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WO2003083134A1 - Sensor zur qualitativen und quantitativen bestimmung von (bio)organischen oligomeren und polymeren, analyseverfahren hierzu sowie verfahren zur herstellung des sensors - Google Patents

Sensor zur qualitativen und quantitativen bestimmung von (bio)organischen oligomeren und polymeren, analyseverfahren hierzu sowie verfahren zur herstellung des sensors Download PDF

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WO2003083134A1
WO2003083134A1 PCT/DE2003/001090 DE0301090W WO03083134A1 WO 2003083134 A1 WO2003083134 A1 WO 2003083134A1 DE 0301090 W DE0301090 W DE 0301090W WO 03083134 A1 WO03083134 A1 WO 03083134A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
electrodes
electrode
sensor
attraction
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2003/001090
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Frey
Christian Paulus
Roland Thewes
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Infineon Technologies AG
Original Assignee
Infineon Technologies AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Infineon Technologies AG filed Critical Infineon Technologies AG
Publication of WO2003083134A1 publication Critical patent/WO2003083134A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors

Definitions

  • the invention relates to a sensor and a method for the qualitative and quantitative determination of (bio) organic oligomers and polymers in solutions, and a method for producing the sensor.
  • the invention relates in particular to such a sensor and such a method which are suitable for the qualitative and quantitative determination of biopolymers in an electronic manner.
  • Another method for analyzing an electrolyte for existing DNA strands with a predetermined sequence is known from [2].
  • the DNA strands are marked with the desired sequence and based on the
  • the existence of fluorescent properties of the labeled molecules is determined.
  • light in the visible wavelength range is radiated onto the electrolyte and that light detected by the electrolyte, in particular by the DNA strand to be detected.
  • On the basis of this fluorescence behavior it is determined whether or not the DNA strand to be detected is contained in the electrolyte with the corresponding predetermined sequence.
  • This procedure is very complex, especially since a very precise knowledge of the fluorescence behavior of the corresponding labeled DNA strand and a very precise adjustment of the detection means for detecting the emitted light beams are required. This procedure is therefore expensive, complicated and very sensitive to interference, which means that the measurement result can easily be falsified.
  • Analytes can be measured directly via an electrical signal.
  • FIG. 1 a A method for the quantitative and qualitative determination of biopolymers by means of an electrode arrangement is known from [1].
  • Figures la and lb show a sensor described in [1].
  • the sensor 200 has two electrodes 201, 202 made of gold, which are embedded in an insulator layer 203 made of insulator material. Electrode connections 204, 205 are connected to the planar electrodes 201, 202, to which the electrical potential applied to the electrode 201, 202 can be supplied. DNA probes 206 immobilized according to the so-called gold-sulfur coupling are located on each electrode 201, 202 (cf. FIG. 1 a).
  • the analyte 207 to be examined is applied to the electrodes 201, 202 and consists for example of an electrolytic solution of the biopolymers to be detected.
  • the analyte 207 contains DNA strands 208 with a sequence that is complementary to the sequence of the DNA probe molecules, these DNA strands 208 hybridize with the DNA probe molecules 206 (cf. FIG. 1b).
  • sequences of DNA strands complementary to the sequences of the probe molecules can be added in the usual way, i.e. Base pairing over
  • Hybridization of a DNA probe molecule 206 and a DNA strand 208 only takes place if the sequences of the respective DNA probe molecule 206 and the corresponding DNA strand 208 are complementary to one another.
  • a DNA probe molecule of a given sequence is only able to bind a specific one, namely the DNA strand with a complementary sequence, i.e. to hybridize.
  • the substance to be detected thus hybridizes with immobilized capture molecules and thus changes the electrical environment in the vicinity of the sensor surface. This change can be evaluated by impedance measurements and represents a measure of the concentration of the substance in the analyte.
  • the electrical parameter which is evaluated according to the method known from [1], is the capacitance between the electrodes or the impedance of the two electrodes.
  • the change in the impedance or the capacitance is recorded here if only DNA probe molecules are present compared to the case where DNA probe molecules are hybridized with the DNA strands to be recorded. If a hybridization takes place, the value of the impedance between the electrodes 201 and 202 changes. This changed impedance is applied by applying an AC voltage with an amplitude of approximately 50 mV to the electrode connections 204, 205 and the resulting current by means of a connected one Measuring device (not shown) determined.
  • the capacitive component of the impedance between the electrodes 201, 202 decreases. This is due to the fact that both the DNA probe molecules 206 and the DNA strands 208, which possibly hybridize with the DNA probe molecules 206, do not are conductive and thus shield the respective electrodes 201, 202 to a certain extent electrically.
  • Interdigital electrode results The dimension of the electrodes and the distances between the electrodes are of the order of the length of the molecules to be detected, i.e. of DNA strands 208 or below, for example in the range of 200 nm and below.
  • a known method of this type is electrophoresis.
  • the analyte is exposed to a suitable, possibly electrical field, which enables the substances to be investigated to move in the solvent in a directed manner. This can take place either due to a permanent electrical charge of the substances (ion migration) or due to polarization effects (migration of induced or permanent dipoles in the inhomogeneous electrical field).
  • the electrode geometry and the choice of the applied voltages or currents and their frequencies can be used to generate suitable concentration gradients within the solution, preferably in such a way that the concentration of the substance to be analyzed is close to the
  • the analyte In the case of di- / electrophoresis, the analyte is usually present in an aqueous solution.
  • the electrodes for generating the electrical field must be in direct electrical contact with the analyte, because otherwise the electrical field within the aqueous solution would be very small due to the high dielectric constant of water and its high electrical conductivity.
  • WO 99/38612 uses a so-called “permeation layer” as a protective layer over the
  • This semipermeable layer is permeable to small molecules or ions such as H 2 O, NaCl, etc., so that current flow is still possible, whereas macromolecules such as DNA cannot penetrate to the electrode surface.
  • [5] discloses an automated molecular biological diagnostic system.
  • [6] discloses a method for carrying out reactions between at least two reactants in aqueous reaction mixtures.
  • the object of the invention was therefore to provide a sensor for the qualitative and quantitative determination of
  • the object of the invention was also to provide a method for the quantitative and qualitative determination of (bio) organic oligomers and polymers using this sensor.
  • the invention therefore relates to a sensor for the qualitative and quantitative determination of (bio) organic oligomers and polymers in solution, comprising an electrode arrangement
  • the invention also relates to a method for the qualitative and quantitative determination of
  • this sensor which comprises an electrode arrangement, at the attraction electrodes (B) and detection electrodes
  • a time-changing electrical voltage is applied to at least some of the attraction electrodes (B) in such a way that at least two groups of
  • Attraction electrodes (B) at least at times have a different voltage, which causes the substance to be analyzed to migrate at least once over the detection electrode (s) (A), so that at least some of them hybridize with the capture molecules on the detection electrode (s) , and c. the (bio) organic oligomers or polymers to be determined are detected optically or electronically.
  • Radius of curvature can be used. As a result of the peak effect, when a voltage is applied, very large field gradients occur within the solution, so that a concentration gradient can be built up within the solution even with uncharged particles.
  • the frictional force of the moving molecule acts on this electrical force
  • ⁇ is the viscosity of the surrounding medium and v is the velocity of the particle (molecule) in the field.
  • a concentration gradient leads to a so-called diffusion pressure, which drives the particles into areas of lower concentration.
  • the electrical force counteracts this diffusion force. The following then applies to the flow of particles through any surface in the balance of electrical force and diffusion pressure:
  • c is the concentration of the substance to be analyzed in the solvent and D is its diffusion constant.
  • the diffusion constant is related to the viscosity ⁇ of the solution in the following way:
  • the concentration profile is calculated depending on the properties of the dissolved molecules and the geometry of the electric field.
  • electrically charged particles is expediently discussed, since the effect of an inhomogeneous electric field on permanent or induced dipoles is several orders of magnitude smaller than its effect on charged particles.
  • DNA is present in aqueous solution as a polyanion, the charge number q of the effective charge increasing with the number of nucleotides contained in it.
  • a homogeneous field only has an effect on charged particles, e.g. DNA as a polyanion. If the particles only have a dipole moment, they are aligned in the homogeneous field, but do not experience any translational force.
  • the electrical field has the following dependence on the distance r from the center electrode:
  • the concentration is at a distance
  • r 0 is the radius of curvature of the spherical surface and U is the applied voltage. No general solution can be found here either.
  • the substance to be analyzed can be concentrated in the vicinity of the electrode. Since the detection electrodes are usually adjacent to the attraction electrodes and are therefore spatially separated, the concentration can also mean that, for example, the DNA does not come close to the capture molecules in order to hybridize with them. On the other hand, however, a strong electric field promotes rapid concentration of the analyte on the
  • FIG. 2 shows the typical course of the local concentration of the analyte as a function of the distance to the electrode surface during electrophoresis.
  • the possible electrode geometries described above were investigated for a typical highly integrated system
  • Electrodes depending on the electrode symmetry are Electrodes depending on the electrode symmetry:
  • the senor is monolithically integrated in a chip.
  • one or more electronic circuits are / are integrated in the chip, which circuits provide electronic functions for the operation of the attraction electrodes in the chip.
  • Figure 1 shows a sensor described in [1], with a
  • FIG. 2 shows concentration profiles calculated for electrodes with different geometry for molecules to be determined.
  • Figure 3 shows a sensor according to the invention with a
  • Electrode arrangement in which electrodes (A) alternate in space (also in the following)
  • Detection electrodes and electrodes (B) (hereinafter also called attraction electrodes) are arranged adjacent to the sensor surface.
  • the smaller attraction electrodes 1, 2 differ from one another in the electrical field applied to them.
  • Catcher molecules are located on the larger detection electrodes.
  • FIG. 4 shows the sensor according to the invention from FIG. 3, the molecule to be detected (e.g. DNA) being enriched in the area of the attraction electrodes 2.
  • the molecule to be detected e.g. DNA
  • FIG. 5 shows the sensor of Figure 4 after switching off the
  • Attraction electrodes (2) The particle clouds move to the attraction electrodes (1) and pass through the larger detection electrodes, on which capture molecules are immobilized.
  • Figure 6 shows the sensor of Figure 5 after switching off the attraction electrodes (2) and long operation of the attraction electrodes (1). It is not shown here that when the particle cloud passed over the detection electrodes, some (DNA) molecules were hybridized and the number of particles for a renewed migration to the attraction electrode (1) thus decreased.
  • FIG. 7 shows a plan view of an electrode arrangement of a sensor according to the invention with point electrodes 1 and 2.
  • FIG. 8 shows a plan view of an electrode arrangement with strip-shaped electrodes 1 and 2.
  • the electrodes (A) are thus coated according to the invention with so-called capture molecules for the (bio) organic oligomers and polymers to be determined.
  • the nature of the oligomer or polymer to be determined determines the nature of the capture molecules and via that
  • the (bio) organic oligomers and polymers are biopolymers.
  • Biopolymers are to be understood in particular as proteins, peptides and DNA strands of a given sequence.
  • the (bio) organic oligomers and polymers are in solution for determination and not in a gel like one
  • Polyacrylamide gel An aqueous solution is preferred.
  • At least two detection electrodes (A) are coated with capture molecules which differ in terms of their capture characteristics for different molecules to be determined.
  • Differentiate catcher molecules in their binding or capture characteristics ligands used, for example active substances with a possible binding activity, which bind the proteins or peptides to be detected to the respective electrode on which the corresponding ligands are arranged.
  • enzyme agonists or enzyme antagonists pharmaceuticals, sugars or antibodies or another molecule which has the ability to specifically bind proteins or peptides can be considered as ligands.
  • a probe or capture molecule is understood to mean both a ligand and a DNA probe molecule.
  • DNA strands of a predetermined sequence are to be used as biopolymers, which are to be detected by means of the electrode arrangement, then DNA strands of a predetermined first sequence with DNA scavengers (probes) can be used as molecules with the sequence complementary to the first sequence as the first Molecules are hybridized on the first electrode.
