CZ300145B6 - Zpusob regulace tvorby biomasy v rostlinách - Google Patents

Abstract

Rešení se týká zpusobu regulace tvorby biomasy v rostline, jehož podstata spocívá v tom, že se v rostline identifikuje gen CKI1 nebo jeho homolog nebo ortolog a sníží nebo zcela eliminuje se exprese genu CKI1 nebo jeho homologu nebo ortologu nebo aktivita genového produktu. Identifiace homologu nebo ortologu genu CKI1 v rostlinném druhu zahrnuje následující kroky: i) zjištení sekvencní homologie na úrovni nukleotidu nebo aminokyselin, ii) prokázání histidinkinázové aktivity genového produktu zkoumaného genu, iii) zjištení exprese ve vaskulárních pletivech daného rostlinného druhu. Modifikaci exprese genu lze provést pomocí RNA interference, modifikaci aktivity genového produktu inzercní mutagenezí nebo místne rízenou mutagenezí.

Description

Způsob regulace tvorby biomasy v rostlinách

Oblast techniky s

Vynález se týká způsobu regulace tvorby biomasy v rostlinách pomocí úpravy aktivity genu nebo produktu genu.

i o Dosavadní stav techniky

V současné ekonomice EU i jiných zemí existuje značná závislost na ropných produktech. Tato závislost jc negativní svým časovým omezením a nutností hledat další, alternativní zdroje energie a materiálové zdroje pro chemický průmysl. Další nevýhoda spočívá v negativní bilanci CCT, která zásadním způsobem přispívá ke zhoršování životního prostředí díky tzv. skleníkovému efektu. Zásadním zájmem nejen pro ekonomiku CR a dalších států EU je tedy využití biotechnologií s vyrovnanou bilancí CO₂ jako zdroje biomasy v konceptu ekonomik s trvale udržitelným rozvojem.

2() Evropská unie si stanovila cíle ve zvyšování užití obnovitelných zdrojů energie (OZE) ve dvou základních dokumentech: „White páper stanovil základní cíl ve zvýšení podílu OZE na spotřebě primárních energetických zdrojů za Evropskou unii jako celek z cca 6 % v roce 1995 na 12 % v roce 2010 a Direktiva 2001/77/EC určuje cíl EU ve zvýšení OZE pro výrobu elektrické energie, a to ze 13,9 % v roce 1997 na 22,1 % v roce 2010, Ke splnění výše uvedených cílů má zásadně přispět biomasa, a to jak odpadní, tak cíleně pěstovaná. Bilancováním celkového potenciálu energetické biomasy v ČR bylo navíc zjištěno, že téměř celá jedna polovina polřebná pro zajištěni stanovených cílů (8 % elektřiny a 6% tepelné energie z celkové potřeby ČR do r. 2010) se musí získat přímým pěstováním energetických plodin - tzv. zbytková biomasa (dřevní a lesní odpady, sláma apod.) nestačí pokrýt tento naléhavý požadavek.

?()

Nejběžnějším způsobem pro zajišťování větší tvorby biomasy je pěstování plodin doporučených pro energetické využití (např, kotnonice bílá, krmný sléz, různé druhy vysokých trav), přičemž nejvíce propracovanou energetickou plodinou je krmný šťovík. Pěstování však vyžaduje patřičnou péči, aby např. nedocházelo k zaplevelování a napadání škůdci, a nejde o způsob zvětšování biomasy rostliny jako takové (Petříková V.: Energetické plodiny nová šance pro zemědělce. Biom. cz [oniine]. 2004 04 21).

Pro samotné zvětšování tvorby biomasy u rostlin se používají různá hnojivá, která mají nahradit odčerpané živiny z půdy, Minerální hnojení se ale ve výsledku na ekonomické efektivnosti

4« zemědělské výroby projeví negativně, současně může ohrozit životní prostředí a vysoká koncentrace minerálních živin v půdním roztoku neodpovídá ani ekologickým požadavkům rostlin. Výnosy hnojených plodin neodpovídají ani vynaloženým prostředkům a postupně klesá i kvalita skiizne. A přestože bylo zjištěno, že důvodem poklesu účinnosti minerálních hnojiv nejsou prvky samotné, ale narušení poměru mezi minerálními živinami a organickými látkami, snaha o eo nej45 optimálnější zvýšení účinnosti minerálních hnojiv neřeší rizika související s používáním hnojiv (Vrba V., Huleš L.: Humus - půda rostlina (15) Minerální hnojivá. Biom.cz [oniine], 2007-0406).

Nejrychlejší cestou přípravy nových výkonných a energetických rostlin je bezpochyby genetická so modifikace rostlin (Váňa I: Nové cíle v energetickém využití biomasy a příprava high-teehnologií kjejich zabezpečování. Biom.cz [oniine]. 2001 11-29). Metod pro cílený zásah do dědičné informace rostlin existuje celá řada. K nej používanějším patří metody založené na přirozené schopnosti bakterie Agrobacterium tumcfaciens vnášet část vlastní dědičné informace (tzv. TDNA) do genomu rostlin, přičemž je lze upravit tak, že si plně uchovají schopnost přenosu genů do rostlinného genomu, ale přenášejí i další vložené geny. 7 dalších metod lze zmínit přímé

CZ 3UU145 B6 „nastrčíování“ genu do rostlinných buněk pomocí zařízení označovaného jako „gene gun, tj.

nastřelení mikroskopické částečky zlata nebo wolframu potažené genem, jenž má být vnesen do genomu rostliny. V současné době převažují mezi geny používanými pro genetické modifikace rostlin geny zajištující rezistenci rostlin k herbicidům, rezistenci ke hmyzím škůdcům a rezistenci k virovým chorobám (Miloš Ondřej, Jaroslav Drobník; Transgenoze rostlin, Academia. Praha, 2002) první geneticky modifikovaná rostlina vstoupila do České republiky oficiálně 14, května roku 2001, kdy byla povolena ke zpracování (nikoli pro pěstování) geneticky modifikovaná sója odolná vůči herbicidu Roundup (sója linie GTS 40-3-2 a veškeré potomstvo odvozené od této linie tradičními šlechtitelskými postupy). Genetických postupů vedoucích čistě ke zvětšování io objemu biomasy je málo, některé byly prováděny pouze u podzemních částí rostlin.

Vodivá pletiva jsou místem produkce buněk xylému, neboli dřeva, kde dochází k lignifikaci buněčných stěn a ukládání celulózy. Tyto procesy jsou kritické pro tvorbu využitelné biomasy a mohou mít tedy ekonomický dopad.

Gen CYTOK1N1N INDEPENDENT 1 (CKH) byl identifikován v roce 1996 pomocí aktivační mutageneze jako dominantní regulátor cytokininové odpovědi u Arabidopsis thaliana (Kakimoto T., Science 274, 982-985 (1996)). Zvýšená exprese genu CKH (CK11 pod kontrolou silného konstitutivního promotoru, tetrameru zesilovačů pro motoru viru tabákové mozaiky pro 35S

RNA [CaMV 35S RNA pro motoru]) vedla na růstovém médiu bez cytokininů k fenotypovým projevům, které jsou závislé na přítomnosti cytokininů v kultivačním mediu (zelenání a tvorba prýtů). Na základě podobnosti aminokyselinové sekvence CKI1 s receptorovými histidinkinázami bakterií byla předpovězena funkce CKI1 jako reeeptoru cytokininů. Nicméně další experimenty neprokázaly vazbu cytokininů na CKI1. Později byly identifikovány homology CKH, geny

AHK2, AHK3 a AHK4ICRE1IWOL, u kterých byla zjištěna jejich funkce ve vnímání cytokininů u rostlin jako pravých receptorů (Inoue et al., Nátuře 409, 1060-1063 (2001); Yamada ct al., Plant Cell Physiol 42, 1017-1023 (2001)). V případě CKI1 byla zjištěna jeho konstitutivní aktivita, nezávislá na přítomnosti nebo absenci cytokininů, a proto byl vysloven předpoklad, že se nejedná o pravý eytokininový receptor (Yamada etal., Plant Cell Physiol 42, 1017-1023 (2001)). Byla prokázána role genu CKH ve vývoji samičího gametoťytu (Hejátko et al.. Mol Genet Genomics 269, 443-453 (2003); Pisehke etal., Proč Nati Acad Sci USA 99, 15 800-15 805 (2002)) a také bylo zjištěno, že CK11 jc exprimován nejen během celého vývoje samičího gametofytu, ale je aktivní také později ve sporo fytu.

Exprese hornologů CKH, genů AHK2, AHK3 a ΑΠΚ4, byla identifikována ve vaskulámích pletivech A. thalia na a byla prokázána jejich funkce v odpovědi na ex o gen ní cytokin iny, růstu kořene, prodlužování hypokotylu, počtu buněk v listu a velikosti listové čepele u A. thaliana (Higuchi etal., Proč Nati Acad Sci USA HH, 8 821-8 826 (2004); Nishímura etal., Plant Cell 16, 13651377 (2004)). Vliv AHK2, AHK3 a AHK4 na tvorbu vaskulámích pletiv v nadzemní části není

-tu znám, byly publikovány pouze výsledky fenotypu ve vaskulámích pletivech kořene (Mahonen et al., Genes Dev 14, 2938-2943 (2000); Seheres et al., Development 121, 53-62 (1995)).

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je způsob regulace tvorby biomasy v rostlině, vyznačený tím, žc se v rostlině identifikuje gen CKH (sekvence 1) nebo jeho homolog nebo ortolog a sníží nebo zcela eliminuje se exprese genu CKH nebo jeho bomologu nebo ortologu nebo aktivita genového produktu (kódovaného proteinu). Homologem je míněn gen podobný svou sekvencí genu CKH 50 podobnost na úrovni sekvence nukleotidů nebo gen. jehož produkt je podobný proteinu CKI1 podobnost na úrovni sekvence aminokyselin -, který se v minulosti vyvinul ze stejné sekvence.

Ortologem je míněn gen, který plní stejnou nebo podobnou funkci v jiném druhu, tj. v tomto případě gen svou funkcí v jiném rostlinném druhu odpovídající funkci genu ('Kil v A. thaliana.

CZ 300145 R6

Identifikace homologu nebo ortologú se provádí na základě následujících kriterií:

/) sekvenční homologie na úrovni nukleotidů nebo aminokyselin, obsahující zejména konzervované oblasti receptorových histidinkináz. Pokud se jedná o druh, jehož genom je již znám. lze identifikovat homologní geny pomocí srovnávání těchto sekvencí s genomovou databází tohoto druhu a identifikací homologní sekvence pomocí vhodných počítačových programů, např, RI.AST. Pokud se jedná o druh, jehož genom ještě není znám, pak lze postupovat např. tak, že sc provede identifikace konzervovaných oblastí srovnáváním sekvencí dosud identifikovaných homologůCKll (nejlépe pomocí srovnávání identifikovaných nebo předpokládaných aminoio kyselinových sekvencí), navrhnou se degenerované primery, pokrývající tyto konzervované nebo částečně konzervované oblasti a provede se identifikace sekvence hledaného genu amplifikací konzervované oblasti s využitím genomové DNA nebo cDNA knihovny příslušného druhu jako tcmplátu a následnou izolací jeho cDNA nebo genomové DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) nebo podobnými metodami. Konzervované oblasti receptorových histidinkináz je is možno také vyhledat vc veřejně přístupných databázích (např. databáze PRINTS, http://www.bio i nf.manchester.ae.uk/dbbrowser/PRlNTS/). Alternativně je možné identifikovat cDNA homologních genů např. pomocí hybridizace scDNA knihovnou nebo genomovou knihovnou daného druhu s využitím sondy získané z genomové DNA nebo cDNA CKll nebo některého z jeho již identifikovaných homologu, např. genů AHK2, ΑΠΚ3 nebo AHK4/CRE1/WOL nebo podobnými metodami.

ii) prokázání a analýza histidinkinázové aktivity genového produktu příslušného homologu, např. pomocí exprese genu v heterologním nebo homologním expresním systému, nejlépe jako rekombinantního proteinu a následné analýzy jeho aktivity (Mahonen et al., Curr Biol 16, 1116-1122 (2006)) nebo pomocí komplementace bakteriálních, kvasinkových nebo rostlinných mutantů v genech pro receptorové histidinkinázy (např M2, ahk3, ahk4 nebo ckil) pomocí kódující sekvence homologu, vložené pod kontrolu pro motoru příslušného genu a v příslušném mutantní rn pozadí pomocí všeobecně známých metod nebo prostřednictvím analýzy aktivity genového produktu v přenosu cytokininovčho signálu pomocí analýzy v rostlinných protop lastech jak bylo popsáno (Hwang a Sheen, Nátuře 413, 383-389 (2001)) a iii) exprese homologu nebo ortologú ve vaskulámích pletivech nebo pletivech sousedících s vaskulámí mi pletivy daného rostlinného druhu.

Význakern vynálezu je, že se exprese genu gen CKíl nebo jeho homologu nebo ortologú změní tak, že se buď sníží, nebo úplně eliminuje, např. pomocí RNA interference, inzerční mutagenezí nebo podobnými metodami. Alternativně lze měnit aktivitu genového produktu homologu nebo ortologú pomocí metod místně řízené mutageneze ve vybraných aminokyselinách, s výhodou v aminokyselinách podílejících se na přenosu fosfátu příslušnou receptorovou histidinkinázou, na

4D potenciálních interakcích s dalšími, např. regulačními, proteiny nebo aminokyselinách s regulační funkcí. Takto upravená DNA pod kontrolou konstitutivně nebo kondicionálně aktivního promotoru se pak použije pro přípravu stabilních transformantů příslušného rostlinného druhu pomocí obecně známých přístupů a metod.

