CZ291438B6 - Kmen Bacillus thuringiensis s pesticidním účinkem - Google Patents

Abstract

Kmeny Bacillus thuringiensis, NRRL B-21093, NRRL B-21090, NRRL B-21091, NRRL B-21092 a NRRL B-21094, kter produkuj · innou l tku maj c pesticidn · inek a u kter²ch je v podstat vÜechna pesticidn · innost v supernatantu. L tka je · inn v i hmyz m Ük dc m ° du Coleoptera a podporuje pesticidn · innost pesticid , produkovan²ch rodem Bacillus. Zp sob pot r n hmyz ch Ük dc ° du Coleoptera, zp sob potenciace pesticidn · innosti pesticid produkovan²ch mikroorganismy rodu Bacillus a zp sob z sk v n v podstat ist uveden · inn l tky.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nového kmene (kmenů) Bacillus thuringiensis, jehož v podstatě veškerá pesticidní účinnost se projevuje v supematantu směsi, ve které je fermentován. Kmen produkuje látku, která je účinná vůči hmyzímu škůdci (škůdcům) řádu Coleoptera, a která zvy šuje účinnost pesticidů, které tvoří mikroorganismy rodu Bacillus (dále ..pesticidy Bacillus“). Dále se vy nález týká konkrétního složení pesticidních prostředků, založených na této látce, které obsahují spolu s touto účinnou látkou nosič nebo pesticid Bacillus, chemický pesticid a/nebo virus s pesticidními vlastnostmi. Vynález se také týká způsobů aplikace těchto prostředků za účelem potírání škůdců.

Dosavadní stav techniky

Vynález navazuje na udělené patenty US 5 976 563 a US 5 976 564. Oba patenty se tak zařazují do popisu formou citace.

Každým rokem se ztrácí značná část světové obchodně významné úrody, včetně potravin, textilu a různých pokojových rostlin poškozením nebo zničením škůdci, což má za následek ztráty, dosahující miliony dolarů. Snahy o jejich potírání se řídí různými strategiemi.

Jednou ze strategií je použití širokospektrálních pesticidů, tj. chemických pesticidů s širokým rozsahem aktivity. Používání těchto chemických pesticidů má však mnoho nevýhod. Typickým problémem jejich použití je skutečnost, že mohou ničit v důsledku svého širokého spektra účinků necílové organismy, například užitečný hmyz a parazity destruktivních škůdců. Kromě toho bývají tyto chemické pesticidy často toxické vůči zvířatům a lidem, a cíloví škůdci získávají při opakovaném vystavení těmto látkám odolnost.

Jinou strategií je používání biopesticidů, při kterém se využívá přírodních patogenů pro potírání hmyzu a houbových a plevelových kontaminací úrody. Mezi biopesticidy patří bakterie, které produkují toxiny, látky toxické vůči škůdcům. Biopesticidy jsou ve srovnání s chemickými pesticidy obecně méně nebezpečné pro necílové organismy i pro životní prostředí jako celek.

Nejvíce používaným biopesticidem je Bacillus thuringiensis (B. t.). B. t. je široce rozšířený, aerobní sporulující mikroorganismus. V průběhu sporulačního cyklu produkuje B. t. protein(-y) známý(-é) jako krystalický(-é) delta endotoxin(-y). Tyto látky zabíjejí larvy hmyzu, a proto je B. t. velmi užitečný jako zemědělský pesticid.

Některé kmeny, například Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki a Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, vykazují specifickou účinnost vůči motýlům (Lepidoptera). Poddruh Bacillus thuringiensis subsp. israelensis vykazuje specifickou účinnost vůči dvoukřídlým (Diptera) (Goldberg, patent US 4 166112). Další kmeny, například Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Kreig et al., 1988, patent US 4 766 203), jsou podle publikovaných údajů specificky účinné vůči broukům (Coleoptera). Izolace dalších kmenů Bacillus thuringiensis, toxických vůči broukům, byla publikována v roce 1986 (Hemnstadt et al. Bio/Technology vol. 4, str. 305 až 308, 1986, patent US 4 764 372 z roku 1988). Tento kmen, pojmenovaný jako „Bacillus thuringiensis subspec. san diego“, M-7, byl uložen vNorthem Research Laboratory, USA, pod číslem NRRL B-15939. Avšak přihlašovatel tohoto patentu US '372. Mycogen Corp. veřejně oznámil, že Bacillus thuringiensis subsp. san diego je Bacillus thuringiensis subspec. tenebrionis. Kromě toho byl patent US '372 postoupen společnosti Novo Nordisk A/S. Dále by nalezen kmen B. t., který je toxický vůči motýlům i vůči broukům (PCT přihláška WO 90/13 651). Toxin popsaný v této zveřejněné PCT přihlášce WO 90/13 651 má molekulovou hmotnost 81 000 (81 kD).

-1 CZ 291438 B6

V průběhu spoluračního cyklu produkuje B. t. protein(-y) v krystalické formě známý(-é) jako krystalický(-é) delta endotoxin(-y) s molekulovou hmotností v rozmezí 27 000 (27 kD) až 140 000 (140 kD), který(—é) při požeru zabíjí hmyzí larvy. Toxická účinnost může být vlastností jednoho či několika těchto delta endotoxinů u daného kmenu B. t. Většina delta endotoxinů jsou protoxiny, které lze proteolyticky přeměňovat na menší (odštěpené) toxické polypeptidy v metabolismu cílového hmyzu (Hofte a Whiteley, 1989, Microbiological (Revievv 53: str. 242255). Tyto delta endotoxiny jsou kódovány prostřednictvím „cry“ (crystal protein) genů. Tyto cry geny se dělí na šest tříd a několik podtříd podle strukturní podobnosti a podle pesticidní specifičnosti. Hlavními třídami jsou Lepidoptera-specifické (cryl), Lepidoptera- i Dipteraspecifické (ciyll), Coleoptera-specifické (crylll), Diptera-specifické (crylV) (Hofte and Whiteley, 1989, Microbiological Review 53: str. 242-255), Coleoptera- i Lepidoptera-specifické (označované jako cryV geny Tailorem et al., 1992, Molecular Microbiology 6: str. 1 211-1 217) a Nematode-specifické (označované jako cryV a cryVI Feitelsonem et al., 1992, Bio/Technology 10: str. 271-255) geny.

Delta-endotoxiny už byly připraveny metodami rekombinantní DNA. Tyto delta endotoxiny, vyráběné metodami rekombinantní DNA mohou avšak nemusí být v krystalické formě.

B.t. delta-endotoxin je ve vodě nerozpustný, s výjimkou alkalického pH a je téměř vždy kódován plazmidy. Některé kmeny Bacillus thuringiensis produkují, jak bylo prokázáno, tepelně stabilní pesticidní adenin-nukleotidový analog, známý jako β-exotoxin nebo thuringiensis, který je sán pesticidní (Sebesta et al., v H. D. Burges (ed.), Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academie Press, N. Y., str. 249 až 281, 1981). β-endotoxin byl zjištěn v supernantantu určitých kultur Bacillus thuringiensis. Má molekulovou hmotnost 789 a sestává z adenosinu, glukózy a allarové kyseliny (Lůthy et al. v Kurstak (ed.), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, str. 35-72). Jeho účinné rozmezí zahrnuje, Musea domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drozophila melanogaster a Tetranychus cinnabarinus, ale není na ně omezen. Toxicita β-exotoxinu je podle dosavadních představ příčinou inhibice DNA řízené polymerázou RNA konkurencí s ATP. Bylo zjištěno, že β-exotoxin je kódován plazmidem CRY v pěti kmenech Bacillus thuringiensis (B.t.) a že β-exotoxin může být klasifikován jako typ I nebo typ II β-exotoxin (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). β-exotoxin typu I je, jak je známo, produkován Bacillus thuringiensis subspecies thuringiensis sérotypu 1, Bacillus thuringiensis subspecies tolworthi sérotypu 9 a Bacillus thuringiensis subspecies darmstadiensis sérotypu 10. β-exotoxin typu 2 je produkován Bacillus thuringiensis subspecies morrisoni sérotypu 8ab a je aktivní vůči Leptinotarsa decemlineata (mandelinka bramborová). Další ve vodě rozpustné látky byly izolovány z Bacillus thuringiensis včetně alfa -exotoxinu, který je toxický vůči larvám Musea domestica (Liithy, 1980, FEMS Microbiological (Letters 8: str. 1-7), gama - exotoxiny, které jsou různými proteolytickými enzymy včetně lecitináz, chizináz a proteáz, jejich toxické účinky jsou exprimovány pouze v kombinaci s beta-exotoxinem nebo delta-endotoxinem (Forsberg et al., 1976, Bacillus thuringiensis: Ist Effects on Enviromental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compouds and Biological Phenomena), sigma -exotoxin, který má strukturu podobnou β-exotoxinu a je také aktivní vůči Leptinotarsa decemlineata (Argauer et al., 1991, J. Entomology (Science 26: str. 206-213) a anhydrothuringiensis (Coli. Czechoslovak Chem. Comm. 40, 1 775,1975).

WO 94/09 630 uvádí ve vodě rozpustné látky, které podporují účinnost Bacillus thuringiensis varieta kurstaki a Bacillus thuringiensis varieta aizawai.

Stonard et al. (1994 vNatural and Engineered Pěst Management Agents, Paul A. Mann, Robert M. Hollingworth, vydavatel ACS, Washington D.C: str. 25-36) uvádí diabroticiny struktury:

-2CZ 291438 B6

1. R, Ri, R₂ = H, R₃ = OH Diabroticin A

2. R, Ri, R₂, R₃ = H Diabroticin B

Diabroticiny byly izolovány z Bacillus sublitis a mají účinnost vůči Diabrotica undecinpunctata, Leptinotarsa decemlineata, Anthomus grandis Boheman, vůči larvám moskytů, Staphylococcus aureus, a Micrococcus lutea, ale nemají účinnost vůči Evropskému vrtavci (European com borer), Eschiérichia coli, B. sublitis a Psudomonas aeruginosa, Aktivita vůči ostatním škůdcům nebyla v publikaci Stonarda et al. zjištěna. Diabrotixin A byl také izolován z fermentační směsi B. cereus.