  • DNA (capture) probe molecules are used as second molecules which have a sequence that is complementary to the second sequence of the DNA strand.
  • the sensor according to the invention has at least two second electrodes (B) on which there are no catcher molecules (attraction electrodes).
  • the first electrode (A) is arranged between the second electrodes (B) in such a way that by changing the electric fields on the second electrodes, an analyte possibly containing the molecules to be determined (e.g. biopolymers) and applied to the sensor depending on Art and size of the electric fields is moved over the first electrode, so that (bio) organic oligomers and polymers contained in the analyte, which can be determined qualitatively and / or quantitatively, can hybridize with the capture molecules.
  • an analyte possibly containing the molecules to be determined (e.g. biopolymers) and applied to the sensor depending on Art and size of the electric fields is moved over the first electrode, so that (bio) organic oligomers and polymers contained in the analyte, which can be determined qualitatively and / or quantitatively, can hybridize with the capture molecules.
  • a first electrode (A) is generally located directly between the two second electrodes (B), preferably halfway.
  • a plurality of first and second electrodes are used.
  • the attraction and detection electrodes are generally arranged alternately on the sensor surface, the distance between the electrodes preferably being essentially the same size (cf. FIG. 3).
  • Attraction electrodes (B) and detection electrodes (A) of the electrode arrangement are thus preferably arranged at substantially the same distance from one another.
  • An electrode arrangement is used in the sensor according to the invention, which preferably has at least 1 detection electrode
  • the number of attraction electrodes (B) is from 100 to 1000 and the number of detection electrodes (A) from 100 to 1000.
  • the detection electrodes (A) preferably each have one
  • the electrodes (A) and (B) can have the same or different sized surfaces.
  • the electrodes (A) preferably have a larger surface area than the electrodes (B).
  • the minimal dimensions of the electrodes in turn result from the properties of the semiconductor process used to manufacture them. Usual minimum widths of metallic structures are currently in the range from 100 nm to 1 ⁇ m.
  • the smallest possible area of the detection electrodes is desirable, since a large number of detection units can then be integrated on a given chip area.
  • the area of the detection electrodes results on the one hand from the detection sensitivity of the measuring device, ie the more sensitive the detection can be (electrical or optical), the smaller the detection electrode can be.
  • Another constraint is the technology for applying the capture molecules. If the state-of-the-art microspotting technology (process similar to inkjet printing) is used, the minimum area of the detection electrodes results from the diameter of the spot. In this case the
  • the size of the detection electrodes is only given by the process-related minimum structure widths or the detection limits of the detection method.
  • the electrodes (A) and (B) used in the electrode arrangements can have different two- or three-dimensional structures.
  • punctiform / round electrodes are suitable as electrodes (A) and / or (B).
  • Pointed electrodes are to be understood here as those which correspond to the
  • Manufacturing process have minimal dimensions. (In a current process, these are, for example, electrodes with dimensions of l ⁇ m x l ⁇ m).
  • the electrodes (A) and / or (B) can be used as planar electrodes in the form of strips (see FIG. 8), rings or other planar surfaces, or as three-dimensional electrodes, for example in the form of cylinders, hemispheres, etc. are, which can be designed symmetrically or asymmetrically.
  • the electrode geometry is of particular importance for the qualitative and quantitative determination of uncharged Particles. Since uncharged molecules can only exert a force on the permanent or induced dipoles in an inhomogeneous electric field, electrodes with a small radius of curvature should preferably be used for their determination.
  • the electrodes (B) therefore have a smaller radius of curvature than the electrodes (A). It is preferred here if the electrodes (A) are planar and the electrodes (B) are pointed or round.
  • the electrodes (A) and (B) are planar.
  • the detection electrodes (A) are planar.
  • the detection electrodes do not necessarily have to be electrically conductive structures when optical detection methods are used. In this case, a surface made of a material is sufficient
  • electrically conductive electrodes can be used as detection electrodes, which are coated with a (non-conductive) dielectric.
  • Embodiments of the detection electrodes and measuring methods according to the invention for concentrating the analyte Substances are used on the sensor surface and thus to accelerate the measuring process.
  • the electrode arrangement can be a plate electrode arrangement or an interdigital electrode arrangement as known from [1].
  • the electrodes can be configured as cylindrical elements, which are each arranged concentrically around one another and are electrically isolated from one another, for example by means of a suitable dielectric, so that an electric field between the electrodes Forms electrodes.
  • the sensor according to the invention is generally in the form of a chip as a so-called sensor chip, which essentially consists of silicon.
  • the detection electrodes (A) and attraction electrodes (B) preferably consist of chemically inert, electrically conductive substances such as gold, platinum, palladium or alloys thereof. In principle, however, any electrically conductive substance is suitable as an electrode material.
  • the electrodes are made of gold, covalent connections between the electrodes and the probe molecules are preferably made, the sulfur being in the form of a sulfide or a thiol to form a gold-sulfur coupling.
  • the sulfur being in the form of a sulfide or a thiol to form a gold-sulfur coupling.
  • DNA probe molecules are used as probe molecules, such sulfur functionalities are part of a modified nucleotide which is incorporated at the 3 'end or at the 5' end of the DNA strand to be immobilized by means of phosphoramidite chemistry during an automated DNA synthesis process , The DNA probe molecule is thus immobilized at its 3 'end or at its 5' end.
  • the sulfur functionalities are formed by one end of an alkyl linker or an alkylene linker, the other end of which has a chemical functionality suitable for the covalent connection of the ligand, for example a hydroxyl radical, an acetoxy radical or a succinimidyl ester radical.
  • these electrodes can also be made from silicon oxide. These can be coated with a material that is suitable for immobilizing the probe molecules on them.
  • alkoxysilane derivatives can be used, such as 3-glycidoxypropylmethyloxysilane,
  • a probe molecule to be immobilized reacts with such an activated group, it is immobilized on the surface of the coating on the electrode via the selected material as a kind of covalent linker.
  • the electrodes (A) and / or (B) are generally arranged on a silicon chip.
  • the electrode arrangement or these supplementary electrical circuits can be produced, for example, by photolithography and various deposition techniques (e.g. “vapor deposition”).
  • an insulator layer which also serves as a passivation layer, has a sufficient thickness, for example in one Thickness of 500 nm can be applied by means of a CVD process.
  • the insulator layer can be made of silicon oxide SiO 2 or silicon nitride Si3N4.
  • tungsten vias contact holes filled with tungsten are formed for the electrical contacting of electrical components through the insulator layer.
  • the electrode arrangement of the biosensor is defined on the insulator layer by means of photolithography. Then, using a dry etching process, for example reactive ion etching (RIE), steps are produced in the insulator layer, ie etched, for example at a minimum height of approximately 100 nm. The height of the steps must be sufficiently large for a subsequent self-adjusting process for forming the metal electrode ,
  • RIE reactive ion etching
  • a vapor deposition process or a sputtering process can also be used to apply the insulator layer.
  • auxiliary layer e.g. a thickness of 10 nm, made of titanium on the step-shaped insulator layer.
  • the auxiliary layer can have tungsten and / or nickel chromium and / or molybdenum.
  • a gold layer with a thickness of approximately 500 to approximately 2000 nm is applied.
  • the thickness of the gold layer should be sufficient so that the gold layer grows porous and columnar.
  • openings are etched into the gold layer, so that gaps form.
  • TM openings can be an etching solution of 7.5 g Super Strip 100 (brand name of Lea Ronal GmbH, Germany) and 20 g
  • KCN can be used in 1000 ml of water H2O.
  • the gaps become dependent on the Duration of the etching process formed. This means that the duration of the etching process determines the base width, ie the distance between the gold electrodes that form.
  • the wet etching is ended.
  • the etching takes place much faster in the direction parallel to the surface of the insulator layer than in the direction perpendicular to the surface of the insulator layer.
  • noble metals such as platinum, titanium or silver
  • these materials can also be used, since these materials likewise have holding areas or can be coated with a suitable material for holding immobilized DNA probe molecules or generally for holding probe molecules, and a columnar one Show growth on evaporation.
  • the structure according to this exemplary embodiment has the particular advantage that the self-adjusting opening of the gold layer over the edges means that the distance between the
  • Electrodes is not tied to a minimal resolution of the manufacturing process, ie the distance between the electrodes can be kept very narrow.
  • a substrate is assumed, for example a silicon substrate wafer, on which a metallization is already provided as an electrical connection, an etching stop layer made of silicon nitride Si 3 N 4 having already been applied to the substrate.
  • a metal layer for example a gold layer, is applied to the substrate by means of a vapor deposition process.
  • a sputtering process or a CVD process can be used to apply the gold layer to the etching stop layer.
  • the metal layer has the metal from which the electrode to be formed is to be formed.
  • An electrically insulating auxiliary layer made of silicon oxide Si0 2 is applied to the gold layer by means of a CVD method (alternatively by means of a vapor deposition method or a sputtering method).
  • a lacquer structure is formed from a lacquer layer, for example a cuboid structure, which lacquer structure corresponds to the shape of the electrode to be formed.
  • a lacquer structure is produced by means of photolithography, the structure of which corresponds to the electrodes to be formed, which form the sensor.
  • the lateral dimensions of the lacquer structure formed thus correspond to the dimensions of the sensor electrode to be produced.
  • the thickness of the lacquer structure corresponds essentially to the height of the electrodes to be produced.
  • the lacquer layer is removed in the areas which are not "developed", that is to say unexposed, for example by ashing or by wet chemical means.
  • the sensor is contacted with a solution containing the substance to be analyzed, the sensor comprising an electrode arrangement in which attraction electrodes (B) and Detection electrodes (A) are present, a time-changing electrical voltage is applied to at least some of the attraction electrodes (B) in such a way that at least two groups of attraction electrodes (B) at least temporarily have a different voltage, which causes the substance to be analyzed migrates at least once over the detection electrode (s) (A), ie passes the area of the detection electrode so that at least a part of the substance to be analyzed is held on the detection electrodes by the capture molecules.
  • a voltage source is coupled to at least two second electrodes, with which a polarity reversible voltage can be applied to the second electrodes.
  • step b which can also be referred to as a “concentration step”
  • a suitable potential is first applied to every second attraction electrode (B), so that the substance to be examined accumulates there (see Fig. 4).
  • the remaining attraction electrodes (B) are not connected, so that their potential results from the bath voltage and no attraction is exerted on the analyte. Then the previously used ones
  • Attraction electrodes switched off and the previously unused switched on.
  • the analyte which is already in the vicinity of one electrode, is now attracted to the other electrodes and passes through the detection electrodes of the sensor (see FIGS. 5 and 6).
  • a time-changing electrical voltage is applied to at least some of the attraction electrodes (B) such that at least two groups of attraction electrodes (B) have a different voltage, at least temporarily.
  • the electrical voltage can differ in terms of the sign, the level of the voltage and the duration.
  • the use of alternating voltage between the attraction electrodes (B) is also suitable. If a suitable AC voltage is applied to the electrodes, the probability of the analyte being in the vicinity of the detection electrodes increases and the measurement duration is reduced accordingly.
  • a counter electrode to the attraction electrodes is of course necessary, which must be in contact with the analyte.
  • This counter electrode is preferably designed as a single large surface electrode, which only has to be present once per sensor array, but can also be designed in the form of several partial electrodes.
  • a further embodiment of the invention consists in that the attraction electrodes (B) are first operated in such a way that the substance to be analyzed is concentrated in their vicinity. The voltage is then switched off, as a result of which the attracted molecules can diffuse into the surrounding areas of the detection electrodes (A), which are occupied by capture molecules, and can hybridize if there is a chemical match.
  • the electrodes are switched on alternately or the polarity is reversed, regardless of the shape of the individual electrodes.
