CZ275997A3 - Pesticidní prostředek a kmen Bacilus thuringiensis - Google Patents

Description

Pesticidní prostředek a kmen Bacillus thuringiensisOblast techniky

Vynález se týká nového kmene (kmenů) Bacillus thuringiensis, jehož pesticidní účinnost se projevuje

- v supernatantu směsi, ve které je fermentovánKmen^produkuje^ ¹ látku, která je účinná proti hmyzímu škůdci (škůdcům) řádu | Coleoptera, a která zvyšuje účinnost pesticidů, které tvoří mikroorganismy rodu Bacillus (dále pesticidy Bacillus). Dále se vynález týká pesticidních konkrétního složení pesticidních prostředků, založených na této látce, které obsahují spolu s touto účinnou látkou nosič nebo pesticid Bacillus, chemický pesticid a/nebo virus s pesticidními vlastnostmi. Vynález se také týká způsobů aplikace těchto prostředků za účelem potírání škůdců.

Dosavadní stav techniky

Vynález dne 14.3.1995, 14.3.1994. Obě citace.

navazuje na přihlášku US 08/404076, podanou která navazuje na US 08/212462, podanou dne přihlášky se tímto zařazují do popisu formou

Každým rokem se ztrácí značná část světové obchodně významné úrody, včetně potravin, textilu a různých pokojových rostlin poškozením nebo zničením škůdci, což má za následek ztráty, dosahující miliony dolarů. Snahy o jejich potírání se -ř-íd-í—různými— stratég řemit . ... i «· . f .. . # -Γ .

Jednou ze strategií je použití širokospektrálních pesticidů, t.j. chemických pesticidů s širokým rozsahem aktivity. Používání těchto chemických pesticidů má však mnoho nevýhod. Typickým problémem jejich použití je skutečnost, že mohou ničit v důsledku svého širokého účinnostního spektra necílové organismy, například destruktivních škůdců. Kromě pesticidy často toxické vůči škůdci získávají při opakovaném vystavení těmto látkám odolnost.

užitečný hmyz a parazity toho bývají tyto chemické zvířatům a lidem, a cíloví

Jinou strategií je používání biopesticidů, při kterém se využívá přírodních pathogenů pro potírání hmyzu a houbových a plevelových kontaminací úrody. Mezi biopesticidy patří bakterie, které produkují toxiny, látky toxické vůči škůdcům. Biopesticidy jsou ve srovnání s chemickými pesticidy obecně méně nebezpečné pro necílové organismy i pro životní prostředí jako celek.

Nejvíce používaným thuringiensis (B.t.). B.t. sporulující mikroorganismus, produkuje B.t. protein(-y) biopesticidem je Bacillus je široce rozšířený, aerobní

V průběhu sporulačního cyklu známý(-é) jako krystalický(-é) delta endotoxin(-y). Tyto látky zabíjejí larvy hmyzu, a proto je B.t. velmi užitečný jako zemědělský pesticid.

Některé kmeny, například Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki a Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, vykazují specifickou účinnost vůči motýlům (Lepidoptera). Poddruh Bacillus thuringiensis subspec. israelensis vykazuje specifickou účinnost vůči dvoukřídlým (Diptera) (Goldberg, US patent čt 4^—Γ66^—ΓΓ2')Ί Další kmeny, například Bacillus 'thuringiensis subspec? tenebrionis (Kreig et al., 1988, US patent 4 166 203), jsou podle publikovaných údajů specificky účinné proti broukům (Coleoptera). Izolace dalších kmenů Bacillus thuringiensis, toxických vůči broukům, byla ί!

publikována v roce 1986 (Hernnstadt et al. Bio/Technology vol. 4, str. 305 až 308, 1986, US patent 4 764 372 z roku

1988). Tento kmen, pojmenovyný jako Bacillus thuringiensis subspec. san diego, M-7, byl uložen v Northern Research Laboratory, USA, pod číslem NRRL B-15939. Avšak přihlašovatel tohoto patentu 372, Mycogen Corp. veřejně oznámil, že Bacillus thuringiensis subspec. san_j diego _je^.Bacillus _til thuringiensis subspec. tenebrionis. Kromě toho byl patent

372 postoupen společnosti Novo Nordisk Α/Ξ. Dále byl nalezen kmen B.t., který je toxický vůči motýlům i vůči broukům (PCT přihláška WO 90/13651). Toxin popsaný v této zveřejněné PCT přihlášce WO 90/13651 má molekulovou hmotnost 81 kD.

přeměňovat na menší v metabolismu cílového

V průběhu sporulačního cyklu produkuje B.t. protein(-y) v krystalické formě známý(~é) jako krystalický(-é) delta endotoxin(-y) s molekulovou hmotnosti v rozmezí 27 až 140 kD, který(-é) při požeru zabíjí hmyzí larvy. Toxická účinnost může být vlastností jednoho či několika těchto deltaendotoxinů u daného kmenu B.t. Většina delta endotoxinů jsou protoxiny, které se proteolyticky (odštěpené) toxické polypeptidy hmyzu* (Hófte a Whiteley, 1989,

Microbiol. Rev. .53.:242-255), Tyto delta endotoxiny jsou kódovány prostřednictvím cry (crystal protein) genů. Tyto cry geny se dělí na šest tříd a několik podtříd podle strukturní podobnosti a podle insektícidní specifity.

Hlavními třídami jsou Lepidoptera-specifické (cryl),

Lepidoptera- i Diptera-specifické (cryll), Coleoptera—specifické (cr y II Γ)“7“ϋΐρ t er a -spec ίϊ Tčke (cryivj (Hófte and 'Whiteley, 1989, Microbiol.Rev.53:242-255), Coleopterai Lepidoptera-specifické (označované jako cryV geny Tailorem et al., 1992, Molekolar Microbiology 6:1211-1217) a Nematoda-specifické (označované jako cryV a cryVI

Feitelsonem et al., 1992, Bio/Technology 10:271-255) geny

Delta-endotoxiny už byly připraveny metodami rekombinantní DNA. Tyto delta endotoxiny, vyráběné metodami rekombinantní DNA mohou avšak nemusí být v krystalické formě.

B.t^ delta-endotoxin je_tve vodě_ nerozpustný,výjimkou alkalického pH a je téměř vždy kodován plasmidy. Některé kmeny Bacillus thuringiensis produkují, jak bylo prokázáno, tepelně stabilní pesticidní adenin-nukleotidový analog, známý jako β-exotoxin nebo thuringiensin, který je sám pesticidní (Sebesta et al., v H.D.Burges (ed.), Microbial Control of Pests and Plant Deseases, Academie Press, N.Y., str. 249 až 281, 1981). β endotoxin byl zjištěn v supernatantu určitých kultur Bacillus thuringiensis. Má molekulovou hmotnost 789 a sestává z adenosinu, glukózy a allarové kyseliny (Luthy et al. v Kurstak (ed.), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, str. 35-72). Jeho účinné rozmezí zahrnuje Musea domestica Mamestra configurata Walker, Tetranichus urticae, Drozophila melanogaster a Tretranichus cinnabarinus, ale neni na ně omezen. Toxicita β -exotoxinu je podle dosavadních představ příčinou inhibice DNA řízené RNA polymerázou konkurencí s ATP. Bylo zjištěno, že β-exotoxin je kodován CRY plazmidem v pěti kmenech Bacillus thuringiensis (B.b.) a že β-exotoxin může být klasifikován jako typ I nebo typ II β-exotoxin (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). β-exotoxin typu I je , jak je známo, produkován Bacillus thuringiensis subspecies thuringiensis serotypu 1, -Baci-l-lus thufingiensiš subspecies tolworthi serotypu 9 a*Bácillus thuringiensis subspecies darmstadiensis serotypu 10. β-exotoxin typu 2 je produkován Bacillus thuringiensis subspecies morrisoni serotypu 8 ab a je aktivní proti Leptinotarsa decemlineata (mandelinka bramborová). Další ve vodě rozpustné látky byly izolovány z Bacillus thuringiensis včetně alfa -exotoxinu, který je toxický proti larvám Musea domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7), gamma - exotoxiny, které jsou různými proteolytickými enzymy včetně lecitináz, chitináz a proteáz, jejichž toxické účinky jsou exprimovány pouze v kombinaci z β-exotoxinem nebo j..—. „delta-endotoxinem·· -(Forsberg- et·. -al·., 19767“-Bacillus i thuringiensis: Its Effects on Enviromental Quality, National

Research Council of Canada, NRC Associate Committee on

Scientific Criteria for Environmental Quality , Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena), sigma-exotoxin, který má strukturu podobnou β-exotoxinu a je také aktivní vůči Leptinotarsa decemlineata (Argauer el al., 1991, J. Entomol. Sci. 26:str. 206-213) a anhydrothuringiensin (Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 40, 1775-1975).