Podle dosavadního stavu techniky se dosáhlo určitého růstu mortality formulacemi Bacillus thuringiensis. Hledány byly nové kmeny s vyšší mortalitou, založené na genetickém ovlivnění existujících kmenů a hledání účinnějších směsí kombinováním spor Bacillus thuringiensis a/nebo krystalů s novými pesticidními nosiči nebo s chemickými pesticidy.

Cílem vynálezu je vylepšení insekticidní účinnosti známých formulací na bázi Bacillus thuringiensis.

Dalším cílem vynálezu je zvýšení pesticidní účinnosti pesticidů a současně nalezení nového použití pro známé pesticidní produkty.

Je výhodné izolovat nové kmeny Bacillus thuringiensis za účelem přípravy nových látek neboť existují širší spektra biopesticidů pro každého daného škůdce.

Podstata vynálezu

Vynález se týká kmene Bacillus thuringiensis, který vykazuje v podstatě veškerou pesticidní aktivitu v supematantu, získaném z fermentace tohoto kmene. Kiystalický protein a spory získané z fermentace kmene Bacillus thuringiensis podle vynálezu nevykazuje žádnou pesticidní účinnost. Jde o kmen vybraný ze skupiny sestávající zEMCC-0077, který má identifikační charakteristiky NRRLB-21090, nebo mutantů tohoto kmene, kteří mají v podstatě tytéž vlastnosti jako EMCC 0077, EMCC 0078 a které mají identifikační charakteristiky NRRLB-21091 nebo mutantů těchto kmenů, které mají v podstatě stejné vlastnosti jako EMCC 0078, EMCC 0079 a mají identifikační charakteristiky NRRLB-21092, nebo jejich mutantů s vlastnostmi v podstatě stejnými jako EMCC-0079, EMCC-0080, které mají identifikační charakteristiky NRRL B-21093, nebo jejich mutantů v podstatě stejných vlastností jako EMCC-0080 a EMCC-0081 s vlastnostmi sNRRL B-21094, nebo jejich mutantů, které mají v podstatě stejné vlastností jako EMCC-0081.

Látka, která má pesticidní účinnost vůči hmyzím škůdcům řádu Coleoptera a působí například společně s umocňující nebo synergickou složkou jiného pesticidu získaného z rodu Bacillus vůči škůdcům, se získá ze supematantu z fermentace některého z uvedených kmenů. Ve výhodném

-3CZ 291438 B6 provedení má uvedená látka LC50 (jedná se o koncentraci daného pesticidu, která je nutná k zabití 50 % škůdců) 126 pg aktivní složky najeden gram celkového materiálu vůči Leptinotarsa texana. LCjo pelet z fermentace uvedeného kmene je více než 3000 pg aktivní přísady na jeden gram celkového materiálu.

V jiném provedení má látka podle vynálezu pesticidní účinnost vůči hmyzím škůdcům řádu Coleoptera. V nejspecifičtějším provedení má tato látka pesticidní účinnost vůči hmyzím škůdcům druhu Diabrotica undecimpunctata, Leptinotarsa texana, Anthomus grandia a překvapivě je účinný vůči hmyzím škůdcům druhů Ips calligraphus, Popillia japonicus, Epilachna varivastis, Leptinotarsa decemlineata a Dendroctonus frontalis řádu Coleoptera.

Ve specifickém provedení má látka podle vynálezu podpůrný účinek na insekticidní aktivitu krystalů delta-endotoxinu(-ů) Bacillus thuringiensis vůči hmyzím škůdcům řádu Coleoptera.

Výraz používaný shora „Pesticid získaný z rodu Bacillus“ je míněn tak, že látka se získává z kmenů nebo spor mikroorganismů Bacillus (např. Bacillus thuringiensis nebo Bacillus sublitis). Pesticid získaný z rodu Bacillus může také znamenat látku odvozenou od mikroorganismů, např. rodu Bacillus, např. protein nebo jeho fragment, který má účinnost vůči škůdcům, nebo který je zabíjí, nebo může jít o látku, která chrání rostliny, např. antifídant nebo mikroorganismus schopný exprese genu Bacillus kódujícího protein nebo fragment rodu Bacillus, který má aktivitu vůči škůdcům nebo který je zabíjí (např. delta-endotoxin Bacillus thuringiensis) a vhodný nosič (viz další odstavce, kde jsou popisovány konkrétní směsi). Škůdcem může být například hmyz, háďátko, roztoč nebo šnek. Mikroorganismus schopný exprese genu Bacillus kódující protein nebo fragment Bacillus s aktivitou vůči škůdcům zahrnuje phylloplane (povrch listů rostlin) a/nebo rhizosféru (půdu obklopující kořeny rostlin) a/nebo vodní prostředí, a je schopen úspěšně konkurovat v určitém konkrétním prostředí (obilí nebo jiné místo výskytu hmyzu) divokým mikroorganismům a umožňuje stabilně udržovat a exprimovat gen Bacillus kódující protein nebo fragment Bacillus, který má aktivitu vůči škůdcům nebo který je zabíjí. Příklady takových mikroorganismů zahrnují: Bacillus, Pseudomonas, Rewinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonad, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacilius, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes, a Clostridium, řasy např. čeledi Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysphyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae, a Chlorophyceae a houby zejména kvasinky např. rodu Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporovolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium.

Jak je uvedeno shora „pesticidní aktivita“ je měřítkem účinnosti vůči škůdcům posuzováno podle intenzity zabíjení nebo poškození růstu škůdců nebo podle ochrany rostlin vůči napadení škůdci.

Vynález se dále týká pesticidních prostředků zahrnujících látku a pesticid získaný z rodu Bacillus a také způsobu použití pesticidních kompozic pro potírání škůdců.

Vynález je dále zaměřen na způsob získání „v podstatě čisté“ látky podle tohoto vynálezu zahrnující tyto stupně:

a) kultivace kmene Bacillus thuringiensis na vhodném růstovém médiu,

b) oddělení supematantu ze směsi ze stupně (a) a

c) podrobení supematantu ze stupně (b) chromatografií na koloně za účelem vyčištění látky.

Jak je shora uvedeno „v podstatě čistá“ látka znamená látka, která obsahuje méně než 5 % nečistot např. delta-endotoxinových proteinů.

-4CZ 291438 B6

Podstatné znaky, aspekty a výhody předloženého vynálezu jsou lépe srozumitelné z následujícího popisu, připojených nároků a doprovodných obrázků.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje schéma syntézy k získání struktury I.

Obr. 2 ukazuje účinnost synergie Ia/Ib aNOVODOR™vůči Leptinotarsa decemlineata.

Podrobný popis vynálezu

Příprava účinné látky

Látku(-y) lze získat ze supernatantu kultury Bacillus thuringiensis fermentací kmenů, což však neznamená omezení, B.t. EMCC-0077, které mají identifikační charakteristiky NRRL B-21090 nebo jejich mutantů EMCC-0077 a EMCC-0078 které mají v podstatě stejné vlastnosti s identifikačními vlastnostmi NRRL B-21091 nebo mutantů v podstatě shodných svými identifikačními charakteristikami s EMCC-0078 a EMCC-0079 a mají identifikační charakteristiky NRRL B-21092, nebo jejich mutantů s vlastnostmi v podstatě stejnými jako EMCC-0079, EMCC-0080, které mají identifikační charakteristiky NRRLB-21093, nebo jejich mutantů v podstatě stejných vlastností jako EMCC-0080 a EMCC-0081 s vlastnostmi s NRRL B-21094, nebo jejich mutantů, které mají v podstatě stejné vlastnosti jako EMCC-0081.

Látka má účinnost vůči hmyzím škůdcům řádu Coleoptera a působí společně s pesticidem získaným zrodu Bacillus jako kupř. umocňující nebo synergická složka. Ve specifickém provedení má látka strukturu I:

(D kde: Ri je amino, hydroxy, (Ci_₁₀) alkyl, alkyl (Ci_io) ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen, (Ci_₅) alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být, ale bez omezení na ně, alanyl, valinyl, leucinyl, izoleucinyl, fenylalanyl, glycinyl a fenylglycinyl,

R₂ je aminoskupina nebo (Ci_i₀) alkyl,

R₃ je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, (Ci_i₀) alkyl, alkyl (Ci_io) ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen, (C]_s) alkoxy, methylamino, dimethylamino, thionyl, methylthionyl, kyano, nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátu, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

Rt je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, (Ci_io) alkyl, alkyl (Cmo) ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen, (Ci_s) alkoxy, nebo jejich

-5CZ 291438 B6 soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

R₅ je vodík, methoxy, aminoskupina. hydroxyskupina, (Ci_₍o) alkyl, alkyl (Ci_io) ester, aryl (např. benzoyl. nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, helogenbenzoyl) ester, halogen, (C^₅) alkoxy,

R$ je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, (Ci_io) alkyl, alkyl (C_t_io) ester, halogen nebo (C|_₅) alkoxy,

R₇ je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, (C|_io) alkyl, alkyl (C_M0) ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen, (C,_₅) alkoxy, nebo jejich soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

Rg je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, (Ci_io) alkyl, alkyl (Ci_io) ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen. (C|_₅) alkoxy, methylamino, dimethylamino, thionyl, methylthionyl, kyano, nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

R₉ je aminoskupina nebo (Ci_₁₀) alkyl a

R_l0 je amino, hydroxy, (C]_ ío) alkyl, alkyl (Ci_io) ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen, (C^₅) alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být alanyl, valinyl, leucinyl, izoleucinyl, fenylalanyl, glycinyl a fenylglycinyl.

