CZ292220B6

CZ292220B6 - Nové použití N-(fosfonomethyl)glycinu a jeho derivátů

Info

Publication number: CZ292220B6
Application number: CZ19982872A
Authority: CZ
Inventors: Ivo Brants; William Graham
Original assignee: Monsanto Europe S. A.
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 2003-08-13
Also published as: PT889692E; UA50765C2; DE69713496T2; HU225460B1; AP927A; HUP9902665A3; EE9800319A; AP9801354A0; OA10888A; HUP9902665A2; DK0889692T3; CN1220579A; BR9708457A; DE69713496D1; TR199801934T2; AU2504997A; EA199800874A1; EP0889692A1; US6083878A; BG102804A

Abstract

Nov pou it N-(fosfonomethyl)glycinu a jeho deriv t , jako jsou soli a estery, jako l tek pro zv²Üen v²t ku plodin, kter jsou tolerantn ke glyfos tu a vybran z cukrov °epy, krmn °epy, kuku°ice, °epky olejky a bavlny.\

Description

Nové použití N-(fosfonomethyl)glycinu a jeho derivátů

Oblast techniky

Vynález se týká nového použití N-(fosfonomethyl)glycinu a jeho derivátů, například soli a estery, jako látek pro zvýšení výtěžku plodin, které jsou tolerantní ke glyfosátu.

Dosavadní stav techniky

Glyfosát je dobře známý jako účinný systemický, aktivní na list (post-energentní) neselektivní herbicid, Je známo, že glyfosát působí ne různé systémy enzymů a tak brání vzniku aminokyselin a jiných endogenních chemických látek v ošetřených rostlinách. V důsledku relativně nízké rozpustnosti ve vodě v kyselé formě se glyfosát většinou prodává ve formě solí, například mono-izopropylamonné, amonné, sodné nebo jiné soli.

Velmi dobře známé produkt zahrnují aktivní složku a povrchově aktivní látku nebo směs povrchově aktivních látek a možná jiná aditiva, například protipěnová činidla, barviva a jiná činidla známá v oboru. Odkazuje se též na knihu „Herbicide Glyfosate“ vydané E. Grossbardem a D. Aktinsonem, Butterworth & Co., 1985.

US 3 853 530 popisuje použití N-(fosfonomethyl)glycinu a jeho derivátů ke změně přirozeného růstu nebo vývoje rostlin, jako pro zbarvení listů a zpoždění vegetativního růstu. U jistých rostlin toto zpoždění prý vede ke kratšímu hlavnímu stvolu a zvětšenému bočnímu rozvětvování. Tato změna přirozeného růstu nebo vývoje rostlin by vedla k menším, keřovitějším rostlinám, které vykazují zvýšenou odolnost k suchu a k zamoření škůdci. V případě trávníků může být též velmi žádoucí opožděný vegetativní růst, tak podporující rozvoj kořenů, aby se získal hustý a odolnější dm a prodloužené intervaly mezi sekáním trávníků, golfových hřišť a podobných zatravněných ploch. U mnoha druhů rostlin, například silážních plodin, brambor, cukrové třtiny, melounů a ovocných stromů, opožděný vegetativní růst způsobený glyfosátem prý vede ke zvýšení obsahu sacharidů v rostlinách při sklizni. Tyto aplikace zřejmě vyžadují subletální dávky, neboť by byly ošetřené rostliny zahubeny.

US 3 988 142 se blíže týká použití N-(fosfonomethyl)glycinu a jeho derivátů k zvýšení ukládání sacharidů v rostlinách, například v cukrové třtině. Opět jsou použity subletální dávky a jsou aplikovány krátce před sklizní.

V obou shora uvedených případech se věří, že neletální dávka glyfosátového herbicidu, například dávka mnohem nižší než dávky normálně užívané k boji proti populaci plevelů na poli plodin působí redukci nebo zpoždění vegetativního růstu, a aktivní materiál sleduje normální cestu, kterou sleduje i při herbicidním působení v rostlinách. V případě US 3 988 142 se věří, že dovoluje, aby se více dostupného sacharidu v rostlině přeměnilo na Škrob nebo sacharosu, než aby se využil jako výživa rostliny pro pokračující růst.

DE 3 200 486 se týká zlepšení produktivity plodin jejich ošetřením subletáními dávkami fosfinothricinem (glufosinát), který je také účinným neselektivním herbicidem. I zde má být inhibice vegetativního růstu subletálními dávkami herbicidu příčinou zvýšení sacharidů v rostlinách nebo v jejich plodech. DE 3 200 486 zmiňuje glyfosát ve srovnávacím příkladu (příklad Π), který je zamýšlen, aby ukázal, že glufosinát má lepší účinek než glyfosát ve stejné dávce.

DE 0 401 407 se týká podobného předmětu. Popisuje použití subletálních dávek neselektivních herbicidů, například mezi jinými glyfosátu a fosfinotricinu, během přechodu od stadia tvorby

-1 CZ 292220 B6 hmoty ke stadiu zralosti rostlin, aby se zvýšilo ukládání sacharidů v rostlinách produkujících cukr nebo škrob, jiných než cukrová třtina, například cukrová řepa, brambory nebo kukuřice.

WO 95/05082 popisuje způsob zvýšení výtěžku plodin, které jsou rezistentní k inhibitorům glutamin syntetázy, jako je fosfitricin, ošetřením těchto plodin dávkami tohoto herbicidu, jak se používá kboji s plevely v plodinách. Tento dokument dále konstatuje, že herbicidy s jiným režimem účinku nemají tento účinek nebo často ukazují záporný účinek na výnos plodin.