  • the method can also be carried out with the aid of a plurality of electrode groups which are appropriately switched on or to which alternating signals are applied with a suitable phase position.
  • the analyte or the species to be detected is thus moved back and forth in a targeted manner via active sensor surfaces (detection electrodes (A)). This is achieved by several neighboring attraction electrodes (B), which are suitably operated electrically. This also results in significantly shorter measuring times for such sensors, for example if DNA is to be determined.
  • the attraction electrodes can either be passive
  • Electrodes are designed, that is, they can be contacted at the edge of the substrate and operated by means of an external voltage supply, or they are designed as active electrodes.
  • This preferred active embodiment includes in particular the monolithic integration of electronic components and thus one or more electronic circuits in the chip, which circuits have electronic functions for the operation of the attraction electrodes in the
  • the functions include, in particular, the switching functions for the application of the required electrical potentials for the attraction or repulsion of the charged particles, and the time control for switching over the potentials and for switching over from the attraction mode to the measurement mode.
  • each sensor can be independent of the surrounding, i.e. neighboring, sensors are operated and so the electrical boundary conditions as the applied
  • Attraction potentials the temporal sequence of the impulses, as well as the switch between attraction and detection mode can be set individually for the respective biological species.
  • step c) the hybridized (bio) organic oligomers or polymers to be determined on the detection electrodes (A) are optically or electronically detected proven in a manner known per se. This detection is preferably carried out electronically by means of impedance measurements.
  • Enrichment step b) of the method according to the invention optionally removes unbound (bio) organic oligomers and polymers, in particular biopolymers, from the respective electrode on which they are located.
  • the probe molecules are DNA strands
  • this is done, for example, enzymatically using an enzyme that selectively degrades single-stranded DNA.
  • the selectivity of the degrading enzyme for single-stranded DNA must be taken into account. If the enzyme selected for the degradation of non-hybridized DNA single strands does not have this selectivity, the hybridized double-stranded DNA to be detected may also be undesirably degraded.
  • DNA nucleases for example a nuclease from mung beans, the nuclease P1 or the nuclease S1 can be used to remove the unbound DNA probe molecules from the respective electrode.
  • the DNA polymerases which are capable of breaking down single-stranded DNA due to their 5 '- ⁇ 3' exonuclease activity or their 3 '-> 5' exonuclease activity can also be used.
  • probe molecules are low molecular weight ligands, they can, if unbound, also be removed enzymatically.
  • the ligands are covalently connected to the electrode via an enzymatically cleavable compound, for example via an ester compound.
  • a carboxyl ester hydrolase can be used to remove unbound ligand molecules.
  • This enzyme hydrolyzes the ester compound between the electrode and the respective ligand molecule that was not bound by a peptide or protein.
  • the ester compounds remain between the electrode and those Molecules that have entered into a binding interaction with peptides or proteins are intact due to the reduced steric accessibility that results from the molecular mass of the bound peptide or protein.
  • a first measurement is first optionally carried out without immobilized capture molecules.
  • a subsequent second measurement takes place after immobilization of the capture molecules, a subsequent third measurement after hybridization has taken place and a washing process has been carried out.
  • a fourth measurement is carried out after enzymatic removal of unbound capture molecules (if applicable).
  • a final fifth measurement is made after all have been completely removed
  • the values determined from the electrical measurements are then generally compared with one another. If the difference between certain measured values (e.g. measured capacitance values) is greater than a predetermined threshold value, it is assumed that biopolymers have bound to probe molecules, which has caused the change in the electrical signal at the electrodes.
  • the result is output that the corresponding biopolymers that specifically bind the first molecules or second molecules have been bound and the corresponding biopolymers are thus in were contained in the medium.
  • the first electrical measurement and the second electrical measurement can be realized by measuring the capacitance between the electrodes. Alternatively, the electrical resistance between individual electrodes can also be determined.
  • an impedance measurement can be carried out as the first electrical measurement and as the second electrical measurement, in the course of which both the capacitance between the electrodes and the electrical resistances are measured.
  • a reference capacitance value is usually determined and stored in a memory.
  • a second capacitance measurement takes place after the single-stranded DNA probe molecules have been removed from the respective electrode.
  • a capacitance value is determined by means of the second capacitance measurement, which is compared with the reference capacitance value.
  • an impedance measurement can be carried out with the sensor instead of the capacitance measurement.
  • a reference electrode is usually provided for each detection electrode in such a way that the DNA probe molecules do not adhere to these reference electrodes. This can be ensured by having a material for the reference electrodes is chosen, which does not allow sulfur binding.
  • undesired adhesion of the DNA probe molecules to the reference electrode can be prevented by not applying the coating material suitable for immobilizing the DNA probe molecules (see above) to the reference electrode in advance. This means that there are no chemically reactive groups on the reference electrode that would otherwise form a covalent bond with the DNA probe molecules and would therefore immobilize them there.
  • each reference electrode is coupled to an electrical reference connection.
  • Impedance measurement in the unoccupied state i.e. for example in a state without probe molecules on the later detection electrodes or with non-hybridized DNA probe molecules.
  • the measuring method according to the invention is also suitable for the quantitative measurement of the concentration of certain species in the analyte. The accuracy of the measurement depends on the measurement method used.
  • the device according to the invention for concentrating the analyte in the vicinity of the detection electrodes leads in any case to an acceleration of the entire measuring process and to an increase in measuring sensitivity, since by means of the concentration of the species to be detected on the sensor surface and the electrically driven movement across the detection electrodes, potentially find all the binding partners to be detected in the analyte and thus the effect to be measured is maximal.
  • An advantage of the sensor and method according to the invention is that it enables rapid qualitative and quantitative determination of (bio) organic oligomers and polymers, in particular DNA, with increased sensitivity.
  • a further advantage of the sensor and method according to the invention is that even with strong electrical fields and thus large concentration gradients, it is ensured that the substance to be analyzed comes close to the capture molecules.

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Abstract

Es sind mindestens eine Detektionselektrode vorgesehen, auf der Fängermoleküle zum Hybridisieren mit zu bestimmenden (bio)organischen Oligomeren und Polymeren immobilisiert sind sowie mindestens zwei Attraktionselektroden, auf denen sich keine Fängermoleküle befinden. Die Detektionselektrode ist zwischen den zweiten Elektroden angeordnet derart, dass durch Änderung der elektrischen Felder an den zweiten Elektroden ein die zu erfassenden chemischen Verbindungen möglicherweise enthaltender, auf die Sensor-Anordnung aufgebrachter Analyt abhängig von Art und Größe der elektrischen Felder über die erste Elektrode hinwegbewegt wird.

Description

Beschreibung
Sensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren und Polymeren, Analyseverfahren hierzu sowie Verfahren zur Herstellung des Sensors
Die Erfindung betrifft einen Sensor und ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren und Polymeren in Lösungen, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Sensors. Die Erfindung betrifft insbesondere einen solchen Sensor und ein solches Verfahren, die zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Biopolymeren auf elektronische Weise geeignet sind.
In der medizinischen Analytik müssen Stoffe nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden, die nur in sehr niedriger Konzentration in einer Lösung enthalten sind. Ein Beispiel hierfür ist die DNA-Analyse. Es sind einige optische Verfahren bekannt, bei denen Fluoreszenzlabel verwendet werden, welche an die zu detektierende DNA gebunden werden. Nach Hybridisierung dieser markierten Makromoleküle mit dazu passenden, auf einer Sensoroberfläche gebundenen Fänger- oder Sondenmolekülen kann durch Einstrahlung kurzwelligen Lichts und Messung der Fluoreszenzintensität die Konzentration des Stoffes im Analyten bestimmt werden.
Aus [2] ist eine weitere Methode zur Analyse eines Elektrolyten auf existierende DNA-Stränge mit vorgegebener Sequenz bekannt. Hierbei werden die DNA-Stränge mit der gewünschten Sequenz markiert und aufgrund der
Fluoreszenzeigenschaften der markierten Moleküle wird deren Existenz bestimmt. Hierzu wird Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich auf den Elektrolyten gestrahlt und das von dem Elektrolyten, insbesondere von dem nachzuweisenden DNA-Strang, emittierte Licht erfasst . Aufgrund dieses Fluoreszenzverhaltens wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz im Elektrolyten enthalten ist oder nicht. Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, zumal eine sehr genaue Kenntnis des Fluoreszenzverhaltens des entsprechenden markierten DNA- Strangs und eine sehr genaue Justierung des Erfassungsmittels zum Erfassen der emittierten Lichtstrahlen erforderlich ist. Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.
Alternativ zu optischen Verfahren wird an elektrischen Verfahren gearbeitet, bei denen die Konzentration des
Analyten direkt über ein elektrisches Signal gemessen werden kann.
Ein Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung ist aus [1] bekannt. Fig. la und Fig. lb zeigen einen in [1] beschriebenen Sensor. Der Sensor 200 weist zwei Elektroden 201, 202 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 203 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die planaren Elektroden 201, 202 sind Elektroden-Anschlüsse 204, 205 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 201, 202 anliegende elektrische Potential zugeführt werden kann. Auf jeder Elektrode 201, 202 befinden sich gemäß der sogenannten Gold-Schwefel -Kopplung immobilisierte DNA-Sondenmoleküle 206 (vgl. Fig. la) . Auf den Elektroden 201, 202 ist der zu untersuchende Analyt 207, aufgebracht, der beispielsweise aus einer elektrolytischen Lösung der zu detektierenden Biopolymeren besteht. Sind im Analyten 207 DNA-Stränge 208 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle komplementär ist, hybridisieren diese DNA-Stränge 208 mit den DNA- Sondenmolekülen 206 (vgl. Fig. lb) .
An die Pyrimidinbasen Adenin (A) , Guanin (G) , Thymin (T) , oder Cytosin (C) , können jeweils zu den Sequenzen der Sondenmoleküle komplementäre Sequenzen von DNA-Strängen in der üblichen Weise, d.h. Basenpaarung über
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T bzw. zwischen C und G, hybridisieren.
Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenmoleküls 206 und eines DNA-Strangs 208 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 206 und des entsprechenden DNA- Strangs 208 zueinander komplementär sind. Somit ist ein DNA- Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage, einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d.h. zu hybridisieren.
Die zu detektierende Substanz hybridisiert somit mit immobilisierten Fängermolekülen und verändert so die elektrische Umgebung in der Nähe der Sensoroberfläche. Diese Änderung kann durch Impedanzmessungen ausgewertet werden und stellt ein Maß für die Konzentration des Stoffes im Analyten dar.
Der elektrische Parameter, der gemäß dem aus [1] bekannten Verfahren ausgewertet wird, ist die Kapazität zwischen den Elektroden bzw. die Impedanz der beiden Elektroden. Hierbei wird die Impedanz bzw. die Kapazität in ihrer Veränderung erfasst, wenn nur DNA-Sondenmoleküle vorhanden sind gegenüber dem Fall, dass DNA-Sondenmoleküle mit den zu erfassenden DNA- Strängen hybridisiert sind. Findet eine Hybridisierung statt, so verändert sich der Wert der Impedanz zwischen den Elektroden 201 und 202. Diese veränderte Impedanz wird durch Anlegen einer WechselSpannung mit einer Amplitude von ungefähr 50 mV an die Elektroden- Anschlüsse 204, 205 und dem dadurch resultierenden Strom mittels eines angeschlossenen Messgeräts (nicht dargestellt) bestimmt .
Im Falle einer Hybridisierung verringert sich der kapazitive Anteil der Impedanz zwischen den Elektroden 201, 202. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sowohl die DNA-Sondenmoleküle 206 als auch die DNA-Stränge 208, die eventuell mit den DNA- Sondenmolekülen 206 hybridisieren, nicht-leitend sind und somit die jeweiligen Elektrode 201, 202 in gewissem Maße elektrisch abschirmen.