Pyrazinové dusíky mohou být popřípadě substituovány (Ci_ic) alkylem, alkyl (C|_io) esterem, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) esterem, nebo kyslíkem. Je tomu třeba rozumět tak, že vynález zahrnuje všechny stereoizomemí formy sloučenin struktury vzorce I a také racemáty. Ve většině specifických provedení má účinná látka strukturu la zde označovanou „la“ nebo 1b zde označovanou jako „1b“.

la: R, Ri, R₂, Rj — H

Ib: R, Ri, R₂ = H, R₃ = OH

Bacillus thuringiensis může být kultivován pomocí půdy a fermentační techniky známé z dosavadního stavu techniky viz např. Ropgoff el al., 1969, J. Invertebrate Path. 14: str. 122-129, Dulmage et al, 1971, J. Invertebrate Path. 18: str. 353-358, Dulmage et al., v Microbial Control of Pets and Plant Diseases, H. D. Burges, ed., Academie Press, N. Y., 1980). Po úplném fermentačním cyklu se supematant oddělí odseparováním spor Bacillus thuringiensis a krystalů z fermentačního roztoku pomocí metod, které jsou dostatečně dobře známy z dosavadního stavu techniky např. odstředěním a/nebo ultrafiltrací. Uvedená účinná látka je obsažena v supematantů, který může být odebírán opět způsobem dostatečně popsaným v dosavadním stavu techniky, např. ultrafiltrací, odpařením, nebo rozprašovacím sušením.

-6CZ 291438 B6

Alternativně může být účinná látka podle vynálezu získána chemickou syntézou pomocí známých reakcí a postupů.

Pro získání struktury I se připraví jednoduchý pyrazinový kruh, substituovaný požadovaným způsobem, obsahující chránící skupiny, některým z mnoha známých postupů např. spontánní kondenzací alfa-aminokarbonylových sloučenin. Dihydropyrazinový meziprodukt, který při této reakci vzniká, se ihned oxiduje kyslíkem na příslušný pyrazin. Dimerizace jednou substituované alfaaminokarbonylové sloučeniny tímto způsobem vede kjednou substituovanému pyrazinu, přičemž reakce dvou různě substituovaných alfaaminokarbonylových sloučenin vede ke třem produktům. Uvedenou látku lze izolovat chromatografickým oddělováním (viz obr. 1). Posledně zmíněná reakce umožňuje syntézu pyrazinu s různými substituenty na každé straně kruhu.

Čištění připravovaných látek (připravované látky) je možné provádět nejrůznějšími postupy, které jsou známy z dosavadního stavu techniky. Patří mezi ně chromatografie (např. na iontoměničích, afinitní a kolonová chromatografie podle velikosti molekuly), elektroforetické postupy, postupy založené na rozdílné rozpustnosti, extrakce nebo jakékoli další standardní techniky o sobě známé (viz např. Protein Purifícation, eds. J-C. Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York. 1989).

Účinnost uvedených látek se dá testovat pomocí postupů, které jsou známé, jako je umělé udržení diety, umělé podání potravy, natírání a postřik listů. Specifické příklady takových biologických testů jsou dále uvedeny v příkladech provedení.

Prostředek s obsahem účinné látky

Zmíněné účinné látky se mohou formulovat samostatně, společně s pesticidem Bacillus, který, jak je definováno shora představuje kmen rodu Bacillus, spory, proteiny nebo jejich fragmenty, které jsou aktivní vůči škůdcům, nebo které zabíjejí škůdce a popřípadě přijatelný nosič, používaný do pesticidních kompozic, jako jsou např. suspenze, roztoky, emulze, popraše, dispergovatelné granule, smáčitelný prášek, emulzní koncentrát aerosol, nebo impregnované granule. Příkladem takových kmenů Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki (označovaný jako DIPEL od Abbot Laboratories, lne. JAVELIN od Sandoz, BIOBIT od fy Novo Nordisk A/S, FORAY od fy Novo Nordisk, MVP od fy Mycogen, BACOSPEINE od fy Novo Nordisk A/S aTHURICIDE od fý Sandoz), Bacillus thuringiensis subspecies, aizawai (označovaný jako FLORBAC od fy Novo Nordisk A/S a XENTARX od fy Abbott Laboratories, lne.), Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis (označovaný jako NOVODOR od Novo Nordisk A/S, TRIDENT od fy Sandoz M-TRAK a M-ONE od fy Mycogen), Bacillus thuringiensis subspecies israelensis (označovaný buď jako BACTIMOS nebo SK.EETAL od Novo Nordisk A/S, TEKNAR od fy Sandoz a VACTOBAC od Abbott Laboratories, lne.), Bacillus phaericus (označovaný jako SPHERIMOS od fy Novo Nordisk A/S), Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (označovaný jako FOIL od Ecogen), Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (označovaný jako CONDOR od Ecogen a AGREE od Ciba-Geigy), a Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (označovaný jako CUTLASS od Ecogen). Proteiny Bacillus mohou být voleny ze skupiny zahrnující Cryl, CrylI, CrylII, CrylV, CryV a CryVI.

Uvedené látky mohou být také formulovány spolu s jinými faktory nebo účinnými látkami, získanými ze supematantů kultury Bacillus zahrnující, ale bez omezení na něj exotoxin a/nebo podpůrný faktor. Popřípadě může formulace také zahrnovat pesticid získaný z mikroorganismu Bacillus, chemický pesticid a/nebo virus pesticidními vlastnostmi a přijatelný nosič.

Ve specifickém provedení mohou složky z této kompozice působit synergický. Jako výsledek vzniká kompozice, která má větší účinnost než by měly samostatně jednotlivé složky. Synergie se také projevuje stejnou nebo větší účinností při nižší a/nebo méně časté dávce než by bylo nutné aplikovat u každé jednotlivé složky. Alternativně může tato látka působit podpůrně na pesticid získaný z mikroorganismu Bacillus.

-7CZ 291438 B6

V prostředcích zahrnujících pesticid Bacillus se běžně používá koncentrace 0,001 až asi 300 gramů/LTU. Jak je uvedeno shora „LTU“ znamená zkouška na Leptinotarsa texana, používaná zde jako standard. Při biologickém testu se srovnává vzorek ve standardním srovnaném složení rodu Bacillus s analogickým vzorkem Leptinotarsa texana nebo s použitím jiného škůdce jako standardního testovacího organismu. Účinnost je definována podílem uváděné standardní LC₅₀ a násobením uváděnou standardní účinností.

V jiném provedení může prostředek obsahovat účinnou látku v podstatě čisté formě nebo supematantu z kultury Bacillus v suchém koncentrovaném nebo kapalném stavu a vhodný pesticidní nosič, jejichž příklady jsou uvedeny dále. Tato kompozice se dá aplikovat odděleně na rostliny, např. transgenní rostliny. Specificky je tato kompozice vhodná pro rostliny, které již předtím obsahují gen Bacillus thuringiensis. V jiném provedení se tato kompozice aplikuje na rostliny předběžně vystavené působení mikroorganismů Bacillus thuringiensis. Účinná látka v této kompozici je přítomna v koncentraci asi 0,001 % hmotnostních až asi 60 % hmotnostních.

Takovéto kompozice, které jsou popsány shora lze získat přidáním povrchově aktivního činidla, inertního nosiče, konzervačního prostředku, zvlhčovacího prostředku, požerového stimulantu, atraktantu zapouzdřovacího činidla, nosiče, emulgátoru, barviva, prostředku chránícího směs vůči účinkům UV záření, pufru, ztekucovacího činidla a popřípadě dalších komponent k produktu získanému podle vynálezu a úpravou pro určitou konkrétní aplikaci vůči určitému konkrétnímu škůdci.

Vhodná povrchově aktivní činidla zahrnují aniontové sloučeniny, jako jsou karboxyláty, např. karboxyláty kovů mastné kyseliny s dlouhými řetězci, N-acylsarkosináty, mono nebo diestery kyseliny fosforečné s ethoxyláty mastných alkoholů nebo soli takovýchto esterů, sírany mastných alkoholů jako je dodecylsulfát sodný, oktadecylsulfátsodný, nebo cetylsulfát sodný, sulfáty ethoxylovaných mastných alkoholů, sulfáty ethoxylovaných alkylfenolů, ligninsulfonáty, ropné sulfonáty, alkylarylsulfonáty, jako např. alkylbenzensulfonáty nebo nižší alkylnaftalensulfonáty, např. butylnaftalensulfonát, soli nebo sulfonované naftalenformaldehydové kondenzáty, soli sulfonovaných fenolformaldehydových kondenzátů nebo komplexní sulfonáty, jako jsou amidsulfonáty, např. sulfonované kondenzační produkty olejové kyseliny a N-methylteurinu nebo dialkylsulfosukcináty, např. sulfonát sodný nebo dioktylsukcinát. Neiontová činidla zahrnují (ale nejsou na tento výčet omezena) kondenzační produkty esterů mastných kyselin, mastných alkoholů, amidů mastných kyselin nebo alkyl-nebo alkenyl - substituovaných matných fenolů s ethylenoxidem, mastné estery vícesytných alkoholů, např. estery mastných kyselin se sorbitanem, kondenzační produkty těchto esterů s ethylenoxidem, např. polyoxyethylen substituované estery sorbitolu a mastných kyselin, blokové kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu, acetylenické glykoly, jako je např. 2,4,7,9-tetraethyl-5-decin-4,7-diol nebo ethoxylované acetylenické glykoly. Příklady kationtových povrchově aktivních činidel zahrnují substituované alifatické mono-di- nebo polyaminy jako acetát naftenát nebo oleát, kyslík obsahující aminy jako je aminoxid polyoxyethylenovaného alkylaminu, amidicky vázaný amin připravený kondenzací karboxylové kyseliny s di- nebo polyaminem nebo kvartémí ammoniové soli.

