JP2000507565A - Ｎ―（ホスホノメチル）グリシンおよびその誘導体の新規な使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はテンサイ、飼料ビート、コーン、菜種および綿から選択されるグリホセート耐性を有する作物の収穫量および／または品質を向上させるためのグリホセートまたはその誘導体の新規な使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンおよび その誘導体の新規な使用 本発明はグリホセートに対して耐性を有する植物の収穫量を高める薬剤として のグリホセート、すなわちＮ−（ホスホノメチル）グリシン、およびその誘導体 、例えばその塩およびエステルの使用に関する。 グリホセートは有効な（発芽後の）全葉活性非選択的除草剤としてよく知られ ている。グリホセートは種々の酵素系に作用することが知られており処理した植 物においてアミノ酸および他の内因的な化物質の生成を妨害する。酸形態の水溶 性が比較的低いため、グリホセートは殆ど塩形態、例えばモノ−イソプロピルア ンモニウム塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩などの形態で販売されている。 よく知られている製剤は活性成分および界面活性剤または界面活性剤混合物、 場合により他の添加剤、例えば消泡剤、凍結防止剤、染料、および当該技術分野 で知られている他の作用物質を含有する。E．GrossbardおよびD．Atkinson編の 「グリホセート除草剤」、Butterworts & Co（1985年）もまた参照されたい。 US−3 853 530は落葉および植物の生長阻止のように、植物の自然な生長また は発達を変えるためのＮ−ホスホノメチルグリシンおよびその誘導体の使用を開 示している。特定の植物において、この阻止は主茎を短くし、側生枝を増やすと 言われている。この自然な生長または発達の変化はしばしば乾ばつおよび害虫侵 入に対する耐性の増大の証拠となるより小さい、よりブッシュの植物をもたらす 。芝生の場合、植物の生長阻止は非常に望ましく、根の発達を増進して密生した 、より生長力の強い芝生とし、また芝地、ゴルフコースおよび同様の草の多生す る地帯の草刈りの間隔を伸ば す。サイレージ用穀物、ジャガイモ、砂糖きび、ビート、ブドウ、メロンおよび 果樹のような様々な植物において、グリホセートにより生じる植物の生長阻止は 収穫時の植物の炭水化物含量を増加させると言われている。明らかに、これらの 施用では枯死量にまで達しない施用量（半枯死量）を使用する必要がある。そう でなければ、これで処理した植物が枯死してしまうからである。 さらに詳しくは、US−3 988 142は砂糖きびのような植物の炭水化物含量を増 加させるためのＮ−ホスホノメチルグリシンおよびその誘導体の使用を開示して いる。また、その使用量は半枯死量であり、収穫直前に施される。 上記の何れの場合にも、枯死量にまで達しない施用量、すなわち農作地の雑草 集団を除去するのに通常使用される量よりかなり低い用量のグリホセート除草剤 は植物の生長の低下または阻止を生じ、活性物質は植物中でその除草作用をする 時に通る通常の経路を通ると考えられている。US−3 988 142の場合、植物の生 長阻止は植物中の利用可能な炭水化物を植物の生長を継続するための栄養物とし て使用するよりも多く殿粉またはスクロースに変換することができると考えられ ている。 DE−3 200 486は有効な非選択的除草剤でもあるホスフィノトリシン(グルホシ ネート)を枯死量にまで達しない量を使用して作物を処理することによりその生 産性を改善することを開示している。また、半枯死量の除草剤による植物の生長 阻害は植物またはその果実中の炭水化物を増加させると考えられている。DE−3 200 486はグルホシネートが同じ割合のグリホセートより良好な効果を示すこと を証明するための比較例（実施例II）においてグリホセートに言及している。 EP−0 401 407は同様の内容に関するものである。それはテンサイ、ジ ャガイモまたはとうもろこしのような砂糖きび以外の糖または殿粉を生成する植 物中の炭水化物含量を増加させるために、植物の集団を形成する段階から成熟段 階までの過渡期の間に半枯死量の非選択的除草剤、とりわけグリホセートおよび ホスフィノトリシンを使用することを開示している。 WO 95／05082はホスフィノトリシンのようなグルタミンシンテターゼ阻害剤に 対して耐性を有する作物を農作地の雑草を除去するのに使用される除草剤で処理 することによりこのような作物の収穫量を高める方法を開示している。この明細 書はさらに、種々の作用を有する除草剤が農作地でこの効果を示さず、しばしば 負の効果を示すことを述べている。 最近、遺伝子工学において、植物、特に作物をグリホセートまたはその誘導体 に対して耐性を有するようにするため、遺伝学的に形質転換することができるよ うになった。例えば、EP−0 218 571は植物細胞中で発現するとこのような細胞 から再生した植物にグリホセート耐性を付与するEPSPSポリペプチドをコード化 する遺伝子からなるクローニングまたは表現ベクターを開示している。