V případě použití RNA interference ke snížení aktivity homologu nebo ortologú je nutně připravit obecně známými metodami molekulární biologie rekombinantní DNA, obsahující části sekvence cDNA homologu nebo ortologú v obrácené repetici, oddělené sekvencí jiné DNA, např. částí kódující sekvence uidA (sekvence 5; ěást (HJSp, sekvence 6) nebo přirozeného íntronu homologu nebo ortologú Pro snížení aktivity homologu nebo ortologú je možné zvolit různé

5(i oblasti jeho cDNA a to pravděpodobné s ilizným výsledkem na pokles exprese homologu nebo ortologú: toto je nutno testoval metodami průměrnému odborníkovi v dané oblasti známými (např. analýza množství proteinu kódovaného homologem nebo ort o logem pomocí westernového přenosu nebo in šitu imunolokalízací na řezech stonku květenství nebo jiných pletiv). Vhodnou částí sekvence cDNA je sekvence nukleotidů, jejichž pořadí odpovídá nejméně z 20 % sekvenci nukleotidů CKlp2, sekvence 4. Tento konstrukt jc pak vložen pod kontrolu konstitutivně aktiv- 3 CZ 30(1145 B6 ního pro motoru (např. CaMV 35S RNA pro motoru) nebo kondieionálně aktivního promotoru (např. dexametbasonem indukovatelného pro motoru) a ukončen terminátorem transkripce. Výsledný konstrukt je pak klonován do binárního vektoru, který je použit pro transformaci vhodného kmene Agrobacterium tumcfaciens (např. GV3013::pMP90; kmen s rezistencí k rifampicinu, nesoucí pomocný plasmid pMP90 s rezistencí ke gentamícinu jako selekčním markérem [Koncz and Schell, Mol Gen Genet 204, 383-396 (1986)] nebo podobný). Následuje příprava transgenních rostlin daného druhu obecně známými metodami, buď infiltrací květenství pomocí transgenního Agrobacterium, nesoucím binární vektor, jehož součástí je zmíněný genový konstrukt, nebo jinou metodou, vhodnou pro daný rostlinný druh, např. prostřednictvím infiltrace tkáňových io explantátů bakteriemi Agrobacterium, nesoucím binární vektor, jehož součástí je zmíněný genový konstrukt, a in vitro regenerací transgenníeh rostlin nebo podobnými metodami. Po selekci několika nezávislých linií primárních tran sfo rmantů na základě přítomnosti selekčního markéru, který je součástí vloženého konstruktu, je nutné identifikovat v jejich potomstvu homozygotní linie a analyzovat jejich fenotyp, vše pomocí obecně známých metod molekulární biologie rost15 lín. Pro analýzu fenotypu vývoje vaskulárních pletiv je možno použít specifického barvení, např. směsí oranže GG a anilinové modři na ručně připravených řezech nebo morfologické a histologické analýzy na tenkých řezech připravených pomocí obecně známých metod.

Význakem vynálezu je také to, že dále zahrnuje histologické barvení řezů živých rostlin směsí oranže GG a anilinové modří, vhodné pro analýzu fenotypu vývoje vaskulárních pletiv v rostlinách s modifikovanou expresí genu CKli nebo jeho homologu nebo ortologu nebo s modifikovanou aktivitou jeho genového produktu. Barvení touto metodou umožňuje rozlišit mezi zdřevnatělými buněčnými stěnami, které se bani spolu s cytoplazmou žlutě až oranžově, a živými, tedy ještě ne zcela zdřevnatělými buněčnými stěnami, které se barví modře. Při použití fluorescence je pak možno identifikovat zdřevnatělé a ligniOkované buňky. Tato metoda takc umožňuje barevně odlišit jednotlivé buněčné složky vaskulárních pletiv u rostlin při použití mikroskopického pozorování v procházejícím světle, zejména diferenčního interferenčního kontrastu (D1C mikroskopie): Floém se barví modře, metaxylém oranžově a protoxylém tmavě modře až fialově.

au Předmětem vynálezu je také způsob přípravy rekombinantní DNA pro regulaci exprese genu prostřednictvím RNA interference, jehož podstata spočívá v tom, že se ampl i fíku je specifická část cDNA nebo kódující oblasti daného genu pomocí přímení, obsahujících kromě sekvence 1821 nukleotidů specifických pro cDNA nebo kódující sekvenci daného genu i oblasti vložené na 5' konec těchto primeru, označené RNAi up a RNAi down,

RNAi up:

BamHI Hinclttl

5' - TAT AGG ATC CAA GCT T - 3'

RNAi_down:

\h;il

5' - CAC TTC TAG A - 3' dále se ampli Ukuje spojovací sekvence, s výhodou část kódující sekvence genu uidA (sekvence 5; část GUSp, sekvence 6), která se ampl i fi kuje pomocí primeru Bgus a Hgus,

Bgus:

BamHI

5' - CAG CGG ATC CCT CTA CAC CAC GCC GAA CAC C - 3' roopjip Hgus:

líinillll

5' - TTC CAA GCT TTT CTC TGC CGT TTC CAA ATG G - 3'

LUUP doMti- 4 C’Z 300145 B6 a prostřednictvím štěpení restríkčním i endonukleázami BamHi. Hindlll, Xbal a Sáli a spojením výsledných fragmentů ligázou se tyto tří části spojí do jednoho výsledného konstruktu, který se pak vloží pod kontrolu vhodného promotoru. Takto připravená sekvence se pak použije pro pří5 právu transgenního organismu daného druhu.

Jako spojovací sekvenci lze v případě nutnosti použít i jiné sekvence než uidA, a v tom případě se amplitlkují pomocí primerů sestávajících z 1 S -21 nukleotidů specifických pro danou sekvenci a dále sekvencí, vložených na 5' konec těchto primerů, označených jako LOOP up a LOOP down.

io LOOP up:

5^f — CAG Cuu v_, — 3^f

LOOPdown:

5' - TTC C - 3'

Sekvence 4 nukleotidů na 5' konci sekvencí RNAiup, RNAi_down, LOOP up a LOOP_down byla optimalizována pro amplifikaee sekvencí CKIp2, resp. GUSp. Tyto sekvence 4 nukleotidů mohou býl případně modifikovány tak, aby docházelo ke zlepšení amplifikaee dané sekvence (zlepšení termodynamických vlastností daného primerů po vložení 18 21 nukleotidu specifických pro sekvenci homo logu nebo ort o logu, resp. dané spojovací sekvence, zamezení tvorby sekundárních struktur a vzájemných podobností atd.), případně mohou být tyto 4 nukleotidy zcela vypuštěny.

2(1

Regulovat aktivitu genového produktu (kódovaného proteinu) homologu nebo ortologu je možno pomocí přípravy rekombinantní DNA, která sestává z modifikované cDNA nebo genomové DNA homologu nebo ortologu pod kontrolou vhodného promotoru (konstitutivně nebo kondicionálně aktivního pro motoru). Modifikace cDNA nebo kódující oblasti genomové DNA spočívá ve výměně části nukleotidové sekvence obecně známými technikami (místně řízená mutageneze) a to tak, aby při překladu mRNA do proteinu došlo k záměně vybraných aminokyselin homologu nebo ortologu na jiné, zvolené aminokyseliny. Lze modifikovat aminokyseliny podílející se na přenosu fosfátu příslušnou reeeptorovou histidinkinázou, kódovanou homo logem nebo orto logem, resp. je možno modifikovat další aminokyseliny, které se mohou podílet jak na vlastním ?o přenosu fosfátu, tak na potenciálních interakcích s dalšími, např. regulačními proteiny nebo aminokyseliny s regulační funkcí. Tyto aminokyseliny je nutno identifikovat obecně známými metodami, zejména srovnáváním aminokyselinové sekvence homologu nebo ortologu s aminokyselinovými sekvencemi podobných proteinů a experimentálně. Výsledný konstrukt je vložen do binárního vektoru a výše popsanými a obecně známými metodami jsou připraveny stabilní transformantní linie příslušného rostlinného druhu, exprimující modifikovanou alelu homologu nebo ortologu. Následuje selekce několika nezávislých linií primárních transformantu na základě přítomnosti selekčního markéru, který je součástí vloženého konstruktu, identifikace homozygolní linie v jejich potomstvu a analýza jejich fenotypu, vše pomocí obecně známých metod molekulární biologie rostlin. Pro analýzu fenotypu vývoje vaskulárních pletiv je možno použít specifického barvení, např. směsí oranže GG a anilinové modři na ručně připravených řezech nebo morťologieké a histologické analýzy na tenkých řezech připravených pomocí obecně známých metod.

Cytokininové signální dráhy j sou mezi rostlinami poměrně konzervované a lze předpokládat, že

4^ tvorbu cévních svazků u ostatních rostlinných druhů budou řídit podobné (homologní) geny jako v případě modelové rostliny A. thaliana. Jako modelové rostliny se v případě výzkumu hospodářské využitelnosti v produkci dřeva používají zejména topol (Popidas trichocarpa) a bříza (Benda sp.}. V případě topolu, jehož genom je v současnosti již. znám, byly identifikovány homo- 5 CZ 300145 Bft logy genu CKII, podílející se na osmoregulaci (Chefdor etal., FEBS Lett 580, 77-81 (2006)).

Naše výsledky vyhledávání homologní ch sekvencí ukazují, žc se v genomu topolu vyskytují geny homologní genu CKH (vlastní nepublikované výsledky). Ilomology genu CKÍI a dalších rcccptorových histidinkináz byly identifikovány již v celé řadě dalších, hospodářsky velice význam5 ných druhů (např, rýže, kukuřice, pšenice).

Vynález je dále osvětlen na následujících příkladech, aniž je jimi jakkoliv omezen.

Přehled obrázků na výkresech io Obr. 1 znázorňuje analýzu produkce biomasy v transgenních liniích nesoucích konstrukt pro snížení exprese CKI! podle příkladu 3. DM SOI 0,0001 %; DMS02=0,001 % a DMS03=0,01 % (vždy v/v) odpovídá rostoucí koncentraci DMSO (dimethylsulfoxid) v kultivačním médiu.

Obr. 2 ukazuje porovnání několika nezávislých transgenních linií se sníženou expresí CK11 (linie

CJH4T3) s mutanty v genech homologních kCA7/ a rostlin s nadměrnou expresí genu pro CYTOKININOXIDAZUIDEEIYDROGENAZU3, vedoucí ke snížené hladině endogenních cytokininu (35S::AtCKX3) s rostlinami standardního typu (wt Col-0). Jsou uvedeny průměry rozet a počet listů v rozetě během růstu rostlin (A, 8 týdnů; B, 10 týdnů; C, 12 týdnů a D, 14 týdnů staré rostliny kultivované za podmínek krátkého dne).

Obr. 3 ukazuje lěnotypovou analýzu podle příkladu 3: Rychlejší vývoj cévních svazků a zvýšené ukládání celulózy během sekundárního tloustnutí u A. thaliana následkem represe genové aktivity CKIL Cévní svazky v bočních větvích květenství standardního typu (a-d), 35S::CK/i rostlin (transgenní rostliny nesoucí konstrukt 35S::CKli2::pA, způsobující umlčení genu CA//, linie

CJH4 I 3, 5-3, [e—h]), u dvojnásobných mutantů v genech homologních genu CKII, ahk2 ahk3, (i-I) a ahk2 ahk4 (q-t) a u transgenní linie s nadměrnou expresí genu pro CYTOKININOXIDÁZCIDEHYDROGENÁZU3 (35S::AtCKX3) vedoucí ke snížené hladině endogenních eytokininů (m-p). Ruční řezy byly barveny směsí anilinové modři a oranže GG a pozorovány pomocí DIC optiky (a, c, e, g, i, k, m, o, q, s) nebo fluorescence (b, d, f, h, j, 1, n, p, r, t), s použitím triple filtru (U-M61000, DAPI/FITC/TRIIC triple filter block, Olympus), if, vlákna interfaseikulámích oblouků; mx, metaxylém; p, floém; px, protoxylém. Měřítko 100 pm (a, b, e, f, i, j, m, n, q, r) a 50 pm (c, d, g, h, k, I, o, p, s, t). Šipkami jsou označené oblasti vláken interfasckulárních oblouků, kótovaeími šipkami pak oblast metaxylému.

Obr. 4 znázorňuje kvantifikaci a porovnání tloušťky vrstvy lign i Okovaných buněk vláken interfaseikulámích oblouku u dvou nezávislých transgenních linií se sníženou expresí CKÍI, 35S::CKlli. 15a 5-3 (zkrácené označení linií CJH4T3. 1 5 a CJH4T3, 5-3), u dvojnásobných mutantů atik2 ahk4, ahk3 M4 a ahk2 ahk3 a v transgenní linii s nadměrnou expresí genu AtCKX3 (35S::AtCKX3) pro CYTOKININOXIDÁZU/DFI IYDROGF.NÁZU3 se sníženou to endogenní hladinou eytokininů v porovnání slinil standardního typu wt <?ol—0. Uvedeny jsou rozměry v pm.

Obr. 5 znázorňuje analýzu vlivu CKII na přenos eytokininového signálu v protoplasteeh A. thaliana podle příkladu 5.

Obr. 6 ukazuje lěnotypovou analýzu transgenních linií se zvýšenou expresí standardní formy genu CKÍI a dominantně negativního mutanta CKII^H4(hQ, A. B. Ektopieká exprese CKÍI vede ke sterilitě, zvýšené tvorbě trichornů (A) a ztloustlého stonku květenství (B). C. Změny v architektuře cévních svazků v rostlinách se zvýšenou expresí CKII (transgenní linie 35S::CKII). Příčné so řezy (a, b, d a e) a podélné řezy (c a f) stonku květenství u rostlin standardního typu (a-c) a transgenních linií 35S/CKH (d 1). Šipky ukazují tvorbu ektopických pletiv, které se podobají cévním svazkům. D, E. Ektopieká a nadměrná exprese CA// vede k tvorbě nadbytečných vegetativních pletiv z laterálních meristémů. Nodální struktura standardního typu a transgenních

- 6 CZ 300145 B6 linií 35S::CKH (D), příčné a podélné řezy z rostlin standardního typu (E.a) a transgenních linií

35S::CKI1 (E.b). Šipka ukazuje na ektopický úžlabní pupen vytvořený u transgenních linií

35S::CKH. Měřítko 100 μηι. F. Ektopická nadměrná exprese CKll vede k poruchám normálního vývoje cévních svazku u A. thalianu. Příčné řezy stonku květenství transgenních linií s nad5 měrnou expresí čvč//¹¹⁴^ (35S::CK.I1^H40?0, a, b a c), standardního typu (d) a dvojitého mutanta ahk2 ahk3 (e). Měřítko 100 pm, (f) Expresní analýza transgenních linií 35S\:CKII^lW'. Celkový protein z 6 týdnů starých transgenních rostlin byl analyzován pomocí imunoblotování (westernového přenosu) s použitím protilátek proti HA epitopu a aktinu.