Příklady inertních materiálů jsou (aniž by to znamenalo omezení na tyto materiály) anorganické minerály, jako je kaolin, křída, sádra, hnojivo, fylosilikáty, uhličitany, sírany nebo fosfáty, organické materiály, jako je cukr, škroby nebo cyklodextriny nebo botanické materiály, jako jsou produkty ze dřeva, korek, rozemleté klasy, rýžové odpady, ořechové slupky apod.

Směsi podle vynálezu mohou být připraveny ve formě vhodné k přímému použiti nebo jako koncentráty nebo premixy, které vyžadují další řádění vhodným množstvím vody nebo jiného rozpouštědla před aplikací. Pesticidní koncentrace se do určité míry mění v závislosti na povaze konkrétní formulacem specificky je důležité, jde—li o koncentrát nebo směs, která má být používána přímo. Směs obsahuje 1 až 98 % hmotnostních pevných nebo kapalných inertních nosičů a 0 až 50%, výhodně 0,1 až 50% povrchově aktivního činidla. Tato kompozice se

-8CZ 291438 B6 dodávají s vyznačením dávky pro použití jako komerční produkt, přičemž tato dávka je výhodně kolem 1,1.10^-2 g/m² až 5,6.10^-1 g/m² (0,01 až 5 liber na akr) v suché formě a 1,1.10 ⁶1/m² až 2,9.10^-31/m² (0,01 až 25 pint na akr) v kapalné formě.

V další provedení se pesticid získaný z mikroorganismu Bacillus a/nebo účinná látka před smísením zpracovává za účelem prodloužení její pesticidní aktivity, když je aplikována do určitého prostředí cílového škůdce, přičemž toto předběžné zpracování je neškodné vůči samotnému pesticidu nebo účinné látce. Takové zpracování lze provádět chemickými a/nebo fyzikálními prostředky, které nepůsobí škodlivě na kompozici (-ce). příkladem chemického činidla (aniž by se na tyto příklady rozsah činidel omezoval) jsou aldehydy, jako formaldehyd a glutaraldehyd, protiinfekční přísady, jako je zefyranchlorid, alkoholy, jako izopropanol a ethanol a histologické fíxativy, jako je Bouinův fixativ a Helliův fixativ (viz příklady v Humason, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Co., 1967).

Prostředky podle vynálezu se mohou aplikovat přímo na rostliny, např. rozstřikováním nebo poprášením v době, kdy se škůdci začínají objevovat na rostlinách nebo před dobou jejich obvyklého výskytu jako prevence. Rostliny, které mohou být chráněny v rozsahu vynálezu, jsou (aniž by tento výčet byl omezující) obilniny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a odpovídající produkty), řepy (cukrová nebo krmná řepa), peckoviny, malvice a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny a ostružiny), luskoviny (alfaalfa, fazole, čočka, hrách, sojové boby), olejové rostliny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokosové ořechy, ricina, kakaové boby, podzemnice olejná), okurkovité rostliny (okurky, dýně, melouny), rostliny pěstované pro vlákno (bavlna, len, konopí, juta), citrusové ovoce (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky), zelenina (špenát, salát, chřest, kapusta a jiné brassicae, karotka, cibule, rajčata, brambory), lauraceae (avokáda, skořice, kafr), listnaté stromy a konifery (např. linda, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, smrky, a borovice) nebo rostliny, jako je kukuřice, tráva pro závodiště, tabák, ořechy, káva, cukrová třtina, čaj. vinná réva, chmel, banány nebo kaučukovník a okrasné rostliny. Účinná látka se může aplikovat na list, do brázdy, rozhazováním granulí, pokládáním, nebo přidáváním do půdy. Je obecně důležité dosáhnout dobré účinnosti vůči škůdcům v ranných stádiích růstu pěstovaných rostlin, neboť v této době mohou škůdci nejvíce rostlinu poškodit. Postřik nebo popraš může obvykle obsahovat i další pesticid, pokud je to podle mínění odborníka nutné. Ve výhodném provedení se aplikuje prostředek podle vynálezu přímo na rostliny.

Prostředek podle vynálezu může být účinný vůči škůdcům řádu Coleoptera, např. Leptinotarsa sp. (např. Leptinotarsa texana, Leptinotarsa decemlineata), Diabrotica undecimpunctata, Dendroctonus formtalis, Anthonomus grandis, Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis. Alphitoblus diaperinus, Palorus ratueburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor. Prostředek podle vynálezu může být také účinný vůči hmyzím škůdcům včetně (aniž by se na ně účinnost omezovala) škůdci z řádu motýlů (Lepidoptera), například Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillaceae, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx moři, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Christoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diapharúa nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euprocris chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicovepra zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege

-9CZ 291438 B6 sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra cobfigurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta. Maeuca testulalis, Melanchra pieta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vemata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyprilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice. Pseudeletia unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Thaumstopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Diptera, např. Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygia, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp.. Culiseta inomata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina moristans morsitans, Glossina moristans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobius irritans, Hypoderma bovis, Hydoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia čupřina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musea autumnalis, Musea domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Phyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa, Acari, např. Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae, Hymenoptera, např. Iridomyrmex humilis, Solenipsis invicta, Isoptera, např. Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans, Siphonaptera, např. Ceraptophyllus gallinae, Ceraptophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalldes felis, Echicnophaga gellinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans a Tylenchida, např. Melodidogyne ineognita, Pratylenchus penetrans.

Následující příklady jsou předkládány pouze jako ilustrace, nikoliv jako omezení vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklady 1: Kultivace různých izolátů B.t.

Subkultury EMMC-0077, EMCC-0078, EMCC-0079, EMCC-0080 a EMCC-0081, udržované na širokém agaru, byly použity k inokulaci 250 ml protřepávaných baněk, obsahujících 50 ml živného roztoku o následujícím složení.

Obilný roztok 15 g/1 maltrin-100 40 g/1 bramborový škrob 30 g/1

KH₂PO₄ 1,77 g/1

K₂HPO₄ 4,53 g/1 pH roztoku bylo udržováno na 7,0 pomocí 10N NaOH.

Po inokulaci byly protřepávané baňky inkubovány při 30 °C na rotačním třepacím zařízení při 250 otáčkách za minutu po dobu 72 hodin. Celá směs s kulturou byla použita pro testování vůči Diabrotica andecimpunstata.

- 10CZ 291438 B6

Příklad 2: Aktivita Diabrotica undecimpunstata v celé kultivační živné směsi pro případ jednotlivých izolátů.

2,5 ml celé kultivované směsi získané shora popsanou fermentací se odebralo a přemístilo z protřepávaných baněk do 50 ml polypropylenových testovacích trubic. Do každé testovací trubice se přidají potravní vzorky Diabrotica undecimpunstata až na konečný objem 25 ml. Potravní vzorek a testovací materiál se pak intenzivně míchá a disperguje do testovací nádoby. Na povrch každého z těchto „potravních vzorků“ byla vložena vajíčka Diabrotica undecimpunstata v počtu 3 až 6. Na nádoby byl aplikován Mylar a byly inkubovány při 28 °C bez osvětlení. Hodnocení bylo provedeno po 7 dnech. Mortalita byla stanovena sedmý den po inkubaci. Vysvětlivky k tabulce: SS7= velikost mrtvých larev sedmý den ve srovnání s živými, kontrolními larvami v ten samý den, což je hodnota SS7=4, SS7=3, SS7=2 a SS7=1 představuje velikost 75 %, 50 % a 25 % oproti živým larvám, které mají kontrolní hodnotu 4. V následující tabulce 1 jsou shrnuty získané výsledky od všech pěti kmenů, u kterých byla mortalita 100 %. Dále, mrtvé larvy měly 12,5% velikost oproti živým kontrolním larvám.

Tabulka 1

Aktivita Diabrotica undecumpinstata v celé kultivační živné směsi

Kmen	% mortality	SS7
EMCC-0077	100	0,5
EMCC-0078	100	0,5
EMCC-0079	100	0,5
EMCC-0080	100	0,5
EMCC-0081	100	0,5

Příklad 3: Lokalizace aktivity Diabrotica undecimpunstata

Za účelem stanovení zda aktivita Diabrotica undecipunstata je spojena s delta-endotoxinem/sporami nebo supematantem, bylo odebráno 2,5 ml celkové kultivované směsi kmenů EMCC-0077, EMCC-0080, EMCC-0081 a NB 125 (Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis pěstovaný za identických podmínek) a odstředí se na centrifuze Sorvall RC-5B při 15 000 otáčkách za minutu (rotor Sorvall SS34) po dobu 15 minut, čímž se oddělí supernatant a částice. Krystalické delta-endotoxiny + spory se získají z částic. Delta-endotoxiny produkované Diabrotica undecimpunstata-aktivním B.t. izolátem EMCC-0077 mají molekulové hmotnosti 66 000(66kD), 29 000(29kD) a 12 000 (12kD), jak je definováno v SDS-PAGE. Delta-endotoxiny, produkované Diabrotica undecimpunstata-aktivním B.t. izolátem EMCC-0078 mají molekulové hmotnosti 153 000 (153kD), 77 000 (77kD), 67 000 (67kD), 50 000 (50kD), 42 000 (42kD), 34 000 (34kD), 30 000 (30kD) a 241 000 (241 kD), jak je definováno v SDS-PAGE. Delta-endotoxiny, produkované Diabrotica undecimpunstataaktivním B.t. izolátem EMCC-0079 mají molekulové hmotnosti 135 000 až 145 000 (135kD a 145kD), jak je definováno v SDS-PAGE. Delta-endotoxiny, produkované Diabrotica undecimpunstata-aktivním B.t. izolátem EMCC-0080 mají molekulové hmotnosti 94 000 (94kD) a 40 000 (40kD), jak je definováno v SDS-PAGE. Delta-endotoxiny, produkované Diabrotica undecimpunstata-aktivním B.t. izolátem EMCC-0081 mají molekulové hmotnosti 129 000 (129kD) a 32 000 (32kD), jak je definováno v SDS-PAGE.