Nejnovější vývoj genové technologie umožnil geneticky měnit rostliny, zejména pěstovaných plodin, aby se staly tolerantní ke glyfosátu a jeho derivátům. Například EP0218571 se týká klonovaného genu nebo genu obsahujícího vektor exprese, který kóduje EPSPS polypeptid, který když je exprimován v rostlinné buňce přenáší tolerantnost ke glyfosátu do rostlin regenerovaných z takové buňky. EP-0 293 358 se dále týká zvýšení účinnosti rostlin tolerantních ke glyfosátu produkcí mutantních enzymů EPSP syntézy, které vykazují nižší afinitu ke glyfosátu, zatímco zachovávají katalytickou aktivitu. WO 92/00377 popisuje geny kódující enzym glyfosát oxidoreduktázu. Geny jsou užitečné pro produkci transformovaných rostlin, které degradují glyfosátový herbicid a jsou tolerantní ke glyfosátovému herbicidu. WO 92/04449 popisuje geny kódující třídu Π EPSPS enzymů, které jsou užitečné pro produkci transformovaných rostlin, které jsou tolerantní ke glyfosátovému herbicidu. Takové plodiny lze udržovat podstatně bez plevelů aplikací glyfosátového herbicidu po potřebě plodin. Chemical Abstracts, svazek 124, číslo 8, 1996 referují o článku ve Weeds (1995) od Β. H. Wellse s názvem „Rozvoj plodin tolerantních ke glyfosátu na trhu“. Autor potvrzuje dva přístupy, aby se dodala tolerance ke glyfosátu na komerčních úrovních u řady plodin. Článek nazvaný „Roundup Ready® cukrová řepa“ od I. Brantse aj., publikovaného počátkem 1996 v „Proceedings of the Intemational Symposium on Weed and Črop Resistance to Herbicides“, symposia, které se konalo 3, až 6. dubna 1995, ukazuje, že se dosáhla tolerance k Roundup® na komerčních úrovních u geneticky modifikovaných rostlin cukrové řepy.

Nyní se neočekávaně zjistilo, že když se ošetří zemina nesoucí plodinu, jako jsou cukrová řepa, řepky olejky nebo kukuřice, u kterých byla provedena tolerance je glyfosátovému herbicidu, dokonce i s normálně letálními dávkami glyfosátového herbicidu nebo dávkami normálně používanými k boji proti plevelům, výtěžek plodin se zvýší. Tento neočekávaný výtěžek nebylo možné očekávat ze shora uvedeného stavu techniky, poněvadž u netolerantních plodin, by plodina byla zničena, a poněvadž fosfinothricinové herbicidy mají způsob účinku zcela odlišný od glyfosátového herbicidu.

Chemical Abstracst, svazek 123, číslo 21, 1995 publikuje v abstraktu (abstrakt číslo 281158c) o článku X. Delannay aj., který se týká výsledku hodnocení linie podzemnice tolerantní ke glyfosátu po ošetření glyfosátem. Autoři článku uzavírají, že trendy v údajích obecně naznačovaly, že neexistoval žádný skutečný rozdíl ve výtěžku a že srovnání se standardními herbicidními testy potvrzují závěr o celkové bezpečnosti výtěžku ošetření glyfosátem, variabilita se chápe jako způsobená nepříznivým počasím a nebo půdními podmínkami.

Ve dříve zmíněném Weeds, Β. H. Wells také poznamenává, že se nepozorovaly žádné významné snížení výtěžku po jednotlivých nebo postupných široce setých aplikacích glyfosátu u různých stadiích plodin. O nej lepších liniích bavlny tolerantních ke glyfosátu se tvrdí, že neukázaly žádné snížení výtěžku ani po aplikacích glyfosátu. To hodnocení byla ovlivněna, aby se potvrdil výsledek genetické modifikace této plodiny pokud se týká jejich tolerance k danému herbicidu. V tomto článku nejsou žádné údaje a nelze žádný popis nebo zmínku o možném zvýšení výtěžku po aplikaci glyfosátu.

Ačkoliv dříve zmíněný článek I. Brantse a kol. ukazuje údaje o průměrné hmotnosti kořenů (%) po tři různé linie cukrové řepy tolerantní ke glyfosátu, pro různá ošetření glyfosátem ve srovnání se standardem, odborník nemůže z ukázaných údajů odvodit zvýšení výtěžku řepy. Údaje byly správně prezentovány jako údaje o testování tolerance. Ukázané údaje nenaznačují žádné zvýšení

-2CZ 292220 B6 výtěžku u cukrové řepy, protože testování tolerance není ovlivněno podmínkami bez plevelů a tedy umožňuje konkurenci s plevely na standardních stanovištích. Dále jak odborník pozná, uvedené údaje jsou velmi časné údaje získané na velmi malých stanovištích, bez opakování, na jednom místě, vzhledem k dostupnosti semen. Také taková časná semena ještě obsahovala štěpící se semenný materiál, což vedlo k nerovnoměrným stavištím plodin ve srovnání se standardem. V důsledku toho se průměrná hmotnost kořenů počítá na rostlinu (nikoliv na jednotku plochy) a srovnává se standardními rostlinami za odlišných podmínek. Jediným závěrem, který odborník může ze shora uvedeného článku odvodit, je to, že tři linie cukrové řepy vykázaly úroveň tolerantnosti, která má potenciál pro komerční rozvoj.