WO 94/09630 uvádí ve vodě rozpustné látky, které podporují účinnost Bacillus thuringiensis varieta kurstaki a Bacillus thuringiensis varieta aizawai.

Stonard et al. (1994 v Natural and Engineered Perst Management Agents, Paul A. Mann, Robert M. Hollingworth, vydavatel ACS, Washington D.S. str. 25-36) uvádí diabroticiny struktury:

í t ' .. -

*0

1. R, Rj,R₂ ^{= H}ř ^R3 ^{= 0H} Diabroticin A

2. R, R_lřR₂, = H Diabroticin B

Diabroticiny byly izolovány z Bacillus subtilis a mají účinnost proti Diabrotica undecimpunctata, Leptinotarsa decenlineata, Anthomus grandis Boheman, proti larvám moskytů,

- Staphylococcus aureus^j ^Micrococcus lutea,-..ale».nemajíúčinnost proti Evropskému vrtavci (European corn borer), ř t Escherichia coli, B. subtilis a Psudomonas aeruginosa.

Aktivita vůči ostatním škůdcům nebyla v publikaci Stonarda et al. zjištěna. Diabroticin A byl také izolován z fermentační směsi B.cereus.

Podle dosavadního stavu techniky se dosáhlo určitého růstu mortalitiy formulacemi Bacillus thuringiensis. Byly hledány nové kmeny s vyšší mortalitou, založené na genetickém ovlinění existujících kmenů a hledání účinnějších směsí kombinováním spor Bacillus thuringiensis a/nebo kristalů s novými pesticidními nosiči nebo s chemickými pesticidy.

Cílem vynálezu je vylepšení insekticidní účinnosti známých formulací na bázi Bacillus thuringiensis.

Dalším cílem vynálezu je zvýšení pesticidní účinnosti pesticidů a současně nalezení nového použití pro známé ; pesticidní produkty.

I

Je výhodné izolovat nové kmeny Bacillus thuringiensis

- za-účerefiTpripravy nových látek nebot existují širší spektra ' ** ********biopesticidů pro každého daného škůdce.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nového kmene Bacillus thuringiensis, který vykazuje v podstatě veškerou pesticidní aktivitu v supernatantu, získaného z fermentace tohoto kmenu. Krystalický protein a spory získané z fermentace kmene Bacillus thuringiensis_m podlevynálezu nevykazuje .žádnou pesticidní účinnost. V konkrétních provedeních jde o kmen vybraný ze skupiny sestávající z EMCC-0077 , který má indentifikační charakteristiky NRRL B-21090, nebo mutantů tohoto kmene, kteří mají v podstatě tytéž vlastnosti jako EMCC 0077, EMCC 0078 a které mají indetifikační charakteristiky NRRL B-21091 nebo mutantů těchto kmenů, které mají v podstatě stejné vlastnosti jako EMCC 0078, EMCC 0079 a mají indentifikační charakteristiky NRRL B-21092, nebo jejich mutantů s vlastnostmi v podstatě

EMCC-0079, EMCC-0080, které charakteristiky NRRL B-21093, nebo stejných vlastností jako EMCC-0080 s NRRL B-21094, nebo jejich mutantů, které mají v podstatě stejné vlastností jako EMCC-0081.

stejnými jako indentifikační jejich mutantů v podstatě a EMCC-0081 s vlastnostmi maj i

Látka, která má pesticidní účinnost vůči hmyzím škůdcům řádu Coleoptera a působí například společně s potenciační nebo synergickou složkou jiného pesticidu získaného z rodu Bacillus vůči škůdcům, se získá ze supernatantu z fermentace některého z uvedených kmenů. Ve výhodném provedení má uvedená látka LC_5Q (jedná se o koncentraci^-daného pesticidu, která je nutná k zabití 50 % škůdců) 126 ug aktivní složky n jeden gram celkového materiálu vůči Leptinotarsa texana. LC₅₀ pelet z fermentace > uvedeného kmene je více než 3000 ug aktivní přísady na jeden gram celkového materiálu.

V jiném provedení má látka podle vynálezu pesticidní účinnost vůči hmyzím škůdcům řádu Coleoptera.

V nejspecifičtějším provedení má tato látka pesticidní účinnost vůči hmyzím škůdcům druhu Diabrotica undecimpunctata, Anthomus grandia a překvapivě je účinný proti hmyzím škůdcům druhů Ips calligraphus, Popillia

- japonicus, Epilachna varivastis, Leptinotarsa.decemlineata^.-., . —Π»-----»*- -- * - --- “* ' a Dendroctonus frontalis řádu Coleoptera.

(

Ve specifickém provedení má látka podle vynálezu podpůrný účinek na inskticidní aktivitu krystaly delta-endotoxinu(-ů) Bacillus thuringíensis proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera.

Výraz používaný shora Pesticid získaný z rodu Bacillus je míněn tak, že látka se získává z kmenů nebo spor mikroorganismů Bacillus (např. Bacillus thuringíensis nebo Bacillus subtilis). Pesticid získaný z roku Bacillus může také znamenat látku odvozenou od mikroorganismů, např. rodu Bacillus, např. protein nebo jeho fragment, který má účinnost proti škůdcům, nebo který je zabíjí, nebo může jít o látku, která chrání rostliny, např. Antifedant nebo mikroorganismus schopný exprese . genu Bacillus kódujícího protein nebo fragment rodu Bacillus, který má aktivitu vůči škůdcům nebo který je zabíjí (např. Bacillus thuringíensis, delta-endotoxin) a vhodný nosič (viz další odstavce, kde jsou popisovány konrkétní směsi). Škůdcem může být například hmyz, * hlístice, roztoč nebo šnek. Mikroorganismus schopnpý exprese

-genu BaciTlus Kódující protein nebo fragment Bacillus wMKiiu»iw-s^jaktivitou- vůči škůdcům zahrnuje phylloplane (povrch listů rostlin) a/nebo rhizosféru (půdu obklopující kořeny rostlin) a/ nebo vodní prostředí, a je schopen úspěšně konkurovat v určitém konrétním prostředí (obilí nebo jiné místo výskytu hmyzu) divokým mikroorganismům a umožňuje stabilně udržovat a exprimovat gen Bacillus kódující protein nebo fragment Bacillus, který má aktivitu proti škůdcům nebo který je zabíjí. Příklady takových mikroorganismů zahrnují: Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, methylophiliuS? Agrobacterium, ^Acetobacter ,_tl... Lactobacillus ,, Arthrobacter, . Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes, a Clostridium, řasy např. čeledi Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae,

Raphidophyceae, Cryptophyceae, a Chlorophyceae Saccharomyces,

Bacillariophyceae, Euglenophyceae, houby zejména Cryptococcus,

Eustigmatophyceae, Prasinophyceae, kvasinky např. rodu Kuyveromyces,

Sporobolomyces,Rhodotorula a Aureobasidium.·

Jak je uvedeno shora pesticidní aktivita je měřítkem účinnosti proti škůdcům posuzováno podle intenzity zabíjení nebo poškození růstu škůdců nebo podle ochrany rostlin proti napadení škůdci.

Vynález se dále týká pesticidních prostředků zahrnujících látku a pesticid získaný z roku Bacillus a také způsobu použití pesticidních kompozic pro potírání škůdců.

Vynález je dále zaměřen na způsob získání v podstatě čisté látky podle tohoto vynálezu zahrnující tyto stupně:

a) kultivace kmene Bacillus thuringiensis na vhodném růstovém“meůTu, ~~ — *** b) oddělení supernatantu ze směsi ze stupně (a) a

c) supernatant ze stupně (b) se podrobí chromatografii na koloně za účelem vyčištěni látky. Jak je shora uvedeno v podstatě čistá látka znamená látka, která obsahuje méně než % nečistot např. delta-endotoxinových proteinů.

Stručný popis přiložených obrázků

Podstatné znaky, aspekty a výhody předloženého vynálezu jsou lépe srozumitelné z následujícího popisu, připojených nároků a doprovodných obrázků.

Obr. 1 ukazuje schematicky syntézu skeletu I,

Obr. 2 ukazuje synergii Ia/Ib a NOVODOR Leptinotarsa decemlineata.