Každý supernatant (2,5 ml) získaný při shora uvedené centrifugaci se přenese do 50ml polypropylenové testovací trubice. Částice se pak resuspendují ve 2,5 ml sterilní destilované vody a přenesou do samostatné 50ml polypropylenové testovací trubice. Do testovacích trubic, jež obsahují buď supernatant nebo resuspendované částice se poté přidá potravní vzorek Diabrotica

-11 CZ 291438 B6 undecimpunstata až na konečný objem 25 ml. Zbylé kroky biologického testu jsou identické s kroky uvedenými výše. Vyhodnocení je opět shodné s tím, jak bylo uvedeno výše.

Výsledky, jak je vidět vtab. 2 ukazují, že Diabrotica undecimpunstata má aktivitu u kmenů 5 EMCC-0077, EMCC-0080 a EMCC-0081 přítomnou ve všech supernatantech, přičemž malá aktivita Diabrotica undecimpunstata od známých kmenů Bacillus thuringiensis subspecies telebrionis je soustředěna v částicích (spory + krystalická část).

Tabulka 2: Aktivita Diabrotica undecimpunstata v supematantu a v částicích

Kmen	Frakce	% mortality	ne j lepší účinnost
EMCC-0077	supematant	100	0,5
	částice	10	3,0
EMCC-0080	supematant	100	0,5
	částice	0	4,0
EMCC-0081	supematant	100	0,5
	částice	0	3,0
NB 125	supematant	0	3,0
	částice	50	1,5

Příklad 4: Účinnost vůči Leptinotarsa texana

Po filtraci přes membránu 0,2 mikrometrů byl supematant z kmene EMCC-0080 získaný z příkladu 1 použit pro test na účinnost vůči broukům. Zfiltrovaný supematant se aplikuje na vajíčka v objemu 1,87.10^-2 1/m² (20 galonů na akr). Ředění byla 0,1 ku 1, 1 ku 4, 1 ku 8 (supematant: deionizovaná voda, objemově). Larvy Leptinotarsa texana byly vystaveny působení 20 prostředků podle následujícího standardního postupu. Každá rostlina byla opatřena 20 larvami Leptinotarsa texana.

Výsledky, jak jsou uvedeny v následující tabulce 3 ukazují, že zfiltrovaný supematant EMCC-0080 je aktivní vůči Leptinotarsa texana.

Tabulka 3: Účinnost vůči Leptinotarsa texana EMCC-0080

Kmen	Ředění	% mortality
EMCC-0080	0	95
	1:1	55
	1:4	20
	1:8	0
neošetřená
kontrola
		0

Příklad 5: Synergický efekt EMCC-0080 a NOVODOR™

Výsledky, jak ukazuje tabulka 3 shora naznačují, že supematant EMCC-0080 je neúčinný sám o sobě při řádění 1:8 objemově. Pokud však ošetříme rostlinu 1,25% nebo 2,5% lOx koncentro35 vanějším supematantem EMCC-0080 v kombinaci s 200 mikrogramy NOVODOR™ (Novo

Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark) na mililitr, získáme synergický efekt, který se projeví silným poklesem LC50 a LC90 NOVODORu™. Data jsou uvedena v následující tabulce 4.

- 12CZ 291438 B6

Tabulka 4: Synergický efekt EMCC-0080 a NOVODOR™

Vzorek	LC50 (pg/g)	LC90 (pg/g)2	zesílení3
NOVODOR™	642	4,286	1,55
+ 1,25% EMCC0080	250	1,292	1,79
+ 2,5% EMCC0080	98	490	1,83

Vysvětlivky k tabulce 4 koncentrace, která zabíjí 50 % cílové hmyzí populace ² koncentrace, která zabíjí 90 % cílové hmyzí populace ³ nárůst % mortality v logaritmické koncentrační křivce

Příklad 6: Čištění účinné látky aktivní vůči škůdcům řádu Coleoptera, produkované B.t. kmenem EMCC-0080

B.t. kmen EMCC-0080 byl pěstován po dobu 24 hodin při 30 °C v živném médiu obsahujícím následující směs v gramech na litr, při pH 7,0:

Maltodextrin40 g

Sójový protein40 g

KH₂PO₄ 1,8g

K₂HPO₄4,5 g

MgSO₄.7H₂O0,3 g stopové prvky 0,2 ml

Buňky a jiné nerozpustné složky byly z kultivační živné směsi B.t. kmene EMCC-0080 odstraněny odstraněním s následnou filtrací získaného supematantů přes Celit a 0,2 pm membránu. Získaný přefiltrovaný roztok (permeát) se pak zahustí odpařením na desetinu.

Čištění aktivní látky, které vychází z lOx zahuštěného filtrátu se provádí pomocí 4 purifikačních stupňů. V průběhu čištění se monitoruje aktivita povrchovým testem na Diabrotica undecimpunstata, jak je popsáno shora, a čistota se kontroluje kapilární elektroforézou, jak je popsána v příkladu 8. Všechny chromatografické stupně využívají detekce při 226 nm.

Konkrétně se povrchový test provádí následovně. Vzorky lOx zahuštěného filtrátu se aplikují do jednotlivých otvorů mikrotitrové desky a obsahují 200 mikrolitrů zpevněné umělé hmyzí potravy na jednu prohlubeň. V této podobě se potom na vzduchu vzorky suší. Dva až čtyři čerstvě vylíhnutí jedinci Diabrotica undecimpunstata se jemně umístí do každé prohlubně. Mikrotitrové desky se pak zatěsní Mylarem s ponecháním otvorů pro výměnu vzduchu a inkubují se při 30 °C a 80% relativní vlhkosti. Hodnocení % mortality se provede po pěti dnech.

V prvním stupni se lOx koncentrovaný filtrát nejprve přečistil na SP Sephadexu C-25 (catex) na chromatografické koloně 5x30 cm. Získaných 450 mililitrů lOx koncentrovaného filtrátu se rozpustí v 18 litrech deionizované vody a uvede se na začátek kolony, která je předtím uvedena do rovnováhy 20 mM amoniumacetátovým pufrem při pH=5. Kolona se eluuje rychlostí 18 mililitrů za minutu celkem 5 litry roztoku s kontinuálním gradientem od 20mM do 0,5M amoniumacetátovým pufrem při pH=5. Frakce po 10 ml se sbírají, testují, a stanoví se jejich čistota. Účinné frakce se spojí (zhruba 150 ml), lyofílizují a znovu rozpustí v deionizované vodě na asi 1/5 původního objemu.

Ve druhém stupni se vezme 25 mililitrů vzorku z 1 stupně a přivádí se na kolonu BioRad P2 (extra jemná o velikosti 5x100 cm), která je předtím uvedena do rovnováhy deionizovanou

-13 CZ 291438 B6 vodou. Kolona se eluuje při průtokové rychlosti 1 ml za minutu deionizovanou vodou. Frakce po 10 ml se sbírají, testují a zkoušejí se jejich čistota kapilární elektroforézou. Účinné frakce se spojí (zhruba 400 ml).

Ve třetím stupni se získaných 400 ml z druhého stupně rozpustí v 16 1 deionizované vody, tento roztok se uvádí na kolonu Pharmacia S Sepharose Fast (silný katex) o rozměrech 5x30 cm, která je předem uvedena do rovnováhy 20mM amonium acetátovým pufrem při pH=5,0. Kolona se eluuje při průtokové rychlosti elučního činidla 17 ml za minutu 5 litry při kontinuálním gradientu od 20mM do 0,5M amonium acetátovým pufrem při pH=5. Frakce po 20 ml se sbírají, testují a zkouší na čistotu. Účinné frakce se spojí (zhruba 250 ml) a pak lyofilizují do sucha za účelem odstranění těkavého amonium acetátového pufru.

Ve čtvrtém stupni se lyofilizovaný spojený podíl ze třetího stupně rozpustí ve 400 ml deionizované vody, roztok se uvádí na kolonu BioRad Chelex 100 o rozměrech 0,9x30 cm, která je předem uvedena do rovnováhy 20mM pufrem mravenčanu amonného při pH=4,0. Kolona se eluuje při průtokové rychlosti 5 ml za minutu 2,4 litry při postupném gradientu 0,02; 0,1; 0,2; 0,35; 0,5; l,0M pufru na bázi mravenčanu amonného při pH=4. Frakce po 20 ml se sbírají, testují a zkouší se jejich čistota. Účinné frakce se spojí (zhruba 300 ml) a pak lyofilizují do sucha pro odstranění těkavého pufru na bázi mravenčanu amonného. Kapilární elektroforéza ukazuje čistotu materiálu, účinného vůči škůdcům řádu Coleoptera, který zahrnuje dvě látky, la a lb.

Příklad 7: Stanovení struktury látky účinné vůči škůdcům řádu Coleoptera

Struktury sloučenin la a lb se stanoví spektroskopickými daty jejich acetylovaných derivátů (deriváty A a B.