Podle vynálezu testy ukázaly zvýšení výtěžku (vyjádřené na jednotku plochy) plodin tolerantních ke glyfosátu, například plodiny řepa, řepka olejka, kukuřice nebo bavlna, ošetřených glyfosátovým herbicidem až o 50 % ve srovnání se stejnou plodinou, která nebyla ošetřena glyfosátovým herbicidem. Zvýšení výtěžku se nepokládá jednoduše za výsledek menší konkurence mezi plodinou a plevely jako důsledek aplikací glyfosátového herbicidu, protože účinek se pozoroval u plodin, která se nechala růst za podmínek podstatně bez plevelů. Také se pozoroval účinek regulace bez růstu, jak se chápal v dřívějším stavu techniky. Nepozorovalo se žádné dočasné opoždění růstu nebo jiná dočasná změna přirozeného růstu nebo rozvoje plodiny.

Podstata vynálezu

Tento vynález se tedy týká použití glyfosátu nebo jeho derivátů pro zvýšení výtěžku plodin, které jsou tolerantní ke glyfosátu.

S výhodou se glyfosát aplikuje v obvykle letálních dávkách pro kontrolu populace plevelů, aby se současně zničily plevele. Glyfosátový herbicid se aplikuje v jednom ošetření nebo ve více postupných ošetřeních.

Použité dávky jsou obecně v rozsahu od 0,2 do 6,0 kg kyselých ekvivalentů (a. e.)/ha, v závislosti na klimatických podmínkách, zamoření plevely, stadiu plevelných rostlin a v závislosti na plodinách a jiných parametrech známých odborníkovi.

Glyfosátový herbicid lze aplikovat v jeho kyselé formě nebo jeho derivát, s výhodou sůl, jako mono-izopropylamonná sůl, sodná sůl, nebo amonná sůl, nebo jejich směsi. Jiné soli glyfosátu, kde samotný kation není harbicidně aktivní nebo fytotoxický, se také mohou použít.

Účinek ošetření glyfosátovým herbicidem zvyšující výnos byl pozorován u plodin, které jsou tolerantní ke glyfosátu, vybraných z řep Jako jsou cukrová řepa nebo krmná řepa, kukuřice, řepky olejky a bavlny, nezávisle na technice vyvolávající toleranci ke glyfosátovému herbicidu.

Účinek je zvláště zřetelný u cukrové řepy a krmné řepy odolné ke glyfosátu.

Glyfosátový herbicid lze například aplikovat v kyselé formě, nebo ve formě jeho derivátů, jako jsou ve vodě rozpustné nebo dispergovatelné granule, jako ve vodě rozpustný koncentrát zředěný v rozprašované vodě, nebo ve formě jiných typů formulací, napřílďad emulze, zapouzdřené aktivní složky a jiné.

Glyfosátový herbicid lze aplikovat a v jedné aplikační dávce nebo v postupných aplikacích v různých stadiích růstu rostliny. Účinek ošetření glyfosátovým herbicidem u plodin tolerantních ke glyfosátu se ukázal nej významnější, když se ošetření použije ve stadiu růstu daných rostlin.

-3CZ 292220 B6

Takové směsi s adjuvans lze nalézt v „McCutcheon's Emulsifiers and Detergents“ a lze je s výhodou vybrat z

- aminů, jako jsou ethoxylované alkylaminy, zejména lojové aminy, kokosové aminy, 5 povrchově aktivní látky prodávané pod obchodním názvem Ethomeen, aminoxidy, jako jsou povrchově aktivní látky prodávané pod obchodním názvem Empigen OB,

- kvartémích amoniových solí, jako jsou ethoxylované a/nebo propoxylované kvartémí amoniové soli, podrobněji povrchově aktivní látky prodávané pod obchodním názvem Ethoquad, Emcol CC a Dodigen,

- alkylpolyglykosidů, alkylglykosidů, esterů glykózy a sacharózy.

Nejvýhodnější jsou kvartémí amoniové soli, jak jsou definovány v EP 0 441 764, případně ve směsi se smáčedlem, nejvýhodněji s alkoxylovaným esterem sorbitanu. Tento typ povrchově aktivní látky nebo směs povrchově aktivních látek nevykazuje významně fytotoxické účinky na 15 kulturní rostliny a dává se jim přednost pro jejich charakteristiky vlídné k životnímu prostředí.

Kvartémí amoniové soli zvláštního zájmu jsou trimethylethoxypolyoxypropyl amonium chloridy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Rostliny cukrové řepy geneticky modifikované podle technologie popsané vEP0218571, aby se převedly na toleranci ke glyfosátovému herbicidu, sely se podle spolehlivé agronomické praxe se vzdáleností mezi rostlinami 4,5 cm v řádku a ručně se jednotily, aby se zajistilo normální stanoviště plodiny v randomizovaném blokovém pokusu. Velikost dílce 2,7 x 6 m; 6 řad na dílec se vzdáleností mezi řádky 0,45 m. Použily se čtyři opakování na test.

Zkušební dílce se udržovaly v podstatě bez plevelů: pokud to bylo potřeba pre-emergentní aplikací herbicidu, a specifikováno post-emergentním ošetřením glyfosátem jak je uvedeno níže nebo standardními oficiálně přijatými ošetřeními řepy (pro účely porovnání).