EP−0 29 3 358はさらに、触媒活性を維持しながらグリホセートに対してより低い親和性 を示す突然変異EPSPシンターゼ酵素を生成する事により、グリホセート耐性植物 の有効性を高めることを開示している。WO 92／00377はグリホセートオキシドレ ダクターゼ酵素をコード化する遺伝子を開示している。これらの遺伝子はグリホ セート除草剤を分解し、グリホセート除草剤に対して耐性を有する形質転換植物 を生産するのに有用である。WO 92／04449はIIクラスEPSPS酵素をコード化する 遺伝子を開示しており、それはグリホセート除草剤に対して耐性を有する形質転 換植物を生産するのに有用である。このような作物は発芽後にグリホセート除草 剤を施すことにより実質的に雑草のない状態に維持することができる。ケミカル アブストラクト、第124巻、No．８、（1996）は “雑草”（1995年）の中のB.H．Wellsの「グリホセート耐性作物の市場への導入 」という表題の論文に関するものである。本発明者らは２つのアプローチが幾つ かの作物において商業レベルのグリホセートに対する耐性を付与するために使用 されていることを確認している。 1995年４月３〜６日に開催されたシンポジウムの“雑草および作物の除草剤耐 性についての国際シンポジウムの会議録”において1996年の初めご えうることを示している。 今般、グリホセート除草剤に対して耐性を有するようにしたビート作物、菜種 、またはとうもろこしのような作物を栽培している農作地を通常の枯死量、また は雑草を除去するのに通常使用される量のグリホセート除草剤で処理すると、作 物の収穫量が増加することを予想外に見い出した。この予想外の効果は非耐性の 作物ではその作用は枯死してしまうため、またホスフィノトリシン除草剤はグリ ホセート除草剤とは完全に異なる型の作用を有するため上記の従来技術から予想 することはできなかった。 ケミカルアブストラクト、第123巻、No.21、（1995）はグリホセート耐性大豆 系のグリホセート処理後の収穫量評価に関するX．Delannayらの論文のアブスト ラクト（アブストラクトNo.2811580）を記載している。論文の著者らはデータの 傾向が概して実質的な違いはなく、標準的な除草剤での試験結果との比較はグリ ホセート処理による全収穫量が安定しているという結論を支持し、その変動は不 順な天候および／または土壌条件によるものと考えられることを示唆している、 と結論づけている。 上記の“雑草”（1995年）において、B.H．Wellはまた、作物の様々な段階で グリホセートを１回または連続的に広く散布した後に収穫量の有意な 減少がみられなかったことを記載している。リードライン(lead line)のグリホ セート耐性綿はグリホセートの施用後に収穫量の減少がみられなかったと言われ ている。これらの評価は関連する除草剤に対するそれらの耐性について関連する 作物を遺伝学的に変異する効果を確認するために行われた。この論文にデータは 含まれておらず、グリホセートの施用後に作物の収穫量が増加する可能性につい ては開示も示唆もしていない。 上記のI．Brantsらの論文は標準と比較した幾つかのグリホセート処理におい て３種の形質転換体を特徴とする３つの異なる系のグリホセート耐性テンサイに 関する根の平均重量（％）データを示しているが、当業者はこれらのデータから テンサイの収穫量増加を推測することはできない。データは耐性試験データとし て正確に示されている。表示データは耐性評価が雑草のない条件下で行われてい ないため、すなわち標準区画において雑草との競争が存在しうるため、テンサイ の収穫量増加を示すものではない。さらに、表示データは種子の入手可能性のた め１ヶ所で反復のない、小区画により得られた非常に早生のデータであることは 当業者ならば理解できよう。また、このような早生の種子は種子を分離する物質 を含み、それは標準と比べて不規則な形状の作物になる。結果として、根の平均 重量は(１単位面積あたりでなく)１株あたりで計算され、異なる条件下で生長し た標準と比較される。当業者が上記の論文から引き出せる唯一の結論は３種のテ ンサイ系が商業的に展開できる程度の耐性を示すことがわかったということであ る。 本発明によれば、試験はグリホセート除草剤で処理したビート作物、菜種、と うもろこしまたは綿のようなグリホセート耐性作物の収穫量（１単位表面積あた りの値）はグリホセート除草剤で処理しなかった同じ作物と比較して約50％まで 増加することを示した。収穫量の増加は単にグリホセ ート除草剤の施用結果として雑草と作物との競争が少なくなるため起こるとは考 えられない。何故なら、その結果は実質的に雑草のない条件下で生長する作物に おいても確認されるからである。また、記録に残っている従来技術において理解 されているような生長調節効果は確認されていない。一時的な生長阻止、あるい は穀物の自然な生長、または発達の他の一時的な変化は確認されていない。 したがって、本発明はグリホセート耐性作物の収穫量を増加するためのグリホ セートまたはその誘導体の使用に関する。 好ましくは、グリホセートは同時に雑草を死滅させるために雑草集団を防除す る通常の枯死量で施される。