Směs la a lb o hmotnosti 114 mg se acetyluje v 5 ml pyridinu pomocí 5 ml acetanhydridu a krystalů 4-dimethylaminopyridinu jako katalyzátoru po dobu 24 hodin při teplotě místnosti a pak se čistí pomocí semipreparativní RP-C_lgHPLC. 5 mg vzorku ve 25 μΐ se uvádí na kolonu a eluuje rychlostí 4 ml za minutu směsí 80 % vody-20 % acetonitrilu. Detekce se provádí při 254 nm.

NMR spektroskopická data se získají pro derivát A a indikují přítomnost 14 uhlíků a 17 protonů. Nicméně spektrální data hmotové spektroskopie naznačují molekulovou hmotnost 652 a vzorek C28H₄oN₆Oi2 (přesná hmotnost je 653,2801, MH+, vypočtená 653,2782). Proto byla sloučenina určena jako symetrická, kdy jenom polovina molekuly se projeví na signálu NMR.

Pomocí NMR se také pozorovalo několik spinových systémů. Centrální pyrazinový kruh, substituovaný v poloze 2 a 5 byl indikován vysokým polem protonových singletů při 8,6 ppm (H-3 a H-6), které ukazují spojení všech uhlíkových atomů v kruhu i s prvním uhlíkem postranního řetězce (c-7). Postranní tříuhlíkový řetězec je acetylován v obou polohách 7 a 8 methylenem v poloze 9. Bylo zjištěno, že uhlík 9 má návaznost s uhlíkem esteru a ester byl determinován jako část alaninu, která je acetylována na aminokyselině.

Struktura derivátu B se liší v jedné pozici od derivátu A. V jednom postranním řetězci derivátu B není C-7 uhlík acetylován ani připojen ke kyslíku, ale bylo zjištěno, že jde o methylen. Druhý postranní řetězec je identický jako je tomu u derivátu A. Tento rozdíl v pouze jednom kyslíku lze také pozorovat v hmotnostních spektrálních datech. Data hmotnostní spektroskopie stanovují přesnou molekulovou hmotnost na 595,2722 (MH+, vypočteno 595,2727) pro derivát B, což indikuje vzorec C26H_3gN₆Oio. Optické hustoty derivátů A a B jsou následující: Derivát A [a]_D27 =-6,9 °C a derivát B [a]_D27 = 32 °C. Plné potvrzení ’H a ¹³C NMR dat se provede pomocí rozkladu, COSY, HMQC a HMBC. Data jsou uvedena v tabulce 5.

- 14CZ 291438 B6

Tabulka 5: *H a ^l3C NMR data derivátu A a derivátu B v D-4 methanolu

Poloha	‘H (mult. integ. interakční konstanty)
	Derivát A	Derivát B	A	B
2			152,9	154,7
3	8,6 (s, 1H)	8,54 (s, 1H)	144,2	144,4
5			152,9	151,1
6	8,6 (s, 1H)		144,2	145,6
7	5,84 (d, 1H, J=7,4 Hz)	2,95 (dd, 1H, J=13,9; 9,2) 3,10 (dd,lH, J=13,9; 4.8)	74,0	37,5
8	4,72 (m, 1H)	4,48 (m, 1H)	52,1	50,2
9	4,24 (dd, 1H, J=11,5;6,7 Hz) 4,30 (dd, 1H, J=ll,5;6,7 Hz)	4,11 (dd, 1H, J=11,4; 6,7)	63,5	66,3
10			174,8-3-	174,7
11	4,20 (q, 1H,J=7,1 Hz)	4,20 (m, 1H)	50,3	49,8
12	1,2 (d,3H, J=7,l Hz)	1,17 (d, 3H, J=7,3)	17,8	18,1
13	5,84 (d, 1H, J=7,4 Hz)	5,80 (d, 1H, J=7,4)	74,0	73,9
14	4,72 (m, 1H)	4,70 (m, 1H)	52,1	52,1
15	4,24 (dd, 1H, J=11,5; 6,7 Hz)	4,20 (m, 1H)	63,5	63,6
	4,30 (dd, 1H, J=11,5; 6,7)	4,30 (dd, 1H, J=11,6; 6,8)
16			174,8-3-	174,7
17	4,20 (q, 1H, J=7,l Hz)	4,20 (m, 1H)	50,3	50,4
18	1,2 (d,3H, J=7,l Hz)	1,20 (d,3H, J=7,3 Hz)	17,8	17,8
19			171,4-3-	171,4
20	2,1’	1,97	20,6	20,6
21			172,9^	172,4
22	2,0’	2,02	20,5	22,5
23			172,3-3-	172,5
24	1,95’	2,09	22,5	22,6
25			172,3-31	172,9
26	1,95*	2,03	_ _ _♦· 22,5	20,7
27			172,9-3-	171,4
28	2,0*	1,95	20,5	20,6
29			171,4-3-
30	2,Γ		20,6

*, , ΐ - signály jsou zaměnitelné

Hmotnostní spektra sloučenin la a lb poskytují dva molekulární ionty 400 a 384. Od těchto dat lze odvodit, že vzorec molekuly sloučeniny la je Ci₆H₂8N₆O6 a sloučeniny lb je C_I6H₂8N₆O5, Struktury la a lb jsou určeny porovnáním NMR dat derivátu A a derivátu B s NMR daty směsi la 10 a lb. Struktury jsou následující:

-15CZ 291438 B6

Ia: R, Ri, R₂, R₃ = H

Ib: R, Ri, R₂ = H, R₃ = OH

Vlastnosti sloučenin Ia a Ib a jejich acetylovaných derivátů jsou shrnuty dále:

Derivát A:

Molekulová hmotnost:	652
Empirický vzorec:	C^HioNftOi?
UV (MeOH):	275,310 nm
MS (FAB):	(M+H) m/z 653,2801, kale. 653,2782

Derivát B:

Molekulová hmotnost Empirický vzorec:	594 C26H38N6Oio
UV (H2O):	275,310 nm
MS (FAB):	(M+H) m/z 595,2722, kale. 595,2727

Ia:

Molekulová hmotnost:	400
Empirický vzorec:	CiýH^gNůOj
UV (MeOH):	275,3 lOnm
MS (FAB):	(M+H) 401

Ib:

Molekulová hmotnost Empirický vzorec:	384 C16H28N6O5
UV (H2O):	275,310 nm
MS (FÁB):	(M+H) 385

Příklad 8: Stanovení množství sloučenin Ia a Ib ve fermentačních směsích.

B.t. kmen EMCC-0080 se namnoží postupem popsaným v příkladu 1. Koncentrace sloučenin Ia a Ib ve fermentační směsi se stanoví kapilární elektroforézou. Konkrétně se pro stanovení množství využívá kapilární elektroforézní systém BioRad Biofocus 3000 s nepovlečenou kapilárou (50 pm x 50 cm), 0,1 M fosfát při pH 2,5, napětí 20 kV, pozitivní až negativní polarita, detekce při 200 nm. Byla použita druhá injektáž vzorku o objemu 30 mikrolitrů za tlaku 34,475 kPa (5 psi). Doba analýzy je 10 minut u sloučenin Ia a 1b eluovaných při 6,0 a 5,9 minutách.

Alternativně se použije kapilární elektroforézní systém Beckman P/ACE2100 s nepovlečenou kapilárou 50 mikrometrů χ x 45 cm, 0,1 M fosfátový pufr při pH 2,5, napětí 20 kV, pozitivní až negativní polarita, detekce při 200 nm. Byl použit vzorek o objemu 30 mikrolitrů s desetisekundovou tlakovou injektáží. Doba analýzy je 10 minut u sloučenin Ia a Ib, které se eluují 7,0 a 6,7 minut.

Buňky a další nerozpustné součásti se odstraní z kultury odstředěním a filtrací přes celitovou 0,2 mikrometrovou membránu. Výsledný supematant se analyzuje kapilární elektroforézou, jak je uvedeno shora. Výsledky ukazují, že sloučeniny Ia a Ib jsou každá přítomny v množství asi 90 mg najeden litr kultivační živné směsi.

-16CZ 291438 B6

Příklad 9: Stanovení účinnosti sloučenin Ia a lb

Relativní účinnost surové směsi sloučenin Ia a lb (zhruba 1:1 hmotnostně) se stanoví pomocí Leptinotarsa texana testu a srovnáním mortality spojené s přípravou vnitřního standardu Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis. Foliámí test se provádí pro stanovení účinku surové směsi sloučenin Ia a lb Leptinotarsa texana. Pro provedení foliámího testu se standardy naváží do 50ml odstředivkových nádob a rozmáchají se s deionizovanou vodou obsahující 0,1 % Tweenu 20. 1,200 mg standardu Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis se suspenduje na finální koncentraci 12 000 pg/g- Testované vzorky (tj. NOVODOR™ a NOVODOR™ se sloučeninami Ia lb) se zpracují podobným způsobem dokud poměr nalezený testem ukazuje, že dodaná dávka je příliš vysoká nebo příliš nízká k získání dostatečně průkazných dat, jestliže v tomto případě koncentrace primárního roztoku vzroste nebo klesne změnou množství rozpouštědla přidaného k výchozímu roztoku. Každý ze vzorků se pak homogenizuje 30 sekund s pomocí homogenizéru Virtis a působí se na něj ultrazvukem po dobu 20 sekund s příkonem 100W a pomocí ultrazvukového homogenizéru Braunsonic 1510. Každý z roztoků se pak zředí pomocí Hamilton Microlab 1000 tak, aby se získala řada sedmi zředění, 3000,2000, 1333,857, 545, 364 a245 pg/ml v celkovém objemu 16 ml. Každý z těchto 16 ml vzorků se aplikuje na zhruba 0,186 m² (288 čtverečních palců) rostlinných listů pomocí rozprašovače Devries Linear Track sprayer, kalibrovaného pro dodávání 1,87.10^-21/m² (20 galonů na akr). Kontrolní listy se postřikují 16 ml deionizované vody. Listy se suší na vzduchu a pak se umístí na hrdlo 28,35 g (1 uncového) čistého plastového pohárku, který obsahuje 5sekundový instar Leptinotarsa texana. Poté se umístí poklopy, které se stlačí, odřízne se kroužek o průměru 4 cm a zatěsní se uvnitř pohárku. Pohárky se pak otočí a larvy spadnou na ošetřený povrch listů. Pro každé ze sedmi zředění se připraví 8 pohárků. Pohárky se pak uloží k sobě, označí, umístí na podložky a inkubují 3 dny při 30 °C a 65% relativní vlhkosti. Těchto 56 pokusných pohárků a 8 kontrolních pohárků představuje 1 biologický test.