Obr. 7 znázorňuje sekvenci rekombinantní DNA 35S::CKIi2::pA (sekvence 7). i o Přehled sekvencí

Sekvence 1 - genomová sekvence CKH Sekvence 2 ~ aminokyselinová sekvence CKll Sekvence 3 - sekvence cDNA CKll

Sekvence 4 - sekvence CKlp2 (ěást sekvence cDNA CKH)

Sekvence 5 - sekvence uidA Sekvence 6 sekvence GUSp (část uidA)

Sekvence 7 - sekvence rekombinantní DNA 35S::CK/i2::pA

Příklady provedení vynálezu

2o Připravili jsme několik nezávislých transgenních linií A. lhaliana, Col-0, nesoucích rekombinantní DNA pro represi genové aktivity genu CKH mechanismem RNA interference.

Příklad 1

Příprava konstruktu pro RNA interferenci

Pomocí PCR jsme ampliťikovali oblast cDNA genu CKH ohraničenou sekvencemi primerů

CKIp2_up a CKlp2 down, kterou jsme nazvali CKlp2. Obdobně pomocí primerů Bgus a Hgus jsme ampliťikovali část kódující sekvence genu uidA (sekvence 5), kterou jsme označili jako GUSp (sekvence 6). Použité primery mají kromě nukleotidů odvozených od sekvence CKH, resp, uidA, vložená místa, rozpoznávaná specifickými restrikčními endonukleázami, viz sekvence jednotlivých primerů, podtržená jsou vložená místa (nespecifická k sekvenci templátu, použitého ?o pro amplifikaci) a barevně jsou označená místa rozpoznávaná restrikčními endonukleázami. V případě primerů CKlp2 up jsou to BamHI a HindlII, v případě příměru CKip2 down místa pro Xbal a Sall, primer Hgus obsahuje místo pro 1 lindlll, primer Bgus obsahuje rozpoznávací sekvenci pro BamHI.

Sekvence použitých primerů:

CKIp2 up;

5' - TAT A_w GC AGT TGT GCT TTT GGT GAT T - 3'

CKlp2jJown:

5' - CAC ,T _ ' TG ATG CGA TTA TCC TCT TAC C - 3'

Bgus.

5' - CAG CCG ATC GCT CTA CAC CAC GCC GAA CAC C - 3'

Hgus b' - TTC C TT CTC TGC CGT TTC CAA ATC G - 3' ΐΛ/vr oown

- 7 (/. 300145 B6

Amplifikace pomocí takto upravených primerů a cDNA genu CK11, resp, DNA genu uidA jako teniplátu vedla k produkci DNA, která obsahovala zmíněná restrikční místa. Pomocí vnesených míst pro restrikční endonukleázy jsme klonovali všechny tyto fragmenty najednou, a to následujícím způsobem: DNA fragment CKIp2 (sekvence 4) jsme rozdělili na poloviny, jednu polovinu jsme štěpili pomocí BamHI a Xbal (tedy enzymu, rozpoznávajících vnější restrikční místa), druhou pak pomocí Hindlll a Sáli (tedy enzymů, rozpoznávajících vnitřní restrikční místa). DNA získanou amplifikaci pomocí primerů Hgus a Bgus jsme štěpili pomocí Hindlll a BamHI. Po purifikaci pomocí QlAquick PCR Purification Kit (Qiagen) jsme smíchali všechny tři různé fragmenty v ekvimolámím množství a přidali vektor pBluescript (Stratagene), štěpený enzymy io Xbal a Sáli a defosfo rylo váný pomocí teplem inaktivovatelné alkalické fosfatázy (Alkaline Phosphatasc, shrimp, Roche, dle přiloženého návodu) tak, aby výsledný molární poměr mezi vkládanými fragmenty a plazmidovou DNA byl mezi 1:1 až 3:1. Následovala ligace pomocí T4 DNA ligázy (T4 DNA Ligase, Roche), 12 h při 16 °C, transformace do Escherichia coli, kmen DHlOp, a kontrolní štěpení DNA (pomocí Sáli), vyizolované z pozitivně selektovaných bakteriálních kolonií na selekčním médiu (ampicilin). Všechny uvedené postupy byly provedeny buď podle návodů udaných dodavatelem jednotlivých chemikálií a enzymu, nebo podle obecně známých metod molekulární biologie (Ausubel el al., Current protocois in molecular biology. John Wiley and Sons, New York (2003)). Výsledný konstrukt byl pak označen jako pBsc::CKlp2i. V našem případě jsme dosáhli více než 50% efektivnosti (13 pozitivních vzorků

2o z celkových 20 testovaných DNA izolátú z pozitivně selektovaných bakteriálních klonů), což je nadprůměrná hodnota a ukazuje na relativně vysokou efektivitu tohoto způsobu přípravy rekombinantní DNA. S podobným výsledkem byly klonovány i jiné úseky genu CK11 pro účely jeho umlčení pomocí RNA interference, což ukazuje na univerzalitu tohoto postupu i pro jiné sekvence. Následovala kontrola vybraných klonů sekvencováním, která prokázala úspěšné naklono25 vání všech tří fragmentů (CKIp2 v proti směrné (antisense) orientaci, uidA fragment a CKlp2 v po směrné (sense) orientaci), které jsme dohromady označili jako CKIp2i. Výše popsaný postup je možno použít univerzálně pro přípravu konstruktů pro umlčování genů pomocí RNA interference s tím, Že je třeba zvolit takové úseky cDNA umlčovaného genu, které neobsahují rozpoznávací místo pro restrikční enzymy BamHI, Hindlll, Xbal a Sall. Dále je třeba navrhnout prime3o ry obsahující cca 18 21 nukleotidů specifických pro vybraný úsek cDNA a na jejich 5'konec přidat sekvenci RNAiup na „leťt (forward) primer, resp. RNAidown na „right (reverse)“ primer (viz část sekvence primerů CKlp2 up a CKIp2_down zvýrazněná podtržením). V případě, že se jako spojovací sekvence nedá použít sekvence genu uidA, je možno obdobným způsobem (vložením sekvencí LOOP up a LOOP_down, obsahujícím místa rozpoznávaná restrikčními enzymy BamHI a Hindlll) modifikovat primery, obsahující specifickou sekvenci vybrané DNA, která ovšem nesmí obsahovat rozpoznávací místa pro restrikční enzymy BamHI a Hindlll.

Příklad 2

Příprava transgenních linií

Pomocí štěpení restrikčními enzymy BamHI a Hindlll. zatupením konců pomocí Klenowova enzymu (Roche) a následnou religací pomocí T4 DNA polymerázy (všechny enzymy Roche) jsme upravili binární vektor pVKHJáXf/CŠS/xJ (Reintantz etal.. Plant Cell /3. 351-367 (2001)). Výsledný vektor, který jsme označili pVKH-.-.(35S-.:pA), obsahoval 35S expresní kazetu (CaMV 35S RNA promotor a terminátor transkripce). Následně jsme z vektoru pBsc:;CKIp2i vyštěpili konstrukt CKlp2i pomocí Sáli a klonovali jej do binárního vektoru pl^rKH\:(355::pA), štěpeného Sall. Výsledný konstrukt jsme pak označili jako ρΙ'ΚΠ;Α355:Ε’ΚΙΐ2'.:ρΑ) (sekvence 7), zkráceně pJH_006. Konstrukt jsme ověřili sekvencováním (viz sekvence 7) a transformovali jsme jej elektroporací do Agrobacterium tumefíwiens, kmen GV3013:.pMP90 (Koncz and Schell. Mol Gen

Genet 204, 383-396 (1986)). Pomocí infiltrace květenství standardního typu A. thaliana, Col fi (Clough a Bent, Plant J /6, 735- 743 (1998)) a následnou selekcí na médiu s hygromyeinem (iti vitro na MS médiu, bez saeharózy, 15 mg/l hygromyein. 400 mg/I tiearciIlin/klax ulanát draselný,

15:1) jsme získali primární transformanty (TI generace, linie označené jako CJH4T1, 1 až

- 8 CZ 31)0145 B6

CJH4TI, 58), / jejichž potomstva jsme pak za základě segregačních poměru (frekvence rezistence, resp. citlivosti k selekčnímu markéru hygromycinu) vybrali předpokládané jednozásahové linie. V potomstvu předpokládaných jednozásahových linií jsme identifikovali linie homozygotní pro daný trans gen (T2 generace, linie označené jako CJH4T2). Semena z těchto linií pak byla sebrána a použita pro další analýzy (T3 generace, linie označené jako CJH4T3, 1 až CJH4T3, 16).

Příklad 3

IU

Fenotypová analýza linií se sníženou expresí CK11

U několika nezávislých homozygotních linií jsme zjistili přítomnost zajímavého ťenotypového projevu. Vybrané transgenní linie (viz Obr. 1 a Obr. 2) jsme kultivovali in vitro ve čtvercových

Petriho miskách (12x12 cm) 21 dní na MS médiu obohaceném 1 % sacharózou a zpevněném 1,5% fytagelem, obsahujícím různou koncentraci dimethylsulfoxidu (DMSO), ve vertikální poloze v kultivačních komorách s regulovatelnými růstovými podmínkami (Pere i val Scientific, Ltd., relativní vzdušná vlhkost 70%, podmínky krátkého dne [světlo 8 hodin, tma 16 hodin], teplota při světle fázi 21 °C, teplota při temné fázi 19 °C). DMS01“0,0001%; DMS02-0,001% a

DMSO3-0,O1% (vždy v/v) odpovídá rostoucí koncentraci DMSO v kultivačním médiu. Po sklizni byly odděleny kořeny a nadzemní část. Hmotnost vytvořené biomasy kořenů a nadzemní části byla změřena vážením. Zjistili jsme, že nejméně u 4 zc 6 testovaných linií dochází ve srovnání s liniemi standardního typu ke zvýšené tvorbě biomasy a to jak v kořeni, tak v nadzemní části rostliny (prýtu, Obr. 1). Při kultivaci v půdě za podmínek krátkého dne rostly transgenní linie v porovnání s rostlinami standardního typu rychleji a tvořily větší vegetativní část rostliny (tzv. listovou rozetu, Obr. 2).

Dále jsme provedli podrobnější analýzu fenotypu ve vývoji vaskulámích pletiv. Ručně jsme připravili řezy z živých rostlin (bez fixace) a provedli barvení pomocí směsi anilinové modři a

5o oranže GG. Řezy byly připraveny žiletkou z bazálních nodů latcrálních větví květenství, vyrůstajících z bazálního nodu hlavního stonku květenství A. thalianu a okamžitě byly 15 minut barveny v barvícím roztoku, který obsahoval 0,25% anilinovou modř a 1 % oranž GG, 10 až 15 min. odbarveny ve vodě a montovány do 50% glycerolu. Barvicí roztok byl připraven následujícím způsobem: Ve 100 ml vody bylo rozpuštěno 0,25 g ve vodě rozpustné anilinové modři a 1 g oranži GG. Tato směs byla uvedena do varu a po vychlazení bylo přidáno 5 ml kyseliny octové a směs byla přefiltrována (Braune, Leman, faubert, Pílanzenanatoniisches Praktikum 11, str. 401, VLB Gustav Fischer Verlag, Jena (1982)). Barvení touto metodou umožňuje rozlišil mezi zdřevnatčlými buněčnými stěnami, které se barví spolu s cytoplazmou žlutě až oranžově, a živými, tedy ještě ne zcela zdřevnatělými buněčnými stěnami, které se barví modře. Při použití tluores4u cenee je pak možno identifikovat zdřevnatělé a ligni 1 ikované buňky. Fato metoda také umožňuje barevně odlišit jednotlivé buněčné a funkční složky vaskulámích pletiv u rostlin: Floém se barví modře, inctaxylém oranžově a protoxylém tmavě modře až fialově (viz Obr. 3). Řezy byly ještě týž den pozorovány a dokumentace byla provedena pomocí motorizovaného mikroskopu (BX 61, Olympus) vybaveného digitální kamerou (DP50. Olympus) a řízeného speciálním programem (AnalySIS, Soft Imaging System, GmbH). Na řezech jsme zjistili, že u transgenních linií dochází k odchylkám ve vývoji vaskulámích (vodivých, cévních) pletiv stonku květenství. Zjistili jsme, žc u transgenních linií s předpokládanou sníženou expresí genu CKU dochází k tvorbě širších vláken interfascikulárních oblouků mezi cévními svazky (Obr. 3). Šířka oblouků byla měřena a vyhodnocena pomocí speciálního programu (AnalySIS, Soft Imaging System, GmbH) na inikro50 fotografiích získaných pomocí pozorování fluorescence u výše zmíněných řezů živých rostlin, barvených směsí oranže GG a anilinové modře, viz Obr. 3. Na Obr. 3 je viděl fenotyp cévních svazků v bočních větvích květenství standardního typu (a d), 35S..CKH rostlin (transgenní rostliny nesoucí konstrukt způsobující umlčení genu CKU 35S-.:CKfi2::pA, linie CJI14T3. 5-3 [e-h]) a u mutanta v genech homologních genu CKH. genech AHK2, ΑΠΚ3 a AHK4\ ahk2 ahk3, (i 4) a ahk2 ohk4 (q t). Na obrázcích (m-p) je fenotyp transgenní linie s nadměrnou expresí genu pro

- 9CZ 300145 B6

CYTOK1NINOXIDÁZU/DEHYDROGENÁZU3 (35S::AtCKX3) vedoucí ke snížené hladině endogenních eytokininú. Ruční řezy byly barveny směsí anilinové modři a oranže GG a pozorovány pomocí DIC¹ optiky (a, c, e, g, i. k, rn. o, q, s). Eloém se barví modře, metaxylém oranžově a protoxylém tmavě modře až fialově. Buňky vláken interfascikulárních oblouku {if) byly pozoro5 vany na týchž řezech s použitím fluorescence a s pomocí triple filtru (U M61000, DAPI/FITC/TRITC triple filter block, Olympus; [b, d, f, h, j, 1, n, p, r, t]). Preparáty byly získány z rostlin starých cca 16 týdnů, 7 týdnů po přenesení do podmínek dlouhého dne a cca 5 týdnů po indukci kvetení. Při porovnání obrázků a-d s obrázky e—h je vidět u linií se sníženou expresí CKH zvýšené ukládání celulózy zejména v oblasti metaxylému (intenzivnější zbarvení oranží κι GG a ztloustlé buněčné stěny, kóto vací šipka). V liniích se sníženou aktivitou CK11 a v dvojnásobném mutantovi M2 ahk4 je znatelná radiální expanze vrstvy buněk interfascikulárních oblouků (ilj. Tento rozdíl je statisticky významný (P<0.05, viz Obr.4). Částečně ligni fikované buňky na vnějším okraji centrálního jádra dřeně, kótovací šipky na obrázcích d, h, 1 a t) nebyly do měření zahrnuty. U linií 35S::CKÍi a ahk2 ahk4 mutantů bylo pozorováno zvýšené ukládání celulózy během sekundárního tloustnutí v podobě intenzivního barvení oranží GG (porovnej obrázky c, g a s, kótovací šipka ukazuje na stěny buněk v xylému, šipka pak na stěny buněk v interfascikulárních obloucích; šipky ukazující na tyto rozdíly v obrazcích a, e, i, m a q jsou ve stejných pozicích jako v odpovídajících obrázcích z fluorescenčního mikroskopu b, f, j, n a r). Zvýšená intenzita barvení pomocí oranže GG v if oblasti u 35S::CKHi linií (e a g) ukazuje na

2(i zvýšenou depozici celulózy a dřevnatění oproti liniím standardního typu, které jsou v těchto oblastech zbarvené modře (a a c). if, vlákna interfascikulárních oblouků; mx, metaxylém; p, tloém; px, protoxylém. Měřítko 100 pm (a, b, e, f, i, j, m, n, q, r) a 50 pm (e, d, g, h, k, I, o, p, s, t).

