösung mit der Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht, wobei die Lösung die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. In einem weiteren Schritt werden in der zu untersuchenden Lösung enthaltene zu erfassende makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen auf der ersten und der zweiten Elektrode gebunden. Die Elektrodenanordnung wird ferner in Kontakt gebracht mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine erhöhte elektrische Leitfähigkeit verleiht. Anschließend wird eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt und die makromolekularen Biopolymere werden abhängig von dem Vergleich der Ergebnisse der zwei elektrischen Messungen an den Elektroden erfasst.

Anschaulich ausgedrückt beruht das vorliegende Verfahren auf der Erkenntnis, dass im allgemeinen nicht leitfähige oder nur schwach leitfähige makromolekulare Biopolymere durch Anlagerung/Bindung eines Reagenzes, das die Leitfähigkeit der Biopolymere erhöht, elektrisch leitend gemacht werden und die nunmehr leitfähigen nachzuweisenden makromolekularen Biopolymere als eine "Leitfähigkeitsbrücke" zwischen zwei Elektroden eingesetzt werden, wobei diese Leitfähigkeitsbrücke den Stromfluss des zwischen den Elektroden fließenden Stroms beeinflusst. Dadurch, dass die Leitfähigkeitsbrücke, die man auch als einen "molekularen Kurzschluss" zwischen zwei Elektroden verstehen kann, prinzipiell von nur einem einzigen Molekül ausgebildet werden kann, besitzt das vorliegende Verfahren eine höhere Nachweisempfindlichkeit als die bekannten Verfahren, nämlich eine Empfindlichkeit von einem einzigen Moleküls der zu erfassenden makromolekularen Biopolymere.

Aufgrund des vorstehend beschriebenen Prinzips wird bei den elektrischen Messungen an den Elektroden vorzugsweise der Widerstand oder der Stromfluss bestimmt.

Als Fängermolekül kann bei dem hier beschriebenen Verfahren eine einzige Molekülart eingesetzt werden, z. B. eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einer definierten Nukleinsäuresequenz. In einer Weiterbildung der Erfindung sind die Fängermoleküle jedoch mindestens erste und zweite Fängermoleküle, z. B. mindestens zwei Oligonukleotide mit einer sich voneinander unterscheidenden Nukleinsäuresequenz (die daher unterschiedliche Bindungsspezifitäten haben) oder zwei Antikörper, die unterschiedliche Oberflächenbereiche (Epitope) eines makromolekularen Biopolymers binden können.

Unter Erfassen wird im Sinne der Erfindung sowohl der qualitative als auch quantitative Nachweis von makromolekularen Biopolymeren in einem zu untersuchenden Analyten verstanden. Dies bedeutet, dass der Begriff "Erfassen" ebenfalls einschließt, die Abwesenheit von makromolekularen Biopolymeren im Analyten festzustellen.

Unter einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren wird hier ein Reagenz verstanden, das in der Lage ist, an makromolekulare Biopolymere zu binden, vorzugsweise spezifisch, und das eine Leitfähigkeit für den elektrischen Strom besitzt, die höher ist als die der zu erfassenden makromolekularen Biopolymere.

Ein solches Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit ist vorzugsweise ein im chemischen Sinne reduzierbares Reagenz, d. h. ein Reagenz, das Elektronen abgegeben kann, wodurch sich die Oxidationsstufe zumindest eines der Atome des Reagenzes erniedrigt. In diesem Fall enthält das Reagenz vorzugsweise Metall-Ionen, die nicht nur chemisch reduzierbar sind und an makromolekulare Biopolymere binden können, sondern des weiteren in für makromolekulare Biopolymere geeigneten Lösungsmitteln leicht lösbar sind. Beispiele solcher Metall- Ionen sind Silber-, Gold-, Kupfer- oder Nickel-Ionen oder Mischungen davon, die als Kationen an negativ geladene Gruppen auf der Oberfläche von makromolekularen Biopolymeren durch elektrostatische Wechselwirkung binden können. Im Falle von Nukleinsäuren als den zu erfassenden Biopolymeren werden solche Kationen an das negativ geladene Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäuren gebunden. Sollen Proteine erfasst werden, kann die Bindung solcher Kationen über die Seitenketten von sauren Aminosäuren wie Aspartat oder Glutamat erfolgen.

Eine andere Art des Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit stellen lösliche den elektrischen Strom leitende Polymere oder Oligomere dar, die im leitenden Zustand positiv geladen sind. Beispiele für solche Reagenzien sind geeignet substituierte Polypyrrole, Polythiophene oder Oligothiophene (beispielsweise mit 2 bis 10 Thiophen-Einheiten, zum Beispiel 6 Thiophen-Einheiten). Substituenten, die die Löslichkeit dieser Polymere oder Oligomere in mit makromolekularen Biopolymeren kompatiblen Lösungsmittel, vorzugsweise in wässrigen Medien, vermitteln, sind beispielsweise Sulfonsäure- oder Carbonsäuregruppen, die über Alkylen- Einheiten an das aromatische Grundgerüst verknüpft sind. Bei Polypyrrolen erfolgt die Substitution vorzugsweise über die 3-Position des aromatischen Rings. Bei diesen Reagenzien erfolgt die Anlagerung an die nachzuweisenden makromolekularen Biopolymere vorzugsweise über elektrostatische Wechselwirkungen mit geladenen Gruppen oder Resten der Biopolymere. Im Fall von Nukleinsäuren als nachzuweisendes Biopolymer ist jedoch auch vorstellbar, dass die Bindung des Reagenzes zur Erhöhung der Leitfähigkeit auch durch Interaktionen mit anderen Bereichen der Nukleinsäure wie z. B. der kleinen Furche der Nukleinsäuren erfolgen kann.