TM vuci

Podrobný popis vynálezu

Příprava účinné látky

Látku(-y) lze získat ze supernatantu kultury Bacillus thuringiensis fermentací kmenů (což vsak neznamená omezení) B.t. EMCC-0077, které mají identifikační charakteristiky NRRL B-21090 nebo jejích mutantů EMCC-0077 a EMCC-007 které mají v podstatě stejné vlastnosti s identifikačními vlastnostmi NRRL B-21091 nebo mutantů v podstatě shodných svými identifikačními charakteristikami s EMCC-0078 a EMCC-0079 a mají indentifikační charakteristiky NRRL B-21092, nebo jejich mutantů s vlastnostmi v podstatě

EMCC-0079, EMCC-0080, které mají charakteristiky NRRL B-21093, nebo jejich mutantů v podstatě ste-j-ných—v-l-as-tnost-í—jako-EMCC=0080—aEMCC-0O'8'r^^l^ťnostmr s NRRL B-21094, nebo jejich mutantů, které' majív podstatě stejné vlastnosti jako EMCC-0081.

stejnými jako indentifikační

Látka má účinnost vůči hmyzím škůdcům řádu Coleoptera a působí společně s pesticidem získaným z roku Bacillus jako kupř. potenciační nebo synergická složka. Ve spcifickém provedení má látka strukturu (I):

kde: R₁ je amino, hydroxy, alkyl (C₁__1Q),alkyl ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen, C_1-5 alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalkinyl, glycinyl a fenylglycinyl,

R₂ je aminoskupina nebo alkyl

R-j je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (^C1-1(P' alkyl (^ci-i(P ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen,(C_1-5) alkoxy, methylamino, dimenthylamino, thionyl, methylthionyl, kyano, nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli, _R_ j-_e---aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (Ci_i₀), alkyl (Cj*_1Q) ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen,(C₁_₅) alkoxy, nebo jejich soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

R₅ je vodík, methoxy, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (^ci-io)' alkyl ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen,() alkoxy,

Rg je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl l^ci-io) '-^alkY¹ (^ci-kP- ^ester, - (^ci_5L^alk^oxy . ------------R? je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (C-, _·,«), alkvl (c, , „ 1 ester.. ar.v_L. (na.or-.--benzo.yl,-. nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen,(C^-g) alkoxy, nebo jejich soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

R_g je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (C^-iq), alkyl (^ci-icP ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl) ester, halogen,() alkoxy, methylamino, dimenthylamino, thionyl, methylthionyl, kyano, nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

R_g je aminoskupina nebo alkyl Cχο) ^a

R₁₀ je amino, hydroxy, alkyl (ύ_1-10),alkyl (ύ_1-10) ester, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl, halogenbenzoyl)· ester, halogen, alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalanyl, glycinyl a fenylglycinyl.

Pyrazinové dusíky mohou být popřípadě substituovány alkylem (C₁__1Q), alkyl (Cy_₁₀) esterem, aryl (např. benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrok)ěnzoyl, halogenbenzoyl) esterem, nebo kyslíkem. Je tomu třeba rozumět tak, že vynález zahrnuje všechny stereoizomerní formy sloučenin vzorce struktury vzorce 1 a také racemáty. Ve většině specifických provedení má účinná látka strukturu la zde označovanou la nebo lb zde označovanou jako lb.

Ia:R, R_lf R₂, R₃, = H

Ib:R, R_lf R₂ = H, R₃ = OH

Bacillus thuringiensis může být kultivovaán pomocí půdy a ferraentační techniky známé z dosavadního stavu viz např. Ropgoff el al., 1969, J. Invertebrate Path. 14:122-129, Dulmage et al, 1971, J. Invertebrate Path. 18:353-358, Dulmage et al., v Microbial Control of Pets and Plant Diseases, H.D. Burges, ed., Academie Press, N.Y., 1980). Po úplném fermentačním cyklu se supernatant oddělí odseparováňím spor Bacillus thuringiensis a krystalů z fermentačního roztoku pomocí metod, které jsou dostatečně dobře známy z dosavadního stavu techniky např. odstředěním a/ nebo ultrafiltrací. Uvedená účinná látka je obsažena v supernatantu, který může být odebírán opět způsobem úošťatěcňe popsaným v dosavadním stavu techniky, např. ultrafiltrací, odpařením, nebo rozprašovacím sušením.

Alternativně může být účinná látka podle vynálezu získána chemickou syntézou pomocí známých reakcí a postupů.

Pro získání struktury 1 se připraví jednoduchý pyrazinový kruh, substituovaný požadovaným způsobem obsahující chránící skupiny některým z mnoha známých postupů např. spontánní kondenzací alfa-aminokarbonylových sloučenin. Dehydropyrazinový meziprodkut, který při této reakci vzniká, se^ihned.oxyduje . kyslíkem na ,příslušný pyrazin. Dimerizace' — jednou substituované alfaaminokarbonilové sloučeniny tímto způsobem vede k jednou, substituovanému pyrazinu přičemž reakce dvou různě substituovaných alfaaminokarbonylových sloučenin vede ke třem produktům. Uvedenou látku lze izolovat chromátografickým oddělováním (viz obr. 1). Posledně zmíněná reakce umožňuje syntézu pyrazinu s různými substitutenty na každé straně kruhu.

Čištění připravovaných látek (připravované látky) je možné provádět nejrůznějšími postupy, které jsou známy z dosavadního stavu techniky. Patří mezi ně chromatografie (např. na ionto měničích, afinitní a kolonová chromatografie podle velikosti molekuly), elektroforetické postupy, postupy založené na rozdílné rozpustnosti, extrakce nebo jakékoli

další standardní techniky	osobě	známé	(viz	např. Protein
Purification,	eds. J-C.	Janson	and	Lars	Ryden, VCH
Publishers, New	York. 1989).
Účinnost	uvedených	látek	se dá	testovat pomocí

postupů, které jsou známé jako je umělé udržení diety, umělé podání potravy, natírání a postřik listů. Specifické příklady takových bilologických testů jsou dále uvedeny v příkladové části.

Prostředek s obsahem účinné látky

Zmíněné účinné látky se mohou formulovat samostatně, společně s pesticidem Bacillus, který jak je definováno shora představuje kmen rodu Bacillus, spory, proteiny nebo jejich fragmenty, které jsou aktivní vůči škůdcům, nebo které zabíjejí škůdce a popřípadě přijatelný nosič, používaný do pesticidních kompozic jako jsou např. suspenze, roztoky, ^P?P,raše, dispergovatelné , granule ,..smáčitelný..prášek,emulzní koncentrát aerosol, nebo impregnované granule. Příkladem takových kmenů Bacillus thur.ingiensis subspecies kurstaki (označovaný jako DIPEL od Abbot Laboratories, lne. JAVELIN od Sandoz, BIOBIT od fy Novo Nordisk A/S, FORAY od fy Novo Nordisk, MVP od fy Mycogen, BACOSPEINE od fy Novo Noridsk A/S a THURICIDE od fy Sandoz), Bacillus thuringiensis subspecies, aizawai (označovaný jako FLORBAC od fy Novo Nordisk A/S a XENTARY od fy Abbott Laboratories, lne.), Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis (označovaný jako NOVODOR od Novo Nordisk A/S, TRIDENT od fy Sandoz M-TRAK a M-ONE od fy Mycogen), Bacillus thuringiensis subspecies israelensis (označovaný buď jako BACTIMOS nebo SKEETAL od Novo Nordisk A/S, TEKNAR od fy Sandoz a VECTOBAC od Abbott Laboratories, lne.), Bacillus sphaericus (označovaný jako SPHERIMOS od fy Novo Nordisk A/S), Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (označovaný jako FOIL od Ecogen), Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (označovaný jako CONDOR od Ecogen a AGREE od Ciba-Geigy), a Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (označovaný jako CUTLASS od Ecogen). Proteiny Bacillus mohou být voleny ze skupiny zahrnující Cryl, CrylI, CrylII, CrylV, CryV a CryVI.

Uvedené látky“mohou být také formulovány spolu s jinými faktory nebo účinnými látkami, získanými ze supernatantů kultury Bacillus včetně exotoxinu a/nebo podpůrného faktoru, popsaného v přihlášce č. 08/095240 podané

20.června 1993, která se zde včleňuje formou odkazu. Popřípadě může formulace také zahrnovat pesticid získaný z mikroorganismu Bacillus, chemický pesticid a/nebo virus s pesticidními vlastnostmi a přijatelný nosič.

Ve specifickém provedení mohou složky této kompozice působit synergicky. Jako výsledek vzniká kompozice,. která,má*, větší účinnost než by měly samostatně jenotlivé složky. Synergie se také projevuje stejnou nebo větší účinností při nižší a/nebo méně časté dávce než by bylo nutné aplikovat u každé jednotlivé složky. Alternativně může tato látka působit podpůrně na pesticid získaný z mikroorganismu Bacillus.

V prostředcích zahrnujících pesticid Bacillus se běžně používá koncentrace 0,001 až asi 300 gramů/LTU. Jak je uvedeno shora LTU znamená zkouška na Leptinotarsa texana, používaná zde jako standard. Při biologickém testu se srovnává vzorek ve standardním srovnatelném složení rodu Bacillus s analogickým vzorkem Leptinotarsa texana nebo s použitím jiného škůdce jako standardního testovacího organismu. Účinnost je definována podílem uváděné standardní LC^q a násobením uváděnou standardní účinností.