Zur Verbesserung der Messgenauigkeit ist es aus [4] bekannt, eine Vielzahl von Elektrodenpaaren 201, 202 zu verwenden und diese parallel zu schalten, wobei diese miteinander verzahnt angeordnet sind und sich eine sogenannte
Interdigitalelektrode ergibt. Die Abmessung der Elektroden und der Abstände zwischen den Elektroden liegen in der Größenordnung der Länge der zu detektierenden Moleküle, d.h. der DNA-Stränge 208 oder darunter, beispielsweise im Bereich von 200 nm und darunter.
Ferner ist es aus der Affinitätschromatographie ( [3] ) bekannt, immobilisierte niedermolekulare Moleküle, insbesondere Liganden hoher Spezifität und Affinität, zu verwenden, um Peptide und Proteine, z.B. Enzyme, im Analyten spezifisch zu binden. Bei diesen optischen und elektrischen Verfahren ist die Hybridisierung der zu untersuchenden Stoffe an immobilisierte Fängermoleküle auf einer Sensoroberfläche notwendig. Da die Konzentration der DNA im Analyten sehr gering ist, dauert es unter Umständen sehr lange, bis alle DNA-Moleküle in der Lösung allein durch Diffusionsprozessse an passende Fängermoleküle hybridisiert haben. Um diese Stoffe durch Verwendung von Mikrosensoren in kurzer Zeit zu charakterisieren, ist daher eine Aufkonzentrierung des zu analysierenden Stoffes im Bereich der Sensoroberfläche notwendig .
Ein bekanntes derartiges Verfahren ist die Elektrophorese. Hierbei wird der Analyt einem geeigneten, gegebenenfalls elektrischen Feld ausgesetzt, das eine gerichtete Bewegung der zu untersuchenden Stoffe im Lösungsmittel ermöglicht. Dies kann entweder aufgrund einer permanenten elektrischen Ladung der Stoffe (Ionenwanderung) oder aufgrund von Polarisationseffekten (Wanderung von induzierten oder permanenten Dipolen im inhomogenen elektrischen Feld) erfolgen. Durch die Elektrodengeometrie und die Wahl der angelegten Spannungen bzw. Ströme und deren Frequenzen können geeignete Konzentrationsgradienten innerhalb der Lösung erzeugt werden, vorzugsweise derart, dass sich die Konzentration des zu analysierenden Stoffes in der Nähe der
Sensoroberfläche erhöht .
Im Falle der Wanderung von ungeladenen, dielektrischen Teilchen im inhomogenen elektrischen Feld durch Induktion von Dipolmomenten spricht man von Dielektrophorese .
Bei der Di-/Elektrophorese liegt der Analyt üblicherweise in wässriger Lösung vor. Die Elektroden zur Erzeugung des elektrischen Feldes müssen mit dem Analyten in direktem elektrischen Kontakt stehen, da anderenfalls wegen der hohen Dielektrizitätskonstante von Wasser und seiner hohen elektrischen Leitfähigkeit das elektrische Feld innerhalb der wässrigen Lösung sehr klein wäre.
Wegen des direkten Kontaktes der Elektroden zum elektrisch leitfähigen Medium findet Elektrolyse statt, die den pH-Wert in Nähe der Elektroden verändert und bei hoher Stromdichte auch zu Gasbildung führen kann. Dieser Effekt kann durch Anlegen von WechselSpannung reduziert werden. Da aber insbesondere Biopolymere (Bio-Makromoleküle) wie DNA empfindlich auf Änderungen des pH-Wertes ins basische reagieren ist in der WO 99/38612 die Verwendung einer sogenannten „permeation layer" als Schutzschicht über den
Elektroden vorgeschlagen. Diese semipermeable Schicht ist für kleine Moleküle bzw. Ionen wie H20, NaCl , usw. durchlässig, so dass weiterhin Stromfluss möglich ist, wohingegen Makromoleküle wie DNA nicht bis zur Elektrodenoberfläche vordringen können.
[5] offenbart ein automatisiertes molekularbiologisches Diagnosesyste .
[6] offenbart ein Verfahren zur Durchführung von Reaktionen zwischen mindestens zwei Reaktionspartnern in wässrigen Reaktionsgemischen.
Aufgabe der Erfindung war es daher, einen Sensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von
(bio) organischen Oligomeren und Polymeren bereitzustellen, welcher diese Bestimmungen mit größerer Nachweisempfindlichkeit und/oder Geschwindigkeit erlaubt. Aufgabe der Erfindung war außerdem die Bereitstellung eines Verfahrens zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren und Polymeren unter Verwendung dieses Sensors.
Demgemäß wurde der Sensor, das Verfahren zu seiner Herstellung (Herstellungsverfahren) und das Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren und Polymeren (Analyseverfahren) nach den unabhängigen Ansprüchen bereitgestellt
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Sensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren und Polymeren in Lösung, umfassend eine Elektrodenanordnung
• A) mit mindestens einer ersten Elektrode, auf der Fängermoleküle zum Hybridisieren mit zu bestimmenden (bio) organischen Oligomeren und Polymeren („chemische Verbindungen) immobilisiert sind (Detektionselektroden) ,
• B) mit mindestens zwei zweiten Elektroden, auf denen sich keine Fängermoleküle befinden (Attraktionselektroden) ,
• wobei die erste Elektrode zwischen den zweiten Elektroden angeordnet ist, derart, dass durch
Änderung der elektrischen Felder an den zweiten Elektroden ein die zu erfassenden chemischen Verbindungen, insbesondere Biopolymeren, möglicherweise enthaltender, auf den Sensor aufgebrachter Analyt abhängig von Art und Größe der elektrischen Felder über die erste Elektrode hinwegbewegt wird, so dass in dem Analyten enthaltene, qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmende (bio) organische Oligomere und Polymere mit den Fängermolekülen hybridisieren können.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von
(bio) organischen Oligomeren und Polymeren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Sensors, wobei
a. dieser Sensor, der eine Elektrodenanordnung umfasst, bei der Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden
(A) vorhanden sind, mit einer die zu analysierende Substanz enthaltenden Lösung kontaktiert wird, wobei b. an zumindest einen Teil der Attraktionselektroden (B) derart eine sich zeitlich ändernde elektrische Spannung angelegt wird, dass mindestens zwei Gruppen von
Attraktionselektroden (B) zumindest zeitweise eine unterschiedliche Spannung aufweisen, die bewirkt, das die zu analysierende Substanz mindestens einmal über die Detektionselektrode (n) (A) hinwegwandern, so dass mindestens ein Teil davon mit den Fängermolekülen auf der oder den Detektionselektrode (n) hybridisieren, und c. die zu bestimmenden (bio) organischen Oligomeren oder Polymeren auf optische oder elektronische Weise nachgewiesen werden.
Da mit dem erfindungsgemäßen Sensor sehr verschiedenartige (bio) organische Oligomere und Polymere qualitativ und quantitativ bestimmt werden können, wird im folgenden eine allgemeine Anleitung für den Aufbau des erfindungsgemäßen Sensors und die Durchführung des erfindungsgemäßen
(Analyse) Verfahrens gegeben. Hierzu werden die unterschiedlichen elektrischen Felder und deren Einfluss auf die Aufkonzentrierung der Moleküle in Elektrodennähe in Abhängigkeit von der Elektrodengeometrie betrachtet .
Zur Erzeugung eines inhomogenen elektrischen Feldes zur Dielektrophorese können Elektroden mit kleinem
Krümmungsradius verwendet werden. Dadurch treten aufgrund des Spitzeneffektes bei Anlegen einer Spannung sehr große Feldgradienten innerhalb der Lösung auf, womit auch bei ungeladenen Teilchen ein Konzentrationsgradient innerhalb der Lösung aufgebaut werden kann.
Bei der Di-/Elektrophorese können zwei unabhängige, konkurrierende Prozesse beobachtet werden. Dies ist zum einen die Diffusion der Moleküle, die zu deren Gleichverteilung innerhalb der Lösung führt. Zum anderen die Migration aufgrund der elektrischen Kraft auf die geladenen Teilchen und den permanenten sowie induzierten Dipol des Makromoleküls. Der Einfluss des Schwerefelds bei Dichteunterschieden, der zum Teilchentransport durch Konvektion führt, sei hier vernachlässigt.
Die elektrische Kraft Feχ auf ein Teilchen mit der Ladung q, einem permanenten Dipolmoment m0 und einer Polarisierbarkeit α im elektrischen Feld beträgt bei Vernachlässigung des Schwerefeldes:
Fei = ( + (mo + OCE)V)E . (1)
Dieser elektrischen Kraft wirkt die Reibungskraft des bewegten Moleküls (z.B. eines Biopolymeren wie DNA) im
Lösungsmittel entgegen. Die Trägheitskraft sowie die Gravitationskraft werden hier vernachlässigt. Für ein kugelförmiges Teilchen mit dem Radius rp gilt für die Reibungskraft Ffr :
Ffr = 6πηrpv , (2)
η ist die Viskosität des umgebenden Mediums und v die Geschwindigkeit des Teilchens (Moleküls) im Feld. Nach dem Einschalten des Feldes stellt sich ein Gleichgewicht zwischen elektrischer Kraft und Reibungskraft ein, so dass sich eine Driftgeschwindigkeit v^ wie folgt ergibt:
Figure imgf000011_0001
Ein Konzentrationsgradient führt zu einem sogenannten Diffusionsdruck, der die Teilchen in Bereiche niedrigerer Konzentration treibt. Die elektrische Kraft wirkt dieser Diffusionskraft entgegen. Für den Teilchenfluss durch eine beliebige Fläche gilt dann im Gleichgewicht von elektrischer Kraft und Diffusionsdruck:
Figure imgf000011_0002
c ist die Konzentration des zu analysierenden Stoffes im Lösungsmittel und D seine Diffusionskonstante. Die Diffusionskonstante hängt in folgender Weise mit der Viskosität η der Lösung zusammen:
D = kT / (6 π η rD) . (5) Zusammengefasst ergibt sich folgende Differentialgleichung für die Beschreibung der räumlichen Konzentrationsverteilung c:
Figure imgf000012_0001
Im folgenden soll das sich einstellende Konzentrationsprofil in Abhängigkeit von den Eigenschaften der gelösten Moleküle und der Geometrie des elektrischen Feldes berechnet werden. Zweckmäßigerweise wird im folgenden lediglich der Fall elektrisch geladener Teilchen diskutiert, da die Wirkung eines inhomogenen elektrischen Feldes auf permanente bzw. induzierte Dipole um mehrere Größenordnungen kleiner ist als dessen Wirkung auf geladene Teilchen. DNA liegt in wassriger Lösung als Polyanion vor, wobei die Ladungszahl q der effektiven Ladung mit der Anzahl der in ihr enthaltenen Nukleotide steigt.
a) Homogenes elektrisches Feld E
Die Lösung dieser Differentialgleichung hängt von der Art des vorliegenden elektrischen Feldes ab. Bei der klassischen Elektrophorese werden konstante Felder verwendet, d.h. es gilt:
U _ E = Enex = — ex 7)
° d
für ein Feld zwischen zwei Elektroden im Abstand d und der Spannung U. In diesem Fall reduziert sich die Differentialgleichung zu: c = - qU
( 8 ) dx kTd
Eine Lösung dieser Differentialgleichung ist:
-qUx c(x) = c0e kTd . ( 9 )
Dies bedeutet, dass die Konzentration des zu analysierenden Stoffes in einer Entfernung
kTd
P = (10) qU
von der einen Elektrodenfläche auf den 1/e-ten Teil abgefallen ist, also eine nutzbare Aufkonzentrierung in einer Schicht der Dicke p um die Elektrode erfolgt . Ein homogenes Feld hat lediglich eine Wirkung auf geladene Teilchen, wie z.B. DNA als Polyanion. Weisen die Teilchen lediglich ein Dipolmoment auf, so werden sie im homogenen Feld zwar ausgerichtet, erfahren jedoch keine translatorische Kraft.
b) Radialsymmetrisches elektrisches Feld E
Im Falle von Elektroden mit Zylindergeometrie weist das elektrische Feld folgende Abhängigkeit vom Abstand r zur Mittelelektrode auf:
E(r) = H . (Ü) r? r In — U ist die angelegte Spannung an den Kondensator, ri und X2 die Radien der inneren bzw. äußeren Elektrode des Zylinders. Bei Einsetzen dieses Feldes in die Differentialgleichung kann keine analytische Lösung mehr gefunden werden. Für den Spezialfall eines geladenen Teilchens ohne Dipolmoment (m = 0, α = o) ergibt sich folgende Lösung:
Figure imgf000014_0001
Die Konzentration ist hierbei in einer Entfernung
Figure imgf000014_0002
auf den 1/e-ten Teil abgefallen.
c) Kugelsymmetrisches elektrisches Feld E
Ein kugelsymmetrisches elektrisches Feld nimmt mit dem Quadrat des Abstandes zum Kugelmittelpunkt ab:
E(r) = ^, (14)
r0 ist hierbei der Krümmungsradius der Kugeloberfläche und U die anliegende Spannung. Auch hier kann keine allgemeine Lösung gefunden werden. Für den Spezialfall eines geladenen Teilchen ohne Dipolmoment (m = 0, α = o) ergibt sich folgende Lösung :
Figure imgf000015_0001
Damit ist die Konzentration in einer Entfernung von
Figure imgf000015_0002
auf den 1/e-ten Teil abgefallen.