Bei Verwendung eines reduzierbaren Reagenzes wie beispielsweise Silber-Ionen wird bei dem hier beschriebenen Verfahren die Elektrodenanordnung mit einem Reduktionsmittel in Kontakt gebracht, das das (an die makromolekularen Biopolymere gebundene) Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit reduziert. Für die Reduktion können bekannte und gängige organische bzw. anorganische Reduktionsmittel wie Hydrochinon bzw. Hydrogensulfit verwendet werden. Werden dagegen die vorstehend genannten leitenden Polymere oder Oligomere eingesetzt, ist keine chemische Reduktion des Reagenzes zur Erhöhung der Leitfähigkeit notwendig, da das Reagenz in seiner bindungsfähigen Form bereits den elektrischen Strom leitet.

An dieser Stelle sei angemerkt, dass es bei dem hier offenbarten Verfahren nicht nur möglich ist, die Elektrodenanordnung nach der Immobilisierung der zu erfassenden makromolekularen Biopolymere mit dem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt zu bringen. Vielmehr ist es auch möglich, die zu untersuchende Lösung zuerst mit dem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit in Kontakt zu bringen und danach die zu erfassenden Biopolymere an die Elektroden zu binden, d. h. zu immobilisieren.

Bei dem Verfahren können als makromolekulare Biopolymere Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Proteine, Peptide oder Komplexe davon, d. h. beispielsweise Komplexe aus Nukleinsäuren und Proteinen, erfasst werden.

Genauer gesagt werden unter makromolekularen Biopolymeren hier zum einen Nukleinsäuren wie DNA und RNA-Moleküle oder auch kleinere Nukleinsäuremoleküle wie Oligonukleotide mit einer Länge von beispielweise ca. 10 bis 40 Basenpaaren (bp) verstanden. Die Nukleinsäuren können dabei doppelsträngig sein, jedoch auch zumindest einzelsträngige Bereiche aufweisen oder, zum Beispiel durch vorangehende thermische Denaturierung oder einer anderen Art der Strangtrennung für ihren Nachweis, insgesamt als Einzelstränge vorliegen. Die Sequenz der zu erfassenden Nukleinsäuren kann dabei zumindest teilweise oder auch vollständig vorgegeben, d. h. bekannt sein. Weitere hier erfassbare makromolekulare Biopolymere sind Proteine oder Peptide. Diese können aus den üblicherweise in Proteinen vorkommenden 20 Aminosäuren aufgebaut sein, aber auch natürlich nicht vorkommende Aminosäuren enthalten oder z. B. durch Zuckerreste (Oligosaccharide) modifiziert sein oder post-translationale Modifikationen enthalten. Ferner können auch Komplexe aus Nukleinsäuren und Proteinen erfasst werden, wie sie zum Beispiel von einem DNA-(spezifisch) bindenden Protein wie einem Translationsfaktor mit einem DNA-Molekül, das die entsprechende Erkennungssequenz besitzt, gebildet werden.

Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so stellen die (auf den Elektroden befindlichen) Fängermoleküle bevorzugt Liganden mit einer Bindungsaktivität für die zu erfassenden Proteine oder Peptide dar. Dadurch können die nachzuweisenden Proteine oder Peptide an die Elektroden binden, auf der die entsprechenden Liganden angeordnet sind. Die Fängermoleküle/Liganden sind ihrerseits vorzugsweise durch kovalente Bindungen mit den Elektroden verknüpft.

Als Liganden für Proteine und Peptide kommen niedermolekulare Enzymagonisten oder Enzymantagonisten, Pharmazeutika, Zucker oder Antikörper oder irgendein Molekül in Betracht, das die Fähigkeit besitzt, Proteine oder Peptide spezifisch zu binden.

Wenn Nukleinsäuren oder Oligonukleotide mit dem hier beschriebenen Verfahren erfasst werden, können sie sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form vorliegen. Vorzugsweise werden als Fängermoleküle für Nukleinsäuren DNA- Sondenmoleküle eingesetzt, weshalb dann die Nukleinsäuren zumindest einen der Hybridisierung zugänglichen einzelsträngigen Bereich aufweisen. Vorzugsweise werden DNA- Sondenmoleküle mit einer zu dem einzelsträngigen Bereich (vollständig) komplementären Sequenz verwendet. Die DNA- Sondenmoleküle können dabei Oligonukleotide sein oder auch längere Nukleotidsequenzen aufweisen, solange diese keine der intermolekularen Strukturen ausbilden, die eine Hybridisierung des Sondenmoleküls mit der zu erfassenden Nukleinsäure verhindern. Allerdings ist es auch möglich, DNA- oder RNA-bindende Proteine oder Agenzien als Fängermolekül einzusetzen.

Ein Problem bei der Erfassung von makromolekularen Biopolymeren stellt die Tatsache dar, dass die nachzuweisenden Biopolymere üblicherweise in keinem Bereich ihrer Sekundär- und/oder Tertiärstruktur identisch sind. So weisen z. B. Polypeptide und Proteine im Prinzip an jeder Stelle/jedem Bereich (der Oberfläche) eine unterschiedliche und einzigartige räumliche Struktur auf. Nachzuweisende Nukleinsäuren besitzen in der Regel an ihren beiden Termini (d. h. dem 3'-Terminus und dem 5'-Terminus) eine unterschiedliche Basensequenz.

Zur Lösung dieses Problems sind bei einer Ausgestaltung des hier beschriebenen Verfahrens die eingesetzten Fängermoleküle mindestens erste und zweite Fängermoleküle. Dabei sind die ersten Fängermoleküle in der Lage, einen ersten Bereich eines zu erfassenden Biopolymers (spezifisch) zu binden, und die zweiten Fängermoleküle sind in der Lage, einen zweiten Bereich eines zu erfassenden Biopolymers (spezifisch) zu binden. Auf diese Weise wird die Ausbildung der hier beschriebenen Leitfähigkeitsbrücke gewährleistet.