グリホセート除草剤は１回で、または数回の連続処 理により施すことができる。施用量は一般に気候条件、季節、雑草の蔓延、雑草 植物の生長段階に応じて、また作物や当業者に知られている他の要因に応じて0. 2〜6.0Kg酸当量／haの範囲である。 グリホセート除草剤はその酸形態で、またはその誘導体、好ましくは塩、例え ばモノ−イソプロピルアンモニウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩、または それらの混合物として施用することができる。カチオンそのものは除草活性また は細胞毒性でない他のグリホセート塩もまた使用することができる。 グリホセート除草剤処理による収穫量増加効果は、グリホセート耐性を生じさ せるために使用される技術とは独立して、テンサイまたは飼料ビートのようなビ ート類、とうもろこし、菜種および綿から選択されるグリホセート耐性作物にお いて確認された。その効果はグリホセート耐性のテンサイおよび飼料ビートにお いて特に著しい。 グリホセート除草剤は例えばその酸形態またはその誘導体形態で、水溶性また は分散性顆粒として、スプレー用水で希釈される水溶性濃厚物とし て、あるいは乳剤、活性成分を封入したものなどのような他のタイプの配合剤形 態で施用することができる。 グリホセート除草剤は植物の様々な生長段階で１回の施用または連続施用によ り施すことができる。グリホセート耐性作物におけるグリホセート除草剤処理の 効果は関連する植物の生長段階で処理する時に最も有意であることがわかった。 このような配合補助剤は“McCutcheonの乳化剤および洗浄剤”に記載されてお り、有利には -アミン、例えばエトキシル化アルキルアミン、特に獣脂アミン、ココア ミン、エトメーン（Ethomeen）の商品名で販売されている界面活性剤、 酸化アミン、例えばエンピゲン(Empigen)OBの商品名で販売されている 界面活性剤； -第４アンモニウム塩、例えばエトキシル化および／またはプロポキシル 化第４アンモニウム塩、特にエトクァット(Ethoquad)、エムコール （Emcol）CCおよびドディゲン（Dodigen）の商品名で販売されている界 面活性剤； -アルキルポリグリコシド、アルキルグリコシド、グルコースおよびスク ロースエステル から選択される。 湿潤剤、最も好ましくはアルコキシル化ソルビタンエステルと混合することが できる、EP−0 441 764に記載されているような第４アンモニウム塩が最も好ま しい。この種類の界面活性剤または界面活性剤混合物は作物において有意な細胞 毒性効果を示さず、その環境に優しい特性のために好ましい。特に重要な第４ア ンモニウム塩はトリメチルエトキシポリオキシプロピルアンモニウムクロライド である。 実施例 １ EP−0 218 571に開示されている方法に従ってグリホセートに対して耐性を有 するように遺伝学的に変異したテンサイを適当な耕種学的方法に従って株間距離 4.5cmの列にして播種し、そして乱塊法；区画の大きさ：2.7×６ｍ；１区画あた り６列、列間距離0.45ｍに従って正常な形状の作物が得られるように手で間引い た。それぞれの試験は４回繰り返した。 試験区画を実質的に雑草がないように保持した；それが必要で明記した場合は 発芽前の除草剤施用により、下記のように施される発芽後のグリホセート処理剤 により、または公認の標準的なビート処理剤（比較用）による。 次の処理剤を施した； Ｎ．１ 標準的なテンサイ除草剤 Ｎ．２ ２倍量の標準的なテンサイ除草剤 Ｎ．３ ３×720ｇ酸当量／haのグリホセート配合物 Ｎ．４ ３×1080ｇ酸当量／haのグリホセート配合物 Ｎ．５ ３×1440ｇ酸当量／haのグリホセート配合物 Ｎ．６ ２×2160ｇ酸当量／haのグリホセート配合物 グリホセート除草剤の３回連続施用が行われる場合、１回目は作物の２〜４葉 段階で行われ、２回目は作物の６〜８葉段階で行われ、そして３回目は作物の10 〜12葉段階で天蓋のように葉が茂る前に行われる。 ２回連続施用が行われる場合、１回目は作物の２〜４葉段階で行われ、そして ２回目は10〜12葉段階で行われる。 グリホセート除草剤の配合物はイソプロピルアンモニウム塩として360ｇ酸当 量／ｌのグリホセート、並びにトリメチルエトキシポリオキシプロピル(８)アン モニウムクロライドおよびエトキシル化(20)ソルビタンエス テル(80：20)からなる180ｇ／ｌの界面活性剤を含有した。グリホセート配合物 は２バールの圧力下、200ｌ／haの水量で施した。 新鮮な根の重量を収穫時に測定した。標準処理Ｎ．１を施した後の新鮮な根の 重量を100％の収穫量とみなし、測定した新鮮な根の重量を標準処理Ｎ．１の結 果と比較した。 表Ｉ．ａ 処理 収穫量(％)(１ヘクタールあたりの新鮮な根の重量) １^* 100 ２^* 96 ３ 108 ４ 108 ５ 110 ６ 113 ＊ 標準処理は３回の施用からなる： ヘルバサン 1.0ｌ／ha 1.0ｌ／ha 1.0ｌ／ha エトサン 0.1ｌ／ha 0.2ｌ／ha 0.2ｌ／ha ゴルティックス 1.0Kg／ha 1.0Kg／ha 1.0Kg／ha レノールＳ 0.3ｌ／ha 0.3ｌ／ha 0.3ｌ／ha 表Ｉ．