Použily se následující ošetření:

Číslo 1 Standardní herbicid pro řepu

Číslo 2 Standardní herbicid pro řepu v dvojité dávce

Číslo 3 3 x 720 g. e./ha formulovaného glyfosátu

Číslo 4 3x1 080 g a.e./ha formulovaného glyfosátu

Číslo 5 3x1 440 g a.e./ha formulovaného glyfosátu

Číslo 6 2x2 160 g a.e./ha formulovaného glyfosátu

Pokud se aplikují tři postupné aplikace glyfosátového herbicidu, prvé se provádí ve stadiu 2 až 50 4 listů plodiny, druhé se provádí ve stadiu 6 až 8 listů plodiny a třetí se provádí ve stadiu 10 až listů plodiny, avšak před uzavíráním klenby listů.

Pokud se provádí dvě postupné aplikace, pak se první provádí ve stadiu 2 až 4 listů a druhá se provádí ve stadiu 10 až 12 listů plodin.

-4CZ 292220 B6

Směs glyfosátového herbicidu obsahovala 360 g glyfosátu na litr jako izopropylamonná sůl al80g na litr povrchově aktivní látky složené ztrimethyl ethoxypolyoxypropyl(8)amonium chloridu a ethoxylovaného(20)esteru sorbitanu (80:20). Směs glyfosátu se aplikovala v objemu vody 200 1/ha při tlaku 2.10⁵Pa.

Čerstvá hmotnost kořenů se měřila při sklizni. Čerstvá hmotnost kořenů po standardním ošetření N.l se považovala za 100% výtěžek a měřená čerstvá hmotnost kořenů se vztahovala k výsledku standardního ošetření N. 1

Tabulka I.a

Ošetření % výtěžku (čerstvá hmotnost kořenů na hektar)

1* 100

2*96

3108

4108

5110

6113 * Standardní ošetření zahrnovalo tři aplikace

Herbasan	1,0 1/ha	1,0 1/ha	1,0 1/ha
Ethosan	0,11/ha	0,2 1/ha	0,2 1/ha
Goltix	l,0kg/ha	1,0 kg/ha	1,0 kg/ha
Renol S	0,3 1/ha	0,3 1/ha	0,3 1/ha

Tabulka I.b

Ošetření % výtěžku (čerstvá hmotnost kořenů na hektar)

1*100

2*102

3110

4113

5117

6113 * Standardní ošetření zahrnovalo tři aplikace

Goltix	1,7 kg/ha	0,75 kg/ha	1,0 kg/ha
Actiproton	1,7 kg/ha
Benatal P		2,0 1/ha
Venzar		0,4 1/ha
Goltix
Benatal P			2,0 1/ha

-5CZ 292220 B6 i

»í

Tabulka I.c

Ošetření % výtěžku (čerstvá hmotnost kořenů na hektar)

1*100

2*

3129

4156

5136

6132 * Standardní ošetření zahrnovalo pre-emergentní aplikaci a dvě post-emergentní aplikace oficiálně přijatých herbicidů pro cukrovou řepu, jak následuje:

Giltix	3 kg/ha	0,5 kg/ha	0,5 kg/ha
PyraminDF	2 kg/ha
Benatal P		1,0 kg/ha	1,0 1/ha
Stratos			1,0 1/ha

Příklad 2

Stejné testy se opakovaly s krmnou řepou tolerantní ke glyfosátu (geneticky transformovanou stejnou technologií).

Tabulka n.a

Ošetření % výtěžku (čerstvá hmotnost kořenů na hektar)

1*100

2*101

3108

4107

5110

6111 * Standardní ošetření tohoto testu zahrnovalo tři aplikace

Herbasan	1,0 1/ha	1,0 1/ha	1,0 1/ha
Ethosan	0,11/ha	0,2 1/ha	0,2 1/ha
Goltix	1,0 kg/ha	1,0 kg/ha	1,0 kg/ha
Renol S	0,3 1/ha	0,3 1/ha	0,3 1/ha

Stejný test se opakoval ve stejné linii jak je uvedeno výše, pouze herbicid se aplikoval preemergentně na všech dílcích. Skládal se z 1,0 1/ha Goltixu (obchodní název) a 3,0 1/ha Benatalu E (obchodní název).

Tabulka H.b

Ošetření % výtěžku (čerstvá hmotnost kořenů na hektar)

1*100

2*100

3108

I

4110

5113

6110 * Standardní ošetření tohoto test zahrnovalo jednu aplikaci:

Goltix	1,0 kg/ha
Benatal E	3 1/ha

Příklad 3

Pro tento pokus se použil v podstatě stejný protokol jako v příkladu 1 a 2.

Rostliny cukrové řepy se sely počátkem května 1995 podle spolehlivé agronomické praxe. Zkušební dílce se udržovaly podstatně bez plevelů ručním pletím (neošetřeno) nebo aplikací glyfosátového herbicidu, podle vhodnosti. Glyfosát se aplikoval jako směs izopropylamonné soli glyfosátu obsahující 360 g/1 kyselého ekvivalentu a 180 g/1 povrchově aktivní látky (trimethyl ethoxypolyoxypropyl(8amonium chlorid (80) s ethoxylovaným(20)esterem sorbitanu (20)).