Unter dem Begriff "Bereich eines zu erfassenden makromolekularen Biopolymers" wird im Sinne der Erfindung sowohl ein Bereich verstanden, der, wie im Falle von Proteinen eine spezielle dreidimensionale (räumliche) Struktur aufweist, oder wie im Falle von Nukleinsäuren, die prinzipiell eine gleiche oder sehr ähnliche dreidimensionale Struktur einnehmen können, eine sich von den anderen Bereichen unterscheidende Nukleotidsequenz besitzt. Folglich können die Fängermoleküle z. B. zwei Antikörper sein, die jeweils ein spezielles Epitop des zu erfassenden Proteins erkennen, oder ein Antikörper, der ein Epitop auf dem zu erfassenden Protein erkennt und ein Peptid, das in das (räumlich entfernte) aktive Zentrum des Proteins bindet, oder zwei Oligonukleotide mit einer bestimmten Sequenz, die jeweils zu der Nukleotidsequenz einer der beiden Termini komplementär ist.

Vorzugsweise sind bei dieser Ausgestaltung des Verfahrens die zumindest ersten und zweiten Fängermoleküle jeweils homogen verteilt, d. h. in einer gleichförmigen Verteilung, auf den beiden Elektroden aufgebracht. Dadurch wird erreicht, dass die makromolekularen Biopolymere unabhängig von der Orientierung, die sie in der zu erfassenden Lösung aufweisen, mittels der Fängermoleküle an die Elektroden gebunden werden. Diese gleichförmige Verteilung kann z. B. dadurch erreicht werden, dass zunächst eine Mischung der Fängermoleküle hergestellt werden und diese Mischung dann auf die Elektroden aufgebracht werden.

Zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens kann prinzipiell jede im Bereich der Biosensorik bekannte Elektrodenanordnung verwendet werden. Beispielsweise kann die Elektrodenanordnung aus einem üblichen Substrat, das z. B. Silizium oder Galliumarsenid aufweist, bestehen, auf das zuerst eine Goldschicht und eine Siliziumnitridschicht aufgebracht worden ist, und das danach mittels konventioneller Lithographie- und Ätztechniken zur Erzeugung der Elektrodenanordnung(en) strukturiert worden ist.

Bei der Strukturierung kann der Abstand zwischen den beiden Elektroden variabel gestaltet werden, je nach Art der verwendeten Strukturierungstechnik und der Art der zu erfassenden Makromoleküle. Im allgemeinen beträgt der Abstand zwischen den Elektroden ca. 5 Nanometer (nm) bis 100 oder mehrere 100 Nanometer. Kleinere Abstände im Bereich von ca. 5 nm bis ca. 30 oder 40 nm sind dabei zum Nachweis kleinerer (kürzerer) Biopolymere bevorzugt, selbst wenn die Erzeugung solcher Abstände z. B. mittels lithographischer oder Dotierungs-Verfahren zur Zeit technologisch aufwendiger ist als die von Abständen im Bereich von ca. 100 nm bis einige 100 nm.

Ist die dreidimensionale Struktur des nachzuweisenden makromolekularen Biopolymers bekannt, kann der vorzugsweise zu verwendende Elektrodenabstand anhand der Größe des Biopolymers abgeschätzt werden. Beispielsweise kann bei Nukleinsäuren, deren 3D-Struktur im allgemeinen bekannt ist, ausgehend von der bekannten helicalen Ganghöhe von idealer A-, B-, und Z-DNA (vgl. [10]), die z. B. für B-DNA 0,34 nm pro helicale Windung und Basenpaar beträgt, näherungsweise angenommen werden, dass 10 Basenpaare (bp) einen Abstand von 3,4 nm überbrücken und somit der Abstand zwischen den Elektroden abgeschätzt werden.

Für die Erfassung einer Nukleinsäure, die eine Länge von 50 bp entsprechend ca. 17 nm aufweist, mit Oligonukleotiden als Fängermolekül, die bei einer Länge von insgesamt je 20 bp eine jeweils komplementäre Sequenz von 15 bp besitzen, sollte der Elektrodenabstand ca. 17 nm + 2.5.0,34 = ca. 21,4 nm betragen. Hierbei sei darauf hingewiesen, dass es nicht erforderlich ist, zur Erfassung eines hier genannten Biopolymers den Elektrodenabstand durch die Strukturierung anzupassen. Es ist vielmehr zum Beispiel auch möglich, die von den zu erfassenden makromolekularen Biopolymere zu überbrückende Distanz und somit den Elektrodenabstand zu verändern, in dem die Länge der Fängermoleküle variiert wird. So können die Fängermoleküle ggf. verlängert oder verkürzt werden. Werden Nukleinsäuren oder Oligonukleotide als Fängermoleküle verwendet, bietet sich zum Beispiel eine Verlängerung dieser Fängermoleküle durch zusätzliche Nukleotide an, da auch sie (diese Fängermoleküle) leitfähige Reagenzien wie Metall-Kationen im wesentlich gleichen Ausmaß wie zu erfassende Biopolymere binden können. Es ist daher möglich, bei dem vorliegenden Verfahren den (optimalen) Elektrodenabstand rein empirisch ohne Kenntnis der 3- dimensionalen Ausdehnung des nachzuweisenden makromolekularen Biopolymers zu ermitteln.

In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dass es auch möglich ist, Fängermoleküle zu verwenden, die an sich keine ausreichende Leitfähigkeit besitzen, jedoch durch Modifikationen leitfähig gemacht werden. Beispielweise kann bei einem Hormon als eigentlichem Fängermoleküle ein negativ geladener Spacer zur Bindung des Hormons an die Elektroden benutzt werden.

Mit Hilfe des hier offenbarten Verfahrens ist es selbstverständlich möglich, nicht nur eine einzige Art von Biopolymeren in einer einzelnen Messreihe zu erfassen. Vielmehr können mehrere makromolekulare Biopolymere gleichzeitig oder auch nacheinander erfasst werden. Dazu muss lediglich ein Substrat verwendet werden, das mehrere Elektrodenanordnungen mit jeweils zwei Elektroden, d. h. einem Elektrodenpaar, aufweist. Auf jedem dieser Elektrodenpaare werden dann jeweils unterschiedliche Fängermoleküle gebunden, von denen jedes (spezifische) Bindungsaffinität für ein bestimmtes zu erfassendes Biopolymer aufweist. Es können auch mehrere Elektrodenpaare eingesetzt werden, wobei jedes Paar nur mit ein Fängermolekül bzw. mindestens ersten und zweiten Fängermoleküle versehen wird, die spezifisch eines der zu erfassenden Biopolymere bindet.