Po třech dnech se vyhodnotí mortalita hmyzu. Každý z pohárků se umístí do ostrého proudění a larvy, které se nepohybují se počítají za mrtvé. Vypočte se procento mortality a data se zpracují statistickou analýzou. Vyhodnotí se zvýšení účinnosti LC₅₀, LC90, koeficient průkaznosti a odhadne se synergie.

Pro stanovení účinnosti se rozpustí surová směs, testuje a srovná se se standardem Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis, který je hodnocen účinností 20 000 LTLJ/g (Leptinotarsa texana Units/gram).

Výsledky účinnosti jsou uvedeny v tabulce 6 a ukazují, že surová směs sloučenin Ia a lb (1:1 hmotnostně) má účinnost 75,555 LTU/g aktivní přísady při LC_5O=7O pg/ml (1,8 mg celkové účinné složky na ml).

Tabulka 6: Účinnost směsi sloučenin Ia a lb

Vzorek	LC50 pg/ml	odhadnutá účinnost
Ia/Ib směs	70	75,555 LTU

Příklad 10: Potenciace krystalického delta endotoxinu Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis sloučeninami Ia a lb.

Schopnost sloučenin Ia a lb násobit (potenciovat) insekticidní aktivitu krystalického endotoxinu Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis vůči Leptinotarsa texana byla stanovena pro surovou směs sloučenin Ia a lb, přidáním kNOVODORu™ a stanovení LC₅₀ cestou paralelní

- 17CZ 291438 B6 srovnávací analýzy. Foliámí testy se prováděly na Leptinotarsa texana, jak je popsáno v příkladu 9, aby se zjistila úroveň potenciace dosažená přidáním sloučenin Ia a Ib k NOVODOR™. Surová směs sloučenin Ia a Ib se přidá k preparátu NOVODOR™. Roztoky se postupně zředí pomocí Hamilton Microlab 1000, aby se získal soubor vzorků o zředění NOVODOR™ o hodnotách 1000,0,666,7, 444,4,285,7, 181,8, 121,2 a 80,0 pg/g. Dvě rozdílná zředění směsi Ia a Ib se připraví na základě sedmi postupných zředění obsahujících 72,0,48,0,32,0,20,6,13,1,8,7 a 5,8 pg/g (2,5% objemově s 1000 pg/g NOVODOR™) a 36,0,24,0,16,0,10,3,6,5,4,4 a 2,9 pg/g (1,25% objemově při 1000 pg/g NOVODOT™) Byly připraveny čisté vzorky (bez sloučenin Ia a Ib) a současně s tím referenční látky. LC₅o párových čistých vzorků bylo rozděleno potenciovanými hodnotami LC₅o, pro zmenšení LC₅₀ směsi sloučenin Ia a Ib. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7 dále a indukují, že surová směs sloučenin Ia a Ib potenciuje insekticidní aktivitou NOVODORu™ vůči Leptinotarsa texana.

Tabulka 7: Potenciace NOVODORu™ se směsí sloučenin Ia a Ib vůči Leptinotarsa texana:

vzorek	LC5o pg/ml	potenciační faktor
NOVODOR™	642	0
NOVODOR™+1,25 Ia/Ib	250	2,6
NOVODOR™+2,5% Ia/Ib	98	6,5

Příklad 11: Účinnost směsi sloučenin Ia a Ib vůči broukům Ips calligraphus a Dendroctonus frontalis

Byla určena toxicita surové směsi sloučenin Ia a Ib vůči těmto broukům (Ips calligraphus a Dendroctonus frontalis). 3 ml surového roztoku sloučenin Ia a Ib (1,8 mg aktivní složky na ml), se přidají ke 5 gramům zmrazeného sušeného lýka kadidlové borovice a k sedmi mililitrům destilované vody. Kontrolní potrava se připravila z 10 ml vody. Potrava byla rozdělená na tři Petriho misky a pro 5 až 10 dospělých brouků Ips nebo nedávno vylíhlých brouků Dendroctonus, kteří se umístí do každé misky, tři nezávislé skupiny ošetřených vzorků potravy a kontrolních vzorků potravy byly kolonizovány 10 až 20 hmyzími jedinci. Petriho misky byly inkubovány ve tmě při 25 °C a byl spočítán počet mrtvých jedinců po 4, 7 a 10 až 12 dnech od umístění na potravu. Data jsou uvedena formou průměru ze tří nebo čtyř oddělených opakování pro každý hmyzí druh v následující tabulce 8 a 9:

Tabulka 8: Hodnocení směsi sloučenin Ia a Ib vůči Ips caligryphus:

Ošetření	Dny po ošetř.	početjedinců	počet mrtvých	Průměrné % mortality
Kontrola	4	20	0	0
Kontrola	7	20	0	0
Kontrola	10	20	1	3
Ia/Ib	4	20	1	5
Ia/Ib	7	20	7	35
Ia/Ib	10	20	20	100

Výsledky testu pro Dendroctonus frontalis jsou uvedeny v tabulce 9, a ukazují, že směs sloučenin Ia/Ibje insekticidní.

-18CZ 291438 B6

Tabulka 9: Hodnocení směsi sloučenin Ia/Ib vůči Dendroctonus frontalis

Ošetření	Dny po ošetření	početjedinců	počet mrtvých	Průměrné % mortality
Kontrola	4	14 až 20	0	0
Kontrola	7	14 až 20	1	7
Kontrola	10 až 12	14 až 20	3	16
Ia/Ib	4	10 až 20	1	5
Ia/Ib	7	10 až 20	1	5
Ia/Ib	10	20	14	83

Příklad 12: Účinnost vůči Popillia japonica (Japanese Beetle)

Surová směs sloučenin la a lb byla testována na pesticidní účinnost vůči třetímu instaru Popillia japonica. Kořeny víceletého jílku (11 dní starého) byly ponořeny do surové směsi sloučenin la alb (1,8 mg látky la a lb na 1 ml) a ponechány částečně schnout. Poté se umístí jedna larva třetího instaru Popillia japonica do nádoby s několika ošetřenými kořeny. Po 24 hodinách byly umístěny do nánosu jílové půdy Wooster. Kontrolní kořeny se ponoří do vody a neošetřené kontroly tvoří larvy, umístěné přímo do půdy první den. Nádoby se inkubují ve tmě při 25 °C a spočítají se mrtvé larvy po 7, 10,21,28 a 36 dnech a jako výsledek se uvede korigovaná mortalita: (Přežití kontroly-Přežití ošetřených)/Přežití kontroly) x 100 %). Celkem se použije pro každé ošetření 25 larev. Výsledky, jak jsou uvedeny v tabulce 10, demonstrují, že surová směs sloučenin la a lb je účinná vůči třetímu instaru Popillia japonica.

Tabulka 10: Účinnost látek la a lb vůči Popillia japonica:

pokus	hodnota	7 dní	10 dní	21 dní	28 dní	36 dní
neošetřeno	počet mrtvých	2	2	4	5	5
voda (kontr.)	počet mrtvých	2	3	8	10	11
	% kontroly	0	4,3	19	25	30
la a lb	počet mrtvých	6	8	13	14	15
	% kontroly	17,4	26,1	42,9	45	50

Příklad 13: Účinnost vůči Epilachna varivesis

Pesticidní účinnost vůči larvám třetího instaru larev Epilachna varivesis se v tomto testu stanovuje u surové směsi sloučenin la a lb. Izolovaná kolonie dospělých jedinců Epilachna varivesis se udržuje potravou tvořenou sójovými boby v teráriu při osvětlení v poměru 16:8, při 27 °C (80 °F) a při 50% relativní vlhkosti. Hmota vajíček se sebere a vajíčka se ponechají vylíhnout na Petriho miskách, obsahujících vlhký bavlněný tampon a listy měsíčních fazolí. Po dvou dnech byly odebrány larvy ve stadiu druhého instaru a použity pro listový ponořovací test, test se provádí tak, že se nejprve listy sklidí, řapíky jednotlivých listů se postrčí gumovou přepážkou do pěstební nádoby s obsahem 4 ml vody. Jednotlivé listy se potom namočí v sekvenci zředěných účinných směsí koncentrací surového materiálu s obsahem sloučenin la a lb 0 až 12 % objemově. Po uschnutí listů se na ně po 8 až 10 kusech umístí larvy Epilachna varivesis ve stadiu druhého instaru. Poté se hmyz, listy a pěstitelské trubice umístí do papírových pohárků o hmotnosti 682 g (22 uncí) a pokryjí se jemným sítem. Tyto pohárky se ponechají ve stejné komoře, která byla použita pro chov kolonie brouků. Každé dva dny se pohárky z chovné komory vyndají, larvy se zkontrolují a listy se nahradí čerstvě ošetřenými listy. Test se ukončí po osmi dnech.

Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 11, ukazují, že surová směs sloučenin la a lb je účinná vůči larvám Epilachna varivesis.