V jiném provedení může prostředek obsahovat účinnou látku v podstatě čisté formě nebo supernatant z kultury Bacillus v suchém koncentrovaném nebo kapalném stavu a vhodný pesticidní nosič, jejichž příklady jsou uvedeny dále. Tato kompozice se dá aplikovat odděleně na rostliny, např. -transgenní--rostl*inyT^_Spéči^_fičky^—je tato kompozice vhodná pro ^*<«*>**“ rostliny , které ' již předtím obsahují gen Bacillus thuringiensis. V jiném provedení se tato kompozice aplikuje na rostliny předběžně vystavené působení mikroorganismů Bacillus thuringiensis. Účinná látka v této kompozici je přítomna v koncentraci asi 0,001 % hmotnostních až asi 60 % hmotnostních.

Takového kompozice, které jsou popsány shora lze získat přidáním povrchově aktivního činidla, inertního nosiče, konzervačního prostředku, zvlhčovacího prostředku, požerového stimulantu, atraktantu_t. zapouzdřovacího.činidla,nosiče, emulgátoru, barviva, prostředku chránícího směs proti účinkům UV záření, pufru ztekucovacího činidla a popřípadě dalších komponent k prodkutu získanému podle vynálezu a úpravou pro učitou konkrétní aplikaci proti určitému konkrétnímu škůdci.

Vhodná povrchově aktivní činidla zahrnují aniontové sloučeniny, jako jsou karboxyláty např. karboxyláty kovů kyseliny s dlouhými řetězci, N-acylsarkosináty, mono nebo diestery kyseliny fosforečné s etoxyláty mastných alkoholu nebo soli takovýchto esterů, sírany mastných alkoholů jako je dodecylsulfát sodný, oktadecylsulfát sodný, nebo cetylsulfát sodný, sulfáty etoxylovaných mastných alkoholů, sulfáty etoxylovaných alkylfenolů, ligninsulfonáty, sulfonáty uhlovodíku petroleje, alkylarylsulfonáty jako např. alkylbenzelsulfonáty nebo nižší alkyl naftalensulfonáty, např. butylnaftalensulfonát, soli nebo sulfonované naftalenformaldehydové kondenzáty, soli sulfonovaných fenolformaldehydových kondenzátů nebo komplexní sulfonáty jako jsou amidsulfonáty, např. sulfonované kondenzační produkty olejové kyseliny a enmetyltaurinu nebo ďi-alky-lsu-lfosukciiTá^ty; např. sulfonát sodný nebo dioktylsukcinát. 'Neiontová činidla zahrnují (ale nejsou na tento výčet omezena) kondenzační produkty esterů mastných kyselin, mastných alkoholů, amidů mastných kyselin nebo vyšší alkyl - nebo alkenyl - substituované fenoly kondenzované s etylenoxydem mastné estery vícesytných alkoholů, např. estery mastných kyselin se sorbitanem, kondenzační produkty těchto esterů s etylenoxydem, např. polyoxyetylen substituované estery sorbitolu a mastných kyselin, blokové kopolymery etylenoxydu a propylenoxydu, acetylenické glykoly jako je např. 2,4,7,9-tetraethyl-5-decin-4,7-diol nebo * _^etoxylQvané _ acetylenické, glykolyPříklady kationtových povrchově aktivních činidel zahrnují substituované alifatické '·* mon-di-nebo polyaminy jako acetát. naf tenat nebo oleát, kyslík obsahující aminy jako je aminoxyd polyoxyethylenovaného alkylaminu, amidicky vázaný amin připravený kondenzací karboxylové kyseliny s di nebo polyaminem nebo kvarterní amoniové soli.

Příklady inertních materiálů jsou (aniž by to znamenalo omezení na tyto materiály) anorganické minerály jako je kaolin, křída, sádra hnojivo fylosilikáty, uhličitany, sírany nebo fosfáty, organické materiály jako je cukr, škroby nebo cyklodextriny nebo botanické materiály jako jsou prodkuty ze dřeva, korek, rozemleté klasy, rýžové odpady ořechové slupky apod.

Směsi podle vynálezu- mohou být připraveny ve formě vhodné k přímému použití nebo jako koncentráty nebo premíxy, které vyžadují další ředění vhodným množstvím vody nebo ► jiného rozpouštědla před aplikací. Pesticidní koncentrace se do určité míry mění v závislosti na povaze konkrétní > formulace, specificky je důležité jde-li o koncentrát nebo _sln-_ě-_s- Ktéřá^má byt používána přímo. Směs obsahuje 1-98 %

....... hmotnostní ch pevných nebo kapalných inertních nosičů a 0-5Ó %, výhodně 0,1 - 50 % povrchově aktivního činidla.

Tyto kompozice se dodávají s vyznačením dávky pro použití jako komerční produkt, přičemž tato dávka je výhodně kolem

0,01-5 liber na akr v suché formě a 0,01-25 pint a akr v kapalné formě.

V dalším provedení se pesticid získaný z mikroorganismu Bacillus a/nebo účinná látka před smísením zpracovává za účelem prodloužení její pesticidní aktivity, když je aplikována do určitého prostředí cílového škůdce, přičemž tohoto předběžné zpracování je neškodné vůči samotnému pesticidu nebo účinné látce. Takové zpracování lze provádět chemickými a/nebo fyzikálními prostředky, které nepůsobí škodlivě na kompozici (-ce). Příkladem chemického činidla je (aniž by se na tyto příklady rozsah činidel omezoval jsou aldehydy jako formaldehyd, aglutaraldehyd, protiinfekční přísady jako je zefyranchlorid, alkoholy jako izopropanol a etanol a histologické fixativy jako je Bouinův fixativ a Helliův fixativ (viz příklady v Humason, Anímal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Co„ 1967).

Protředky podle vynálezů se mohou aplikovat přímo na rostliny, např. rozstřikováním nebo poprášením v době, kdy se škůdci začínají objevovat na rostlinách nebo před dobou jejich obvyklého výskytu jako prevence. Rostliny, které mohou být chráněny v rozsahu vynálezu jsou (aniž by tento výčet byl omezující) obilniny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a odpovídající prokukty) řepy (cukrová nebo krmná řepa) . peckoviny, malvice a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, višně, jahody, maliny a ostružiny), luskoviny (alfalfa, fazole, čočka, hrách, sojové boby),

-olejové—ros-fel-i-ny—(řepka,—hořčice^ irrákyTJIIvy, s luňečnice wnwww kokosové ořechy, ricina, * kakaové boby', podzemníce olejna), okurkovité rostliny (okurky, dýně, melouny), rostliny pěstované pro vlákno (bavlna, len, konopí, juta), citrusové ovoce (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky), zelenina (špenát, salát, chřest, kapusta a jiné brassicae, karotka, cibule, rajčata, brambory), lauraceae (avokáda, skořice, kafr), listnaté stromy a konifery (např. linda, tis, dub, lše, topol, bříza, jedle, smrky^ a borovice) nebo rostliny jako je kukuřice, tráva pro závodiště, tabák, ořechy, káva, cukrová třtina, čaj, vinná réva, chmel, banány nebo kaučukovník a okrasné rostliny. Účinná látky se může aplikovat na list, do brázdy, rozhazováním granulí, pokládáním, nebo přidáváním do půdy. Je obecně důležité dosáhnout dobré účinnosti vůči škůdcům v ranných stádiích růstu pěstovaných rostlin neboř v této době mohou škůdci nejvíce rostlinu poškodit. Postřik nebo popraš může obvykle obsahovat i další pesticid, pokud je to podle mínění odborníka nutné. Ve výhodném provedení se aplikuje prostředek podle vynálezu přímo na rostliny.