Für die Durchführung des hier beschriebenen Verfahrens kann als Elektrodenanordnung beispielsweise eine konventionelle Interdigitalelektrode verwendet werden. Für eine Parallel- oder Mehrfachbestimmung kann folglich ein mit mehreren Interdigitalelektroden, d. h. einem Elektrodenarray, versehener Biosensor eingesetzt werden. Ein weitere einsetzbare Elektrodenanordnung stellt eine Elektrodenanordnung in Form eines Grabens bzw. einer Kavität dar. Diese wird zum Beispiel dadurch gebildet, dass auf zwei gegenüberliegenden Seitenwände sich Halte-Bereiche wie z. B. eine Goldschicht befinden, auf denen die Fängermoleküle, die die makromolekularen Biopolymere binden können, immobilisiert werden.

Bei dem vorliegenden Verfahren wird in einem ersten Verfahrensschritt eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. Dabei können bei dieser ersten Messung die Fängermoleküle schon auf dem Mittel zur Immobilisierung angebracht sein, müssen es aber noch nicht. Zum Aufbringen der Fängermoleküle kann jede für diesen Zweck bekannte Technik verwendet werden. Wenn eine Mehrfachbestimmung durchgeführt werden soll, kann das Aufbringen der Fängermoleküle z. B. mit Hilfe von Tintenstrahl-Drucktechniken geschehen.

Ein Medium, beispielsweise ein Elektrolyt, wird mit der Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht. Dies erfolgt in der Weise, dass die makromolekularen Biopolymere an die Fängermoleküle binden können. Für den Fall, dass sich in dem Medium mehrere zu erfassende makromolekulare Biopolymere befinden, werden die Bedingungen so gewählt, dass diese jeweils zur gleichen Zeit oder nacheinander an ihre entsprechende Fängermolekül binden können.

Nachdem eine ausreichende Zeitdauer gewartet worden ist, damit die makromolekularen Biopolymere an das entsprechende Fängermolekül bzw. die entsprechenden Fängermoleküle binden konnten, können nicht gebundene Fängermoleküle von den Elektroden, auf den sie sich befinden, entfernt werden.

Für den Fall, dass die Fängermoleküle Nukleinsäure(DNA)- Stränge sind, erfolgt dies beispielsweise enzymatisch mittels eines Enzyms, das selektiv einzelsträngige DNA abbaut. Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau nicht-hybridisierter DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende, hybridisierte doppelsträngige DNA unerwünschterweise ebenfalls abgebaut.

Insbesondere können zum Entfernen der nicht gebundenen DNA- Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode DNA Nukleasen, beispielsweise eine Nuklease aus Mung-Bohnen, die Nuklease P1 oder die Nuklease S1 verwendet werden. Gleichfalls können DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer
5' → 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer
3' → 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, verwendet werden.

Für den Fall, dass die Fängermoleküle niedermolekulare Liganden sind, lassen sich diese, falls ungebunden, auch enzymatisch entfernen.

Hierzu sind die Liganden über eine enzymatisch spaltbare Verbindung kovalent mit den Elektroden verbunden, beispielsweise über eine Esterverbindung.

In diesem Falle kann beispielsweise eine Carboxylester- Hydrolase (Esterase) eingesetzt werden, um ungebundene Ligandenmoleküle zu entfernen. Dieses Enzym hydrolysiert diejenige Esterverbindung zwischen der Elektrode und dem jeweiligen Ligandenmolekül, das nicht von einem Peptid oder Protein gebunden wurde. Dagegen bleiben die Esterverbindungen zwischen der Elektrode und denjenigen Molekülen, die eine Bindungswechselwirkung mit Peptiden oder Proteinen eingegangen sind, aufgrund der verminderten sterischen Zugänglichkeit, die durch die Raumerfüllung des gebundenen Peptids oder Proteins eintritt, unversehrt.

Das Entfernen der nicht gebundenen Fängermoleküle ist optional. Es kann jedoch den Vorteil besitzen, dass das erhaltene Messsignal z. B. nicht von Fängermolekülen beeinflusst wird, die (wie Oligonukleotide) ebenfalls in der Lage sind, Reagenzien zur Erhöhung der Leitfähigkeit der makromolekularen Biopolymere wie reduzierbare Metall-Kationen zu binden.

Entweder vor oder nach dem Entfernen nicht gebundener Fängermoleküle wird die Elektrodenanordnung mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt gebracht, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine elektrische Leitfähigkeit verleiht. Dabei wird ebenfalls für eine ausreichende Zeitdauer gewartet, damit das Reagenz an die makromolekularen Biopolymere binden kann.

Falls das Reagenz noch in einer Form vorliegt, die noch nicht die Leitfähigkeit der makromolekularen Biopolymere in dem gewünschten Maße erhöht (wie dies bei Metall-Kationen wie Ag⁺ oder Au⁺ der Fall ist), kann in einem weiteren Verfahrensschritt diese noch nicht ausreichend leitfähige Form in einer solche leitfähige Form (z. B. metallisches Silber oder Gold) umgewandelt werden.

Anschließend wird eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird. Die ermittelten Werte aus der ersten und der zweiten elektrischen Messung werden dann miteinander verglichen. Wenn die gemessenen Werte der herangezogene Messgröße sich in einer Weise unterscheiden, dass die Differenz der ermittelten Werte größer ist als ein vorgegebener Schwellenwert, so wird angenommen, dass makromolekulare Biopolymere an Fängermoleküle bzw. allgemein an die Elektroden gebunden haben und dadurch die Veränderung der Intensität des am Empfänger empfangenen Signals verursacht worden ist.