In Abhängigkeit von der Elektrodengeometrie, den elektrischen Eigenschaften des gelösten Stoffes und des Lösungsmittels sowie der angelegten Spannung kann es somit zu einer starken Aufkonzentrierung der zu analysierenden Substanz in der Nähe der Elektrode kommen. Da die Detektionselektroden den Attraktionselektroden üblicherweise benachbart sind und damit räumlich getrennt sind, kann die Aufkonzentrierung auch dazu führen, dass beispielsweise die DNA nicht in die Nähe der Fängermoleküle kommt, um mit ihnen zu hybridisieren. Andererseits begünstigt jedoch ein starkes elektrisches Feld eine schnelle Aufkonzentrierung des Analyten auf der
Sensoroberfläche und ist damit für eine Beschleunigung der Messung vorteilhaft. Figur 2 zeigt den typischen Verlauf der lokalen Konzentration des Analyten in Abhängigkeit von der Entfernung zur Elektrodenoberfläche bei der Elektrophorese. Die zuvor beschriebenen möglichen Elektrodengeometrien wurden für ein typisches hochintegriertes System untersucht
(d = r0 = r^ = lμm, r2 = 2μm) . Die Spannung wurde zu IV gewählt, die Ausgangskonzentration zu lpM (in Fig. 2 dargestellt durch: •-•-•-•-•-•), die Temperatur zu 37°C und als Ladungszahl der Teilchen 20 angenommen. In Fig. 2 ist die Aufkonzentrierung des Analyten in unmittelbarer Nähe zur Elektrodenoberfläche zu erkennen. Typischerweise fällt die Konzentration des Stoffs bereits nach 10 nm auf den Wert der Ausgangskonzentration ab. An der Elektrodenoberfläche kann eine Aufkonzentrierung über mehrere Größenordnungen beobachtet werden. Die Aufkonzentrierung fällt stärker aus, wenn anstelle paralleler Elektroden (homogenes Feld) Elektroden mit kleinem Krümmungsradius verwendet werden (Spitzeneffekt) . In Fig. 2 bedeuten die verschieden markierten Linien den Konzentrationsverlauf vor der
Elektroden in Abhängigkeit von der Elektrodensymmetrie:
: Kugelsymmetrie
: Zylindersymmetrie
.--.--.--.--.--.--.--.--.--. : Homogenes Feld
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung ist der Sensor in einem Chip monolithisch integriert.
In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung ist/sind in dem Chip eine oder mehrere elektronische Schaltungen integriert, welche Schaltungen elektronische Funktionen für den Betrieb der Attraktionselektroden in dem Chip bereitstellen.
Im folgenden werden die Merkmale des erfindungsgemäßen Sensors anhand der Figuren näher beschrieben.
Figur 1 zeigt einen in [1] beschriebenen Sensor, mit einer
Elektrodenanordnung, mit der insbesondere Biopolymere qualitativ und quantitativ bestimmt werden können. Figur 2 zeigt für Elektroden mit unterschiedlicher Geometrie berechnete Konzentrationsprofile für zu bestimmende Moleküle .
Figur 3 zeigt einen erfindungsgemäßen Sensor mit einer
Elektrodenanordnung, bei der räumlich abwechselnd Elektroden (A) (im folgenden auch
Detektionselektroden genannt) und Elektroden (B) (im folgenden auch Attraktionselektroden genannt) benachbart auf der Sensoroberfläche angeordnet sind.
Die kleineren Attraktionselektroden 1,2 unterscheiden sich durch das an ihnen angelegte elektrische Feld voneinander. Auf den größeren Detektionselektroden befinden sich Fängermoleküle.
Figur 4 zeigt den erfindungsgemäßen Sensor von Figur 3, wobei das nachzuweisende Molekül (z.B. DNA) im Bereich der Attraktionselektroden 2 angereichert ist.
Figur 5 zeigt den Sensor von Figur 4 nach dem Abschalten der
Attraktionselektroden (2) . Die Teilchenwolken bewegen sich zu den Attraktionselektroden (1) und passieren dabei die größeren Detektionselektroden, auf denen Fängermoleküle immobilisiert sind.
Figur 6 zeigt den Sensor von Figur 5 nach dem Abschalten der Attraktionselektroden (2) und längerem Betrieb der Attraktionselektroden (1) . Nicht dargestellt ist hierbei, dass beim Passieren der Teilchenwolke über den Detektionselektroden einige (DNA-) Moleküle hybridisiert wurden und somit die Anzahl der Teilchen für eine erneute Wanderung zur Attraktionselektrode ( 1 ) abgenommen hat .
Figur 7 zeigt eine Draufsicht einer Elektrodenanordnung eines erfindungsgemäßen Sensors mit punktförmigen Elektroden 1 und 2. Figur 8 zeigt eine Draufsicht einer Elektrodenanordnung mit streifenförmigen Elektroden 1 und 2.
Bei der Elektrodenanordnung des erfindungsgemäßen Sensors ist mindestens eine erste Elektrode (A) vorhanden, auf der Fängermoleküle zum Hybridisieren mit zu bestimmenden
(bio) organischen Oligomeren und Polymeren immobilisiert sind
(Detektionselektroden) .
Die Elektroden (A) sind somit erfindungsgemäß mit sogenannten Fängermolekülen für die zu bestimmenden (bio) organischen Oligomere und Polymere beschichtet.
Die Natur des zu bestimmenden Oligomeren oder Polymeren bestimmt die Natur der Fängermoleküle und über die
Beschichtung der Detektionselektroden mit den immobilisierten Fängermolekülen den Aufbau der erfindungsgemäßen Sensoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die (bio) organischen Oligomere und Polymere Biopolymere. Unter Biopolymeren sind insbesondere Proteine, Peptide und DNA- Stränge einer jeweils vorgegebenen Sequenz zu verstehen.
Die (bio) organischen Oligomere und Polymere liegen zur Bestimmung in Lösung und nicht in einem Gel wie einem
Polyacrylamidgel vor. Bevorzugt ist eine wässrige Lösung.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sensors sind mindestens zwei Detektionselektroden (A) mit Fängermolekülen beschichtet, die sich hinsichtlich ihrer Fangcharakteristika für unterschiedliche, zu bestimmende Moleküle unterscheiden. Für den Fall, dass mit dem erfindungsgemäßen Sensor Biopolymere und hierbei insbesondere Proteine oder Peptide bestimmt werden sollen, werden als erste Moleküle (erste Fängermoleküle) und als zweite Moleküle (zweite Fängermoleküle, wobei sich die ersten und zweiten
Fängermoleküle in ihre Binde- bzw. Fangcharakteristik unterscheiden) Liganden verwendet, beispielsweise Wirkstoffe mit einer möglichen Bindungsaktivität, welche die zu erfassenden Proteine oder Peptide an die jeweilige Elektrode binden, auf der die entsprechenden Liganden angeordnet sind.
Als Liganden kommen aber ganz allgemein Enzymagonisten oder Enzymantagonisten, Pharmazeutika, Zucker oder Antikörper oder ein sonstiges Molekül in Betracht, das die Fähigkeit besitzt, Proteine oder Peptide spezifisch zu binden.
Im Rahmen dieser Beschreibung ist unter einem Sonden- bzw. Fängermolekül sowohl ein Ligand als auch ein DNA- Sondenmolekül zu verstehen.
Werden hierbei als Biopolymere DNA-Stränge einer vorgegebenen Sequenz verwendet, die mittels der Elektrodenanordnung erfasst werden sollen, so können mittels der Elektrodenanordnung DNA-Stränge einer vorgegebenen ersten Sequenz mit DNA-Fänger (Sonden) molekulen mit der zu der ersten Sequenz komplementären Sequenz als erste Moleküle auf der ersten Elektrode hybridisiert werden. Zum Erfassen eines DNA- Strangs einer vorgegebenen zweiten Sequenz mittels zweiter Moleküle auf der zweiten Elektrode werden DNA- (Fänger) Sondenmoleküle als zweite Moleküle eingesetzt, die eine Sequenz aufweisen, die komplementär ist zu der zweiten Sequenz des DNA-Strangs. Der erfindungsgemäße Sensor weist zusätzlich zu der mindestens einen Elektrode (A) mindestens zwei zweite Elektroden (B) auf, auf denen sich keine Fängermoleküle befinden (Attraktionselektroden) .
Im erfindungsgemäßen Sensor ist die erste Elektrode (A) zwischen den zweiten Elektroden (B) derart angeordnet, dass durch Änderung der elektrischen Felder an den zweiten Elektroden ein die zu bestimmenden Moleküle (z.B. Biopolymere) möglicherweise enthaltender, auf den Sensor aufgebrachter Analyt abhängig von Art und Größe der elektrischen Felder über die erste Elektrode hinwegbewegt wird, so dass in dem Analyten enthaltene, qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmende (bio) organische Oligomere und Polymere mit den Fängermolekülen hybridisieren können.
Hierzu befinden sich eine erste Elektrode (A) im allgemeinen direkt zwischen den zwei zweiten Elektroden (B) , vorzugsweise auf halbem Weg. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mehrere erste und zweite Elektroden eingesetzt. Hierbei sind die Attraktions- und Detektionselektroden im allgemeinen abwechselnd auf der Sensoroberfläche angeordnet, wobei der Abstand zwischen den Elektroden vorzugsweise im wesentlichen gleichgroß ist (vgl . Figur 3) . Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) der Elektrodenanordnung sind somit vorzugsweise im wesentlichen in gleichem Abstand voneinander angeordnet.
Im erfindungsgemäßen Sensor wird eine Elektrodenanordnung verwendet, die vorzugsweise mindestens 1 Detektionselektrode
(A) und vorzugsweise mindestens 2 Attraktionselektroden (B) aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Anzahl der Attraktionselektroden (B) von 100 bis 1000 und die Anzahl der Detektionselektroden (A) von 100 bis 1000.
Die Detektionselektroden (A) haben vorzugsweise jeweils eine
2 Fläche von 100 bis 10000 μm . Die Attraktionselektroden (B)
2 haben vorzugsweise jeweils eine Fläche von 0,1 bis 100 μm .