Prostředek podle vynálezu může být účinný proti škůdcům řádu Coleoptera např. Leptinotarsa sp. (např. Leptinotarsa texana, Leptinotarsa decemlineata), Díabrotica undecirnpunctata, Dendroctonusfrontalis, Anthonomus grandis, Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta lureola, Cylasformicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popilliajaponica, Rhizorrogus majalis. Alphitoblus diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor. Prostředek podle vynálezu může být také účinný -prot-i-hmyzím—škůdcům včetně (aniž By še ha ně účinnost 'omezovala)' škůdců z ’rádu motýlů (Lepidopteřa)’,' například Achroia · grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Anryelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia genvnatalis, Archips sp. , Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx moři, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia lanferreanus, Cydia pomonella, Datana integen-ima, Dendrolimus sibericus, _Desmiafuneralis ,_u Diaphania hyalinata, Diapharúa.nitidalis,, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos » subsignaria, Eoreuma loftini. Ephestia elu.tel.la.. Erannis tilaria. Estigmene acrea. Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euprocris chrysorrhoea, Euzoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Helíothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Larnbdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymanrria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchrapicta, Operophtera b/a^ha, Orgyia sp. , Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana,

- Platyprilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura . concinna, Šitótroga cerealellaj Spilonoťa ocellana, u ju ίu<,spodoptera sp. , ' Thaurnstopoea pirvočámpa’, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Diptera, např. Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anasrrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbarus, Calliphora stygia, Callíphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya ru facies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina _? brevipalpis, Glossinafuscipes, Glossina morsitans centralis,,

Glossina morťstans morsitans, Glossina moristans rV submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobius irritans, Hypoderma bovis, Hydoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia čupřina, Lucilia sericata, Luitzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musea autumnalis, Musea domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ohyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes syaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinesis, Tripteroides bambusa, Acari, např. Ligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae, Hymenoptera, anpř. Iridomymermex humilis, Solenopsis invicta, Isoptera, např. Reticulitermes hesperus, Reticulitermes Flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incissitermes minor, Incisitermes immigrans, Siphonaptera, např. Ceraptophyllus gallinae, Ceraptophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenospehalides canis, ctenosephalldes felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga

-peneferans-a—Ty±en‘ch'iďa“ např; Mělodrdogyne ineognita,

-*****--*Pratylerichus penetrans. *

NásWující příklady jsou předkládány pouze jako ilustrace, nikoliv jako omezení vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Kultivace různých izolátú B.t.

Subkultury EMMC-0077, EMCC-0078, EMCC-0079, EMCC-0080 a EMCC-0081, udržované na šikmém agaru byly použity k inokulaci 250 ml protřepátjíaných baněk, obsahujících 50 ml živného roztoku o následujícím složení.

Obilný roztok 15 g/1

Maltrin-100 40 g/1 bramborový škrob 30 g/1

KH₂PO₄ 1,77 g/1

K₂HP0₄ 4,53 g/1 pH roztoku bylo udržováno na 7,0 pomocí 10 N NaOH.

Po inokulaci byly protřepávané baňky inkubovány při 30°C na rotačním třepacím zařízení při 250 otáčkách za minutu po dobu 72 hodin. Celá směs s kulturou byla použita pro testování proti Diabrotica undecimpunetata.

Příklad 2: Účinnost Diabrotica undecimpunfitata v podobě celé kultivační směsi pro případ jenotlivych ' izolátů.

2,5 ml celé kultivované směsi získané shora popsanou fermentací se odebralo a přemístilo s protřepávaných baněk do 50 ml polypropylenových testovacích trubic. Vzorky Diabrotica undec-impunšta-ta—po—25—mi—byly—přidány^-ďo KáržíTé^-'testovací trubice. Vzorek a testovací materiál se pak intenzivně smíchá a disperguje do testovací nádoby. Na povrch každého z těchto vzorků byly vloženy vajíčka Diabrotica undecimpunfitata v počtu 3-6. Na nádoby byl aplikován Mylar a byly inkubovány při 28°C bez osvětlení. Hodnocení bylo provedeno po 7 dnech. Mortalita byla stanovena sedmý den po inkubaci. Vysvětlivky k tabulce: SS7= velikost mrtvých larev sedmý den ve srovnání s živými, kontrolními larvami v ten samý den, což je hodnota SS7=4. SS7=3, SS7=2 a SS7=1 představuje velikost 75 %, 50 % a 25 % oproti živým larvám, které mají kontrolní hodnotu 4.

V následující tabulce l jsou shrnuty získané výsledky od všech pěti kmenu, u kterých byla mortalita 100 %. Dále, mrtvé larvy měly 12,5% velikost oproti živým kontrolním larvám.

Tabulka l

Diabrotica undecimpunfitata aktivita celé kultivační směsi

Kmen	% mortality	SS7
EMCC-0077	100	0,5
EMCC-0078	100	0,5
EMCC-0079	100	0,5
EMCC-0080	100	0,5
EMCC-0081	100	0,5

Příklad 3: Lokalizace Diabrotica undecimpunfctata účinnosti

Za účelem stanovení zda účinnost Diabrotica undecimpunctata je spojena s delta-endotoxinem/sporami nebo supernatantem, bylo odebráno 2,5 ml celkové kultivované směsi kmenů EMCC-0077, EMCC-0080 ,EMCC-0081 a NB 125 (Bacillus thuringiensTs—subspecles těňěSriónís pěstovaný za identických podmínek) se^odstředí na centrifuze Sorvall RC-5B při 15 000 otáčkách za minutu (rotor Sorvall SS34) po dobu 15 minut, čímž se oddělí supernatant a částice. Krystalické delta-endotoxiny + spory se získají z částic.

delta-endotoxiny produkované Diabrotica undecimpun^tata-aktivním B.t. izolátem EMCC-0077 mají molekulovou hmotnost

66kD, 29kD a 12kD, jak je definováno v SDS-PAGE.

Delta-endotoxiny, produkované Diabrotica undecimpunCtata-áktivním B.t. izolát EMCC-0078 mají molekulové hmotnosti

153 kD, 77kD,67kD, 61kD, 50kD, 42kD, 34kD, 30kD, 241kD jak je definováno_ v_____^SDSyPAGE.*. „ Delta-endotoxiny„produkované

Diabrotica undecimpunfttata-aktivním B.t. izolát EMCC-0079 mají molekulovou hmotnost 135 až 145 kD, jak je definováno v SDS-PAGE. Delta-endotoxiny, undecimpunfttata-aktivním B.t. molekulové hmotnosti 94 a v SDS-PAGE. Delta-endotoxiny, undecimpunfitata-aktivním B.t. molekulové hmotnosti 129 a SDS-PAGE.

produkované Diabrotica izolát EMCC-0080 mají 40kD, jak je definováno produkované Diabrotica izolát EMCC-0081 mají 32kD, jak je definováno v

Každý supernatant (2,5 ml) získaný ze shora uvedené centrifugace se přenese do 50 ml polypropylenové testovací trubice. Částice se pak resuspendují v 2,5 ml sterilní destilované vody a přenesou do samostatné 50 ml polypropylenové testovací trubice. Diabrotica undecimpunetata má aktivitu u kmenů EMCC-0077. EMCC-0080 a EMCC-0081 přítomnou ve všech supernaťantech, přičemž malá aktivita Diabrotica undecimpunetata od známých kmenů Bacillus thuringiensis subspecies telebrionis je soustředěná v částicích (spory+ krystalická část).

pt- >

Tabulka 2: Diabrotica undecimpun&tata-aktivita v supernatantu

a v částicích
Kmen	Frakce	%mortality	nej lepší účinnost
EMCC-0077	supernatant	100	0,5
ri*. i .r>Wn_.	^částice	_„10. ......	3‘, 0 .«·_ -fJI·- -fc. —* tu
EMCC-0080	supernatant	100	0,5
	částice	0	λ .n - r ~
EMCC-0081	supernatant	100	0,5
	částice	0	3,0
NB 125	supernatant	0	0,5
	částice	50	1,5
Příklad 4:	Účinnost vůči	Leptinotarsa	texana

Po filtraci přes membránu 0,2 mikrometrů byl supernatant z kmene EMCC-0080 získány z příkladu 1 použit pro test na účinnost proti broukům. Zfiltrovaný supernatant se' aplikuje na vajíčka v objemu 20 galonů na akr. Ředění byla 0, 1 ku 1, l ku 4, l ku 8 (supernatant ku dionizovaná voda,objemově) Leptinotarsa texana larvy byly vystaveny působení prostředků podle následujícího standardního postupu. Každá rostlina byla opatřena 20 larvami Leptinotarsa texana.

Výsledky jak jsou uvedeny v následující tabulce 3 ukšTzupjlý že zfiltrovaný supernatant EMCC-0080 je aktivní proti Leptinotarsa texana.

Tabulka 3: Účinnost Leptinotarsa texana EMCC-0080

Kmen	Ředění	% mortality
EMCC-0080	0	95
	1:1	55
	1:4	20
h. 1 ΙΙΐίφΙΙ . LÉ»’' «	1:8 R. * -01 » (	0 0. nn. · jk -u-f. J0U w

neošetřená kontrola 0

Příklad 5: Synerqický efekt EMCC-0080 a NOVODOR™

Výsledky ukázané v tabulce 1 shora naznačují, že supernatant. EMCC-0080 je neúčinný sám o sobě při ředění 1:8 objemově. Pokud však ošetříme rostlinu 1,20% nebo 2,5% lOxkoncentrovanějším EMCC-0080 supernatantem v kombinaci s 200 mikrogramy NOVODOR™ (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark) na mililitr, získáme synergický efekt, který se projeví silným poklesem LC₅₀ a LC_go NOVODORu™. Data jsou uvedena v následující tabulce 4.