Ist die Differenz zwischen den Werten der ersten und der zweiten elektrischen Messung größer als der vorgegebene Schwellenwert, so wird als Ergebnis ausgegeben, dass die entsprechenden, ein Fängermolekül spezifisch bindenden makromolekularen Biopolymere gebunden worden sind und somit, dass die entsprechenden makromolekularen Biopolymere in dem Medium enthalten waren.

Auf diese Weise sind die makromolekularen Biopolymere erfasst worden.

Das Verfahren kann so ausgestaltet werden, dass gleichzeitig eine Referenzmessung und eine Messung zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren durchgeführt wird. Dies geschieht zum Beispiel in der Weise, dass eine Referenzmessung nur mit dem Medium durchgeführt wird, und zugleich eine Messung mit der Medium, das die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthält (oder auch nicht), wenn z. B. ein qualitativer Nachweis gewünscht ist.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im weiteren näher erläutert.

Es zeigen

Fig. 1a und 1b eine Skizze zweier Planarelektroden, mittels derer die Existenz zu erfassender DNA-Stränge in einem Elektrolyt (Fig. 1a) bzw. deren Nicht- Existenz (Fig. 1b) nachgewiesen werden können;

Fig. 2 eine Skizze einer Elektrodenanordnung, die zur Durchführung des Verfahren der Erfindung verwendet werden kann;

Fig. 3a bis 3d unterschiedliche Verfahrenszustände eines Verfahren zur Erfassung von Nukleinsäuren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;

Fig. 4a bis 4e unterschiedliche Verfahrenszustände eines Verfahren zur Erfassung von Proteinen gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung.

Fig. 2 zeigt in einer Schnittansicht eine grabenförmige Elektronenanordnung 200, die für das hier offenbarte Verfahren verwendet werden kann. Bei dieser Elektrodenanordnung 200 sind auf einem isolierenden Substrat 201, z. B. einem Siliziumoxid-Substrat, eine Goldschicht 202 und eine Siliziumnitrid 203 aufgebracht. Durch Strukturierung, z. B. mittels eines gängigen chemischen Ätzverfahrens, wird die Grabenform 204 gebildet, wobei das Elektrodenpaar aus der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode durch die gegenüberliegenden Seitenwände 205 und 206 ausgebildet wird. Die erste Elektrode 205 ist mit einem ersten elektrischen Anschluss 207 und die zweite Elektrode ist mit einem zweiten elektrischen Anschluss 208 versehen. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass ein für eine Mehrfachmessung geeigneter Sensor beispielsweise eine Mehrzahl von parallel angeordneten Gräben aufweisen kann.

Fig. 3a zeigt einen Ausschnitt aus einer Elektrodenanordnung 300 mit einem isolierenden Substrat 301, einer ersten Schicht 302, einer Siliziumnitridschicht 303, einer ersten Elektrode 305 und einer zweiten Elektrode 306, wobei die erste Elektrode 305 und die zweite Elektrode 306 aus Gold hergestellt sind. Die Elektrodenanordnung bildet einen Graben 304.

Alternativ können die Elektroden 305 und 306 auch aus Siliziumoxid hergestellt sein. Diese können mit einem Material beschichtet werden, das geeignet ist, die Fängermoleküle darauf zu immobilisieren.

Beispielsweise können bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie

- 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
- 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
- 3-Aminopropyltriethoxysilan,
- 4-(Hydroxybutyramido)propyltriethoxysilan,
- 3-N,N-bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan,

oder andere artverwandte Materialen, die imstande sind, mit ihrem einen Ende eine kovalente Bindung mit der Oberfläche des Siliziumoxids einzugehen und mit ihrem anderen Ende dem zu immobilisierenden Sondenmolekül eine chemisch reaktive Gruppe wie einen Epoxy-, Acetoxy-, Amin- oder Hydroxylrest zur Reaktion anzubieten.

Reagiert ein zu immobilisierendes Fängermolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Beschichtung auf der Elektrode immobilisiert.

Auf den immobilisierten Bereichen der Elektroden 305, 306 sind als Fängermoleküle DNA-Sondenmoleküle 307, 308 aufgebracht. Bei den hier gezeigten Goldelektroden erfolgt die Immobilisierung z. B. über die Gold-Schwefel-Kopplung.

Auf der ersten Elektrode 305 sind erste DNA-Sondenmoleküle 307 aufgebracht, wobei deren Nukleotidsequenz komplementär ist zu einer vorgegebenen ersten DNA-Sequenz einer zu erfassenden Nukleinsäure. Auf der zweiten Elektrode 306 sind zweite DNA-Sondenmoleküle 308 aufgebracht, wobei deren Nukleotidsequenz komplementär ist zu einer vorgegebenen zweiten DNA-Sequenz der zu erfassenden Nukleinsäure. Somit stellt diese Ausführungsform ein Beispiel dar, bei der erste und zweite Fängermoleküle mit unterschiedlicher Spezifität eingesetzt werden.

Entweder vor oder nach der Immobilisierung der DNA- Sondenmoleküle wird eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt. Dabei wird mittels zwei in Fig. 3 nicht dargestellter Elektrodenanschlüsse an der ersten und zweiten Elektrode 305, 306 und eines angeschlossenen Messgeräts (ebenfalls nicht dargestellt) vorzugsweise der Widerstand oder der Stromfluss bestimmt. Im Rahmen der ersten elektrischen Messung wird ein Referenzwert, z. B. für den Widerstand, ermittelt und in einem Speicher (nicht dargestellt) gespeichert.

An die Pyrimidinbasen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T), oder Cytosin (C), können jeweils zu den Sequenzen der Sondenmoleküle komplementäre Sequenzen von DNA-Strängen in der üblichen Weise, d. h. durch Basenpaarung über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T bzw. zwischen C und G, hybridisieren.

Fig. 3a zeigt ferner ein Elektrolyten 309, der mit den Elektroden 305, 306 und den DNA-Sondenmolekülen 307, 308 in Kontakt gebracht wird.