TI = stadium 2 až 4 listů (přibližně 30 dní po setí)

T2 = stadium 8 až 10 listů (přibližně 50 dní po setí)

T3 = stadium 14 až 18 listů (přibližně 65 dní po setí)

Tabulka ΙΠ níže ukazuje čerstvou hmotnost kořenů (v g) na rostlinu 180 dní po setí pro řadu dávek směsi glyfosátu, jak jsou uvedeny výše.

Tabulka ΙΠ

TI	T2	T3	180 dní po setí g
Neošetřeno	Neošetřeno	Neošetřeno	1 420
2	2	21	1 717
3	0	31	1 538
6	0	61	1 885
4	0	41	1 904

Tento experiment jasně ukazuje zvýšení čerstvé hmotnosti kořenů při sklizni po řadě aplikací glyfosátu. Je zde také trend ke zvýšení výtěžku jako funkce aplikovaných dávek glyfosátu.

Zvýšený výtěžek suché hmotnosti rostlin při sklizni se také promítá do odpovídajícího zvýšení suché hmotnosti rostlin při sklizni.

Příklad 4

Účelem tohoto pokusu bylo srovnání transgenních cukrových řep, které byly postříkány směsí glyfosátového herbicidu, z hlediska kvality řepy (obsah cukru, polarizovaného cukru, draslíku, sodíku, amino-dusíku v kořenech, živiny ve vzorcích kořenů a chrástu, suchá hmota, obsah surové vlákniny a toxinů).

Cukrová řepa se hlavně používá v cukrovamickém průmyslu k produkci bílého cukru, řízků a melasy. Technologická hodnota řepy pro tyto účely je obecně hodnocena analýzou obsahu cukru, draslíku, sodíku a amino-dusíku. Pokud se týká jedovatých látek v řepě, monitorují se saponiny.

Příprava vzorků

Po sklizni se řepa udržovala mezi 0 °C a 10 °C a chrást se zmrazil na méně než -20 °C.

Příprava řepy na kaši se provádí poloautomatickým zpracováním, kdy se řepa rozřeže na řepné pile, čímž vznikne kaše. Pak se kaše homogenizuje, 1 vzorek se použije po extrakci na analýzu polarizace, polarizovaného cukru, Na, K a amino-dusíku, a jiný podvzorek se suší a použije se pro analýzu živin. Třetí část stejného vzorku kaše se zmrazila pro analýzu jedovaté látky. Extrakce řepné kaše se prováděla s demineralizovanou vodou, ke které se přidala tableta síranu hlinitého pro čiření, a přenesla se do automatického digesčního a filtračního zařízení Venema. Zpracování objemného řepného chrástu se provádělo jeho vodorovným dělením do stejných podvzorků.

Analytické metody:

Suchá hmotnost - metoda sušárny (EF 71/393/E0F, L279/7 strany 858-61 20/12-71):

Kořen:

Když se kořen zpracuje na kaši, vzorek kaše se dá do sušárny při 95 °C a suší se 24 hodin (do konstantní hmotnosti).

Chrást:

Vzorek se dá do sušárny při 95 °C a suší se až 72 hodin v závislosti na velikosti vzorku do konstantní hmotnosti).

Jak pro kořen, tak pro chrást se ztráta hmotnosti kvantifikuje a vypočítá se jako procenta suché hmotnosti.

Surová vláknina - metoda Weende (EF L 344/36-37 26/11-92, modifikovaná):

Vzorek se zpracuje postupně ve vroucích roztocích kyseliny sírové a hydroxidu draselného o specifikovaných koncentracích. Zbytek se oddělí filtrací na Goschově kelímku se skelnou vlnou, promyje se, suší, zváží a spálí se v muflové peci při 550 °C během 3 hodin. Ztráta hmotnosti spalováním se kvantifikuje gravimetricky a vypočítá se jako procenta surové vlákniny ve vzorku.

Toxiny: Saponiny- metoda HPLC (Hilmer S0rensen, KVL 1991, modifikovaná DC):

Metoda se zakládá na kyselé hydrolýze saponinů řepy. Uvolněná oleanolová kyselina se extrahuje s dichlormethanem. Po odpaření vody ze vzorku se zbytek rozpustí v methanolu Oleanolová kyselina se odhadne HPLC v reversní fázi s acetonitrilem/vodou a stanoví se při 210 nm na UV detektoru.

Obsah cukru v extraktu řepy - polarizace (Pol) (ICUMSA, Sugar, Analysis 1979, Proč. 1990)

Extrakt řepy, vyčištěný síranem hlinitým se stanoví na polarimetru typu PROPOL, který je založen na stanovení poměru optické rotace. Optická rotace se měří při 546 nm v 70 mm dlouhé trubici a konvertuje se na Z (Pol%) nebo g/100 g řepy.

Obsah amino-dusíku v extraktu řepy-SMAIIC analyzátor (ICUMSA, Sugar, Analysis 1979, modifikováno):

I

Extrakt řepy, vyčištěný síranem hlinitým se stanoví na kolorimetru při 570 nm po barevné reakci s ninhydrinem.

Draslík a sodík v extraktu řepy - SMAIIC analyzátor (Technicon, Těch. Publ. THO-0160-10):

Extrakt řepy, vyčištěný síranem hlinitým se stanoví na plamenném fotometru IV, kde se intenzita světelné energie emitované draslíkem a sodíkem v plameni měří při 586 a 768 nm. Vzorek se zředí síranem lithným, kde se lithium používá jako vnitřní standard k vyrovnání signálu z plamenného fotometru.