ｂ 処理 収穫量(％)(１ヘクタールあたりの新鮮な根の重量) １^* 100 ２^* 102 ３ 110 ４ 113 ５ 117 ６ 113 ＊ 標準処理は３回の施用からなる： ゴルティックス 1.7Kg／ha 0.75Kg／ha 1.0Kg／ha アクチプロン 1.7ｌ／ha ベタナールＥ 2.0ｌ／ha ベンザール 0.4ｌ／ha ゴルティクス ベタナールプログ 2.0ｌ／ha 表Ｉ．ｃ 処理 収穫量(％)(１ヘクタールあたりの新鮮な根の重量) １^* 100 ２^* − ３ 129 ４ 156 ５ 136 ６ 132 ＊ 標準処理は公認のテンサイ除草剤の発芽前施用および２回の発 芽後施用からなる： ゴルティックス ３Kg／ha 0.5Kg／ha 0.5Kg／ha ピラミンDF ２Kg／ha ベタナールＰ 1.0Kg／ha 1.0ｌ／ha ストラトス 1.0ｌ／ha 実施例 ２ 同じ試験をグリホセート耐性飼料ビート（同じ方法により遺伝学的に形質転換 した）について繰り返した。 表II．ａ 処理 収穫量(％)(１ヘクタールあたりの新鮮な根の重量) １^* 100 ２^* 101 ３ 108 ４ 107 ５ 110 ６ 111 本試験の標準(＊)は３回の施用からなる： ヘルバサン 1.0ｌ／ha 1.0ｌ／ha 1.0ｌ／ha エトサン 0.1ｌ／ha 0.2ｌ／ha 0.2ｌ／ha ゴルティックス 1.0Kg／ha 1.0ｌ／ha 1.0Kg／ha レノールＳ 0.3ｌ／ha 0.3ｌ／ha 0.3ｌ／ha 発芽前に１Kg／haのゴルティックス（商品名）および３ｌ／haのベタナールＥ （商品名）からなる除草剤をすべての区画に施すことを除けば、同じ試験を上記 と同じ系について繰り返した。 表II．ｂ 処理 収穫量(％)(１ヘクタールあたりの新鮮な根の重量) １^* 100 ２^* 100 ３ 108 ４ 110 ５ 113 ６ 110 ＊ 本試験の標準は１回の施用からなる： ゴルティックス １Kg／ha ベタナールＳ ３ｌ／ha 実施例 ３ この実験では、実質的に実施例１および２と同じプロトコルに従った。グリホ セート耐性テンサイを適当な農耕法に従って1995年５月初旬に植えた。各区画を 人の手で除草すること（未処理）により、または適当にグリホセート除草剤を施 すことにより、実質的に雑草がないように保持した。グリホセートは360ｇ／ｌ 酸当量のグリホセートのイソプロピルアンモニウム塩および180ｇ／ｌの界面活 性剤（トリメチルエトキシポリオキシプロピル(８)アンモニウムクロライド(80) およびエトキシル化(20)ソルビタンエステル(20)）からなる配合物として施した 。 Ｔ１＝２〜４葉段階（約30DAP；播種後の日数） Ｔ２＝８〜10葉段階（約50DAP） Ｔ３＝14〜18葉段階（約65DAP） 下表IVは上記のように数種の用量グリホセート配合物を施用して測定した１植 物（180DAP）当たりの新鮮な根の平均重量(ｇ)を示す。 表 III Ｔ１ Ｔ２ Ｔ３ 180DAP( ｇ) 未処理 未処理 未処理 1420 ２ ２ ２ｌ 1717 ３ ０ ３ｌ 1538 ６ ０ ６ｌ 1885 ４ ０ ４ｌ 1904 この実験は明らかに、数回のグリホセート施用により収穫時の新鮮な根の重量 が増加することを示している。また、収穫量はグリホセート施用量 の関数として増加する傾向がある。収穫量の増加はまた、収穫時の植物の相当す る乾燥重量の増加ということになる。 実施例 ４ この実験の目的はグリホセート除草剤配合物を散布した変異種 （transgenic）テンサイとこのような除草剤配合物で処理していない変異種テン サイをテンサイの品質（根の糖、転化糖、カリウム、ナトリウム、アミノ−窒素 の含量；テンサイの根および地上部分の試料の養分、例えば乾燥分(％)、粗繊維 および毒素含量）の観点から比較することである。 テンサイは主として白砂糖、パルプおよび糖蜜を製造する砂糖産業において使 用されている。この用途におけるテンサイの技術的価値は一般にそれらの糖、カ リウム、ナトリウムおよびアミノ−窒素の含量を分析することにより評価される 。テンサイの毒素に関しては、サポニンが検討される。 試料調製 収穫後、根を０℃〜10℃で保存し、地上部分の試料を−20℃未満で冷凍した。 テンサイのブライ調製は半自動処理により行われ、テンサイをビートソ−（be et saw）でスライスしてブライを作る。ブライを均質化した後、１個の副試料を 抽出して偏光、転化糖、Na、Ｋおよびアミノ−Ｎ含量について分析するために使 用し、また別の副試料を乾燥し、養分を分析するために使用した。同じブライ試 料の第３部分を毒素分析用に冷凍した。テンサイブライの抽出は脱イオン水を用 いて行い、それに１錠の硫酸アルミニウムを加えて透明にし、そして自動Venema 熟成および濾過プラントに移した。大きなテンサイの地上部分の調製はそれらを 水平にして相等しい副試料に分析した。 分析法 乾燥分−オーブン法(EF 71/393/EφF；L279/7 P.858〜6120/12〜71)；根： 根を処理してブライにした後、ブライ試料を95℃のオーブンに入れ、24時間乾 燥する（恒量となるまで）。 