Výsledky hislochcmického barvení ukazují, že u těchto linií dochází v důsledku snížené exprese genu CKH ke zvýšenému ukládání celulózy a dřevnatění během tzv. sekundárního tloustnutí stonku, a to jak v xylému, tak v interfascikulárních obloucích. Znamená to tedy, žc CKI 1 je negativním regulátorem uvedených procesů (tedy především vývoje a diferenciace cévních svazků, tvorby (lignifikaee) vláken interfascikulárních oblouků a sekundárního tloustnutí). Tohoto faktu je možno potenciálně využít v biotechnologických aplikacích spojených s produkcí biomasy.

Příklad 4

Fenotypu vá analýza mutantů v genech homologních s CKI 1

Podobným způsobem jako v případě linií se sníženou expresí CKll jsme provedli analýzu fenotypu vaskulárních pletiv u linií s inzerčními mutacemi v genech homologních genu CKll, AHK2, AHK3 a AHK4. Výsledky fenotypových analýz u dvojnásobných mutantů v genech homologních genu CKll, genech AHK2, AHK3 a AHK4, potvrdily účast homologů genu CKll vc vývoji vas40 kulárních pletiv u A. ihaliana. V případě dvojnásobných mutantů ahk2, uhk3 (dvojnásobných homozygotů pro danou mutaci, Nishimura et al., Plant Cell 16, 1365 1377 (2004)) jsme pomocí analýzy fenotypu vaskulárních pletiv stonku květenství (viz výše) identifikovali fenotyp ve vaskulárních pletivech opačný než v případě linií se sníženou expresí CKH, tedy v porovnání se standardním typem opožděnou a neúplnou diferenciaci proloxylému i metaxylému, tvorbu užších vláken interfascikulárních oblouků mezí cévními svazky a menší ukládání celulózy jak v xylému, tak v oblasti vláken interfascikulárních oblouků; porovnej intenzitu barvení oranží GG v oblasti interfascikulárních oblouků na Obr. 3: U dvojnásobných mutantů M2 M3 (i a k) sc oblast vláken interíáseikulárníeh oblouků (šipky) v porovnání s linií standardního typu (a a c) a zejména 35S::CK/i linií (e a g) barví více modře. Podobný fenotyp jsme také zaznamenali v případě trans5(i geimich linií s nadměrnou expresí genu pro CYTOKININOXIDÁZU/DEHYDROGENÁZU3 AtCKX3 (Obr. 3. in o). Jak jsme zjistili, dochází v květenství těchto linií kc snížení endogenní hladiny eytokininú zeatínového typu až na úroveň cca 1 % hladiny v liniích standardního typu (vlastní nepublikované výsledky). Naopak v případě dvojnásobných mutantů v genech ahk3, M4 (Nishimura cl al.. Plant Cell /6, 1365 -1377 (2004)) a zejména M2, uhk4 (Higuchi etal.,

Proč Nati Acad Sci USA /0/, 8 821-8 826 (2004)) jsme identifikovali fenotyp podobný fenotypu

- 10CZ 3(Η)Ϊ45 B6 u transgenních linií se sníženou expresí CKÍ1, kdy v porovnání s liniemi standardního typu dochází k tvorbě širších vláken interfascikulámíeh oblouků mezi cévními svazky (Obr. 3 a 4) a zvýšenému ukládání celulózy jak v oblasti vláken interfascikulámíeh oblouků, lak v případě xylému (porovnej Obr. 3, a, c vs. q, s). Tyto výsledky tedy ukázaly, že pozorované efekty jsou genově specifické pro danou cytokininovou signální dráhu a že je možno pro účel modulace vývoje vaskulárníeh pletiv nadzemních částí u rostlin využít i regulace exprese genů, resp. modifikace aktivity genových produktů genů homologních nebo ortologních genu CKIl.

io Příklad 5

Příprava rekombinantní DNA kódující ('ΚΙ 1 se změněnou aktivitou pomocí metod místně řízené mutageneze i? Připravili jsme rekombinantní DNA, kódující ('Kil se změněnou aktivitou. Změna aktivity CKI 1 byla testována pomocí exprese v rostlinných protoplastech a pomocí genetických a biochemických analýz. Následně jsme připravili transgenní linie, exprimující CKI! se změněnou aktivitou. Fcnotypová analýza těchto transgenních linií prokázala změny v tvorbě vaskulárníeh pletiv. Tyto výsledky ukázaly, že pomocí modulace aktivity CKI 1 a pravděpodobně i jeho ortologů lze ovliv2o nit tvorbu vaskulárníeh pletiv u rostlin.

Cíenomová DNA pro CKI1 byla atnplifikována pomocí primerů CKI 1 gen fwd a CKI 1 gen re v.

CKIlgen_fwd:

ICC ATG ATG GTG AAA GTT ACA AAG C-3'

CKIlgenrev:

’í!: 1

5'-AGC CCC GTG ACG TTT GCT TTC GAT TTC-3'

Výsledná DNA (CKI/gen) byla štěpena pomocí BamHI a Stul a klonována do vektoru pCB302ES, který byl získán úpravou vektoru pCB3O2 2 (Xiang etal., Plant Mol Biol 40, 711 717 (1999)) a to tak. že kódující oblast CK11 se dostala pod kontrolu promotoru 35SC4PPDK (Hwang a Shecn, Nátuře 413, 383 389 (2001)). Výsledný vektor byl označen jako

2o pCB302ES::(35S::C'KI 1 gen). Pomocí soupravy pro místně řízenou mutagenezi (QuiekChange site directed mutagenesis, Stratagene) a primerů His405_CAA byla sekvence CKI 1 gen modifikována tak, že vzniklá DNA kódovala mutantu CKll^H4tbQ se záměnou histidinu v poloze 405 (nukleotidová sekvence ('AC) na glutamin (CAA). Vzniklý konstrukt byl označen jako pCB302ES::(35S::CKHgenH405Q).

His405_CAA:

5'-GCA AAT GCT AGC GAT ATT AGA GGT GCC-3'

Podobně byla s využitím primerů Asp 1050 AAC připravena genomové DNA kódující mutanta ^^jlDio.Mix _{se 7}á_ni£_nou ky_seii_ny asparagové v poloze 1050 (CAC) na asparagin (AAC) a výs40 ledný konstrukt byl označen jako pCB302ES::(35S::CKf/genD1050Q).

A$pl050_AAC

5'-GAC TAC ATA TTC ATG

TGC CAA ATG CCA G-3'

CY JUUI45 B6

Tato DNA pak byla použita pro transformaci protoplastů A. thaliana a byla analyzována aktivita kódovaných proteinů ve smyslu jejich vlivu na přenos signálu v cytokinovc signální dráze popsanými metodami (Hwang a Sheen, Nátuře 413, 383-389 (2001)). Přenos signálu v cytokininové signální dráze je v protoplastech A. thaliana kvantifikován pomocí měření aktivity lueiferázy, jejíž exprese je kontrolována cytokininem indukovatclným pro motorem genu ARR6. Jako kontrola konstitutivní (na cytokininu nezávislé) aktivity CKI1 byly pro transformaci kromě protoplastů izolovaných ze standardní linie A. thaliana, Col-0 (wl) použity i protoplasty izolované z transgenní linie A. thaliana s nadměrnou expresí genu AtCKX2, kódujícího CYTOKININOXIDÁZU/DRHYDROGENÁZU2 (35S;:CKX2 9). U těchto transgenních linií io došlo v důsledku nadměrné exprese AK3KX2 ke snížení endogenní hladiny aktivních forem cytokininu (isopentenyladeninu a zealinu) na přibližně 45 % oproti standardnímu typu (Werner et al., Plant Gel 1 /5, 2532 -2550 (2003)). Touto analýzou bylo zjištěno, že v případě nadměrné exprese standardní alely CKll dochází ke konstitutivní, tedy na přítomnosti cytokininu nezávislé, aktivaci cytokininové signální dráhy A. thaliana. Naopak v případě nadměrné exprese genů pro mutantní i? formy CKll, CKIl^ll4tbQ a CKI]^I),050\ dochází k dominantně negativnímu efektu na přenos signálu v cytokininové signální dráze A. thaliana (viz Obr. 5).

DNA pCB302ES::CKIIgen a pCB3B2ES.:CKllgenH405Q byla transformována do Agrobacterium tumefaciens, kmen GV3101, a pomocí infiltrace květenství (Clough a Bent, Plant J 16, 7352i) 743 (1998)) byly získány transgenní rostliny, produkující ve zvýšeném množství CKll, resp.

CKI l^{1 N,,5Q} ve formě rekombinantních proteinů (luzní protein, obsahující kromě aminokyselinové sekvence CKll. resp. CKIl^4(btJ také sekvenci dvou kopií tzv. epitopu HA (hemaglutininu), umožňující detekci fúzního proteinu pomocí protilátek proti epitopu HA, viz Obr. 6Flj. Byly analyzovány tři nezávislé transgenní linie nesoucí konstrukt 35S::CKf Igen, označené jako 2-2,

2-13, 1-13 a čtyři nezávislé transgenní linie, nesoucí konstrukt 35S::CKllgenll405Q, označené jako 2, 6, 7 a 9.

Analýzou fenotypu výše uvedených transgenních linii bylo zjištěno, že došlo ke změnám vývoje vaskulárních pletiv u transgenních linií, a to jak u linií s nadměrnou (zvýšenou) expresí stan?o dardní alely CKll (linie 2-2. 2-13, 1 13 a 4), tak v případě linií s nadměrnou expresí mutantní alely CKri^,wfí> (linie 2, 6. 7 a 9).

V případě linií se zvýšenou expresí standardní alely CKll došlo (kromě dalších fcnolypových projevů, jako např. různé míry sterility transgenních rostlin nebo zkrácení šešulí, zobrazených na

Obr. 6), také k tvorbě ektopiekýeh cévních svazků a poruchám v jejich diferenciaci. V případě linií se zvýšenou expresí CKll jsme identifikovali oproti liniím standardního typu absenci nebo podstatné snížení lignifikace. Na příčných řezech stonků transgenních linií byly identifikovatelné depozity celulózy v rozích buněk, což je stadium, které předchází ligniílkaci těchto pletiv u A. thaliana (Altamura et al., New Phytologist 151, 381-389 (2001)). Stonky květenství transgen40 nich linií se zvýšenou expresí CKll také obsahovaly oproti standardnímu typu zvýšené množství buněk (Obr. 6).

Obr, 6 ukazuje výsledky fenoly po vé analýzy transgenních linií se zvýšenou expresí standardní formy genu CKll a dominantně negativního mutanta CKI l¹¹⁴¹¹'^, A, B. Ektopická exprese CKll vede ke sterilitě, zvýšené tvorbě trichomů (A) a ztloustlého stonku květenství (B). C. Změny v architektuře cévních svazků v rostlinách se zvýšenou expresí CKll (transgenní linie 35S::CKll). Příčné řezy (a, b, d a e) a podélné řezy (c a tj stonku květenství u rostlin standardního typu (a-c) a transgenních linií 35S::CKll (d-tj. Šipky ukazují tvorbu ektopiekýeh pletiv, které se podobají cévním svazkům. D, E. Ektopická a nadměrná exprese CKll vede k tvorbě nad byso tečných vegetativních pletiv z laterálních meristémú. Nodální struktura standardního typu a transgenních linií 35S::CK11 (D), příčné a podélné řezy z rostlin standardního typu (E.a) a transgenníeh linií 35S::CKI1 (E.b). Šipka ukazuje na ektopieký úžiabní pupen vytvořený u transgennich linií 35S::CKll. Měřítko 100 pm. F. Ektopická nadměrná exprese CKlf⁴⁴^ vede k poruchám normálního vývoje cévních svazků li A. thaliana. Příčné řezy stonku květenství

5^ transgenních linií 35S..CKI(^ll4l>X (_a-_cy standardního typu (d) a dvojitého mutanta ahk2 ahk3 (e).

Měřítko 100 pm. (f) Expresní analýza transgenních linií 35S::CKI1^IÍ411^. Celkový protein z 6 týdnu starých transgenních rostlin byl analyzován pomocí imunobl oto ván i (westernového přenosu) s použitím protilátek proti HA epitopu a aktinu. Aktin sloužil jako vnitřní kontrola.

V případě linií s nadměrnou expresí mutantní alelv CKIl jsme identifikovali ve vaskulámích pletivech fenotyp do značné míry opačný než v případě nadměrné exprese standardní aíely CKIl. Ve stoncích květenství jsme oproti liniím standardního typu identifikovali menší množství buněčných vrstev, zejména v případě buněk kambia a nepravidelnou velikost buněk jak v xylému, tak ve flocmu (viz Obr. 6). Podobný fenotyp byl také identifikován u dvojnásobných io mutantů M2 ahk3.