Tabulka 4: Synergický efekt EMCC-0080 a NOVODOR™

Vzorek LC^tug)¹ LC_go^g)² zesílení³

NOVODOR™

—..—+—3-^25 %-ÉMCC0080 *** +2,5% EMCC0080

642	4,286	1,55
250		1,292	1,79
' 98	•*fc- ·.	490	‘ * 1,83	i**?,? mwp

Vysvětlivky k tabulce 4 ¹ koncentrace, která zabijí 50 % cílové hmyzí populace ² koncentrace, která zabíjí 90 % cílové hmyzí populace o _# nárůst % mortality v logaritmické koncentrační křivce ^Příklad 6: Čištění účinné látky aktivní proti broukům,.......- - _ produkované B.t, kmenem EMCC-0080

B.t. kmen EMCC-0080 byl pěstován po dobu 24 hodin při. 30°C v živném médiu obsahujícím následující směs v gramech na litr, při PH 7,0:

Maltodextrin 40g

Sojový protein 40g

KH₂PO₄ l,8g

K₂HPO₄ 4,5

MgS0₄.7H₂0 0,3g stopové kovy 0,2ml částice a jiné- nerozpustné složky byly z kultivační směsi B.t. kmene EMCC-0080 odstraněny odstředěním s následující filtrací získaného supernatantu přes Celit a 0,2 μπι membránu. Získaný přefiltrovaný roztok se pak zahustí na desetinu odpařením. Čištění aktivní látky, které vychází z lOx zahuštěného filtrátu se provádí pomocí 4 purifikačních stupňů. V průběhu čištění se monitoruje účinnost povrchovým testem na Diabrotica undecimpunctata a jak je popsáno shora, a čistota se kontroluje kapilární elektroforézou jak je popsána v příkladu 8. Všechny chromatografické stupně využívají^-detekce při 226nm.

a·»· .jmu I.mimwan·—' h·*

Konkrétně se povrchový test provádí následovně. Vzorky lOxzahuštěného filtrátu se aplikují do jednotlivých otvorů mikrotitrové desky a obsahují 200 mikrolitrů zpevněné umělé hmyzí potravy na jednu prohlubeň. V této podobě se potom na vzduchu vzorky suší. Dva až čtyři čerstvě vylíhnutí jedinci Diabrotica undecimpunfttata se jemně umístí do každé prohlubně. Mikrotitrové desky se pak zatěsní Mylarem s ponecháním otvorů pro výměnu vzduchu a inkubují se při 30°C 80% relativní vlhkosti. Hodnocení % mortality se provede po pěti dnech. __ filtrátu se na začátek

V prvním stupni se 120x koncentrovaný filtrát nejprve přečistil na SP Sephadexu C-25 (catex) na chromatografické koloně 5x30 cm. Získaných 450 mililitrů lOx koncentrovaného rozpustí v 18 litrech dionizované vody uvede se kolony, která je předtím ekvilibrována 20 mM amoniumacetátovým pufrem při pH=5. Kolono se eluuje rychlostí 18 mililitrů za minutu celkem 5 litry roztoku s kontinuálním, gradientem od 20 mM do 0,5 M amoniumacetátovým pufrem při se sbírají, testují, a stanoví se frakce se spojí (zhruba 150 ml), lyofilizují a znovu rozpustí v deionizované vodě na asi 1/5 původního objemu.

pH=5. Frakce po 10 ml jejich čistota. Účinné

Ve druhém stupni se vezme 25 mililitrů vzorek z 1 stupně a přivádí se na kolonu BioRad P2 (extra jemná o velikosti 5x100 cm), která je předtím vyrovnána dionizovanou vodou. Kolona se eluuje při rychlosti toku 1 ml za minutu deionizovanou vodou. Frakce po 10 ml se sbírají, testují a zkouší se jejich čistota kapilární elektroforézou. Účinné frakce se spojí (zhruba 400 ml).

Ve' třetím stupňi se získaných 400 ml *z druhého stupně rozpustí v 16 1 deionizované vody, tento roztok se uvádí na kolonu Pharmacia S Sepharose Fast Flow (silný katex) o rozměrech 5x30 cm, která je předem vyrovnána 20 mM amonium

Λ1-γ30 acetátovým puf rent pří pH=5,0. Kolona se eluuje při rychlosti toku elučního činidla 17 ml za minutu 5 litry při kontinuálním gradientu od 20 mM do 0,5 M amonium acetátovým pufrem při pH=5. Frakce po 20 ml se sbírají, testují a zkouší na čistotu. Účinné frakce se spojí (zhruba 250 ml) a pak lyofilizují do sucha za účelem odstranění těkavého amonium acetátového^ pufru. . . .. _ . ... . -----------Ve čtvrtém stunni se lvofilizovanv snoienv nodíl ze třetího stupně rozpustí ve 400 ml deionizované vody, ro2tok se uvádí na kolonu BioRad Chelex 100 o rozměrech 0,9x30 cm, která je předem upravena 20 mM amoniumformiátovým pufrem při pH=4,0. Kolona se eluuje při rychlosti toku 5 ml za minutu 2,4 litry při postupném gradientu 0,02-0,1-0,2-0,35-0,5-0,0 M pufru na bázi mravenčanu amonného při pH=4. Frakce po 20 ml se sbírají, testují a zkouší se jejich čistota. Účinné frakce se spojí (zhruba 300 ml) a pak lyofilizují do sucha pro odstranění těkavého pufru na bázi mravenčanu amonného. Kapilární elktroforéza ukazuje čistotu materiálu, účinného proti broukům, který zahrnuje dvě látky, Ia a Ib.

Příklad 7: Stanovení struktury látky účinné proti broukům.

Struktury sloučenin Ia a Ib se stanoví spektroskopickými daty jejich acetylovaných derivátů (derivát A a B_±

Směs Ia a Ib o hmotnosti 114 mg se acetyluje v 5 ml pyridinu pomoci 5 ml acetanhydridu ď krystalů

4-dimethylaminopyridinu jako katalyzátoru po dobu 24 hodin při teplotě místnosti a pak se čistí pomocí semipreparativní RP-Ci₈HPLC. Vzorek 5 mg ve 25 ml se uvádí na kolonu a eluuje rychlostí 4 ml za minutu směsí 80 % vódy-20 % acetonitrylu.

jl/

Detekce se provádí při 254 nm.

NMR spektkroskopická data se získají pro derivát A a indikují přítomnost 14 uhlíků a 17 protonů. Nicméně spektrální data hmotové spektroskopie naznačují molekulovou hmotnost 652 a V2orek ^c28^H40^N6°12 (přesná hmotnost je _*653,2801 .vypočtená653.2782)Proto, byla„sloučenina. .

determinována jako symetrická, kdy jenom polovina molekuly se projeví na sÁgnálu NMR=

Několik spinových systémů se také pozorovalo pomocí NMR. Centrální pyrazinový kruh, substituovaný v poloze 2 a5 byl indikován vysokým polem protonových singletů při 8,6 ppm (H-3 a H-6), které ukazují spojení všech uhlíkových atomů v kruhu i s prvním uhlíkem postranního řetězce (c-7). Postranní tříuhlíkový řetězec je acetylován v obou polohách 7a 8 metylenem v poloze 9. Bylo zjištěno, že uhlík 9 má návaznost s uhlíkem esteru a ester byl determinován jako část alaninu, která je acetylována na aminokyselině.

·,

Struktura derivátu B se liší v jedné pozici od derivátu A. V jednom postranním řetězci derivátu B není C-7 uhlík acetylován ani připojen ke kyslíku, ale bylo zjištěno, že jde o metylen. Druhý postranní řetězec je indetický jako jě tomu u derivátu A. Tento rozdíl v pouze jednom kyslíku lze také pozorovat v hmotnostních spektrálních datech. Data hmotnostní spektroskopie se stanovují přesnou molekulovou hmotnost na 595,2722 (MH+, vypočteno 595.2727) pro derivát B, což indikuje vzorec ^c26^H38^N6°10‘ Optické hustoty derivátů A a B jsou následující: Derivát A [a]_D27 = -6,9 C a derivát B [a] _D27 = 32°C. Plné potvrzení ¹H a ¹³C NMR dat se provede pomocí rozkladu , COSY, HMQC HMBC. Data jsou uvedena v tabulce 5.