地上部分： 試料を95℃のオーブンに入れ、試料の大きさに応じて72時間まで恒量となるま で乾燥する。 根および地上部分の両方について、重量減少を定量し、乾燥分パーセントとし て計算する。 粗繊維−weede法（EF L344/36〜37 26/11〜92修正法）： 試料を所定濃度の硫酸および水酸化カリウムの沸騰溶液で連続的に処理する。 残留物をガラス綿の入ったGoschるつぼで濾過することにより分離し、洗浄し、 乾燥し、秤量し、そして550℃のマッフルオーブン中で３時間灰化する。灰化に よる重量減少を重量分析により定量し、試料の粗繊維パーセントとして計算する 。 毒素：サポニン−HPLC法（Hilmer Sφrensen，KVL 1991，DCによる修正法） 本法はテンサイサポニンの酸加水分解に基づいている。遊離したオレアノール 酸をジクロロメタンで抽出する。試料から水を蒸発させた後、残留物をメタノー ルに溶解する。オレアノール酸を溶離剤としてアセトニトリル／水を使用する逆 相HPLCにより定量し、そしてUV検出器において210nmで測定する。 テンサイ抽出物の糖含量−偏光(Pol)（ICUMSA，糖分析1979，Proc.1990） 硫酸アルミニウムで透明にしたテンサイ抽出物を比旋光度の測定に基づくPROP OL型旋光計で測定する。旋光度は長さ70mmの試験管中、546nmで測定し、°Z（Po l％）またはｇ／100ｇの根に変換する。 テンサイ抽出物のアミノ−窒素含量−SMAIIC分析器（ICUMSA，糖分析1979，修 正法）： 硫酸アルミニウムで透明にしたテンサイ抽出物をニンヒドリンで発色させた後 、比色計において570nmで定量する。 テンサイ抽出物のカリウムおよびナトリウム含量−SMAIIC分析器（テクニコン 、Tech．Publ．THO−0160−10）： 硫酸アルミニウムで透明にしたテンサイ抽出物を炎光光度計IVで定量する。炎 の中でカリウムおよびナトリウムにより放出される光エネルギーの強度をそれぞ れ589nmおよび768nmで測定する。試料を硫酸リチウムで希釈する。リチウムは炎 光光度計からの信号のバランスをとるために内部基準として使用される。 テンサイ抽出物の転化糖含量−SMAIIC分析器（テクニコン、Tech．Publ.THO− 0160−10）： 硫酸アルミニウムで透明にしたテンサイ抽出物を硫酸銅ネオキュプロイン塩酸 塩試薬と反応させた後、比色計において560nmで定量する。 グリホセート除草剤に対する耐性に関してEP−0 218 571に開示されている方 法に従って遺伝学的に形質転換したグリホセート耐性テンサイを６つの異なる地 域（イタリア、スペイン、べルギー、デンマーク、フランス、英国）で栽培した 。 栽培する変種のタイプは地域の要件に依存する。作物は多くの特性が異なり、 １つの重要な特性は偏光(Pol)により定量される糖含量である。テンサイはＥ− 型、Ｎ−型およびＺ−型に組分けすることができる。Ｅ−型 はPolが低く、Ｚ−型はPolが高く、そしてＮ−型はＥ−型とＺ−型の間である。 北ヨーロッパで栽培される変種はＥ−Ｎ、ＮまたはＮ−Ｚ型として特性表示する ことができる。本実施例で使用される作物はＮグループに属する。 テンサイを地域に適した耕種法に従って播種し、正常な形状の作物が得られる ように手で間引いた。１試験当たりは少なくとも１回の繰り返しを行った。 各区画を次のようにして実質的に雑草がないように保持した：グリホセート除 草剤を試験区画に施用し、標準的なビート選択的除草剤を（地域に応じて）対照 区画に施用した。デンマーク、イタリアは雑草がない状態に維持するのにグリホ セート以外の除草剤は必要でないとみなした。 グリホセート除草剤配合物は実施例１で使用したものと同じである。除草性グ リホセート配合物を次のように施用した： 発芽前 2.5ｌ／ha テンサイの２〜４本葉段階 ２ｌ／ha テンサイの６〜８本葉段階 ２ｌ／ha テンサイの12〜14本葉段階 ２ｌ／ha （天蓋のように茂る前） 選択的除草剤の施用量は次の通りである： スペイン： 3.55Kg／haのゴルティックスWG（メタミトロン）発芽前。 ベルギー： ２ｌ／haのグラモキソン（パラクアット200）播種前。 ３ｌ／haのピラミンFL（クロリダゾン430）播種後１週。 0.5ｌ／haのベタナール（フェンメディファム150）播種後３週。 0.5ｌ／haのゴルティックス（メタミトロン70％WP）播種後３週。 0.5ｌ／haのトラマット（エトフメセート200）播種後３週。 0.75ｌ／haのゴルティックス播種後５週。 0.75ｌ／haのベジルクス（鉱油40）播種後５週。 0.75ｌ／haのトラマット播種後５週。 0.75ｌ／haのゴルティックス播種後６週。 0.75ｌ／haのベジルクス播種後６週。 0.17ｌ／haのフジレード播種後６週。 0.75ｌ／haのベタナール播種後６週。 0.75ｌ／haのトラマット播種後９週。 0.75ｌ／haのベタナール播種後９週。 0.75ｌ／haのゴルティックス播種後９週。 0.75ｌ／haのベジルクス播種後９週。 フランス： 0.75ｌ／haのゴルティックスWP（メタミトロン）播種後１日。 0.75ｌ／haのゴルティックスWP播種後２週。 