Tyto výsledky tedy ukazují, že jak kvantitativní změna exprese standardní alely CKIl (tedy jak snížení tak zvýšení), tak exprese mutantní alely, kódující CKIl se změnou aktivity, vedou ke změně fenotypu vaskulárních pletiv. Tohoto faktu je možno potenciálně využít k regulaci pro15 dukěních vlastností rostlin s ekonomickým efektem. Zároveň výsledky analýzy linií s mutacemi v genech homologních genu CKIl ukázaly, že je možné využít metod genového inženýrství k regulaci vývoje vodivých pletiv u rostlin prostřednictvím genových manipulací u genů z rodiny reeeptorových histidinkináz, tedy homologů a ortologů CKIL

21)

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález, genetické manipulace aktivity CKli a jeho homologů nebo ortologů, umožňuje cílené získání rostlin se zvýšenou produkcí biomasy. Další využití je možné např. v bio25 technologických aplikacích umožňujících dekontaminaci zasažených půd prostřednictvím tzv. iytoremediací. Při vývoji těchto technologií se uvažuje o využití transgenních rostlin produkujících enzymy, které umožňují dekontaminaci rozkladem polutantů, např. ropných produktů u jimi zasažených pud a zvýšená produkce biomasy u takových rostlin může zvýšit efektivitu jejich využití, Zvýšené ukládání celulózy, pozorované u transgenních linií, je vhodné pro využití v papírenském a dřevozpracujícím průmyslu, kde by mohlo usnadnit a především zlevnit časově náročné získávání dřevní hmoty. Zvýšení biomasy v některých druzích rostlin bude výhodné i pro potravinářský a farmaceutický průmysl. Důležitou oblastí využitelnosti je produkce tzv. energetických plodin, např. šfovíku Uteuša, kde může podobná genetická modifikace zlepšit energetickou bilanci těchto rostlin. Potenciálně možné je také využití ve šlechtění rostlin, kdy regulace tvorby ligniUkovaných pletiva dřevnatění ve vaskulárních pletivech a vláknech interfascikulárníeh oblouků muže být potenciálně využito při šlechtění odrůd se s níženou poléhavostí (např. o obilovin nebo řepky olejky).

sekvencePatentln 03072007.ST25 SEQUENCE LISTINO < 11 ()> Masarykova univerzita v Brně <120> Způsob regulace tvorby biomasy v rostlinách, sekvence DNA a způsob jejich přípravy <13()> plOS3cz()O <16O>7 < 170> Patentin version 3.3 <2I()> 1

i) <211> 9490 <212> DNA <213> Arabidopsis <400> 1

gaggaggcac	aaaatgacga	atatacaaaa	tgatcttaaa	cagctaaact	atattggaca	60
ttttttcgat	ctcagatata	aaagatttca	ttcaatataa	tacttggata	aatactctta	120
ttatttttct	ttagtttatt	aaaaaaaacc	tctaataaat	acgagtttaa	gtccacaaaa	180
tcgcttagac	taaaatacac	catataattt	caaacgataa	agtttacaaa	agtaatatcc	240
aagtatctca	tagtcaacat	atatatagta	ataattagtt	gacgtataag	aaaataaaaa	300
taaataaatt	agtatcttat	tttgggtggt	gctgactggt	gactggtgac	tgcagaatgc	360
tcggcaaatg	gaaccatatc	ccaagacatg	ggttttagat	agaacaaaat	aagtgtccga	420
aggaatgata	ttaaaagtca	aatagaataa	ttataaatat	tgtaattagc	aaataaaaac	480
gtcatgattt	tgttgtttag	tcgaaaccaa	aaaaatatta	acgttgggca	tcaaaacaag	540
catcgagcta	gttgctcaaa	ttcacacaat	ttagacctct	ttgaattttg	aaattgctgg	600
aacttgaaac	taatcaaaaa	aagtcagaga	gacctctgcg	gaaaggcacg	tgttctcgga	660
ttagatttca	cgtgggaatg	agttatccat	gtgctattcc	acacaaaaaa	aatccctaat	720
ttttcaaaca	ctaataatat	taaattctca	gtttcttctt	tttactctgt	tattgtatag	780
ctttttgatc	catacgttaa	gcaatatatg	ccttgtttta	ttcgttttta	ttttattttt	840
tgaaatagat	agttgttgct	tatgaaaacg	aggtagttag	atttgattta	gaattattat	900
aaaaaaatac	attcggactc	tgacgttgaa	tgattatatt	agaatgaaga	catgaattca	960
ccaaacctca	ttcaaaaaaa	gaaaaaaaat	cttaaaccga	atgataattt	gtttcgtcgt	1020
catttaaaat	cgtcatcaat	ttatttttaa	gaaaagaaat	taaaagaaag	catcggaaaa	1080
agagggccag	acaccagctt	ggcaatgctt	tgctgaaaag	ttgtgaataa	tgcaattaaa	1140
aacgaacgaa	aataaataaa	caaatattaa	agaaattcga	atgggaatat	caacaaaatt	1200
atttattttt	tagttatgga	gacaagaatc	gatccaaagg	ttgtactctg	gacttgaaag	1260
taaaaataaa	aagggaatga	caataattgg	gaaaacatgt	gataaaagtc	tgaattcaca	1320
gactttgaca	gtagtttata	gtttcatggg	cttttttttt	tcctctctca	caggacacag	1380
aatcttatct	aataggagca	gccgctaata	tgcactgtgt	ttggcatgtt	acgattagcg	1440
ttttagagaa	ttagagtttg	attgaagtgt	gttttatata	ttgatagtgg	gacattactt	1500

. u CZ 300145 Β6 sekvencePatentin 03072^.,

ataaaaagca	caaggataca	acaatagaga	cagtcacatg	tatatcacat	aagtggatgg	1560
tcctcaatgt	gttgcttgta	ggacatttgt	gagtatgtca	aaaacttatt	tcacatggta	1620
cactcataga	ttagccccac	ttaggagtgt	ctagaaaaag	attgggacta	aagtcttgtt	1680
ggatcgaata	tgattccaaa	cacgttaata	tttccctaaa	acccatttcg	aaaagtatgg	1740
aatgatgaac	acattataaa	tattttggtt	gtgcgaaata	ggggtcaaat	gtaaaggtta	1800
actttgtatt	agttgatgga	tagtaaaagg	tcaaatttag	aagtattggg	ccaaatagaa	1860
aacataatgg	gccaaacaga	ccaaaagaaa	gacaacggtg	aacgggtcag	aacattaaaa	1920
catacatttt	ctcgctacaa	ttaacgctat	caatatattt	ataaaaccat	ttgtcatttc	1980
acttccttaa	etaatcacat	aaatgatttt	tttttgtgtg	tccctacttt	ttttatataa	2040
aatttaaacc	ggaaagttac	attggataaa	gctttaacaa	tcaaaaacgt	gttggatata	2100
tatataagta	acaaatttac	ttcttttaat	aattataata	atattacatt	aaaatataat	2160
aaagcatatg	ttacttttga	agaaaactaa	ttttggatta	aaaatttcac	ttttattata	2220
tttaatatgt	gatctcaaaa	tttataaaag	attatcgtca	aacaagttta	tatcataatt	2280
ttatggtata	tatatttatc	gtgtgaccat	tataatctaa	tctatggtgt	atatggtata	2340
tatgactaaa	ttaccgtatt	tggagaagtg	aaaatgttgc	atcgtcccac	gactcttaga	2400
aaatttgtta	gtcaaatcat	tcttttaatt	aaaaatttag	atgtaagttt	aagtcgtgaa	2460
tttacatcta	aaattttaga	tttaagtggc	gaatttcgca	gccaaactat	tattttacca	2520
cagacatgca	gtgttgaaat	ctaaggtagt	atgtggattt	tttttttggc	agcaaaacgt	2580
aaagttaatt	tatctttata	tatattaaaa	tgtaatttat	ctttttatac	atatatattt	2640
atacacatca	tatcataaga	catacataca	taaatctcta	aatatgtaag	gggtgtcatc	2700
agttttgcct	tctgtttatg	gttcactcga	tttcacatta	attattcact	caaattcaca	2760
aaggttattt	cgttttcatt	agcgcccttt	ctctcgactt	tcttgatgaa	tctttatttc	2820
ttctatgtga	aatctaatta	agactatttt	cgtgttatat	tgatgtttaa	aaatgaaaat	2880
cttttggttt	ttatgtttaa	tcattttcat	gagtattaaa	tgtaatagat	ttaagttaaa	2940
actaatatcc	gaatgcctga	gatattgttt	cctaaaatga	gatgattgtt	tttatttatt	3000
accatgattt	gtttgtacta	agcttccttt	cccctttgca	atacatagga	tataaattca	3060
tacatgttcc	taattttatt	tttgcacttg	agtttatggt	tttctttggt	ggaagatcta	3120
tatgtatcta	tatctatatt	attttactct	tttcttcgtc	gtcatttata	gtatattata	3180
tatatgcaca	cacacacaca	cctatatgta	tagctcaatt	ctagataaaa	tatatagaaa	3240
tggatcttga	gaatcatttt	ttttgtattc	ttttgttatc	aaagggtttc	gactttgctc	3300
cgaggaagaa	gataatatga	aaagagcttt	ttagggttta	tcattctcct	tgactttgca	3360
aaacgtgaaa	tgtaaggcac	tttgatcgtt	gtactttgtt	gctttttata	cgtatcgctt	3420
cctacaataa	gttaacaatg	cttcctcgta	gaattgcaaa	acatttgtgg	accgtgattt	3480
acatgactga	gctcttttca	gtggcttctt	tgcagcagct	tcttccttgg	aggactaatc	3540

= 15.

sekvencepatentln 03072007,ST25

aagacagaaa	tctgttcctc	taaaaacgat	cgccgttcta	ggtaatcttg	ccattcttga	3600
cgagtcttga	tctttagaat	caaatttata	agggatcacg	agatacacgt	attaattatt	3660
attttttttt	tttttgcttt	ttgtggttat	acaagttcac	tcaaatgatg	gtgaaagtta	3720
caaagcttgt	ggcttcacgt	ccaattgtgg	tcttttgcgt	cctggtaatt	ctgctttctt	3780
tcttctaaat	tatacgatga	ttctacattt	ctactcatct	cgttcttgtt	tttcaaatga	3840
tataattatt	gtgtgtatat	cacccattca	tgtatattta	ttgaaaaata	taggcattcc	3900
tggtggttgt	tttcgagtgc	atttggatct	caaattggcg	aacaacaacg	gagaacctag	3960
tcaaagaggt	cgcttcattt	accgaagatc	tccggacaag	tctagtttcg	gagattgaaa	4020
acatcggaaa	atttacatat	gccaagacaa	acttatctac	gatcggttta	gcgagagtta	4080
tagattctta	tatcaccaac	aacgacactg	gttttacaga	gattcaaaca	caggttgtta	4140
aaactaatta	cataaattca	attattctta	gttattatct	taggattagt	ttgagttata	4200
taacattaac	tataatttta	tgttgttgtt	gttgttgtta	ttattgttct	tcagatcgca	4260
ccattgttgt	ttgtagctta	ttcaacgatc	cttcaagtct	cacaagtttc	gtacatcagt	4320
agggacggtc	tcatgttttc	ttacattgca	gaatcaaaca	caagtgtcgc	tgtttttgcc	4380
aattcctcgt	cgaattcaag	tcgtggagac	tacacttggt	acactcaaac	cgtggatcag	4440
ttaactggtc	gtcttaacgg	gaactcaacg	aaatctcagt	cgttagatgt	aacccataca	4500
gattggttcc	aagcagcaca	gagtaataac	tacactacag	cctttgtagg	aacgagcttg	4560
ggaggagaag	ataacgagac	tctaatacag	agcgtggtta	gcttgtacag	caagaaaggt	4620
cttgtttctt	tagggtttcc	ggttaagact	ttaaccgaag	ttttgaacag	tttgaatcta	4680
cacggcgaag	agctttacat	gtggacaaag	gacgggacgg	tgcttgttcg	tgaaggttca	4740
ctgaatgatt	etttcttcat	ctccaatggc	tcgatttgct	tcggtagaga	atcgaactcc	4800
ctctggtctc	aatgcatccc	tgaaaattgc	agttccagtg	gctacgaggt	ggagatcaaa	4860
agattaagat	accaagcttt	ttgctctgtt	attgaagttt	cgggcgttcc	tctggtaaat	4920
actgaaacat	atttcacttt	gatgcagtaa	aaatgcatcg	acttgttgtt	tctcagcttc	4980
ttccaatggt	tttttttttg	ccagagatac	acactcatgt	ttcccaacaa	aggaggagca	5040
acacgcatca	agcaccaagc	ggaaaaggca	aaatatcaac	ttattgtggt	tatgatattt	5100
cttggcttcg	gttggcctgt	atggtttgtg	tggtttatga	tgcaagcaac	aaggagagag	5160
atgcatatgc	gtgcaacgct	gataaaccaa	atggaagcga	cacaacaagc	tgagagaaag	5220
agcatgaaea	agagtcaagc	atttgcaaat	gctagccacg	atattagagg	tgcccttgca	5280
gggatgaaag	gtctgattga	tatatgtcgt	gatggagtta	aacctggctc	cgacgtagac	5340
accactctca	accaagtgaa	tgtttgcgcc	aaggatttgg	ttggtaagac	tctgtttctt	5400
tagctttctc	ttatgcgttt	tcttcacttt	ctctctaaca	gaaaattctt	cctcatgttg	5460
ttaaaattac	agctctgctc	aactctgttt	tggacatgag	caaaatcgaa	agcgggaaga	5520
tgcagttagt	ggaagaagat	ttcaacttgt	cgaaacttct	tgaagacgtc	atcgattttt	5580