-19CZ 291438 B6

Tabulka 11: Závislost mortality Epilachna varivesis na dávce:

Dny po ošetření	LC50 %	95% odvozená účinnost
spodní	horní
4	5,6	2,58	10.65
6	2,12	3,03	9,37
8	1,94	0,75	2.81

Příklad 14: Polní pokus s Leptinotarsa decemlineata (mandelinkou bramborovou)

Je testována účinnost vůči Leptinotarsa decemlineata na bramborách (varieta Kathadin) se surovou směsi sloučenin Ia a Ib při aplikaci 20 (50), 40 (100), 60 (150) a 120 (300) gha (g/akr) v kombinaci sNOVODORem™, jehož koncentrace byla 0,2(0,5), 0,4 (1,0) 1/ha (kvartů/akr), přičemž byl samostatně aplikován i NOVODOR™ v koncentracích 0,2(0,5). 0,4(1,0) a 0,8 (2,0) 1/ha (kvartů/akr). Ošetření se provádí dvakrát za 7 dní pomocí přenosného CO₂ postřikovače, vybaveného systémem se třemi kónickými rozstřikovacími tryskami TXVX-12 na jednu řadu a kalibrovaným pro dodání 32 GPA při rychlosti 4,8 km/h a tlaku 386 kPa (56 psi). Každé ošetření se opakuje čtyřikrát na parcelkách o dvou řadách (vzdálenost mezi řádkami 0,86 m (34 inch) o délce jednoho bloku 7,62 m (25 stop). Byli počítáni dospělci a larvy Leptinotarsa decemlineata bez poškozování listů na celé délce řádky 15,2 m (50 stop) v jedné parcelce.

Výsledky, jak jsou uvedeny na obr. 3, ukazují, že surová směs sloučenin Ia a Ib má významný synergický efekt při společném použití s prostředkem NOVODOR™ na bramborách. Při 0,2 1/ha (0,5 kvartů/akr) NOVODORu™ lze zaznamenat potlačení 21 %, zatímco při 20 g/ha (50 g/akr) surové směsi sloučenin Ia a Ib se dosáhne potlačení 13 %. Avšak když se pak použije kombinace prostředku NOVODOR™ se surovou směsí sloučenin Ia a Ib ve stejných koncentracích, dosáhne se potlačení 81 %. Obdobně aplikací 40 g/ha (100 g/akr) samotné surové směsi sloučenin Ia a 1b se dosáhne 28% potlačení, aplikací 0,2 1/ha (0,5 kvartů/akr) samotného NOVODORu™ dojde k 21% potlačení a při kombinovaném použití těchto prostředků při stejných koncentracích vzroste procento potlačení na hodnotu 81 %. Kromě toho společná aplikace 20 g/ha (50 g/akr) surové směsi sloučenin Ia a Ib a 0,4 1/ha (1,0 kvartů/akr) NOVODORu™ umožní dosáhnout vzrůst potlačení na 88 %.

Uložení mikroorganismů

Podle Budapešťské dohody o ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení byly v mezinárodní sbírce s adresou Agricultural Research Service Patent Cultura Collection Northern Regional Research Center (NRRL), 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, OSA, uloženy následující kmeny Bacillus thuringiensis:

Kmen	Sbírkové číslo	Datum uložení
EMCC-0077	NRRL B-21090	10.5. 1993
EMCC-0078	NRRLB-21091	10.5.1993
EMCC-0079	NRRL B-21092	10. 5. 1993
EMCC-0080	NRRL B-21093	10.5. 1993
EMCC-0081	NRRL B-21094	10. 5.1993

Kmeny byly uloženy za podmínky, že přístup ke kulturám bude umožněn v průběhu řízení o této patentové přihlášce jen s povolením Commisioner of Patents and Trademarks podle 37 C.F.R. §§ 1.14 a 35, U.S.C. § 122. Depozita představují v podstatě čisté kultury každého uloženého kmene. Jsou přístupná, pokud to požadují zákony cizích zemí, pro ty země, ve kterých byl podán analog předmětné přihlášky nebo kde byla podána přihláška z ní odvozená. Tomu je však třeba

-20CZ 291438 B6 rozumět tak, že přístupnost depozita v tomto smyslu neznamená licenci k využívání předmětu vynálezu při omezení patentových práv, udělených vládním rozhodnutím.

Popsaný a chráněný vynález není omezen jen na rozsah konkrétních provedení, která jsou uvedena v popisu, neboť tato provedení jsou míněna jako ilustrace několika aspektů vynálezu. Jakékoliv ekvivalentní provedení patří do rozsahu vynálezu. Také různé modifikace, které může z popisu vynálezu vyvodit osoba znalá v oboru, spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

Různé citované odkazy jsou svým popisem začleněny v přihlášce jako celek.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (12)

1. Kmen Bacillus thuringiensis NRRLB-21093 nebo jeho odpovídající mutant, který má stejné vlastnosti, produkující účinnou látku se strukturou I kde R, Ri, R₂ je vodík, R₃ je vodík nebo hydroxyl; s pesticidním účinkem a který je v supernatantu z fermentace tohoto kmene.

2. Kmen nebo jeho mutant podle nároku 1, kde supematant z uvedené fermentace produkujícího kmene zahrnuje uvedenou látku mající pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera.

3. Kmen Bacillus thuringiensis NRRLB-21090 nebo jeho odpovídající mutant, který má stejné vlastnosti, produkující účinnou látku se strukturou I kde R, Rj, R₂ je vodík, R₃ je vodík nebo hydroxyl; s pesticidním účinkem a který je v supernatantu z fermentace tohoto kmene.

4. Kmen nebo jeho mutant podle nároku 3, kde supematant z uvedené fermentace produkujícího kmene zahrnuje uvedenou látku mající pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera.

-21 CZ 291438 B6

5. Kmen Bacillus thuringiensis NRRL B-21091 nebo jeho odpovídající mutant, který má stejné vlastnosti, produkující účinnou látku se strukturou I kde R, Ri, R₂ je vodík, R₃ je vodík nebo hydroxyl; s pesticidním účinkem a který je v supernatantu z fermentace tohoto kmene.

6. Kmen nebo jeho mutant podle nároku 5, kde supernatant z uvedené fermentace produkujícího kmene zahrnuje uvedenou látku mající pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera.

7. Kmen Bacillus thuringiensis NRRL B-21092 nebo jeho odpovídající mutant, který má stejné vlastnosti, produkující účinnou látku se strukturou I (I), kde R, R_b R₂ je vodík, R₃ je vodík nebo hydroxyl; s pesticidním účinkem a který je v supernatantu fermentace tohoto kmene.

8. Kmen nebo jeho mutant podle nároku 7, kde supernatant z uvedené fermentace produkujícího kmene zahrnuje uvedenou látku mající pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera.

9. Kmen Bacillus thuringiensis NRRL B-21094 nebo jeho odpovídající mutant, který má stejné vlastnosti, produkující účinnou látku se strukturou I

-22CZ 291438 B6 kde R, Ri, R? je vodík, R₃ je vodík nebo hydroxyl; s pesticidním účinkem a který je v supernatantu z fermentace tohoto kmene.

9. Kmen nebo jeho mutant podle nároku 9, kde supematant z uvedené fermentace produkujícího kmene zahrnuje uvedenou látku mající pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera.

10. Způsob potírání hmyzích škůdců druhů řádu Coleoptera, vybraných ze skupiny sestávající z Leptinotarsa decemlineata, Ips calligraphus, Dendroctonus frontalis, Epilachna varivestis a Popillia japonica, zahrnující působení pesticidní kompozice na škůdce, vyznačující se t í m , že na hmyzího škůdce působí kompozicí zahrnující účinné množství látky se strukturou I definovanou v nároku 1, která má pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera a působí zároveň s různými pesticidy produkovanými mikroorganismy rodu Bacillus, přičemž uvedená látka se získává ze supematantu z fermentace kmene Bacillus thuringiensis vybraného ze skupiny sestávající z kmenů NRRLB-21090, NRRLB-21091, NRRLB-21092,

NRRL B-21093 a NRRL B-21094 nebo jejich odpovídajících mutantů a pesticidně účinného nosiče.

11. Způsob zesílení pesticidní účinnosti pesticidů produkovaných mikroorganismy rodu Bacillus při působení pesticidní kompozice na škůdce zahrnující látku s pesticidním účinkem a pesticidně účinný nosič, vyznačující se tím, že se na hmyzího škůdce řádu Coleoptera působí za použití pesticidní kompozice, která zahrnuje účinnou látku struktury I definovanou v nároku 1, která má pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera a působí zároveň s různými pesticidy produkovanými mikroorganismy rodu Bacillus, přičemž uvedená látka se získává ze supematantu z fermentace kmene Bacillus thuringiensis vybraného ze skupiny sestávající z kmenů NRRL B-21090, NRRL B-21091, NRRL B-21092, NRRL B-21093 a NRRL B-21094 nebo jejich odpovídajících mutantů, a pesticidně účinného nosiče v množství účinném k zesílení pesticidní účinnosti uvedeného pesticidu produkovaného mikroorganismy rodu Bacillus.

12. Způsob získávání v podstatě čisté látky se strukturou definovanou v nároku 1, která má pesticidní účinek proti škůdcům řádu Coleoptera a která působí proti škůdcům zároveň s různými pesticidy produkovanými mikroorganismy rosu Bacillus, vyznačující se tím, že se uvedená látka získává ze supematantu z fermentace kmene Bacillus thuringiensis, vybraného ze skupiny sestávající z kmenů NRRLB-21090, NRRLB-21091, NRRLB-21092,

NRRLB-21093 a NRRLB-21094 nebo jejich odpovídajících mutantů kultivováním na vhodném růstovém médiu uvedeného kmene Bacillus thuringiensis, u něhož je v podstatě veškerá pesticidní účinnost v supematantu z fermentace uvedeného kmene, oddělí se supematant, přičemž se ze supematantu izoluje a získá se v podstatě čistá účinná látka se strukturou I.