Die Elektroden (A) und (B) können gleiche oder verschieden große Oberflächen haben. Vorzugsweise haben die Elektroden (A) eine größere Oberfläche als die Elektroden (B) . Es sollten möglichst viele kleinflächige bzw. möglichst schmale Attraktionselektroden eingesetzt werden, um große elektrische Felder aufbauen zu können. Die minimalen Dimensionen der Elektroden wiederum ergeben sich aus den Eigenschaften des zu deren Herstellung verwendeten Halbleiterprozesses. Übliche minimale Breiten metallischer Strukturen liegen derzeit im Bereich von lOOnm bis lμm.
Grundsätzlich ist eine möglichst kleine Fläche der Detektionselektroden wünschenswert, da dann eine große Anzahl von Detektionseinheiten auf einer vorgegebenen Chipfläche integriert werden kann. Die Fläche der Detektionselektroden resultiert zum einen aus der Nachweisempfindlichkeit der Messvorrichtung, das heißt je empfindlicher der Nachweis erfolgen kann (elektrisch oder optisch) desto kleiner kann die Detektionselektrode sein. Eine weitere Randbedingung ist die Technologie zum Aufbringen der Fängermoleküle. Wird die dem Stand der Technik entsprechende Microspotting-Technologie (Verfahren ähnlich dem Tintenstrahldruck) angewandt, ergibt sich die minimale Fläche der Detektionselektroden aus dem Durchmesser des Spots. In diesem Falle liegt der
Spotdurchmesser in der Größenordnung von 100 μm, woraus sich die minimale Fläche der Detektionselektrode ergibt. Alternativ zum Spotting können auch elektrochemische Methoden zur Immobilisierung der Fängermoleküle angewandt werden, wie
TM beispielsweise von der Firma Nanogen vorgeschlagen. In diesem Falle ist die Größe der Detektionselektroden nur durch die prozessbedingten minimalen Strukturbreiten beziehungsweise die Nachweisgrenzen der Detektionsmethode gegeben.
Für die erfindungsgemäßen Sensoren bzw. für die diese umfassenden Elektrodenanordnungen kommen verschiedene Geometrien in Frage.
Die in den Elektrodenanordnungen verwendeten Elektroden (A) und (B) können verschiedene zwei- oder dreidimensionale Strukturen aufweisen.
Beispielsweise sind als Elektroden (A) und/oder (B) punktförmige/runde Elektroden (Knopfelektroden) (vgl. Figur 7) geeignet. Unter punktförmigen Elektroden sind hierbei solche zu verstehen, die entsprechend des
Herstellungsprozesses minimale Dimensionen aufweisen. (In einem aktuellen Prozess sind dies beispielsweise Elektroden mit Abmessungen von lμm x lμm) .
Des weiteren können die Elektroden (A) und/oder (B) als planare Elektroden in Form von Streifen (vgl. Figur 8), Ringen oder sonstigen planaren Flächen, oder aber als dreidimensionale Elektroden, beispielsweise in Form von Zylindern, Halbkugeln etc. eingesetzt werden, wobei diese symmetrisch oder asymmetrisch gestaltet sein können.
Die Elektrodengeometrie ist von besonderer Bedeutung für die qualitative und quantitative Bestimmung von ungeladenen Teilchen. Da bei ungeladenen Molekülen nur bei einem inhomogenen elektrischen Feld eine Kraft auf die permanenten bzw. induzierten Dipole ausgeübt werden kann, sollten für deren Bestimmung bevorzugt Elektroden mit kleinem Krümmungsradius eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sensors, die insbesondere zur Bestimmung von ungeladenen oder wenig geladenen Oligomeren oder Polymeren geeignet ist, weisen daher die Elektroden (B) einen kleineren Krümmungskreisradius auf als die Elektroden (A) . Bevorzugt ist hierbei, wenn die Elektroden (A) planar und die Elektroden (B) spitz oder rund geformt sind.
Zur Bestimmung von geladenen Oligomeren oder Polymeren ist es dagegen vorteilhaft, wenn die Elektroden (A) und (B) planar sind.
Unabhängig von der Art des Moleküls ist es bevorzugt, dass die Detektionselektroden (A) planar sind.
Die Detektionselektroden müssen nicht notwendigerweise elektrisch leitfähige Strukturen sein, wenn optische Nachweisver ahren angewandt werden. In diesem Falle genügt eine Oberfläche aus einem Material, das sich zur
Immobilisierung von Fängermolekülen eignet. Weiterhin können elektrisch leitfähige Elektroden als Detektionselektroden eingesetzt werden, die mit einem (nichtleitenden) Dielektrikum überzogen sind.
Die Attraktionselektroden werden in allen genannten
Ausführungsformen der Detektionselektroden und Meßmethoden erfindungsgemäß zur Aufkonzentration der zu analysierenden Stoffe auf der Sensoroberfläche verwendet und somit zur Beschleunigung des Messvorganges .
Die Elektrodenanordnung kann eine Plattenelektrodenanordnung sein oder eine Interdigitalelektrodenanordnung, wie aus [1] bekannt .
Ferner können verschiedene Anordnungen der Parallelschaltung von Elektroden in der Elektrodenanordnung vorgesehen sein, beispielsweise können die Elektroden als zylindrische Elemente ausgestaltet sein, die jeweils konzentrisch umeinander angeordnet sind und elektrisch voneinander beispielsweise mittels eines geeigneten Dielektrikums voneinander isoliert sind, so dass sich ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden ausbildet.
Der erfindungsgemäße Sensor liegt im allgemeinen in der Form eines Chips als sogenannter Sensorchip vor, der im wesentlichen aus Silizium besteht.
Die Detektionselektroden (A) und Attraktionselektroden (B) bestehen vorzugsweise aus chemisch inerten, elektrisch leitfähigen Stoffen, wie Gold, Platin, Palladium oder Legierungen daraus. Grundsätzlich eignet sich jedoch jeder elektrisch leitfähige Stoff als Elektrodenmaterial.
Wenn die Elektroden aus Gold hergestellt sind, werden vorzugsweise kovalente Verbindungen zwischen den Elektroden und den Sondenmolekülen hergestellt, wobei der Schwefel zum Bilden einer Gold-Schwefel -Kopplung in Form eines Sulfids oder eines Thiols vorhanden ist. Für den Fall, dass als Sondenmoleküle DNA-Sondenmoleküle verwendet werden, sind solche Schwefelfunktionalitäten Teil eines modifizierten Nukleotids, das mittels der Phosphoramiditchemie während eines automatisierten DNA- Syntheseverfahrens am 3 ' -Ende oder am 5 ' -Ende des zu immobilisierenden DNA-Strangs eingebaut wird. Das DNA- Sondenmolekül wird somit an seinem 3 ' -Ende oder an seinem 5 ' - Ende immobilisiert.
Für den Fall, dass als Sondenmoleküle Liganden verwendet werden, werden die Schwefelfunktionalitäten durch ein Ende eines Alkyllinkers oder eines Alkylenlinkers gebildet, dessen anderes Ende eine für die kovalente Verbindung des Liganden geeignete chemische Funktionalität aufweist, beispielsweise einen Hydroxylrest , einen Acetoxyrest oder einen Succinimidylesterrest .
Alternativ können diese Elektroden auch aus Siliziumoxid hergestellt sein. Diese können mit einem Material beschichtet werden, das geeignet ist, die Sondenmoleküle darauf zu immobilisieren.
Beispielsweise können bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie • 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
• 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
• 3-Aminopropyltriethoxysilan,
• 4- (Hydroxybutyramido) propyltriethoxysilan,
• 3-N,N-bis (2-hydroxyethyl) aminopropyltriethoxysilan, oder andere artverwandte Materialen, die imstande sind, mit ihrem einen Ende eine vorzugsweise kovalente oder van der Waals'sche Bindung mit der Oberfläche des Siliziumoxids einzugehen und mit ihrem anderen Ende dem zu immobilisierenden Sondenmolekül eine chemisch reaktive Gruppe wie einen Isocyanat-, Alkylsilan-, Epoxy- , Acetoxy- , Amin- oder Hydroxylrest zur Reaktion anzubieten.
Reagiert ein zu immobilisierendes Sondenmolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Beschichtung auf der Elektrode immobilisiert.
Die Elektroden (A) und/oder (B) sind im allgemeinen auf einem Siliziumchip angeordnet.
Die Elektrodenanordnung bzw. diese ergänzenden elektrischen Schaltkreise können beispielsweise durch Photolithographie und verschiedene Abscheidungstechniken (z.B. „Vapor Deposition") hergestellt werden.
So kann auf einem Siliziumsubstrat, wie es für bekannte CMOS- Prozesse hergestellt wird, in dem sich bereits integrierte Schaltungen und/oder elektrische Anschlüsse für die zu bildenden Elektroden befinden, eine Isolatorschicht, die auch als Passivierungsschicht dient, in ausreichender Dicke, beispielsweise in einer Dicke von 500 nm, mittels eines CVD- Verfahrens aufgebracht werden. Die Isolatorschicht kann aus Siliziumoxid Siθ2 oder Siliziumnitrid Si3N4 hergestellt sein.
Ferner werden zur elektrischen Kontaktierung elektrischer Komponenten durch die Isolatorschicht hindurch Wolfram- Durchkontaktierungen (mit Wolfram gefüllte Kontaktlöcher) gebildet.
Die Elektrodenanordnung des Biosensors wird mittels Photolithographie auf der Isolatorschicht definiert. Anschließend werden mittels eines Trockenätzverfahrens, z.B. dem Reactive Ion Etching (RIE) , in der Isolatorschicht Stufen erzeugt, d.h. geätzt, beispielsweise in einer Mindesthöhe von ungefähr 100 nm. Die Höhe der Stufen muss ausreichend groß sein für einen anschließenden selbstjustierenden Prozess zum Bilden der Metallelektrode.
Zum Auftragen der Isolatorschicht kann alternativ auch ein Aufdampfverfahren oder ein Sputterverfahren eingesetzt werden.
In einem weiteren Schritt wird eine Hilfsschicht, z.B. einer Dicke von 10 nm, aus Titan auf die stufenförmige Isolatorschicht aufgebracht. Die Hilfsschicht kann Wolfram, und/oder Nickel -Chrom, und/oder Molybdän aufweisen.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird eine Goldschicht mit einer Dicke von ca. 500 bis ca. 2000 nm aufgebracht. Die Dicke der Goldschicht sollte ausreichend sein, dass die Goldschicht porös kolumnar aufwächst.
In einem weiteren Schritt werden Öffnungen in die Goldschicht geätzt, so dass sich Spalten ausbilden. Zum Nassätzen der
TM Offnungen kann eine Atzlösung aus 7,5 g Super Strip 100 (Markenname der Firma Lea Ronal GmbH, Deutschland) und 20 g
KCN in 1000 ml Wasser H2O verwendet werden.
Durch das kolumnare Wachstum des Goldes, allgemein des Metalls, während des Aufdampfens auf die Haftschicht wird ein anisotroper Ätzangriff erzielt, so dass der Oberflächenabtrag des Goldes ungefähr im Verhältnis 1:3 erfolgt. Durch das Ätzen der Goldschicht werden die Spalten abhängig von der Zeitdauer des Ätzvorgangs gebildet. Dies bedeutet, dass die Zeitdauer des Ätzprozesses die Basisbreite, d.h. den Abstand zwischen den sich ausbildenden Goldelektroden bestimmt.
Nachdem die Metallelektroden eine ausreichende Breite aufweisen und der Abstand zwischen den sich bildenden Goldelektroden erreicht ist, wird das Nassätzen beendet. Üblicherweise erfolgt aufgrund des porösen Aufdampfens das Ätzen in zu der Oberfläche der Isolatorschicht parallelen Richtung wesentlich schneller als in zu der Oberfläche der Isolatorschicht senkrechten Richtung.
Anstelle einer Goldschicht können auch andere Edelmetalle, wie beispielsweise Platin, Titan oder Silber verwendet werden, da diese Materialien ebenfalls Haltebereiche aufweisen bzw. mit einem geeigneten Material beschichtet werden können zum Halten von immobilisierten DNA- Sondenmolekülen oder allgemein zum Halten von Sondenmolekülen, und ein kolumnares Wachstum beim Aufdampfen aufweisen.