Fig. 3b zeigt die Elektrodenanordnung 300 für den Fall, dass in dem Elektrolyt 309 ein DNA-Molekül 310 enthalten ist, das eine vorgegebene ersten Sequenz und eine vorgegebene zweite Sequenz aufweist, die jeweils komplementär zu der Sequenz des ersten DNA-Sondenmoleküls 307 bzw. des zweiten DNA-Moleküls 308 ist. Das DNA-Molekül kann dabei einzelsträngig sein, wie in Fig. 3 angedeutet, oder doppelsträngig.

Aufgrund der Sequenzspezifität der Basenpaarung hybridisiert in diesem Fall der zu erfassende DNA-Strang 310 (das zu erfassende DNA-Molekül) an das erste DNA-Sondenmolekül 307 über die erste vorgegebene Sequenz und an das zweite DNA- Sondenmolekül 308 über die zweite vorgegebene Sequenz. Die Hybridisierung kann dabei spontan erfolgen, im Falle von doppelsträngig vorliegenden Nukleinsäuremolekülen 310 aber auch z. B. durch thermische Denaturierung oder durch Induktion einer Fluidbewegung senkrecht zu den Elektroden, wie in [9] beschrieben, bewirkt werden.

Wie aus Fig. 3b ersichtlich ist, ist das Resultat nach erfolgter Hybridisierung die Ausbildung einer DNA-"Brücke" zwischen den Elektroden.

In einem optionalen Schritt wird mittels eines biochemischen Verfahrens, beispielsweise mittels Zugabe von DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyt 309, ein Hydrolysieren von nicht hybridisierten Einzelstrang-DNA-Sondenmoleküle 307 oder 308 (vgl. Fig. 3b) bewirkt. Soll einzelsträngige DNA erfasst werden, sollte allerdings auf diesen Schritt verzichtet werden, wenn dadurch die Möglichkeit besteht, dass der zu erfassende Einzelstrang 310 ebenfalls abgebaut wird.

Bei der Entfernung nicht hybridisierter Fängermoleküle ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau nicht- hybridisierter DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende, hybridisierte doppelsträngige DNA unerwünschterweise abgebaut, was zu einer Verfälschung des Messergebnisses führen würde.

Nach Entfernen der Einzelstrang-DNA-Sondenmoleküle, d. h. der ersten DNA-Sondenmoleküle 307 auf der ersten Elektrode 305 und der zweiten DNA-Sondenmoleküle 308 auf der zweiten Elektrode 102 sind lediglich die mit dem zu erfassenden DNA- Molekül hybridisierten DNA-Stränge 307 und 308 vorhanden (vgl. Fig. 3c).

Beispielsweise kann zum Entfernen der einzelsträngigen DNA- Sondenmoleküle 306 und 307 auf den beiden Elektroden einer der folgenden Stoffe beigegeben werden:

- Nuklease aus Mung-Bohnen,
- Nuklease P1, oder
- Nuklease S1.

DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer
5' → 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer
3' → 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, können zu diesem Zweck ebenfalls verwendet werden.

Nach oder auch ggf. vor diesem Abbauschritt wird die Elektrodenanordnung 300 in Kontakt gebracht mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine elektrische Leitfähigkeit verleiht. Dieses Reagenz sind beispielsweise in alkalischem Medium gelöste Silber-Ionen 311, wie in [9] beschrieben. Die in Fig. 3c dargestellte resultierende Bindung der Silber-Ionen 311 an die DNA-Moleküle erfolgt durch den Austausch der an das Phosphat-Rückgrat gebundenen Natrium-Ionen.

Zur Ausbildung der Leitfähigkeitsbrücke werden schließlich die an die DNA-Moleküle gebundenen Silber-Ionen 311 reduziert. Dazu können, wie in [9] beschrieben, mittels einer basischen Hydrochinonlösung zuerst kleine Silberkeime an der DNA gebildet werden und anschließend die DNA zu einem vollständig mit metallischen Silber bedeckten "Draht" durch Zugabe einer sauren "Entwicklerlösung" aus Hydrochinon und Silber-Ionen umgewandelt werden. Ein solcher "Draht" ist in Fig. 3d gezeigt.

Unter Verwendung der oben genannten, nicht dargestellten Elektrodenanschlüsse und des angeschlossenen Messgeräts (ebenfalls nicht dargestellt) erfolgt gemäß diesem ersten Ausführungsbeispiel dann eine zweite elektrische Messung, z. B. eine zweite Messung des Widerstands. Mittels der zweiten Widerstandsmessung wird ein Wert für den Widerstand ermittelt, der mit dem Referenzwert verglichen wird.

Ist der Differenzwert zwischen diesen Widerstandswerten größer als ein vorgegebener Schwellenwert, so bedeutet dies, dass in dem Elektrolyt 309 ein DNA-Strang enthalten war.

In diesem Fall wird ein entsprechendes Ausgangssignal von dem Messgerät dem Benutzer des Messgeräts ausgegeben.

Fig. 4 zeigt eine weitere Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens, bei der mit Hilfe der Elektrodenanordnung 400 ein Protein, genauer gesagt ein DNA bindendes Protein wie beispielsweise ein Transkriptionsfaktor, als nachzuweisendes Biopolymer erfasst wird. Die Elektrodenanordnung 400 weist ein isolierendes Substrat 401, eine erste Schicht 402, eine Siliziumnitridschicht 403, eine erste Elektrode 405 und eine zweite Elektrode 406 auf. Die erste Elektrode 405 und die zweite Elektrode 406 sind wiederum aus Gold hergestellt. Die Elektrodenanordnung bildet ebenfalls eine Graben 304 aus.

Bei dieser Ausführungsform wird nur eine einzige Art von Fängermolekül verwendet, nämlich doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle 407, die eine Erkennungssequenz für das DNA bindende Protein aufweisen (Fig. 4a).