Invertní v extraktu řepy - SMAIIC analyzátor (Technicon, Těch. Publ. THO-0160-10):

Extrakt řepy, vyčištěný síranem hlinitým se stanoví na kolorimetru při 560 nm po reakci s reagentem síranem měďnatým - neokuproin hydrochloridem.

Rostliny cukrové řepy tolerantní k glyfosátu geneticky přeměněné podle technologie popsané VEP0218571 pro toleranci ke glyfosátovému herbicidu se pěstovaly na 6 různých stanovištích (Itálie, Španělsko, Belgie, Dánsko, Francie a Spojené království)

Typy pěstovaných variet závisí na místních požadavcích. Materiál se liší v řadě charakteristik, jednou důležitou charakteristikou je obsah cukru stanovený polarizací (Pol). Cukrové řepy se mohou rozdělit do podskupin: E-typ, N-typ a Z-typ. E-typ má nízkou polarizaci, Z-typ má vysokou polarizaci a N-typ je mezi E a Z. Variety pěstované v Severní Evropě lze charakterizovat jako E-N, N nebo N-Ztypy. Materiál použitý v tomto příkladě spadá do N skupiny.

Cukrové řepy se sely podle místních spolehlivých agronomických postupů, ručně se jednotily, aby se zajistilo normální stanoviště plodiny. Použilo se alespoň jedno opakování na test.

Dílce se udržovaly podstatně bez plevelů aplikací:

- glyfosátového herbicidu na testovaných dílcích

- standardním ošetřením herbicidem selektivním pro řepu (podle polohy) na kontrolních dílcích, s výjimkou Dánska a Itálie, kde se nepovažoval jiný herbicid než glyfosát za potřebný pro udržování podmínek bez plevelů.

Formulace glyfosátového herbicidu je stejná jako v příkladě 1. Formulace glyfosátového herbicidu se aplikoval následovně:

- pre-emergentně 2,51/ha

- stadium 2 až 4 pravých listů řepy 2 1/ha

- stadium 6 až 8 pravých listů řepy 2 1/ha

- stadium 12 až 14 pravých listů (uzavírání klenby) 2 1/ha

Dávky selektivního herbicidu se aplikovaly následovně: - Španělsko:

Goltix WG 3,55 kg/ha (metamitron) pre-emergentně.

Belgie

1/ha Gramoxon (paraquat 200) před setím

1/ha Pyramin FL (chloridazon 430) 1 týden po setí

0,5 1/ha Benatal (Phenmedipham 150) 3 týdny po setí

0,5 1/ha Goltix (metamitron 70 % WP) 3 týdny po setí

-9CZ 292220 B6

0,5 1/ha Tramat (ethofumesát 200)

0,75 1/ha Goltix

0,75 1/ha Vegelux (minerální olej 40)

0,75 1/ha Tramat

0,75 1/ha Goltix

0,75 1/ha Vegelux

0,171/ha Fusilade

0,75 1/ha Benatal

0,75 1/ha Tramat

0,75 1/ha Benatal

0,75 1/ha Goltix

0,75 1/ha Vegelux týdny po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí týdnů po setí

Francie:

0,75 1/ha Goltix (metamitron)

0,75 1/ha Goltix WP den po setí týdny po setí

0,75 1/ha Benatal (phenmedipham 150) 2 týdny po setí

0,75 1/ha Tranam (ethofumasát 200) 2 týdny po setí

Spojené království:

1,01/ha Laser (cycloxidym) týdnů po setí

Analytické výsledky se shrnuly a průměry jsou reprodukovány v tabulce níže, všechny státy mají stejné váhy při počítání průměrů.

Část rostliny	Analyzovaná jednotka	Ošetřeno/Neošetřeno	Cukrová řepa
kaše	Suchá hmota	Ošetřeno	21,309
	g/100 g kořene	Neošetřeno	20,444
kořen	inverzní cukr	Ošetřeno	1,011
	mmol/100 g kořene	Neošetřeno	1,755
	draslík	Ošetřeno	5,162
	mmol/100 g kořene	Neošetřeno	5,286
	NH2N	Ošetřeno	2,470
	mmol/100 g kořene	Neošetřeno	2,878
	sodík	Ošetřeno	1,118
	mmol/100 g kořene	Neošetřeno	1,769
	Pol	Ošetřeno	15,610
	mmol/100 g kořene	Neošetřeno	14,478
chrást	suchá hmota	Ošetřeno	14,724
	g/100 g chrástu	Neošetřeno	13,996

Ošetřeno: postříkáno glyfosátovým herbicidem

Neošetřeno: nepostříkáno glyfosátovým herbicidem

Data ukazují, že cukrová řepa ošetřená glyfosátovým herbicidem má významně vyšší obsah cukru se sníženým sodíkem, draslíkem, amino-dusíkem a polarizovaného cukru v kořenech. 35 Suchá hmota kořene a chrástu je také zvýšena. Podrobnější údaje naznačují, že listy cukrové řepy ošetřené glyfosátem mají vyšší obsah vláknin. Při korelaci výsledků tohoto příkladu s výsledky předešlých příkladů se ukazuje, že zvýšení výtěžku vyhodnocené dříve ve hmotnosti na hektar, se také projevuje jako zvýšení suché hmoty, vlákniny a obsahu cukru ve sklizeném materiálu.