Tabulka 5 ♦, ΪΗ a 1 NMR data derivátu A a derivátu B v D-4 methanolu

EsísSe. ímult- integ, interakční konstanty)

	Derivát A	Derivát B	A	B
2			152.9	154.7
3 '5	8.6 (s.lH) _ - <..·>. .|R F. . JÍ ,	8.54 (s.lH)	„144.2 , ... 152.9	«>„.144.4 151.1
6	8.6 (s,lH)		1442	145.6
7	5.84 (d„lHJ=7.4 Hz)	2.95 (ddJH. J=13.9,9.2) 3.lO(dd,lH, 1=13,9.4.8)	74.0	37.5
8	4.72 (m.lH)	4.48 (m.lH)	52.1	502
9..	4.24(dd,lH>	4.11(dd.lH.	63.5	66.3
	J= 11.5.5.7 Hz)	1=11.4.6.7)
	4.30 (dd,lH„ J= li.5.6.7 Hz)	4.20 (m.lH)
10			174.87	174,7
11	42Q(q,lHJ=7,l Hz)	420 (m.lH)	50.3	49.8
12	12 (d.3HJ= 7.1 Hz)	1.17 (d,3HJ=7.3)	17.8	18.1
13	5.84 (d,lHJ=7.4 Hz)	5.80 (d,lHJ=7.4)	74.0	73.9
14	4.72 (m,lH) '	4.70 (m.lH)	52.1	52.1
15	424 (dd,lH. J= 11.5.6.7 Hz)	420 (m.lH)	63.5	63,6
	4,30 (dd.lHJ=l U,6.7)	4.30 (dd,lH2= 11.6,6.8)
16			174.81	174,7
17	420 (q,lHJ=7.1 Hz)	4.20 (m.lH)	50.3	50.4
18	12 (d,3HJ= 7,1 Hz)	120 (d,3HJ=7.3Hz)	17.8	17.8
19			171.47	171.4
20	2.1·	1.97	20.6* *	20.6
21			172.97	172.4
22	2.0’	2.02	20.5··	22.5
23			172.31	172.5
24	1.95*	2.09	22.5··	22.6
25			172.31	172.9
26	1.95·	2,03	22.5**	20.7
27			172.97	171.4
28	2.0·	1.95	20.5··	20.6
29			171.47
-30 -	22*		20.6··

*, **, γ _ signály jsou zaměnitelné

Hmotnostní spektra sloučenin la a Ib poskytují dva molekulární ionty 400 a 384. Od těchto dat lze odvodit, že vzorec molekuly sloučeniny la je CjgH^N^Og a sloučeniny Ib je (£428^05 Struktury la a Ib jsou určeny porovnáním NMR dat

-22 * derivátu A a derivátu B s NMR daty směsi la a Ib. Struktury jsou následující:

la: R, Rj, R₂, R₃ ⁼H

Ib: R, R_b R₂=H, R₃=OH

Vlastnosti sloučenin la a Ib a jejich acetylovaných derivátů jsou shrnuty dále:

Derivát A:

Molekulová hmotnost: Empirický vzorec:

UV (MeOH):

MS (FAB):

Derivát. B:

Molekulová hmotnost: Empirický vzorec:

UV (H₂O):

MS (FAB):

652

CiaRi&NůOi:

275. 310 nm (M+H) miz 653.2801. calc. 6532782

594

CífiHjgNfiOio

275, 310 nm (M+H) m/z 595.2722. calc. 5952727 la;

__Molekulová hmotnost:

Empirický vzorec:

-- UV (MéOH): '

MS (FAB):

Ib:

Molekulová hmotnost: Empirický vzorec:

UV (H₂O):

MS (FAB):

MO_

Ci6H₂gN6O_fi

275. 310 nm * (M+H) 401

384 ^C16Rlí^N6°5 275. 310 nm (M+H) 385

Přiklad 8; Stanovení sloučenin Ia a Ib ve fermentačních směsích.

B.t. kmen EMCC-0080 se namnoží postupem popsaným v příkladu 1. Koncentrace sloučenin Ia a Ib ve fermentační směsi se stanoví kapilární elektroforézou. Konkrétně se využívá BioRad Biofocus 3000 Kapilární elektroforézní systém s nepovlečenou kapilárou (50 μιη x 50cm), 0,1 M fosfát při pH 2,5*7 napětí 20 kV, pozitivní až negativní polarita, detekce při 200nm. Objem vzorku je 30 mikrolitrů a 5 psi druhá injektáž. Doba analýzy je 10 minut u sloučenin I a a Ib eluovaných při 6,0 a 5,9 minutách.

Alternativně se použije Beckman P/ACE 2100 s nepovlečenou kapilárou 50 mikrometrů x 45 cm, 0,1 M fosfátový pufr při pH 2,5 napětí 20 kV, pozitivní až negativní polarita, detekce při 200 nm. Z deseti sekundovou tlakovou injektáží byl použit vzorek o objemu 30 mikrolitrů. Doba analýzy je 10 minut u sloučenin Ia a Ib, které se eluují při 7,0 a 6,7 minut.

Buňky a další nerozpustné součásti se odstraní z kultury odstředěním a filtrací přes celitovou 0,2 mikrometrovou membránu. Výsledný supernatant se analyzuje kapilární elektroforézou jak je uvedenou shora. Výsledky ukazují, že sloučeniny Ia a Ib jsou každá přítomny v množství asi 90 mg na jeden litr kultivační směsi.

Příklad 9: Stanovení účinnosti sloučenin Ia a Ib

--* Relativní účinnost surové směsi sloučenin Ia a Ib (zhruba 1:1 hmotnostně) se stanoví pomocí Leptinotarsa texana testu a v srovnáním mortality spojené s přípravou vnitřního standardu Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis.

Foliární test se provádí pro stanovení účinku surové směsi sloučenin Ia a Ib proti Leptinotarsa texana. Pro provedení foliárního testu se standardy naváží do 50 ml odstředivkových nádob a rozmíchají se s dionizovanou vodou obsahující 0,1 % Tweenu 20. 1,2 mg standardu Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis se suspenduje na finální koncentraci 12 000 M,g/g.., .Testované . vzorky- (tj.—NOVODOR™ a- - NOVO DOR™ ”se· sloučeninami Ia a Ib) se zpracují podobným způsobem dokud poměr nalezený testem ukazuje, ž-s -dodaná dávka je příliš vysoká nebo příliš nízká k získání dostatečně průkazných dat, jestliže v tomto případě koncentrace primárního roztoku vzroste nebo klesne změnou množství rozpuštěných přidaných látek. Každý ze vzorků se pak homogenizuje 30 minut s pomocí homogenizeru Virtis a působí se na něj ultrazvukem po dobu 20 sekund s příkonem 100 W a pomocí ultrazvukového homogenizeru Braunsonic 1510. Každý z roztoků se pak zředí pomocí Hamilton Microlab 1000 tak aby se získala řada sedmi Zředění, 3000, 2000, 1333,857, 545, 364 a 245 μg/ml v objemu 16 ml. Každý z těchto 16 ml vzorků se na zhruba 288 čtverečních· palců rostlinných listů rozprašovače Devries Linear Track sprayer calibrovaného pro dodávání 20 galonů na akr. Kontrolní listy se postřikují 16 ml deionizované vody. Listy se suší na vzduchu a pak se umístí na hrdlo jedno uncového čistého plastového pohárku, který obsahuje 5 sekundový instar Pak se umístí poklopy a stlačí se o průměru 4 cm a zatěsní se uvnitř celkovém aplikuje pomocí

Leptinotarsa texana odsekne se kroužek pohárku.Pohárky se pak otočí a larvy spadnou na ošetřený povrch listů. Pro každé se sedmi zředění se připraví 8 ^pohárků. Pohárky se pak uloží k sobě, označí, umístí na podložky a inkubují 3 dny při 30°C a 65% relativní vlhkosti. Těchto 56 pokusných pohárků a 8 kontrolních pohárků představuje 1 biologický test. Po třech dnech se vyhodnotí mortalita hmyzu. Každý z pohárků se umístí do ostrého proudění s larvy, které se nepohybují se počítají za mrtvé.

Procento mortality se vypočte a data se zpracují statistickou analýzou. Vyhodnotí se LC_5Q, LC_g0, zvýšení účinnosti, koeficient průkaznosti a odhadne se synergie.

Pro stanovení, . účinnosti^ se rozpustí-surová—směs, testuje a srovnává s Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis standardem, který j.e hodnocen účinností 28 000 LTU/g (Leptinotarsa texana Units/gram).

Účinnost která je takto získaná, je uvedena v tabulce 6 a ukazuje, že surová směs sloučenin Ia a Ib (1:1 hmotnostně) má účinnost 75,555 LTU/g aktivní přísady při LC₅₀=70 μ9/ίη1 (1,8 mg celkové účinné složky na ml).

Taulka 6: Účinnost směsi sloučenin Ia a Ib

Vzorek ^lc50 odhadnutá účinnost

Ia/Ib směs 50 75,555 LTU

Příklad 10: Potenciace Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis krystalového delta endotoxinu sloučeninami Ia a

Ib.