0.75ｌ／haのベタナール（フェンメディファム150）播種後２週。 0.75ｌ／haのトラマット（エトフメセート200）播種後２週。 英国： 1.0ｌ／haのレーザー（シクロキシディム）播種後５週。 分析結果を集め、その平均値を下表に示した。すべての国が平均値の計算にお いて等しい重量を有する。 表 IV 植物部分 分析単位 処理/未処理 テンサイ ブライ 乾燥分(DM) 処理 21.309 ｇ/100ｇの根 未処理 20.444 根 転化糖 処理 1.011 ミリモル/100ｇの根 未処理 1.755 カリウム 処理 5.162 ミリモル/100ｇの根 未処理 5.286 NH2N 処理 2.470 ミリモル/100ｇの根 未処理 2.878 ナトリウム 処理 1.118 ミリモル/100ｇの根 未処理 1.769 Pol 処理 15.610 ｇ/100ｇの根 未処理 14.478 地上部分 乾燥分 処理 14.724 ｇ/100ｇの地上部分 未処理 13.996 処理：グリホセート除草剤を散布した。 未処理：グリホセート除草剤を散布しなかった。 DM：乾燥分 データを見てわかるように、グリホセート除草剤で処理したテンサイは未処理 のものより根の糖含量が高く、ナトリウム、カリウム、アミノ−窒素および転化 糖が減少している。根および地上部分の乾燥分もまた増加した。より詳しいデー タはグリホセートで処理したテンサイの葉の繊維質含量がより高いことを示して いる。 本実施例の結果を前記実施例の結果と相関させると、先に１ヘクタール あたりの重量で評価した収穫量の増加はまた、収穫物中の乾燥分、繊維質および 糖含量の増加として反映されていることがわかる。 実施例 ５ EP−0 218 571に開示されている方法に従ってグリホセートに対して耐性を有 するように遺伝学的に変異したテンサイおよび飼料ビートを適当な耕種法に従っ て株間距離4.5cmの列にして播種し、そして乱塊法；区画の大きさ：2.7×７ｍ； １区画あたり６列、列間距離0.45ｍに従って正常な形状の作物が得られるように 手で間引いた。それぞれの試験は４回繰り返した。 発芽前は標準的な除草剤を全領域に施用することにより、次いで手で雑草を抜 くことにより、そして、発芽後は下記のように施されるグリホセート処理剤によ り、試験区画を実質的に雑草がないように保持した。 次の処理を施した： 手で雑草を抜くだけ ３×720ｇ酸当量／haのグリホセート配合物 ３×1080ｇ酸当量／haのグリホセート配合物 ３×1440ｇ酸当量／haのグリホセート配合物 ２×2160ｇ酸当量／haのグリホセート配合物 グリホセート除草剤の３回連続施用が行われる場合、１回目は作物の２〜４葉 段階で行われ、２回目は作物の６〜８葉段階で行われ、そして３回目は作物の10 〜12葉段階で天蓋のように葉が茂る前に行われる。 ２回連続施用が行われる場合、１回目は作物の２〜４葉段階で行われ、そして ２回目は10〜12葉段階で行われる。 グリホセート除草剤の配合物はイソプロピルアンモニウム塩として360ｇ酸当 量／ｌのグリホセート、並びにトリメチルエトキシポリオキシプロ ピル(８)アンモニウムクロライドおよびエトキシル化(20)ソルビタンエステル(8 0：20)からなる18０ｇ／lの界面活性剤を含有した。グリホセート配合物は２バ ールの圧力下、200ｌ／haの水量で施した。 新鮮な根の重量を収穫時に測定した。手で雑草を抜いただけの区画の新鮮な根 の重量を100％の収穫量とみなし、グリホセート処理後に測定した新鮮な根の重 量を手で雑草を抜いただけの区画の結果と比較した。 表 Ｖ 収穫量（％：新鮮な根の重量） 処 理 テンサイ 飼料ビート 手で雑草を抜く 100％ 100％ ３×720ｇ酸当量 101 105 ３×1080ｇ酸当量 98 106 ３×1140ｇ酸当量 115 108 ２×2160ｇ酸当量 107 102 実施例 ６ 圃場試験において、遺伝的背景があり、（EPSPS表現およびグリホセートオキ シドレダクターゼ表現を組み合わせた方法に従って）グリホセート除草剤耐性を 示すように遺伝学的に変異した秋まき菜種を適当な耕種法に従って1995年９月中 旬に乱塊法；区画の大きさ：３×７ｍ、列間距離0.14ｍ；４回の反復試験により １ｍ²あたり約100株（正常な形の作物）となるように１ヘクタールあたり４Kgの 種子をまいた。 発芽前は標準的な除草剤を全領域に施用することにより、すなわち種子をすじ まきした次の日に1.5ｌのブチサン（メタザクロル）、さらにその後１ｌを標準 区画に施用することによりそして下記のように施用されるグリホセート処理剤に より各区画を実質的に雑草がないように保持した。 グリホセート処理剤を秋にB4−B5の植物生長段階で施用した。実施例１で使用 したものと同じ配合物を施用した。 ８月初旬に収穫を行い、その収穫量を測定し、トン／haの粒(湿度９％)として 表した。測定した収穫量を標準区画の収穫量の百分率(％)として表VIに示す。 表 VI 収穫量 標準 100 1080ｇ酸当量／ha 104.5 実施例 ７ 本圃場試験は春まき菜種の種を（1996年４月中旬に）まいたことを除けば、前 記実施例の試験と同様にして行った。