Die Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle 407 an die beiden Elektroden 405 und 406 erfolgt über die Gold-Schwefel- Kopplung. Für diesen Zweck werden Thiolgruppen jeweils an die 3'-Termini der Nukleinsäure 407 angefügt, was beispielsweise, wie in [9] beschrieben, über enzymatische Verlängerung der Nukleinsäure 407 mit Oligonukleotiden, die Disulfidgruppen am 3'-Ende aufweisen, möglich ist (vgl. Fig. 3).

Alternativ ist es jedoch auch möglich, das als Fängermolekül dienende Nukleinsäuremolekül 407 selbst über ein erstes und ein zweites Oligonukleotid, das an der ersten Elektrode 405 bzw. an der zweiten Elektrode 406 angefügt ist, d. h. über zwei weitere Fängermoleküle, an die beiden Elektroden 405 und 406 zu binden.

Auch bei dieser Ausführungsform wird entweder vor oder nach der Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle 407 eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt, wobei mittels zwei in Fig. 4 nicht dargestellter Elektrodenanschlüsse an der ersten und zweiten Elektrode 405 und 406 und eines angeschlossenen Messgeräts (ebenfalls nicht dargestellt) vorzugsweise der Widerstand oder der Stromfluss bestimmt wird, und im Rahmen der ersten elektrischen Messung dann ein Referenzwert, z. B. für den Widerstand, ermittelt und in einem Speicher (nicht dargestellt) gespeichert wird.

Anschließend wird ein Elektrolyt 408 mit den Elektroden 405 und 406 und den DNA-Sondenmolekülen 407 in Kontakt gebracht. Fig. 4b zeigt den Fall, dass der Elektrolyt 408 ein zu erfassendes Proteinmolekül 409 enthält. In diesem Fall bindet das Protein 409 an seine auf dem Fängermolekül 407 befindliche Erkennungssequenz.

In einem weiteren Verfahrensschritt werden die beiden Elektroden 405, 406 und die Fängermoleküle 407 (sowohl diejenigen Fängermoleküle, die einen Komplex mit einem zu erfassenden Proteinmolekül 409 gebildet haben, als auch die unkomplexierten) in Kontakt gebracht mit biochemischen Reagenz wie eine Restriktionsendonuklease, die eine spezifische Erkennungssequenz, d. h. eine spezifische Restriktions-Schnittstelle, besitzt. Vorzugsweise wird eine Restriktionsendonuklease eingesetzt, für die die Nukleinsäuremoleküle 407 eine singuläre Restriktions- Schnittstelle besitzen, und die im demjenigen Bereich der Nukleinsäuremoleküle 407 liegt, an dem das nachzuweisenden Protein 409 gebunden hat. Aufgrund der räumlichen Abschirmung durch das Protein 409 wird erreicht, dass nur die DNA- Moleküle (Fängermoleküle) 407 durch die Restriktionsendonuklease gespalten werden, die kein Proteinmolekül 409 gebunden haben. DNA-Moleküle 407, die einen Komplex mit einem nachzuweisenden Proteinmolekül 409 ausgebildet haben, bleiben dagegen unversehrt, d. h. sie werden nicht gespalten (vgl. Fig. 4b).

Nach der Behandlung mit der Restriktionsendonuklease, d. h. der Doppelstrang-Spaltung, weisen nicht komplexierte Fängermoleküle 407 überstehende, freie Enden 410 mit einer 5'-Phosphatgruppe auf, wie es in Fig. 4c schematisch gezeigt ist.

In einem weiteren biochemischen Verfahrensschritt werden die Fängermoleküle 407 mit einem Enyzm wie Lambda (λ) Exonuklease behandelt, das selektiv einen einzelnen Strang einer doppelsträngigen DNA-Duplex von seinem 5'-phosphorylierten Ende her verdaut/abbaut. Im Falle der gespaltenen Fängermoleküle 407, die ein solches phosphoryliertes Ende 410 besitzen, bedeutet dies, dass jeweils dieser Strang abgebaut wird und somit der komplementäre, nicht mehr hybridisierte Einzelstrang des Fängermoleküls 407 zurückbleibt (Fig. 4d).

Dieser Einzelstrang kann in einem weiteren biochemischen Verfahrenschritt entfernt werden, wobei geeignete, Einzelstrang spezifische Nukleasen wie Nuklease P1, die in dem anhand Fig. 3 beschriebenen Ausführungsbeispiel genannt ist, eingesetzt werden können. Als Ergebnis bleiben nach dieser Behandlung nur Fängermoleküle 407 zurück, an die das zu erfassende Protein 409 gebunden ist, oder, falls z. B. kein solches Protein in dem Elektrolyten 409 vorhanden war, keine Fängermoleküle 407 (Fig. 4e).

Anschließend kann, analog zu der im vorstehenden Ausführungsbeispiel beschriebenen Vorgehensweise, die Elektrodenanordnung 400 in Kontakt gebracht mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren wie in alkalischem Medium gelöste Silber-Ionen. Diese werden nach ihrer Bindung an den Komplex aus Fängermolekül 407 und nachzuweisenden Protein 409 zur Ausbildung einer Leitfähigkeitsbrücke, wie ebenfalls vorstehend beschrieben, reduziert (vgl. Fig. 3d, 3e).

Abschließend wird unter Verwendung von nicht dargestellten Elektrodenanschlüsse und des angeschlossenen Messgeräts (ebenfalls nicht dargestellt) eine zweite elektrische Messung durchgeführt, wobei durch den Vergleich des dabei erhaltenen Messwertes auf die Anwesenheit oder Abwesenheit des zu erfassenden Proteins geschlossen wird.

Es wird deutlich, dass mit dem Verfahren gemäß diesem zweiten Ausführungsbeispiel nicht nur Proteine wie ein DNA bindendes Protein erfasst werden kann, sondern ebenfalls Komplexe aus makromolekularen Biopolymeren wie Nukleinsäure/Protein- Komplexe.