sekvencePatentin 03072007.ST25

accatcccgt	tgcgatgaag	aaaggggttg	atgtagtttt	ggatccgcac	gatggctcgg	5640
ttttcaaatt	ctcgaatgta	cgaggggata	gtggcagact	gaagcagatt	ctgaacaatc	5700
ttgttagcaa	tgctgtcaag	ttcaccgtcg	acgggcacat	tgcggtaaga	gcttgggctc	5760
agaggccagg	ttccaatagc	tctgtggtcc	ttgcatcata	tcctaaaggt	gtgtccaagt	5820
ttgtaaagag	tatgttctgc	aagaataaag	aagagtcatc	aacctacgag	acagaaatat	5880
cgaattccat	aagaaacaat	gcaaacacga	tggagtttgt	gtttgaagtg	gatgatactg	5940
gtaaagggat	acctatggag	atgcgtaagt	cggtatttga	aaactatgtt	caagtaagag	6000
aaacagctca	aggacaccaa	ggaactggtt	tagggctcgg	gattgtgcag	tctttggtaa	6060
gctactaaaa	cagaacacgt	tctttctctt	cacaagtaaa	tctagatggt	tttcatttgt	6120
ggtctattat	tataggtaag	attaatggga	ggggagataa	gaatcaccga	caaggccatg	6180
ggagagaaag	gaacatgttt	ccaattcaat	gttttattga	caacattaga	gtctcctcca	6240
gtgagtgaca	tgaaagtgag	acaggagatc	gaagcaggag	gcgattatgt	atccacgcca	6300
aacctcgggc	tgactataaa	cacttcactt	ggaggtagca	tgaatatacg	taacctgagt	6360
cctagattca	acaactgtct	cagctcaagt	ccaaagcaag	aaggttctag	agtggttctt	6420
ctattgaaaa	atgaagaacg	cagaagagtt	acagagaaat	acataaagaa	tcttgggatt	6480
aaagttacag	tggtggagaa	atgggagcat	ttgagttatg	ctttggagag	actttttgga	6540
ttttcacctc	agagttccat	gggaagagca	gagtgtagtt	tgtcatgtcc	gagctcaagg	6600
gagttacctt	tcattggcat	ggacggtatt	gattcaagaa	gccaacttcc	taaaaggaga	6660
agcatcagtt	tctctgcagt	tgtccttttg	gtgattgatg	caaaaactgg	accatttttt	6720
gagctgtgcg	atattgtcaa	acagtttcgt	agaggcttgc	cccatggaat	atcctgtaaa	6780
gttgtttggc	ttaacgaatc	gagcaetcgt	gtaagtgaga	gaggggacat	tagttgttcg	6840
agacctttgc	acggatcgcg	tcttatggaa	gtcttgaaga	tgttgcctga	atttggagga	6900
actgtgctaa	aagaaccacc	tactgagctg	caaagggaat	cattgctgag	acattctttt	6960
gttgcagaga	gatcaccaaa	acataaagtc	caagaagagg	ggccaagctc	aatgtttaac	7020
aaaaaattag	gtaagaggat	aatggcatca	acagattcag	agagtgagac	tagggtcaag	7080
tcagtgcgta	ccggtcgaaa	gcctattggg	aacccagagg	acgagcaaga	gacttccaag	7140
ccgagtgacg	atgaattctt	aagaggaaag	agagttcttg	tggtcgatga	taactttata	7200
tcacgtaaag	ttgcaacagg	aaagctgaag	aagatgggag	tctcagaggt	cgaacaatgc	7260
gacagtggga	aagaagcttt	gagattagtc	actgaagggc	ttacacaaag	agaagaacaa	7320
ggttcagtag	ataaacttcc	gtttgactac	atattcatgg	actgccaagt	aagtttaatt	7380
gattaacaac	ctttcataac	acaaaaacaa	atagttgagt	cctaataagt	attaatgttc	7440
tgcacagatg	ccagaaatgg	atggctatga	agcaactaga	gagattagga	aagtggagaa	7500
aagttatggg	gtgcgtacac	caattatagc	tgtatctggt	catgatcctg	gttcagagga	7560
agcaagagaa	accattcaag	ctggaatgga	cgccttctta	gataaaagct	tgaatcaact	7620

- 17 CZ 300145 Β6 sekvencePatentin 03072007,ST25

tgcaaacgtc	attagagaaa	tcgaaagcaa	acgtcactag	tattgtataa	gtagacagca	7680
cgcagctttg	tgctactacc	attagtgttt	tagacaatac	ttttttagta	tgacgatgtc	7740
atagcagttt	tcttctaagt	ttatttaaag	tccatttcag	atacagaaca	catgcactag	7800
tcttaagtcc	caaaagatgt	aggcaaatga	aaccagtgca	tcttttatgg	gcaacgacac	7860
tgcattgagc	taagagaaca	aaatggttag	atgaactcaa	acttcacaga	aaaaactgat	7920
tcattatagt	tatgagcaga	agaaagggtt	gcgtcagtaa	ctcaaagact	ttgattgatt	7980
ttcacttcca	aatgttaaaa	cttgaacaat	agtaataagt	aaggacaaaa	ctttcacacc	8040
acaaaacgat	tatgtgaagt	gaataccaga	cttgttgaac	aaggaaagaa	gatacaaaaa	8100
ctcttgttgt	gatagctttg	aagatctctt	ctcctcgaaa	ccaccttcct	tcaagacatt	8160
cataactttc	tccttgaact	ctgatgtttc	tcctccgtct	ccttctccct	catccatctc	8220
catatcatcg	tcatccattt	cgttgtcgtc	atcttccatt	cccatgctct	ggtcaccaag	8280
atccatggag	gtggtgttca	aagcaggttc	tccattgttc	tgcaacgaag	ctagtacggc	8340
ctgaagagtc	ttgaagttct	tctccagcat	ggaaagaaca	gacttttgct	tgaaaatgga	8400
tcccaaggtt	ttgttctttc	tgatgaaaca	gactcttaag	aacccatccc	actccttctt	8460
gttaacctga	gggccaggcc	tccttggttc	gatcctgaca	acggaagaat	ccacctttgg	8520
aggagggcgg	aaattgttct	tgccgacttt	gaggaggtgg	gagactctgg	cataaagctg	8580
agtgttgaca	gagagacggc	agtagagatt	gtcaccaggc	tgggcaacga	gtctcatggc	8640
gaattccctc	tggtacatga	tgacagcaca	tctgaagctt	gttggatgga	agagaagttt	8700
gaatgtgaga	ggagatgata	tctgatacgg	aatgtttgcc	acacatatgt	caaacctggg	8760
aagctccgtc	ttgagcacat	ccccttgaat	tacctttaaa	agagacaaag	tagaacagtc	8820
agcatatgtt	ccagtaacca	agacacaaga	atctatattc	caagacaaag	ataaatgaat	8880
catcacaatg	aatagataga	tgctcgaatt	caataacaat	cgagcagtag	agtaccttca	8940
agcggttaga	gaagggagtt	ccttgaaaac	ggcgctgaag	ctcgagaacc	atacgagagt	9000
caagttcgac	ggcgataact	tctttgccag	cttctagaag	cttcttggtc	aagtttccag	9060
taccgggacc	gatctcgaga	atcacatcgg	tactcttgat	accagctttc	tgaacgatcg	9120
aatccacaag	cagagggttc	ttaaggatat	gttgcccttt	cgatttgtgg	aacgatattc	9180
ctccttggta	atggttcgat	ggtgctctat	tcgaagcctt	gggcttctcc	ttcctgatct	9240
tgcctcccgc	cattgttgct	cactttgctt	cttcgaaacc	tcttacggcc	gacggcggga	9300
gaagatgaag	atgaagatta	gggtttttct	ctttactttc	tctcagccgt	gttttctatt	9360
caacctactc	tgtttttatt	ttattctttt	ctctggtcgg	ttttcattta	atttaatttt	9420
attacatttc	atctcaagta	atgtttgttt	tcgatttcac	aaacctttta	aacgaaaata	9480
aaatgttaat						9490