既知の遺伝的背景を有するこのような植物 を実施例６に記載のように組み合わせた方法によりグリホセート除草剤に対して 耐性を有するようにした。 1.5ｌ／haのブチサンを全領域に施用し、標準区画は手で雑草を抜き、そして 残りの区画はグリホセート除草剤を施用して各区画を雑草がないように保持した 。同じグリホセート配合物を播種後約１ケ月、すなわち植物の生長段階B3−B4で 施用した。８月中旬に収穫を行った。（実施例６のように測定および計算した） 収穫量データを標準区画の収穫量の百分率(％)として表VIIに示す。 表 VII 収穫量 標準 100 720ｇ酸当量／ha 120 1080ｇ酸当量／ha 112 実施例 ８ グリホセート除草剤施用後のグリホセート耐性とうもろこし作物の収穫量増加 を評価するための別の圃場試験をイタリアで行った。EPSPSおよびグリホセート オキシドレダクターゼ表現を組み合わせた方法に従ってグリホセート耐性を有す るように遺伝学的に変異した既知のとうもろこしを適当な耕種法に従って、４回 反復する完全乱塊法により９ｍの列を４つ作った３×９ｍの区画において約62,0 00株／ha(約4.7個の種子／ｍ)で播種および栽培し、そして正常な形状の作物を 得るために、またすべての区画において同数の株となるように手で間引いた。標 準区画および試験区画からなる全領域を６l／haの発芽前用除草剤(ラッソミクロ ミックスすなわち、2016ｇのアラクロルおよび864ｇのテルブチラジン)で処理し た。標準区画は必要に応じて手で雑草を抜くことにより、そして試験区画は実施 例１と同じグリホセート配合物を数回、植物の生長段階で施用することにより雑 草がないように保持した。中央の２列だけを中央の長さの７ｍで収穫した。その 収穫量を湿度15％でトン／haの穀粒として測定し、標準（STD）の収穫量の百分 率(％)として下表に示す。 表VIII．ａ 収穫量(％)／３〜４葉段階でグリホセート処理 形質転換１ 形質転換２ ＳＴＤ 100 100 720ｇ酸当量/ha のグリホセート 106 103 1800ｇ酸当量/ha 107 107 表VIII．ｂ 収穫量／５〜６葉段階でグリホセート処理 形質転換１ 形質転換２ ＳＴＤ 100 100 720ｇ酸当量/ha のグリホセート 114 105 1080ｇ酸当量/ha 109 108 1440ｇ酸当量/ha 109 105 1800ｇ酸当量/ha 111 102 実施例 ９ 収穫量増加に対する様々なグリホセート除草剤配合物の効果を評価するために 、圃場試験を実施例１と同じプロトコルに従って行った。変異種の作物をそれぞ れ720ｇ酸当量／haおよび1080ｇ酸当量／haのグリホセート除草剤（３種）で処 理した。 表 IX 収穫量(％)−新鮮な根の重量 ３×720ｇ酸当量 ３×1080ｇ酸当量 ラウンドアップ (登録商標) 100 100 顆粒状配合物 101.4 100.2 液状配合物 104.2 102 ラウンドアップ（登録商標）： ・360g酸当量／ｌのグリホセートイソプロピルアンモニウム塩 ・180ｇ／ｌのエトキシル化獣脂アミン界面活性剤 固体状配合物： ・430g酸当量／Kgのグリホセートナトリウム ・160ｇ／Kgのトリメチルエポキシポリオキシプロピル(８)アンモニウムクロラ イド ・330ｇ／Kgの硫酸アンモニウム 液状配合物：実施例１で使用したものと同じ。 本実施例は定義されたような環境に優しい界面活性剤を含有する配合物の効力 が改善されたことを示す。 実施例 10 本実施例は実施例７（春まき菜種）で説明した手順に従って様々なグリホセー ト除草剤配合物の効果を評価した。本試験において、試験区画は、1.5×10ｍで ある。 表 Ｘ 収穫量（トン／haの粒：湿度９％） 収穫量(％) ｌ／ha １ ２ ３ ４ ラウンドアップ （登録商標） 100 100 100 100 顆粒状配合物 101 103 109 − 液状配合物 103 101 110 108 ラウンドアップ（登録商標）処理後に得られた収穫量を100％とみなした。 本実施例により、実施例７で使用した配合物は優れていることがわかる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年５月１５日（１９９８．５．１５） 【補正内容】 請求の範囲 １．作物はグリホセート耐性のテンサイ、飼料ビート、とうもろこし、菜種およ び綿から選択され、そしてグリホセートは通常の枯死量で施用することを特徴と する、作物の収穫量を増加させるためのグリホセートまたはその誘導体の使用。 ２．0.2〜6.0Kg酸当量／haの通常の枯死量で施用することを特徴とする、請求項 １記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ３．グリホセートまたはその誘導体を単一処理または連続処理により施用される ことを特徴とする、請求項１または２記載のグリホセートまたはその誘導体の使 用。 ４．グリホセート誘導体がグリホセート塩、好ましくはモノイソプロピルアンモ ニウム塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの混合物であることを 特徴とする、請求項１〜３の何れかの項記載のグリホセート誘導体の使用。 ５．グリホセートまたはその誘導体がアミン、例えばエトキシル化アルキルアミ ン、特に獣脂アミン、ココアミン、エトメーン（Ethomeen）の商品名で販売され ている界面活性剤、酸化アミン、例えばエンピゲン（Empigen）OBの商品名で販 売されている界面活性剤： 第４アンモニウム塩、例えばエトキシル化および／またはプロポキシル化第 ４アンモニウム塩、特にエトクアッド（Ethoquad）、エンコール(Emcol)CCおよ びドジゲン（Dodigen）の商品名で販売されている界面活性剤： アルキルポリグリコシドまたはアルキルグリコシド、グルコースおよびスク ロースエステル から選択される補助剤、好ましくはエトキシル化ポリプロポキシル化第 ４アンモニウム界面活性剤との配合物において使用されることを特徴とする、請 求項１〜４の何れかの項記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ６．グリホセート除草剤に対して耐性を有するようにしたビート、菜種、綿また はとうもろこし作物の収穫量を増加させるための請求項１〜５の何れかの項記載 のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ７．テンサイまたは飼料ビート作物の収穫量および／または品質を向上させるた めの請求項６記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ８．作物がEPSPSポリペプチドをコード化する遺伝子を含有する請求項１〜６の 何れかの項記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ９．作物がグリホセートオキシドレダクターゼ酵素をコード化する遺伝子を含有 する請求項１〜６の何れかの項記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 10．植物がIIクラスEPSPS酵素をコード化する遺伝子を含有する請求項１〜６の 何れかの項記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．テンサイ、飼料ビート、とうもろこし、菜種および綿から選択されるグリホ セート耐性作物の収穫量を増加させるためのグリホセートまたはその誘導体の使 用。 ２．0.2〜6.0Kg酸当量／haの通常の枯死量で施用することを特徴とする、請求項 １記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ３．グリホセートまたはその誘導体を単一処理または連続処理により施用される ことを特徴とする、請求項１または２記載のグリホセートまたはその誘導体の使 用。 ４．グリホセート誘導体がグリホセート塩、好ましくはモノイソプロピルアンモ ニウム塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの混合物であることを 特徴とする、請求項１〜３の何れかの項記載のグリホセート誘導体の使用。 ５．グリホセートまたはその誘導体がアミン、例えばエトキシル化アルキルアミ ン、特に獣脂アミン、ココアミン、エトメーン（Ethomeen）の商品名で販売され ている界面活性剤、酸化アミン、例えばエンピゲン（Empigen）OBの商品名で販 売されている界面活性剤： 第４アンモニウム塩、例えばエトキシル化および／またはプロポキシル化第 ４アンモニウム塩、特にエトクアッド（Ethoquad）、エンコール(Emcol)CCおよ びドジゲン(Dodigen)の商品名で販売されている界面活性剤： アルキルポリグリコシドまたはアルキルグリコシド、グルコースおよびスク ロースエステル から選択される補助剤、好ましくはエトキシル化ポリプロポキシル化第４アン モニウム界面活性剤との配合物において使用されることを特徴と する、請求項１〜４の何れかの項記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ６．グリホセート除草剤に対して耐性を有するようにしたビート、菜種、綿また はとうもろこし作物の収穫量を増加させるための請求項１〜５の何れかの項記載 のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ７．テンサイまたは飼料ビート作物の収穫量および／または品質を向上させるた めの請求項６記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ８．作物がEPSPSポリペプチドをコード化する遺伝子を含有する請求項１〜６の 何れかの項記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 ９．作物がグリホセートオキシドレダクターゼ酵素をコード化する遺伝子を含有 する請求項１〜６の何れかの項記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。 10．植物がIIクラスEPSPS酵素をコード化する遺伝子を含有する請求項１〜６の 何れかの項記載のグリホセートまたはその誘導体の使用。