In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert:
[1] WO 93/22678
[2] R. Hintsche et al., Microbiosensors Using Electrodes Made in Si-Technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al., Dirk Hauser Verlag, Basel, S. 267-283, 1997
[3] DE 196 10 115 A1
[4] US Patent Serial No. 60/007840
[5] M. Paeschke et al., Voltammetric Multichannel Measurements Using Silicon Fabricated Microelectrode Arrays, Electroanalysis, Vol. 7, Nr. 1, S. 1-8, 1996
[6] P. von Gerwen, Nanoscaled Interdigitated Electrode Arrays for Biochemical Sensors, IEEE, International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, Chicago, S. 907- 910, 16.-19. Juni 1997
[7] N. L. Thompson, B. C. Lagerholm, Total Internal Reflection Fluoresence: Applications in Cellular Biophysics, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 8, S. 58-64, 1997
[8] P. Cuatrecasas, Affinity Chromatography of Macromolecules, Advances in Enzymology, Vol. 36, S. 29- 89, 1972
[9] E. Braun et al., DNA-templated assembly and electrode attachment of a conducting silver wire, Nature, Vol. 391, S. 775-778, 1998
[10] Voet, Voet: Biochemie, S. 799, 1992, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, ISBN 3-527- 28242-4)

Bezugszeichenliste

100

Sensor

101

Elektrode

102

Elektrode

103

Isolator

104

Elektrodenanschluss

105

Elektrodenanschluss

106

DNA-Sondenmolekül

107

Elektrolyt

108

DNA-Stränge

200

Elektrodenanordnung

201

isolierendes Substrat

202

Goldschicht

203

Siliziumnitridschicht

204

Graben

205

Seitenwand

206

Seitenwand

207

Elektrodenanschluss

208

Elektrodenanschluss

300

Elektrodenanordnung

301

isolierendes Substrat

302

erste Schicht

303

Siliziumnitridschicht

304

Graben

305

Elektrode

306

Elektrode

307

DNA-Sondenmoleküle

308

DNA-Sondenmoleküle

309

Elektrolyt

310

DNA-Molekül

311

Silber-Ionen

400

Elektrodenanordnung

401

isolierendes Substrat

402

erste Schicht

403

Siliziumnitridschicht

404

Graben

405

Elektrode

406

Elektrode

407

Doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül

408

Elektrolyt

409

Proteinmolekül

410

überstehende, freie Enden

Claims

1. Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung, die aufweist:
eine erste Elektrode,
eine zweite Elektrode,

a) bei dem die erste Elektrode mit Fängermolekülen versehen wird, die makromolekulare Biopolymere binden können,
b) bei dem die zweite Elektrode mit Fängermolekülen versehen wird, die makromolekulare Biopolymere binden können,
c) bei dem eine erste elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird,
d) bei dem eine zu untersuchende Lösung mit der Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht wird, wobei die Lösung die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann,
e) bei dem in der zu untersuchenden Lösung enthaltene zu erfassende makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen auf der ersten und der zweiten Elektrode gebunden werden,
f) bei dem die Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht wird mit einem Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren, das an die makromolekularen Biopolymere bindet und diesen eine erhöhte elektrische Leitfähigkeit verleiht,
g) bei dem anschließend eine zweite elektrische Messung an den Elektroden durchgeführt wird,
h) bei dem abhängig von dem Vergleich der Ergebnisse der zwei elektrischen Messungen an den Elektroden die makromolekularen Biopolymere erfasst werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit von makromolekularen Biopolymeren (chemisch) reduzierbar ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei das Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit Metall-Ionen enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Metall-Ionen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Silber-, Gold-, Kupfer-, Nickel-Ionen und Mischungen davon besteht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei dem nach Schritt f) die Elektrodenanordnung in Kontakt gebracht wird mit einem Reduktionsmittel, das das Reagenz zur Erhöhung der Leitfähigkeit reduziert.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem als makromolekulare Biopolymere Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Proteine, Peptide oder Komplexe davon verwendet werden.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Fängermoleküle in der Lage sind, die makromolekularen Biopolymere spezifisch zu binden.

8. Verfahren nach Anspruch 7,
bei dem die Fängermoleküle mindestens erste und zweite Fängermoleküle sind, und
bei dem die ersten Fängermoleküle in der Lage sind, einen ersten Bereich eines zu erfassenden Biopolymers (spezifisch) zu binden, und
bei dem die zweiten Fängermoleküle in der Lage sind, einen zweiten Bereich eines zu erfassenden Biopolymers (spezifisch) zu binden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die ersten und zweiten Fängermoleküle jeweils homogen verteilt auf den zwei Elektroden aufgebracht sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem als Nukleinsäuren DNA oder RNA-Moleküle erfasst werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem DNA- oder RNA-Moleküle einer vorgegebener Sequenz erfasst werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die zu erfassenden DNA oder RNA-Moleküle zumindest einen einzelsträngigen Bereich aufweisen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem als Fängermoleküle DNA-Sondenmoleküle mit einer zu dem einzelsträngigen Bereich komplementären Sequenz verwendet werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem nicht gebundene DNA-Sondenmoleküle von den Elektroden entfernt werden, indem ein Enzym mit Nukleaseaktivität mit den beiden Elektroden in Kontakt gebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem als Enzym mit Nukleaseaktivität mindestens einer der folgenden Enzyme verwendet wird:

a) Nuklease aus Mung-Bohnen
b) Nuklease P1
c) Nuklease S1, oder
d) DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer
5' → 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer
3' → 5' Exonukleaseaktivität oder ihrer

Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem als Fängermoleküle Liganden verwendet werden, die Proteine oder Peptide spezifisch binden können.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem nicht gebundene Liganden von den beiden Elektroden entfernt werden, indem ein Material mit den beiden Elektroden in Kontakt gebracht wird, das imstande ist, die chemische Verbindung zwischen den Liganden und den Elektroden zu hydrolysieren.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Material, das mit den Elektroden in Kontakt gebracht wird, ein Enzym ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Enzym, das mit den Elektroden in Kontakt gebracht wird, eine Carboxylester-Hydrolase (Esterase) ist.