Für den Fall, dass die Haftschicht in den geöffneten Spalten zwischen den Metallelektroden entfernt werden soll, erfolgt dies ebenfalls selbstjustierend, indem die Goldelektroden als Ätzmaske verwendet werden.
Gegenüber den bekannten Interdigitalelektroden weist die Struktur gemäß diesem Ausführungsbeispiel insbesondere den Vorteil auf, dass durch das selbstjustierende Öffnen der Goldschicht über den Kanten der Abstand zwischen den
Elektroden nicht an eine minimale Auflösung des Herstellungsprozesses gebunden ist, d.h. der Abstand zwischen den Elektroden kann sehr schmal gehalten werden. In anderen Herstellungsverfahren für den erfindungsgemäßen Sensor wird von einem Substrat ausgegangen, beispielsweise von einem Silizium-Substrat-Wafer, auf dem bereits eine Metallisierung als elektrischer Anschluss vorgesehen ist, wobei auf dem Substrat schon eine Ätzstoppschicht aus Siliziumnitrid Si3N4 aufgebracht ist. Auf dem Substrat wird eine Metallschicht, z.B. eine Goldschicht, aufgebracht mittels eines AufdampfVerfahrens . Alternativ kann ein Sputterverfahren oder ein CVD-Verfahren zum Aufbringen der Goldschicht auf die Ätzstoppschicht eingesetzt werden. Allgemein weist die Metallschicht das Metall auf, aus dem die zu bildende Elektrode gebildet werden soll. Auf der Goldschicht wird eine elektrisch isolierende Hilfsschicht aus Siliziumoxid Si02 mittels eines CVD-Verfahrens (alternativ mittels eines Aufdampfverfahrens oder eines Sputterverfahrens) aufgebracht.
Durch Einsatz der Photolithographie-Technologie wird eine Lackstruktur aus einer Lackschicht gebildet, beispielsweise eine quaderförmige Struktur, welche Lackstruktur der Form der zu bildenden Elektrode entspricht.
Soll ein im weiteren beschriebenes Biosensor-Array mit einer Vielzahl von Elektroden erzeugt werden, wird mittels der Photolithographie eine Lackstruktur erzeugt, die in ihrer Form der zu bildenden Elektroden entsprechen, die den Sensor bilden. Die lateralen Abmessungen der gebildeten Lackstruktur entsprechen somit den Abmessungen der zu erzeugenden Sensorelektrode.
Die Dicke der Lackstruktur, d.h. der Lackschicht, entspricht im wesentlichen der Höhe der zu erzeugenden Elektroden. Nach Aufbringen der Lackschicht und Belichtung, welche die entsprechenden Lackstrukturen vorgibt, wird die Lackschicht in den nicht "entwickelten", d.h. nicht belichteten Bereichen beispielsweise mittels Veraschen oder nasschemisch entfernt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren oder Polymeren unter Verwendung der Elektrodenanordnung des erfindungsgemäßen Sensors wird der Sensor mit einer die zu analysierende Substanz enthaltenden Lösung kontaktiert, wobei der Sensor eine Elektrodenanordnung umfasst, bei der Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) vorhanden sind, an zumindest einen Teil der Attraktionselektroden (B) derart eine sich zeitlich ändernde elektrische Spannung angelegt wird, dass mindestens zwei Gruppen von Attraktionselektroden (B) zumindest zeitweise eine unterschiedliche Spannung aufweisen, die bewirkt, dass die zu analysierende Substanz mindestens einmal über die Detektionselektrode (n) (A) hinweg wandert, d.h. den Bereich der Detektionselektrode passiert, so dass zumindest ein Teil der zu analysierenden Substanz von den Fängermolekülen auf den Detektionselektroden festgehalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist mit mindestens zwei zweiten Elektroden eine Spannungsquelle gekoppelt, mit der eine umpolbare Spannung an die zweiten Elektroden anlegbar ist.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Schritt b) , der auch als „Aufkonzentrationsschritt " bezeichnet werden kann, zunächst an jede zweite Attraktionselektrode (B) ein geeignetes Potential gelegt, sodass sich der zu untersuchende Stoff dort anreichert (vgl. Fig. 4). Die restlichen Attraktionselektroden (B) sind hierbei nicht angeschlossen, womit sich ihr Potential aus der Badspannung ergibt und keine Anziehung auf den Analyten ausgeübt wird. Anschließend werden die zuvor benutzten
Attraktionselektroden abgeschaltet und die zuvor unbenutzten angeschaltet. Der Analyt, der sich bereits in der Nähe der einen Elektroden befindet, wird nun von den anderen Elektroden angezogen und passiert hierbei die Detektionselektroden des Sensors (vgl. Figuren 5 und 6).
Im erfindungsgemäßen Analyseverfahren wird an zumindest einen Teil der Attraktionselektroden (B) derart eine sich zeitlich ändernde elektrische Spannung angelegt, dass mindestens zwei Gruppen von Attraktionselektroden (B) zumindest zeitweise eine unterschiedliche Spannung aufweisen. Die elektrische Spannung kann sich hierbei im Vorzeichen, Höhe der Spannung und Zeitdauer unterscheiden. Geeignet ist auch die Anwendung von WechselSpannung zwischen den Attraktionselektroden (B) . Wird eine geeignete WechselSpannung an die Elektroden angelegt, so nimmt die Aufenthaltswahrscheinlichkeit des Analyten in der Nähe der Detektionselektroden zu und die Messdauer verringert sich entsprechend.
Zum Aufbau eines geschlossenen Stromkreises ist natürlich eine Gegenelektrode zu den Attraktionselektroden notwendig, die mit dem Analyten in Kontakt stehen muss. Diese Gegenelektrode ist vorzugsweise als einzelne große Flächenelektrode ausgeführt, die nur einmal pro Sensorarray vorhanden sein muss, aber auch in Form mehrerer Teilelektroden ausgeführt sein kann. Abhängig von der Meßmethode ist es gegebenenfalls auch notwendig, auf dem Sensor eine Referenzelektrode vorzusehen. Dies ist insbesondere bei Detektionsarten notwendig, die auf elektrochemischen Methoden basieren (z.B. Redox-Recycling) .
Anstelle die Elektroden wechselweise ein- bzw. auszuschalten, kann bei Teilchen mit permanenter Ladung wie z.B. DNA auch die Polarität der Elektroden umgeschaltet werden. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kommt zu der anziehenden Wirkung des Potentials der neuen Elektroden noch die abstoßende Wirkung der alten Elektroden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass die Attraktionselektroden (B) zunächst derart betrieben werden, dass sich die zu analysierende Substanz in deren Nähe aufkonzentriert . Anschließend wird die Spannung abgeschaltet, wodurch die angezogenen Moleküle in die umliegenden, mit Fängermolekülen besetzten Bereiche der Detektionselektroden (A) diffundieren und bei chemischer Übereinstimmung hybridisieren können.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Elektroden unabhängig von der Form der einzelnen Elektroden jeweils wechselweise angeschaltet bzw. deren Polarität vertauscht.
Erfindungsgemäß können nicht nur zwei Elektrodengruppen mit Attraktionselektroden (B) wechselweise betrieben werden, sondern das Verfahren kann auch mit Hilfe mehrerer Elektrodengruppen durchgeführt werden, die geeignet zugeschaltet werden bzw. an die Wechselsignale mit geeigneter Phasenlage angelegt werden. Im Teilschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit bewirkt, dass der Analyt bzw. die nachzuweisende Spezies gezielt über aktive Sensorflächen (Detektionselektroden (A) ) hin- und herbewegt werden. Dies wird durch mehrere benachbarte Attraktionselektroden (B) erreicht, die geeignet elektrisch betrieben werden. Zudem ergeben sich hierdurch wesentlich verkürzte Messdauern für derartige Sensoren, wenn beispielsweise DNA bestimmt werden soll.
Die Attraktionselektroden können entweder als passive
Elektroden ausgeführt sein, das heißt, sie können am Rande des Substrates kontaktiert und mittels einer externen Spannungsversorgung betrieben werden, oder sie werden als aktive Elektroden ausgeführt.
Diese bevorzugte aktive Ausführungsform beinhaltet insbesondere die monolithische Integration elektronischer Bauelemente und damit einer oder mehrerer elektronischer Schaltungen in den Chip, welche Schaltungen elektronische Funktionen für den Betrieb der Attraktionselektroden in dem
Chip bereitstellen.
Die Funktionen weisen insbesondere die Schaltfunktionen für das Anlegen der benötigten elektrischen Potentiale zur Attraktion oder Repulsion der geladenen Partikel, sowie die Zeitsteuerung zum Umschalten der Potentiale und zur Umschaltung vom Attraktionsbetrieb in den Messbetrieb auf.
Eine Integration dieser Funktionen ist neben der vereinfachten Ansteuerung des Chips insbesondere deshalb vorteilhaft, da gemäß dieser Ausführungsform eine hohe Integrationsdichte realisierbar ist. Üblicherweise sind mehrere Sensoreinheiten, die mit verschiedenen Fängersequenzen ausgerüstet wurden, auf einem Chip integriert. Innerhalb jeder dieser Sensoreinheiten ist die beschriebene Struktur aus Attraktions- und Detektionselektroden enthalten.
Sind die Ansteuerschaltungen auf dem Chip integriert, kann jeder Sensor unabhängig von den umgebenden, d.h. benachbarten, Sensoren betrieben werden und so die elektrischen Randbedingungen wie die angelegten
Attraktionspotentiale, die zeitliche Abfolge der Impulse, sowie die Umschaltung zwischen Attraktions- und Detektionsbetrieb auf die jeweiligen biologischen Spezies individuell eingestellt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden nach einem Waschvorgang, der alle nicht gebundenen (bio) organischen Oligomere oder Polymere entfernt, im Schritt c) die auf den Detektionselektroden (A) befindlichen hybridisierten, zu bestimmenden (bio) organischen Oligomere oder Polymere auf optischem oder elektronischen Wege auf an sich bekannte Weise nachgewiesen. Bevorzugt erfolgt dieser Nachweis elektronisch durch Impedanzmessungen.
Zum empfindlicheren Nachweis werden nach beendetem
Anreicherungsschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens optional nicht gebundene (bio) organische Oligomere und Polymere, insbesondere Biopolymere, von der jeweiligen Elektrode, auf der sie sich befinden, entfernt.
Die folgenden Angaben erfolgen beispielhaft für Biopolymere als zu analysierende Substanzen. Für den Fall, dass die Sondenmoleküle DNA-Stränge sind, erfolgt dies beispielsweise enzymatisch mittels eines Enzyms, das selektiv einzelsträngige DNA abbaut. Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau nicht- hybridisierter DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende, hybridisierte doppelsträngige DNA unerwünscht mit abgebaut .
Insbesondere können zum Entfernen der nicht gebundenen DNA- Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode DNA Nukleasen, beispielsweise eine Nuklease aus Mung-Bohnen, die Nuklease Pl oder die Nuklease Sl verwendet werden. Die DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5'-^ 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer 3 ' -> 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, können ebenfalls verwendet werden.
Für den Fall, dass die Sondenmoleküle niedermolekulare Liganden sind, lassen sich diese, falls ungebunden, auch enzymatisch entfernen.
Hierzu sind die Liganden über eine enzymatisch spaltbare Verbindung kovalent mit der Elektrode verbunden, beispielsweise über eine Esterverbindung.