-10CZ 292220 B6

I

Příklad 5

Rostliny cukrové řepy a krmné řepy geneticky modifikované podle technologie popsané vEP0218571, aby se učinily tolerantní ke glyfosátovému herbicidu, se sely na různých stavištích podle spolehlivé agronomické praxe se vzdáleností mezi rostlinami 4,5 cm řádku a ručně se jednotily, aby se zajistilo normální stanoviště plodiny v randomizovaném blokovém pokusu. Velikost dílce 2,7 x 6 m 6 řad na dílec se vzdáleností mezi řádky 0,45 m. Použily se čtyři opakování na test.

Zkušební dílce se udržovaly podstatně bez plevelů: standardní předběžnou aplikací herbicidu na celou plochu a potom ručním pletím, a pokud to bylo potřeba ošetřením glyfosátem po potřebě, použitým jak je specifikováno níže.

Použily se následující ošetření:

Pouze ruční pletí x 720 g a.e./ha formulovaného glyfosátu

3x1 080 g a.e./ha formulovaného glyfosátu

3x1 440 g a.e./ha formulovaného glyfosátu

2x2 160 g a.e./ha formulovaného glyfosátu

Pokud se aplikují tři dostupné aplikace glyfosátového herbicidu, prvé se provádí ve stadiu 2 až pravých listů plodiny, druhé se provádí ve stadiu 6 až 8 pravých listů plodiny a třetí se provádí ve stadiu 10 až 12 pravých listů plodiny, avšak před uzavíráním klenby.

Směs glyfosátového herbicidu obsahovalo 360 g glyfosátu na litr jako izopropylamonná sůl al80g na litr povrchově aktivní látky složené ztrimethyl ethoxypolyoxypropyl(8)amonium chloridu a ethoxylovaného(20)esteru sorbitanu (80:20). Směs glyfosátu se aplikovala v objemu vody 200 1/ha při tlaku 2.10⁵Pa.

Čerstvá hmotnost kořenů se měřila při sklizní. Čerstvá hmotnost kořenů pouze ručně pletých dílců se považovala za 100% výtěžek a měřená čerstvá hmotnost kořenů po ošetření glyfosátem se vztahovala k výsledku ručně pletých dílců.

Tabulka V % výtěžek (čerstvá hmotnost kořenů)

Ošetření	Cukrová řepa	Krmná řepa
Ručně pieto	100 %	100%
3 x 720 g a.e.	101	105
3 x 1 080 g a.e.	98	106
3x1 140 g a.e.	115	108
3x2 160 ga.e.	107	102

Příklad 6

Pro tento polní pokus se geneticky modifikované rostliny zimní řepky olejky s existujícím genetickým základem pro vykazování tolerantnosti ke glyfosátovému herbicidu (podle kombino

-11 CZ 292220 B6

I vane techniky exprese EPSPS a exprese glyfosát oxidereduktázy se sely v polovině září 1995 podle spolehlivých agronomických postupů při 4 kg semen/ha, odpovídajících přibližně 100 rostlinám na m² (normální stanoviště plodiny), podle randomizovaného blokovacího pokusu, velikosti dílce 3 x 7 m, vzdálenost mezi řádky 0,14 m, čtyři opakování na test.

Dílce se udržovaly podstatně bez plevelů: standardní pre-emergentní aplikací herbicidu na celou plochu, například 1,5 1 Butizanu (Metazachlor) jeden den po setí a 11 navíc u standardních dílců a ošetřením glyfosátem použitým jak je specifikováno níže:

Ošetření glyfosátem se použily na podzim ve stadiu růstu rostlin B4 až B5; použila se stejná směs jako se použila v příkladě 1.

Ke sklizni došlo začátkem srpna a výnos se měřil a vyjádřil v tunách zrna na hektar (při 9% vlhkosti). Tabulka VI ukazuje měřené výtěžky v % výtěžku standardního dílce.

Tabulka VI

Výtěžek

Standard 100

080 g a.e./ha 104,5

Příklad 7

Tento polní pokus se provedl podobně jako test v předešlém příkladě, pouze se v tomto příkladě sela jarní řepka olejka (v polovině dubna 1996). Takové rostliny se známým genetickým základem se převedly na tolerantní ke glyfosátovému herbicidu (podle kombinované techniky zmíněné v příkladu 6).

Dílce se udržovaly podstatně bez plevelů aplikací 1,5 1 Butizanu na celou plochu a ručním pletím pro standardní dílce a glyfosátový herbicid na ostatních dílcích. Stejná směs glyfosátového herbicidu se aplikovala asi 1 měsíc po setí, to znamená ve stadiu růstu B3 až B4. Sklizeň proběhla v polovině srpna.

Tabulka VII níže ukazuje údaje o výtěžku (měřeno a vyjádřeno jako v příkladě 6) v % hmotnostních na standardních dílcích.