- 18 C/. Jínili ttt) <210> 2 <211> 1122 <212> PRT <213> Arabidopsts ? <400> 2

Met Met 1

Val

Lys

val 5

Thr Lys

Leu

Val

Ala 10

Ser Arg

Pro

lle

val 15

val

Phe

Cys

val

Leu

Ala

Phe

Leu

val

Val

Val

Phe

Glu

Cys

lle

Trp

Ile

20

25

30

Ser

Asn

Trp

Arg

Thr

Thr

Thr

Gl u

Asn

Leu

Val

Lys

Glu

Val

Ala

Ser

35

40

45

Phe

Thr

Glu

Asp

Leu

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Ser

Glu

Ile

Glu

Asn

Ile

50

55

60

Gly

Lys

Phe

Thr

Tyr

Ala

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser

Thr

Ile

Gly

Leu

Ala

65

70

75

80

Arg

val

ile

Asp

Ser

Tyr

ile

Thr

Asn

Asn

Asp

Thr

Gly

Phe

Thr

Glu

85

90

95

ile

Gin

Thr

Gin

Ile

Ala

Pro

Leu

Leu

Phe

val

Ala

Tyr

Ser

Thr

Ile

100

105

110

Leu

Gin

Val

Ser

Gin

Val

Ser

Tyr

Ile

Ser

Arg

Asp

Gly

Leu

Met

Phe

115

120

125

Ser

Tyr

Ile

Ala

Gl u

Ser

Asn

Thr

Ser

val

Ala

Val

Phe

Al a

Asn

Ser

130

135

140

Ser

Ser

Asn

Ser

Ser

Arg

Gly

Asp

Tyr

Thr

Trp

Tyr

Thr

Gl n

Thr

val

145

150

155

160

ASp

Gin

Leu

Thr

Gly

Arg

Leu

Asn

Gly

Asn

Ser

Thr

Lys

Ser

Gin

Ser

165

170

175

Leu

Asp

val

Thr

His

Thr

Asp

Trp

Phe

Gin

Ala

Ala

Gin

Ser

Asn

Asn

180

185

190

Tyr

Thr

Thr

Ala

Phe

val

Gly

Thr

Ser

Leu

Gly

Gly

Glu

Asp

Asn

Glu

195

200

205

Thr

Leu

Ile

Gin

Ser

Val

Val

Ser

Leu

Tyr

Ser

Lys

Lys

Gly

Leu

val

210

215

220

Ser

Leu

Gly

Phe

Pro

val

Lys

Thr

Leu

Thr

Glu

Val

Leu

Α5Π

Ser

Leu

225

230

235

240

Asn

Leu

His

Gly

Gl u

Glu

Leu

Tyr

Met

Trp

Thr

Lys

Asp

Gly

Thr

val

245 250 255 y ν/ >υυι<4> Hh sekvencePatentln 03072007.ST25

Leu Val Arg Glu

Gly Ser

Leu

Asn

Asp Ser Phe Phe ile Ser Asn

Gly

260

265

270

Ser

Ile

cys

Phe

Gly

Arg

Glu

Ser

Asn

Ser

Leu

Trp

Ser

Gin

cys

Ile

275

280

285

Pro

Glu

Asn

cys

ser

ser

Ser

Gly

Tyr

Glu

val

Glu

ile

Lys

Arg

Leu

290

295

300

Arg

Tyr

Gin

Ala

Phe

Cys

ser

Val

Ile

Glu

Val

Ser

Gly

val

Pro

Leu

305

310

315

320

Arg

Tyr

Thr

Leu

Met

phe

Pro

Asn

Lys

Gly Gly

Ala

Thr

Arg

ile

Lys

325

330

335

His

Gin

Ala

Glu

Lys

Ala

Lys

Tyr

Gin

Leu

Tle

val

val

Met

Ile

Phe

340

345

350

Leu

Gly

phe

Gly

Trp

pro

val

Trp

Phe

val

Trp

Phe

Met

Met

Gin

Ala

355

360

365

Thr

Arg

Arg

Glu

Met

His

Met

Arg

Ala

Thr

Leu

Ile

Asn

Gin

Met

Glu

370

375

380

Ala

Thr

Gin

Gin

Ala

Glu

Arg

Lys

Ser

Met

Asn

Lys

Ser

Gin

Ala

Phe

385

390

395

400

Ala

Asn

Ala

Ser

His

Asp

ile

Arg

Gly

Ala

Leu

Ala

Gly

Met

Lys

Gly

405

410

415

Leu

Ile

Asp

Ile

cys

Arg

Asp

Gly

val

Lys

Pro

Gly

ser

Asp

Val

Asp

420

425

430

Thr

Thr

Leu

Asn

Gin

val

Asn

val

Cys

Ala

Lys

Asp

Leu

Val

Ala

Leu

435

440

445

Leu

Asn

Ser

val

Leu

ASp

Met

Ser

Lys

Ile

Glu

Ser

Gly

Lys

Met

Gin

450

455

460

Leu

Val

Glu

Gl u

A$p

Phe

Asn

Leu

ser

Lys

Leu

Leu

Glu

ASP

Val

Ile

465

470

475

480

ASp

Phe

Tyr

HiS

Pro

Val

Ala

Met

Lys

Lys

Gly

val

Asp

val

Val

Leu

485

490

495

ASP

Pro

HIS

ASp

Gly

ser

val

Phe

Lys

Phe

Ser

Asn

Val

Arg

Gly

Asp

500

505

510

Ser

Gly

Arg

Leu

Lys

Gin

ile

Leu

Asn

Asn

Leu

val

Ser

Asn

Ala

val

515 520 525

- 20 CZ J(IU145> B6

Lys Phe Thr Val 530

Asp Gly

sekvencePatentln 03072007.ST25

His 535

ile

Ala

val

Arg

Ala 540

Trp

Ala

Gin

Arg

Pro

Gly

Ser

Asn

ser

Ser

val

val

Leu

Ala

Ser

Tyr

pro

Lys

Gly

Val

545

550

555

560

Ser

Lys

phe

val

Lys

Ser

Met

Phe

cys

Lys

Asn

Lys

Glu

Glu

ser

Ser

565

570

575

Thr

Tyr

Glu

Thr

Glu

Ile

Ser

Asn

Ser

Ile

Arg

Asn

Asn

Ala

Asn

Thr

580

585

590

Met

Glu

phe

val

Phe

Glu

val

Asp

Asp

Thr

Gly

Lys

Gly

Ile

Pro

Met

595

600

605

Glu

Met

Arg

Lys

Ser

val

Phe

Glu

Asn

Tyr

val

Gin

Val

Arg

Glu

Thr

610

615

620

Ala

Gin

Gly

Hi 5

Gin

Gly

Thr

Gl y

Leu

Gly

Leu

Gly

Ile

Val

Gl n

ser

625

630

635

640

Leu

val

Arg

Leu

Met

Gly Gly

Glu

Ile

Arg

Ile

Thr

Asp

Lys

Ala

Met

645

650

655

Gly

Glu

Lys

Gly

Thr

cys

Phe

Gin

Phe

Asn

Val

Leu

Leu

Thr

Thr

Leu

660

665

670

Glu

Ser

Pro

pro

val

Ser

ASp

Met

Lys

Val

Arg

Gin

Glu

Ile

Glu

Ala

675

680

685

Gly Gly

ASp

Tyr

Val

Ser

Thr

Pro

Asn

Leu

Gly

Leu

Thr

Ile

Asn

Thr

690

695

700

Ser

Leu

Gly

Gly

Ser

Met

Asn

Ile

Arg

Asn

Leu

Ser

Pro

Arg

Phe

Asn

705

710

715

720

Α5Π

cys

Leu

Ser

Ser

Ser

Pro

Lys

Gin

Gl u

Gly

ser

Arg

val

val

Leu

725

730

735

Leu

Leu

Lys

Asn

Glu

Glu

Arg

Arg

Arg

val

Thr

Glu

Lys

Tyr

ile

Lys

740

745

750

Asn

Leu

Gly

Ile

Lys

val

Thr

Val

val

Glu

Lys

Trp

Glu

Hl S

Leu

Ser

755

760

765

Tyr

Ala

Leu

Gl u

Arg

Leu

Phe

Gly

Phe

Ser

pro

Gin

Ser

Ser

Met

Gly

770

775

780

Arg

Ala

Glu

cys

Ser

Leu

Ser

Cys

pro

Ser

Ser

Arg

Glu

Leu

Pro

Phe

785

790

795

800

-21 (’Ζ 300145 Β6 sekvencePatentln 03072007.ST25

ile Gly Met Asp Gly

Ile

Asp

Ser Arg Ser Gin Leu Pro Lys Arg

Arg

805

810

815

ser

ile

ser

Phe

Ser

Ala

val

val

Leu

Leu

val

Ile

ASp

Ala

Lys

Thr

820

825

830

Gly

pro

phe

Phe

Gl u

Leu

Cys

Asp

He

val

Lys

Gin

Phe

Arg

Arg

Gly

835

840

845

Leu

Pro

His

Gly

Ile

Ser

Cys

Lys

val

Val

Trp

Leu

Asn

Glu

Ser

Ser

850

855

860

Thr

Arg

Val

Ser

Glu

Arg

Gly

Asp

Ile

Ser

cys

ser

Arg

Pro

Leu

His

865

870

875

880

Gly

ser

Arg

Leu

Met

Glu

val

Leu

Lys

Met

Leu

pro

Glu

Phe

Gly Gly

885

890

895

Thr

val

Leu

Lys

Glu

Pro

Pro

Thr

Glu

Leu

Gl n

Arg

Glu

Ser

Leu

Leu

900

905

910

Arg

Hl S

Ser

Phe

Val

Al a

Glu

Arg

Ser

Pro

Lys

His

Lys

val

Gin

Glu

915

920

925

Glu

Gly

Pro

Ser

Ser

Met

phe

Asn

Lys

Lys

Leu

Gly

Lys

Arg

ile

Met

930

935

940

Ala

Ser

Thr

ASp

Ser

Gl u

Ser

Glu

Thr

Arg

val

Lys

ser

val

Arg

Thr

945

950

955

960

Gly

Arg

Lys

pro

Ile

Gly

Asn

Pro

Glu

ASp

Glu

Gl n

Gl u

Thr

Ser

Lys

965

970

975

Pro

ser

ASp

Asp

Glu

Phe

Leu

Arg

Gly

Lys

Arg

val

Leu

Val

val

Asp

980

985

990

Asp Asn Phe Ile Ser Arg Lys Val Ala Thr Gly Lys Leu Lys Lys Met 995 1000 1005

Gly Val Ser Glu Val Glu Gin Cys Asp Ser Gly Lys Glu Ala Leu 1010 1015 1020

Arg Leu val Thr Glu Gly Leu Thr Gin Arg Glu Glu Gin Gly Ser 1025 1030 1035 val Asp Lys Leu Pro Phe Asp Tyr Ile Phe Met Asp Cys Gin Met 1040 1045 1050

Pro Glu Met Asp Gly Tyr Glu Ala Thr Arg Glu ile Arg Lys Val 1055 1060 1065

sekvencePatentm

03072007

. ST25

Glu

Lys

Ser

Tyr

Gly

val

Arg

Thr

Pro

ile

Ile

Al a

Val

ser

Gly

1070

1075

1080

HIS

ASp

pro

Gly

Ser

Glu

Glu

Al a

Arg

Glu

Thr

Ile

Gin

Al a

Gly

1085

1090

1095

Met

Asp

Ala

Phe

Leu

Asp

Lys

Ser

Leu

Asn

Gin

Leu

Ala

Asn

val

1100

1105

1110

Ile

Arg

Glu

Ile

Glu

Ser

Lys

Arg

His

1115

1120

<210>3 <211> 3677 <212>DNA <213> Arabidopsis <400>3

aattattcac	tcaaattcac	aaagggtttc	gactttgctc	cgaggaagaa	gataatatga	60
aaagagcttt	ttagggttta	tcattctcct	tgactttgca	aaacgtgaaa	taagcttctt	120
ccttggagga	ctaatcaaga	cagaaatctg	ttcctctaaa	aacgatcgcc	gttctagttc	180
actcaaatga	tggtgaaagt	tacaaagctt	gtggcttcac	gtccaattgt	ggtcttttgc	240
gtcctggcat	tcctggtggt	tgttttcgag	tgcatttgga	tctcaaattg	gcgaacaaca	300
acggagaacc	tagtcaaaga	ggtcgcttca	tttaccgaag	atctccggac	aagtctagtt	360
tcggagattg	aaaacatcgg	aaaatttaca	tatgctaaga	caaacttatc	tacgatcggt	420
ttagcgagag	ttatagattc	ttatatcacc	aacaacgaca	ctggttttac	agagattcaa	480
acacagatcg	caccattgtt	gtttgtagct	tattcaacga	tccttcaagt	ctcaeaagtt	540
tcgtacatca	gtagggacgg	tctcatgttt	tcttacattg	cagaatcaaa	cacaagtgtc	600
gctgtttttg	ccaattcctc	gtcgaattca	agtcgtggag	actacacttg	gtacactcaa	660
accgtggatc	agttaactgg	tcgtcttaac	gggaactcaa	cgaaatctca	gtcgttagat	720
gtaacccata	cagattggtt	ccaagcagca	cagagtaata	actacactac	agcctttgta	780
ggaacgagct	tgggaggaga	agataacgag	actctaatac	agagcgtggt	tagcttgtac	840
agcaagaaag	gtcttgtttc	tttagggttt	ccggttaaga	ctttaaccga	agttttgaac	900
agtttgaatc	tacacggcga	agagctttac	atgtggacaa	aggacgggac	ggtgcttgtt	960
cgtgaaggtt	cactgaatga	ttctttcttc	atctccaatg	gctcgatttg	cttcggtaga	1020
gaatcgaact	ccctctggtc	tcaatgcatc	cctgaaaatt	gcagttccag	tggctacgag	1080
gtggagatca	aaagattaag	ataccaagct	ttttgctctg	ttattgaagt	ttcgggcgtt	1140
cctctgagat	acacactcat	gtttcccaac	aaaggaggag	caacacgcat	caagcaccaa	1200
gcggaaaagg	caaaatatca	acttattgtg	gttatgatat	ttcttggctt	cggttggcct	1260
gtatggtttg	tgtggtttat	gatgcaagca	acaaggagag	agatgcatat	gcgtgcaacg	1320
ctgataaacc	aaatggaagc	gacacaacaa	gctgagagaa	agagcatgaa	caagagtcaa	1380

- 73 CZ 300145 B6 sekvencePatentln 03072007.ST25

gcatttgcaa	atgctagcca	cgatattaga	ggtgcccttg	cagggatgaa	aggtctgatt	1440
gatatatgtc	gtgatggagt	taaacctggc	tccgacgtag	acaccactct	caaccaagtg	1500
aatgtttgcg	ccaaggattt	ggttgctctg	ctcaactctg	ttttggacat	gagcaaaatc	1560
gaaagcggga	agatgcagtt	agtggaagaa	gatttcaact	tgtcgaaact	tcttgaagac	1620
gtcatcgatt	tttaccatcc	cgttgcgatg	aagaaagggg	ttgatgtagt	tttggatccg	1680
cacgatggct	cggttttcaa	attctcgaat	gtacgagggg	atagtggcag	actgaagcag	1740
attctgaaca	atcttgttag	caatgctgtc	aagttcaccg	tcgacgggca	cattgcggta	1800
agagcttggg	ctcagaggcc	aggttccaat	agctctgtgg	tccttgcatc	atatcctaaa	1860
ggtgtgtcca	agtttgtaaa	gagtatgttc	tgcaagaata	aagaagagtc	atcaacctac	1920
gagacagaaa	tatcgaattc	cataagaaac	aatgcaaaca	cgatggagtt	tgtgtttgaa	1980
grggatgata	ctggtaaagg	gatacctatg	gagatgcgta	agtcggtatt	tgaaaactat	2040
gttcaagtaa	gagaaacagc	tcaaggacac	caaggaactg	gtttagggct	cgggattgtg	2100
cagtctttgg	taagattaat	gggaggggag	ataagaatca	ccgacaaggc	catgggagag	2160
aaaggaacat	gtttccaatt	caatgtttta	ttgacaacat	tagagtctcc	tccagtgagt	2220
gacatgaaag	tgagacagga	gatcgaagca	ggaggcgatt	atgtatccac	gccaaacctc	2280
gggctgacta	taaacacttc	acttggaggt	agcatgaata	tacgtaacct	gagtcctaga	2340
ttcaacaact	gtctcagctc	aagtccaaag	caagaaggtt	ctagagtggt	tcttctattg	2400
aaaaatgaag	aacgcagaag	agttacagag	aaatacataa	agaatcttgg	gattaaagtt	2460
acagtggtgg	agaaatggga	gcatttgagt	tatgctttgg	agagactttt	tggattttca	2520
cctcagagtt	ccatgggaag	agcagagtgt	agtttgtcat	gtccgagctc	aagggagtta	2580
cctttcattg	gcatggacgg	tattgattca	agaagccaac	ttcctaaaag	gagaagcatc	2640
agtttctctg	cagttgtcct	tttggtgatt	gatgcaaaaa	ctggaccatt	ttttgagctg	2700
tgcgatattg	tcaaacagtt	tcgtagaggc	ttgccccatg	gaatatcctg	taaagttgtt	2760
tggcttaacg	aatcgagcac	tcgtgtaagt	gagagagggg	acattagttg	ttcgagacct	2820
ttgcacggat	cgcgtcttat	ggaagtcttg	aagatgttgc	ctgaatttgg	aggaactgtg	2880
ctaaaagaac	cacctactga	gctgcaaagg	gaatcattgc	tgagacattc	ttttgttgca	2940
gagagatcac	caaaacataa	agtccaagaa	gaggggccaa	gctcaatgtt	taacaaaaaa	3000
ttaggtaaga	ggataatggc	atcaacagat	tcagagagtg	agactagggt	caagtcagtg	3060
cgtaccggtc	gaaagcctat	tgggaaccca	gaggacgagc	aagagacttc	caagccgagt	3120
gacgatgaat	tcttaagagg	aaagagagtt	cttgtggtcg	atgataactt	tatatcacgt	3180
aaagttgcaa	caggaaagct	gaagaagatg	ggagtctcag	aggtcgaaca	atgcgacagt	3240
gggaaagaag	ctttgagatt	agtcactgaa	gggcttacac	aaagagaaga	acaaggttca	3300
gtagataaac	ttccgtttga	ctacatattc	atggactgcc	aaatgccaga	aatggatggc	3360
tatgaagcaa	ctagagagat	taggaaagtg	gagaaaagtt	atggggtgcg	tacaccaatt	3420

- 24 CZ 41MH4S BC sekvencePatentln 03072007.ST25 atagctgtat ctggtcatga tcctggttca gaggaagcaa gagaaaccat tcaagctgga 3480 atggacgcct tcttagataa aagcttgaat caacttgcaa acgtcattag agaaatcgaa 3540 agcaaacgtc actagtattg tataagtaga cagcacgcag ctttgtgcta ctaccattag 3600 tgttttagac aatacttttt tagtatgacg atgtcatagc agttttcttc taagtttatt 3660

taaagtccat	ttcagat	3677
<210> 4 <211> 375 <212> DNA <213> Arabidopsis <400> 4 gcagttgtcc ttttggtgat tgatgcaaaa actggaccat tttttgagct gtgcgatatt	60
gtcaaacagt	ttcgtagagg cttgccccat ggaatatcct gtaaagttgt ttggcttaac	120
gaatcgagca	ctcgtgtaag tgagagaggg gacattagtt gttcgagacc tttgcacgga	180
tcgcgtctta	tggaagtctt gaagatgttg cctgaatttg gaggaactgt gctaaaagaa	240
ccacctactg	agctgcaaag ggaatcattg ctgagacatt cttttgttgc agagagatca	300
ccaaaacata	aagtccaaga agaggggcca agctcaatgt ttaacaaaaa attaggtaag	360
aggataatgg	catca	375

io <2lO>5 <211> 1809 <212> DNA <213> Arabidopsis <400>5

atgttacgtc	ctgtagaaac	cccaacccgt	gaaatcaaaa	aactcgacgg	cctgtgggca	60
ttcagtctgg	atcgcgaaaa	ctgtggaatt	gatcagcgtt	ggtgggaaag	cgcgttacaa	120
gaaagccggg	caattgctgt	gccaggcagt	tttaacgatc	agttcgccga	tgcagatatt	180
cgtaattatg	cgggcaacgt	ctggtatcag	cgcgaagtct	ttataccgaa	aggttgggca	240
ggccagcgta	tcgtgctgcg	tttcgatgcg	gtcactcatt	acggcaaagt	gtgggtcaat	300
aatcaggaag	tgatggagca	tcagggcggc	tatacgccat	ttgaagccga	tgtcacgccg	360
tatgttattg	ccgggaaaag	tgtacgtatc	accgtttgtg	tgaacaacga	actgaactgg	420
cagactatcc	cgccgggaat	ggtgattacc	gacgaaaacg	gcaagaaaaa	gcagtcttac	480
ttccatgatt	tctttaacta	tgccgggatc	catcgcagcg	taatgctcta	caccacgccg	540
aacacctggg	tggacgatat	caccgtggtg	acgcatgtcg	cgcaagactg	taaccacgcg	600
tctgttgact	ggcaggtggt	ggccaatggt	gatgtcagcg	ttgaactgcg	tgatgcggat	660
caacaggtgg	ttgcaactgg	acaaggcact	agcgggactt	tgcaagtggt	gaatccgcac	720
ctctggcaac	cgggtgaagg	ttatctctat	gaactgtgcg	tcacagccaa	aagccagaca	780
gagtgtgata	tctacccgct	tcgcgtcggc	atccggtcag	tggcagtgaa	gggcgaacag	840
ttcctgatta	accacaaacc	gttctacttt	actggctttg	gtcgtcatga	agatgcggac	900