In diesem Falle kann beispielsweise eine Carboxylester- Hydrolase (Esterase) eingesetzt werden, um ungebundene Ligandenmoleküle zu entfernen. Dieses Enzym hydrolysiert diejenige Esterverbindung zwischen der Elektrode und dem jeweiligen Ligandenmolekül , das nicht von einem Peptid oder Protein gebunden wurde. Dahingegen bleiben die Esterverbindungen zwischen der Elektrode und denjenigen Molekülen, die eine Bindungswechselwirkung mit Peptiden oder Proteinen eingegangen sind, aufgrund der verminderten sterischen Zugänglichkeit, die durch die molekulare Masse des gebundenen Peptids oder Proteins eintritt, unversehrt.
Üblicherweise wird zunächst optional eine erste Messung ohne immobilisierte Fängermoleküle durchgeführt.
Eine anschließende zweite Messung erfolgt nach der Immobilisierung der Fängermoleküle, eine darauffolgende dritte Messung nach erfolgter Hybridisierung und einem durchgeführten Waschvorgang. Eine vierte Messung wird nach enzymatischer Entfernung ungebunderer Fängermoleküle (falls zutreffend) durchgeführt. Eine abschließende fünfte Messung wird durchgeführt nach vollständiger Entfernung aller
Fängermoleküle. Es ist anzumerken, dass auch die fünfte Messung optional ist.
Die ermittelten Werte aus den elektrischen Messungen werden dann im allgemeinen miteinander verglichen. Wenn die Differenz bestimmter Messwerte (z.B. gemessene Kapazitätswerte) größer ist als ein vorgegebener Schwellenwert, so wird angenommen, dass sich Biopolymere mit Sondenmolekülen gebunden haben, wodurch die Veränderung des elektrischen Signals an den Elektroden verursacht worden ist.
Ist die Differenz zwischen den Werten einer ersten elektrischen Messung und einer zweiten elektrischen Messung größer als der vorgegebene Schwellenwert, so wird als Ergebnis ausgegeben, dass die entsprechenden, die ersten Moleküle bzw. zweiten Moleküle spezifisch bindenden Biopolymere gebunden worden sind und die entsprechenden Biopolymere somit in dem Medium enthalten waren. Die erste elektrische Messung und die zweite elektrische Messung können realisiert werden, indem die Kapazität zwischen den Elektroden gemessen wird. Alternativ können auch der elektrische Widerstand zwischen einzelnen Elektroden ermittelt werden.
Allgemein kann als erste elektrische Messung und als zweite elektrische Messung eine Impedanzmessung durchgeführt werden, in dessen Rahmen sowohl die Kapazität zwischen den Elektroden als auch die elektrischen Widerstände gemessen werden.
Im Rahmen der ersten Kapazitätsmessung wird üblicherweise ein Referenz-Kapazitätswert ermittelt und in einem Speicher gespeichert. Eine zweite Kapazitätsmessung erfolgt, nachdem die einsträngigen DNA-Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode entfernt worden sind. Mittels der zweiten Kapazitätsmessung wird ein Kapazitätswert ermittelt, der mit dem Referenz-Kapazitätswert verglichen wird.
Ist der Differenzwert zwischen diesen Kapazitätswerten größer als ein vorgegebener Schwellenwert, so bedeutet dies, dass in dem Elektrolyt DNA-Stränge enthalten waren, die entweder mit den DNA-Sondenmolekülen hybridisiert sind. In diesem Fall wird ein entsprechendes Ausgangssignal von dem Messgerät dem Benutzer des Messgeräts ausgegeben.
Erfindungsgemäß kann mit dem Sensor anstelle der Kapazitätsmessung eine Impedanzmessung durchgeführt werden. Für jede Detektionselektrode ist hierbei üblicherweise eine Referenzelektrode vorgesehen, derart, dass die DNA- Sondenmoleküle nicht an diesen Referenzelektroden haften. Dies kann dadurch gewährleistet werden, dass ein Material für die Referenzelektroden gewählt wird, das keine Schwefelbindung ermöglicht.
Alternativ kann eine unerwünschte Haftung der DNA- Sondenmoleküle auf der Referenzelektrode dadurch verhindert werden, dass das zur Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle geeignete Beschichtungsmaterial (s. oben) im Voraus nicht auf die Referenzelektrode aufgebracht wird. Somit entstehen keine chemisch reaktiven Gruppen auf der Referenzelektrode, die sonst eine kovalente Bindung mit den DNA-Sondenmolekülen eingehen, und somit diese dort immobilisieren würden.
Alternativ kann dies durch Anlegen eines ausreichend großen negativen elektrischen Feldes gewährleistet werden, wodurch sichergestellt wird, dass die negativ geladenen DNA- Sondenmoleküle nicht an den Referenzelektroden haften. Jede Referenzelektrode ist mit einem elektrischen Referenzanschluss gekoppelt .
In einem weiteren Ausführungsbeispiel erfolgt eine erste
Impedanzmessung im unbelegten Zustand, d.h. beispielsweise in einem Zustand ohne Sondenmoleküle auf den späteren Detektionselektroden oder mit nicht hybridisierten DNA- Sondenmolekülen .
Nach Entfernung der einsträngigen DNA-Sondenmoleküle nach eventueller Hybridisierung der passenden DNA-Sondenmoleküle mit einem DNA-Strang der vorgegebenen, zu dem jeweiligen DNA- Sondenmolekül komplementären Sequenz wird eine zweite Impedanzmessung in bekannter Weise durchgeführt. Aufgrund der möglicherweise veränderten Impedanzwerte wird dann ermittelt, ob eine Hybridisierung von Sondenmolekülen und DNA-Strängen mit jeweils komplementärer Sequenz stattgefunden hat. Neben der bisher beschriebenen, rein qualitativen Analyse des Stoffgemisches im Analyten, eignet sich die erfindungsgemäße Meßmethode auch zur quantitativen Messung der Konzentration bestimmter Spezies im Analyten. Die Genauigkeit der Messung hängt hierbei von der eingesetzten Meßmethode ab. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Aufkonzentration des Analyten in der Nähe der Detektionselektroden führt in jedem Falle zu einer Beschleunigung des gesamten Messvorganges sowie zu einer Erhöhung der Messempfindlichkeit, da mittels der Aufkonzentrierung der zu detektierenden Spezies auf der Sensoroberfläche und die elektrisch getriebene Bewegung über die Detektionselektroden hinweg, potentiell alle im Analyten vorhandenen zu detektierenden Moleküle Bindungspartner finden und somit der zu messende Effekt maximal ausfällt.
Ein Vorteil von erfindungsgemäßem Sensor und Verfahren ist, dass hierdurch eine rasche qualitative und quantitative Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren und Polymeren, insbesondere von DNA, bei erhöhter Nachweisempfindlichkeit möglich ist. Ein weiterer Vorteil von erfindungsgemäßem Sensor und Verfahren ist es, dass auch bei starken elektrischen Feldern und somit großen Konzentrationsgradienten sichergestellt ist, dass die zu analysierende Substanz in die Nähe der Fängermoleküle gelangt . In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert :
[1] R. Hintsche et al . , Microbiosensors Using Electrodes Made in Si -Technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al . , Dirk Hauser Verlag, Basel, S. 267 - 283, 1997
[2] N.L. Thompson, B.C. Lagerholm, Total Internal Reflection Fluoresence: Applications in Cellular Biophysics, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 8, S. 58 - 64, 1997
[3] P. Cuatrecasas, Affinity Chromatography, Annual Revision Biochem, Vol. 40, S. 259 - 278, 1971
[4] P. van Gerwen, Nanoscaled Interdigitated Electrode Arrays for Biochemical Sensors, IEEE, International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, Chicago, S.907 - 910, 16. - 19. Juni 1997
[5] WO 96/07917 AI
[6] WO 99/53093 AI
Bezugszeichenliste
200 Sensor
201 Elektrode
202 Elektrode
203 Isolatorschicht
204 Elektroden-Anschluss
205 Elektroden-Anschluss
206 immobilisierte DNA-Sondenmoleküle
207 Analyt
208 DNA-Stränge
(A) erste Elektrode
(B) zweite Elektrode
1 Elektrode
2 Elektrode

Claims

Patentansprüche
1. Sensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren und Polymeren in Lösung, umfassend eine Elektrodenanordnung
• mit mindestens einer ersten Elektrode als Detektionselektrode, auf der Fängermoleküle zum Hybridisieren mit zu bestimmenden (bio) organischen Oligomeren und Polymeren („chemische Verbindungen") immobilisiert sind (Detektionselektroden (A) ) ,
• mit mindestens zwei zweiten Elektroden als Attraktionselektroden, auf denen sich keine Fängermoleküle befinden (Attraktionselektroden (B)) , • wobei die erste Elektrode zwischen den zweiten Elektroden angeordnet ist, derart, dass durch Änderung der elektrischen Felder an den zweiten Elektroden ein die zu erfassenden chemischen Verbindungen möglicherweise enthaltender, auf die Sensor-Anordnung aufgebrachter Analyt abhängig von
Art und Größe der elektrischen Felder über die erste Elektrode hinwegbewegt wird, so dass in dem Analyten enthaltene, qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmende (bio) organische Oligomeren und Polymere mit den Fängermolekülen hybridisieren können.
2. Sensor nach Anspruch 1, bei dem die (bio) organischen Oligomere und Polymere Biopolymere sind.
3. Sensor nach Anspruch 1 oder 2 , bei dem die Detektionselektrode (n) (A) einen größeren Krümmungskreisradius haben als die Attraktionselektroden (B) .
4. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem mindestens zwei Detektionselektroden (A) mit
Fängermolekülen beschichtet sind, die sich hinsichtlich ihrer Fangcharakteristika für unterschiedliche, zu bestimmende Moleküle unterscheiden.
5. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Anzahl Attraktionselektroden (B) von 100 bis 1000 beträgt und die Anzahl der Detektionselektroden (A) von 100 bis 1000 beträgt.
6. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Detektionselektroden (A) planar sind.
7. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Detektionselektroden (A) eine jeweils
2 gleiche Oberfläche von 100 bis 10000 μm aufweisen.
8. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Attraktionselektroden (A) eine jeweils
2 gleiche Oberfläche von 0,1 bis 100 μm aufweisen.
9. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) der Elektrodenanordnung im wesentlichen in gleichem Abstand voneinander angeordnet sind.
10. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Elektroden aus Gold bestehen oder Gold enthalten und auf einem Siliziumchip angeordnet sind.
11. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, integriert in einem Chip.
12. Sensor nach Anspruch 11, mit einer oder mehrerer elektronischer Schaltungen in dem Chip, welche Schaltungen elektronische Funktionen für den Betrieb der Attraktionselektroden in dem Chip bereitstellen..
13. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio) organischen Oligomeren oder Polymeren in Lösung unter Verwendung einer Elektrodenanordnung gemäß Anspruch 1, wobei
a. ein Sensor mit einer die zu analysierende Substanz enthaltenden Lösung kontaktiert wird, wobei der
Sensor eine Elektrodenanordnung umfasst, bei der Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) vorhanden sind, b. an zumindest einen Teil der Attraktionselektroden (B) derart eine sich zeitlich ändernde elektrische
Spannung angelegt wird, dass mindestens zwei Gruppen von Attraktionselektroden (B) zumindest zeitweise eine unterschiedliche Spannung aufweisen, die bewirkt, das die zu analysierende Substanz mindestens einmal über die Detektionselektrode (n) (A) hinwegwandern, so dass mindestens ein Teil der zu analysierenden Substanz mit den Fängermolekülen auf der oder den Detektionselektrode (n) (A) hybridisiert, und c. die zu bestimmenden (bio) organischen Oligomere oder Polymere auf optische oder elektronische Weise nachgewiesen werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem mit den zwei zweiten Elektroden eine Spannungsquelle gekoppelt ist, mit der eine umpolbare Spannung an die zweiten Elektroden anlegbar ist.
PCT/DE2003/001090 2002-04-03 2003-04-02 Sensor zur qualitativen und quantitativen bestimmung von (bio)organischen oligomeren und polymeren, analyseverfahren hierzu sowie verfahren zur herstellung des sensors Ceased WO2003083134A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

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