Tabulka VII

	Výtěžek
Standard	100
720 g a.e./ha	120
1 080 g a.e./ha	112

Příklad 8

Aby se vyhodnotilo zvýšení výtěžku kukuřice tolerantní ke glyfosátu po aplikaci(ch) glyfosátového herbicidu prováděly se další pokusy v Itálii. Známé rostliny kukuřice geneticky modifikované pro tolerantnost ke glyfosátu podle kombinované techniky experese EPSPS a glyfosát oxidoreduktázy se sely a pěstovaly podle spolehlivých agronomických postupů přibližně 62 000 rostlin/ha (přibližně 4,7 semene/m) v dílcích 3x9 m se čtyřmi 9 m řadami rostlin v každém, ve zcela randomizovaném blokovém pokusu se čtyřmi opakováními, a ručně se

- 12CZ 292220 B6 jednotily, aby se zajistilo normální stanoviště plodiny a stejný počet rostlin ve všech dílcích. Celá plocha zahrnující standardní dílce a testované dílce se ošetřila pre-emergentním herbicidem (Lasso Micromix) v dávce 6 1/ha (například 2 016 g alachloru a 864 g terbutylazinu). Standardní dílce se udržovaly bez plevelů ručním pletím, pokud to bylo třeba, a testované dílce stejnou směsí glyfosátového herbicidu jako v příkladě 1 ve více dávkách a stadiích růstu daných rostlin. Pouze obě střední řady se sklidily na střední délce 7 m. Výnos se měřil v tunách zrna na hektar vyjádřený při 15 % vlhkosti aje ukázaný v tabulkách jako % výtěžku standardu (STD).

Tabulka XHIa % výtěžku (ošetření glyfosátem ve stadiu 3 až 4 listů)

	Transformace Případ 1	Transformace Případ 2
STD	100	100
720 g glyfosátu a.e./ha	106	103
1 800 g a.e./ha	107	107

Tabulka XHIb % výtěžku (ošetření glyfosátem ve stadiu 5 až 6 listů)

	Transformace Případ 1	Transformace Případ 2
STD	100	100
720 g glyfosátu a.e./ha	114	105
1 080 g a.e./ha	109	108
1 140 g a.e./ha	109	105
1 800 g a.e./ha	111	102

Příklad 9

Aby se vyhodnotil účinek různých směsí glyfosátového herbicidu na zvýšení výtěžku, provedl se další polní pokus podle stejného postupu jako v příkladě 1. Transgenní rostliny třikrát ošetřily glyfosátovým herbicidem při 720 g a.e./ha a 1 080 g a.e./ha.

Tabulka IX

Ošetření % výtěžku (čerstvá hmotnost kořenů)

Roundup®

Granulovaná směs

Kapalná směs x 720 g a.e.

100

101,4

101,4 x 1 080 g a.e.

100,2

Roundup®

- izopropylamonná sůl glyfosátu 430 g a.e./kg

- povrchově aktivní látka ethoxylovaný lojový amin 180 g/1

-13CZ 292220 B6

I

Pevná směs:

- glyfosát sodný 430 g a.e./kg

- trimethyl ethoxypolyoxypropyl(8)amonium chlorid 160 g/kg

- síran amonný 330 g/ha

Kapalná směs: stejná jako v příkladě 1.

Tento příklad ukazuje tendenci ke zlepšení výkonu směsi obsahující povrchově aktivní látku 10 nepoškozující životní prostředí, jak bylo definováno.

Příklad 10

Podobný postup jak byl popsán v příkladě 7 (jarní řepky olejky) se sledoval v tomto příkladě, aby se vyhodnotil účinek odlišných směsi glykofosátového herbicidu. Zkušební dílce v tomto testu byly 1,5 x 10 m.

Tabulka X

Výtěžek v tunách/ha zrna při 9% vlhkosti

	% výtěžku
1/ha	1	2	3	4
Roundup®	100	100	100	100
Granulovaná směs	101	103	109	—
Kapalná směs	103	101	110	108

Výtěžek, který se získal po ošetření Rouddupem® se považoval za 100 %

Tento příklad dále potvrzuje převahu směsi použité v příkladě 7.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu pro zvýšení výtěžku plodin, které jsou vybrané z ke glyfosátu tolerantní cukrové řepy, krmné řepy, kukuřice, řepky olejky a bavlny, přičemž se glyfosát nebo jeho derivát aplikuje obvykle v letální dávce.
2. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle nároku 1, přičemž se glyfosát nebo jeho derivát aplikuje v obvykle letální dávce 0,2 a 6,0 kg a.e./ha.
3. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle nároku 1 nebo 2, přičemž se glyfosát nebo jeho derivát aplikuje v jednom ošetření nebo v postupných ošetřeních.
4. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde je to glyfosátová sůl, mono-izopropylamonná sůl, amonná sůl nebo sodná sůl, nebo jejich směsi.
5. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, přičemž se použije ve směsi s adjuvans vybraně z

- aminů, jako jsou ethoxylované alkylaminy, zejména lojové aminy, kokosové aminy, povrchově aktivní látky na bázi aminů, aminoxidy, jako jsou povrchově aktivní látky na bázi aminoxidů,

- kvartérních amoniových solí, jako jsou ethoxylované a/nebo propoxylované kvartémí amoniové soli, zejména povrchově aktivní látky na bázi kvartérních amoniových solí,

- alkylpolyglykosid nebo alkylglykosid, estery glukózy a sacharózy, s výhodou s ethoxylovanou propoxylovanou kvartémí amoniovou povrchově aktivní látkou.
6. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro zvýšení výtěžku řepy, řepky olejky, bavlny nebo kukuřice, které se staly tolerantní ke glyfosátu.
7. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle nároku 6, pro zvýšení výtěžku a nebo kvality plodin cukrové řepy nebo krmné řepy.
8. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde plodina obsahuje gen, který kóduje EPSPS polypeptid.
9. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde plodina obsahuje gen, který kóduje enzym glyfosát oxidoreduktázu.
10. Použití glyfosátu nebo jeho derivátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde plodina obsahuje gen, který kóduje enzymy třídy Π EPSPS.