CZ 5»υΐ4ϊ» B6 sekvencePatentln 03072007.ST25

ttacgtggca	aaggattcga	taacgtgctg	atggtgcacg	accacgcatt	aatggactgg	960
atrggggcca	actcctaccg	tacctcgcat	tacccttacg	ctgaagagat	gctcgactgg	1020
gcagatgaac	atggcatcgt	ggtgattgat	gaaactgctg	ctgtcggctt	taacctctct	1080
ttaggcattg	gtttcgaagc	gggcaacaag	ccgaaagaac	tgtacagcga	agaggcagtc	1140
aacggggaaa	ctcagcaagc	gcacttacag	gcgattaaag	agctgatagc	gcgtgacaaa	1200
aaccacccaa	gcgtggtgat	gtggagtatt	gccaacgaac	cggatacccg	tccgcaagtg	1260
cacgggaata	tttcgccact	ggcggaagca	acgcgtaaac	tcgacccgac	gcgtccgatc	1320
acctgcgtca	atgtaatgtt	ctgcgacgct	cacaccgata	ccatcagcga	tctctttgat	1380
gtgctgtgcc	tgaaccgtta	ttacggatgg	tatgtccaaa	gcggcgattt	ggaaacggca	1440
gagaaggtac	tggaaaaaga	acttctggcc	tggcaggaga	aactgcatca	gccgattatc	1500
atcaccgaat	acggcgtgga	tacgttagcc	gggctgcact	caatgtacac	cgacatgtgg	1560
agtgaagagt	atcagtgtgc	atggctggat	atgtatcacc	gcgtctttga	tcgcgtcagc	1620
gccgtcgtcg	gtgaacaggt	atggaatttc	gccgattttg	cgacctcgca	aggcatattg	1680
cgcgttggcg	gtaacaagaa	agggatcttc	actcgcgacc	gcaaaccgaa	gtcggcggct	1740
tttctgctgc	aaaaacgctg	gactggcatg	aacttcggtg	aaaaaccgca	gcagggaggc	1800
aaacaatga						1809

<210> 6 <211> 920 <212> DNA <213> Arabidopsis <400>6

ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa	60
gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa	120
ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa	180
gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca	240
gccaaaagcc agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca	300
gtgaagggcg aacagttcct gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt	360
catgaagatg cggacttacg tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt gcacgaccac	420
gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc ttacgctgaa	480
gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac tgctgctgtc	540
ggctttaacc tctctttagg cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa agaactgtac	600
agcgaagagg cagtcaaegg ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat taaagagctg	660
atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaccggat	720
acccgtccgc aagtgcacgg gaatatttcg ccactggcgg aagcaacgcg taaactcgac	780
ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg acgctcacac cgataccatc	840

-26CZ 300145 B6 sekvencePatentln 03072007.ST25 agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac cgttattacg gatggtatgt ccaaagcggc 900 gatttggaaa cggcagagaa 920 <210> 7 <211> 2636 <212> DNA <213> modified <400>7

gcgggcctct	tcgctattac	gccagctggc	gaaaggggga	tgtgctgcaa	ggcgattaag	60
ttgggtaacg	ccagggtttt	cccagtcacg	acgttgtaaa	acgacggcca	gtgaattcga	120
gctcggtacc	caacatggtg	gagcacgaca	ctctcgtcta	ctccaagaat	atcaaagata	180
cagtctcaga	agaccagagg	gctattgaga	cttttcaaca	aagggtaata	tcgggaaacc	240
tcctcggatt	ccattgccca	gctatctgtc	acttcatcga	aaggacagta	gaaaaggaag	300
atggcttcta	caaatgccat	cattgcgata	aaggaaaggc	tatcgttcaa	gatgcctcta	360
ccgacagtgg	tcccaaagat	ggacccccac	ccacgaggaa	catcgtggaa	aaagaagacg	420
ttccaaccac	gtcttcaaag	caagtggatt	gatgtgatat	ctccactgac	gtaagggatg	480
acgcacaatc	ccactatcct	tcgcaagacc	cttcctctat	ataaggaagt	tcatttcatt	540
tggagaggac	ctcgagggga	tcagcttatc	gataccgtcg	actgatgcca	ttatcctctt	600
acctaatttt	ttgttaaaca	ttgagcttgg	cccctcttct	tggactttat	gttttggtga	660
tctctctgca	acaaaagaat	gtctcagcaa	tgattccctt	tgcagctcag	taggtggttc	720
ttttagcaca	gttcctccaa	attcaggcaa	catcttcaag	acttccataa	gacgcgatcc	780
gtgcaaaggt	ctcgaacaac	taatgtcccc	tctctcactt	acacgagtgc	tcgattcgtt	840
aagccaaaca	actttacagg	atattccatg	gggcaagcct	ctacgaaact	gtttgacaat	900
atcgcacagc	tcaaaaaatg	gtccagtttt	tgcatcaatc	accaaaagga	caactgcaag	960
cttggatccc	tctacaccac	gccgaacacc	tgggtggacg	atatcaccgt	ggtgacgcat	1020
gtcgcgcaag	actgtaacca	cgcgtctgtt	gactggcagg	tggtggccaa	tggtgatgtc	1080
agcgttgaac	tgcgtgatgc	ggatcaacag	gtggttgcaa	ctggacaagg	cactagcggg	1140
actttgcaag	tggtgaatcc	gcacctctgg	caaccgggtg	aaggttatct	ctatgaactg	1200
tgcgtcacag	ccaaaagcca	gacagagtgt	gatatctacc	cgcttcgcgt	cggcatccgg	1260
tcagtggcag	tgaagggcga	acagttcctg	attaaccaca	aaccgttcta	ctttactggc	1320
tttggtcgtc	atgaagatgc	ggacttacgt	ggcaaaggat	tcgataacgt	gctgatggtg	1380
cacgaccacg	cattaatgga	ctggattggg	gccaactcct	accgtacctc	gcattaccct	1440
tacgctgaag	agatgctcga	ctgggcagat	gaacatggca	tcgtggtgat	tgatgaaact	1500
gctgctgtcg	gctttaacct	ctctttaggc	attggtttcg	aagcgggcaa	caagccgaaa	1560
gaactgtaca	gcgaagaggc	agtcaacggg	gaaactcagc	aagcgcactt	acaggcgatt	1620
aaagagctga	tagcgcgtga	caaaaaccac	ccaagcgtgg	tgatgtggag	tattgccaac	1680
gaaccggata	cccgtccgca	agtgcacggg	aatatttcgc	cactggcgga	agcaacgcgt	1740

-27CZ 51HJI45 Bft sekvencePatentln 03072007.ST25

aaactcgacc	cgacgcgtcc	gatcacctgc	gtcaatgtaa	tgttctgcga	cgctcacacc	1800
gataccatca	gegatetett	tgatgtgctg	tgcctgaacc	gttattacgg	atggtatgtc	1860
caaagcggcg	atttggaaac	ggcagagaaa	agettgeagt	tgtccttttg	gtgattgatg	1920
caaaaactgg	accatttttt	gagctgtgcg	atattgtcaa	acagtttcgt	agaggcttgc	1980
cccatggaat	atcctgtaaa	gttgtttggc	ttaacgaatc	gagcactcgt	gtaagtgaga	2040
gaggggacat	tagttgttcg	agacctttgc	acggatcgcg	tcttatggaa	gtcttgaaga	2100
tgttgcctga	atttggagga	actgtgctaa	aagaaccacc	tactgagctg	caaagggaat	2160
cattgctgag	acattctttt	gttgeagaga	gatcaccaaa	acataaagtc	caagaagagg	2220
ggccaagctc	aatgtttaac	aaaaaattag	gtaagaggat	aatggcatca	gtcgactaga	2280
gtccgcaaaa	atcaccagtc	tctctctaca	aatetatete	tctctatttt	tctccagaat	2340
aatgtgtgag	tagttcccag	ataagggaat	tagggttctt	atagggtttc	gctcatgtgt	2400
tgageatata	agaaaccctt	agtatgtatt	tgtatttgta	aaatacttct	atcaataaaa	2460
tttctaattc	ctaaaaccaa	aatccagtga	cctcgacctc	gagggggggc	cccgagcttg	2520
gatcagattg	tccgtttccc	gccttcggtt	taaactatca	gtggtttgac	aggatatatt	2580
ggccgggtaa	acctaaaaga	aagagcgttt	attagaataa	tccggatatt	ttaaaa	2636

S

Claims (15)

1. Způsob regulace tvorby biomasy v rostlině, vyznačený t í m . že se v rostlině identilili) kuje gen CKíl nebo jeho homolog nebo ortolog a sníží nebo zcela eliminuje se exprese genu

CKli nebo jeho homologu nebo ortologu nebo aktivita genového produktu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený t í ni. že identifikace homologu nebo ortologu genu CKli v rostlinném druhu zahrnuje následující kroky:

iš i) zjištění sekvenční homologie na úrovni nukleotidu nebo aminokyselin, ii) prokázání histidinkinázové aktivity genového produktu zkoumaného genu, iii) zjištění exprese homologu nebo ortologu ve vaskulámích pletivech nebo pletivech sousedících s vaskulárními pletivy daného rostlinného druhu,

20

3. Způsob podle nároku 2, vyznačený t í m , že krok i) se provádí vyhledáváním v genomovýeh databázích sekvencí podobných konzervovaným oblastem reeeptorových hislidinkináz, získaných srovnáváním dosud identifikovaných homologu CKli nebo experimentálně pomocí hybridizace genomové knihovny nebo cDNA knihovny příslušného druhu se sondou získanou z genomové DNA nebo cDNA CKli nebo některého z jeho již identifikovaných homologu, např.

25 genů AllK2, AHK3 nebozíΗK4C'KK//íVOL.

4. Způsob podle nároku 2, vyznačeny tím, že krok ii) se provádí prostřednictvím exprese genu v heterologním nebo homologním expresním systému a následnou analýzou jeho aktivity.

V)

- 28 CZ 300145 B6

5 pak vloží pod kontrolu vhodného promotoru.

5' - TTC CAA GCT T - 3' a prostřednictvím štěpení restrikčními cndonuklázami BamHI, H indií I, Xbal a Sall a spojením výsledných fragmentů ligázou se tyto tři části spojí do jednoho výsledného konstruktu, který se

5' “ CAG CGG ATC C - 3'

LOOPdown:

IlindlH

5' konec těchto primerů.

- CZ 300145 B6

LOOPup:

BamHI

5' ~ CAC TTC TAG A - 3' dále se amplifikuje spojovací sekvence pomocí primeru sestávajících z 18 21 nukleotidu specifických pro danou spojovací sekvenci a sekvencí LOOPup a LOOP down, vložených na

5' - TAT AGG ATC CAA GCT T - 3'

RNAi down:

\lml

5, Způsob podle nároku 2, vyznačený t í m , že krok ii) se provádí prostřednictvím komplementace bakteriálních, kvasinkových nebo rostlinných mutantú v genech pro receptorové histidinkinázy pomocí kódující sekvence homo logu nebo ortologu, vložené pod kontrolu promotoru příslušného genu a v příslušném mutantním pozadí.

6. Způsob podle nároku 2, vyznačený t í m , že krok ii) se provádí prostřednictvím analýzy aktivity genového produktu v přenosu eytokininového signálu v rostlinných protoplastech.

7* Způsob podle nároku 1, vyznačený t í m , že se exprese genu CKH nebo jeho homoio logu nebo ortologu sníží RNA interferencí.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačený t í m , že se konstrukt pro RNA interferenci připraví vložením rekombinantní DNA, obsahující části sekvence cDNA homologu nebo ortologu v obrácené repetici, oddělené sekvencí jiné DNA, s výhodou částí kódující sekvence uidA nebo

15 přirozeného inlronu homologu nebo ortologu CKfl, pod kontrolu konstitutivně aktivního promotoru nebo kondicionálně aktivního promotoru a ukončí terminátorem transkripce.

9. Způsob podle nároku 1, vyznačený t í m , že se exprese genu CKl 1 nebo jeho homologu nebo ortologu sníží inzerční mutagenezí.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se aktivita genového produktu změní místně řízenou mutagenezí.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačený t í ni, že se mutace provede v tripletu kódujícím

25 vybranou aminokyselinu, s výhodou aminokyselinu podílející se na přenosu fosfátu příslušnou receptorovou hislidinkinázou, na potenciálních interakcích s regulačními proteiny nebo aminokyselinu s regulační funkcí.

12. Způsob podle nároku 11, vyznačený t í m , že se mutací provede záměna v tripletu

3o kódujícím aminokyselinu histidin v poloze odpovídající poloze 405 vCKIl (H405) nebo kyselinu asparagovou v poloze odpovídající poloze 1050 (Dl050) v CKI1.

13. Způsob podle nároku 1, vy zna éený t í m , že navíc zahrnuje krok analýzy fenotypu vývoje vaskulámích pletiv, zahrnující histologieké barvení řezů živých rostlin směsí oranže GG a

35 anilinové modři a analýzu barvených řezů DIC nebo fluorescenční mikroskopií.

14. Způsob přípravy rekombinantní DNA pro regulaci exprese genu prostřednictvím RNA interference, vyznačený t í ni, že se amplifikuje specifická část cDNA nebo kódující oblasti daného umlčovaného genu pomocí primeru, obsahujících kromě sekvence 18 až 21 nukleotidů

4o specifických pro cDNA nebo kódující sekvenci daného genu i oblasti vložené na 5' konec těchto primerů, označené RNA i up a RNAi down,

RNAi up:

BamHl Ihndlll

15. Způsob podle nároku 14. kde spojovací sekvencí je část GUSp (sekvence 6) kódující sekvence genu uidA (sekvence 5), která se amplitlkuje pomocí primerň Bgus a Hgus.