Schopnost sloučenin Ia a Ib potenciovat insekticidní aktivitu krystalického endotoxinu žáci 1 lus _._thuring.iensis subspeciers tenebrionis vůči Leptinotarsa texana byla stanovena pro surovou směs sloučením Ia a Ib přidáním k NOVODOR·¹·¹ a stanovením LC_5Q cestou paralelní srovnávací paralýzy. Foliární testy se prováděly na Leptinotarsa texana jak je popsáno v příkladu 9, aby se zjistila úroveň potenciace dosažená přidáním sloučenin Ia a lb přidáním k

NOVODOR™. Surová směs sloučenin Ia a lb se přidá k preparátu

NOVODOR . Roztoky se postupně zředí pomocí Hamilkton

Microlab 1000, aby se získal soubor vzorků o zředění

NOVODOR™ o hodnotách 1000,0, 666,7 444,4, 285,7, 181,8,

121,2 a 80,0 pg/g. Dvě rozdílná zředění směsi Ia a lb se připraví^na základě ..sedmi npostupných ..zředění -obsahujících— - - 72,0, 48,0, 32,0, 20,6, 13,1, 8,7 a 5,8 mg/g (2,5 % objemově s 10OOmg./g NOVODOR™) = A 36,0, 24,0, 1-6,0, 10,2, 6,5, 4,4 a

2,9 mg/g (1,25 % objemově při 1000 mg/g NOVODOR™). Vzorky (bez sloučenin Ia a lb a referenční látky byly připraveny současně s tím. LC₅₀ párových vzorků bylo děleno potenciovaným LC₅₀, které je nižší. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7 dále a indikují, že surová směs sloučenin Ia a lb potenciuje insekticidní aktivitu NOVODOR™ proti Leptinotarsa texana. v

Tabulka 7: Potenciace NOVODOR™ směsí Ia a lb proti

Leptinotarsa texana:

vzorek ^LC5o M-g/^il potenciační faktor

NOVODOR™		642	0
NOVODOR™+1,25	Ia/Ib	250	2,6
NOVODOR™+2,5%	Ia/Ib	98	6,5

Příklad 11: Účinnost směsi sloučenin Ia a lb proti broukům

Ips calliqraphus a Dendroctonus frontális

Toxicita surové směsi sloučeni Ia a lb proti těmto broukům (Ips calligraphus a Dendroctonus frontalis)byla.

stanovena pomocí tří mililitrových vzorků (1,8 mg aktivní složky na ml), které byly přidány k 5 gramům zmrazeného sušeného lýka kadidlové borovice? a sedmi mililitrů destilované vody. Kontrolní potrava se připravila z 10 ml vody. Potrava byla rozdělená na tři Petriho misky a pro 5-10 dospělých brouků. Tři nezávislé„skupiny ošetřených-vzorků *-*- *·***“ potravy a kontrolních vzorků potravy byly kolonizovány 10 až 20 hmyzími jedinci. Petriho misky byly inkubová-ny ve tmě při 25 °C a byl spočítán počet mrtvých jedinců po 4, 7a 10-12

dnech od průměru ze tabulce 8	umístění na potravu, tří nebo čtyř oddělenýc a 9:	Data jsou ?h opakování	uvedena formou v následující
Tabulka 8:	Hodnocení	směsi Ia a Ib	proti Ips caliqrvphus:
Ošetření	Dny po	počet	počet	Průměrné %
	ošetř.	jedinců	mrtvých	mortality
Kontrola	4	20	0	0
Kontrola	7	20	0	0 .
Kontrola	10	20	1 .	3
Ia/Ib	4	20	1	5
Ia/Ib	7	20	7	35
Ia/Ib	10	20	20	100
				...... ..........

Výsledky testu pro Dendroctonus frontalis jsou uvedeny v⁷tabulce 9, a ukazují, že směs Ia/Ib je insektícidní.

Tabulka 9: Hodnocení smési Ia/Ib proti Dendrococcus frontalis

ošetření	Dny po ošetření	počet jedinců	počet mrtvých	Průměrné % mortality
Kontrola	4	14-20	0	0
Kontrola	7	14-20	1	y
«____ř- *-*·*	^ltl . *
Kontrola	10-12	14-20	3	16
Ia/Ib	4	10-20	1 ‘	5
Ia/Ib	7	10-20	1	5
Ia/Ib	10	20	14	83
Příklad 12:	účinnost	vůči Popillia	japonica	(Japanese Beetle)

Surová směs sloučenin Ia a Ib byla testována na pesticidní účinnost proti třetímu instaru Poppilia japonica. Kořeny víceletého jílku (11 dní starého) byly ponořeny do surové směsi sloučenin Ia a Ib (1,8 mg látky Ia a Ib na 1 ml) a ponechány částečně schnout. Poté se umístí jedna larva třetího instaru Popillia japoníčy do nádoby s několika ošetřenými kořeny. Po 24 hodinách byly umístěny do půdy Wooster. Kontrolní kořeny se ponoří do vody a neošetřené kontroly tvoří larvy, umístěné přímo do půdy první den. Nádoby se inkubují ve tmě při 25 °C a spočítají se mrtvé larvy po 7, 10, 21, 28 a 36 dnech a jako výsledek se uvede korigovaná mortalita: 100 x (Přežití kontroly-Přežití

---------ošetřených-//-(--Přežití kont ro:l.y:)i._iiCe 1 Kem- š^-pou^í-jé—pr o—kaž dé ošetření 25 larev. Výsledky, jak jsou uvedeny v tabulce 10, demonstrují, že surová směs sloučenin Ia a Ib je účinná proti třetímu instaru Popillia japonica.

Tabulka 10: účinnost látek la a Ib proti Popillia japonica:

pokus	hodnota	7dní	lOdní	21dní	28dní	36dní
neošetřeno	počet mrtvých	2	2	4	5	5
voda (kontr.	) počet mrtvých	2	3	8 .	10	11
	% kontroly	0	4,3	19	25 ..	30
la a Ib	počet mrtvých	6	8	13	14	15
	% kontroly	17,4	26,1 y	42,9	45	50
Příklad 13:	účinnost proti :	Epilachna	varivestis

Pesticidní účinnost vůči larvám třetího instaru larev Epilachna varivestis se v tomto testu stanovuje u surové směsi sloučenin la a Ib. Izolovaná kolonie dospělých jedinců Epilachna varivestis se udržuje na potravě tvořené sojovými boby v teráriu při osvětlení v poměru 16 : 8, při 27 °C a při 50% relativní vlhkosti. Hmota vajíček se sebere a vajíčka se ponechají vylíhnout na Petriho miskách, obsahujících vlhký bavlněný tampon a listy měsíčních fazolí. Po dvou dnech byly odebrány larvy ve stadiu druhého instaru a použity pro listový ponořovací test. Test se provádí tak, že se nejprve listy sklidí, řapíky jednotlivých lis£ů se prostrčí gumovou přepážkou do pěstební nádoby s obsahem 4 ml vody. Jednotlivé listy se potom namočí v sekvenci zředěných účinných směsí koncentraci surového materiálu s obsahem sloučenin la a Ib 0 až 12 % objemově. Po uschnutí listů se na ně po 8 až 10 kusech umístí^-larvy Epilachna varivestis ve stadiu druhého instaru. Poté se hmyz, listy a pšstitelské'^Tťrubice umístí do papírových pohárků o hmotnosti 682 g a pokryjí se jemným sítem. Tyto pohárky se ponechají ve stejné komořen která se byla použita pro chov kolonie. Každé dva dny se pohárky z chovné komory vyndají, larvy se nahradí čerstvě ošetřenými listy, dnech.

zkontrolují a listy se Test se ukončí po osmi

Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce ll, ukazují, že surová směs sloučenin la a lb je účinná proti larvám Epilachna varivestis.

Tabulka 11: Závislost mortality Epilac-hna varvestis na dávce:

Dny po ošetření	LC50 %	95% odvozená účinnost
spodní	horní
4	5,6	2,58	10,65
6	2,12	3,03	9,37
8	1,94	0,75	‘ 2,81
Příklad 14:	Polní pokus	proti Leptinotarsa	decemlineata

(mandelince bramborové)

Je testována účinnost proti Leptinotarsa decemlineata na bramborách (varieta Kathadin) se surovou směsí sloučenin la a lb při aplikaci 20, 40, 60 a 120 g/ha v kombinaci s NOVODORem , jehož koncentrace byla 0,2, 0,4 1/ha, přičemž byl aplikován i NOVODOR™ samostatně v koncentracích 0,2, 0,4 a 0,8 1/ha. Ošetření se provádí cb/akrát za 7 dní pomocí přenosného CO₂ postřikovače, vybaveného__systémem. s třemi.

konickými rozstřikovacími tryskami TXVX-12 na jednu řadu a kalibrovaným pro dodámí 32 GPA při rychlosti 4,8 km/h a tlaku 390 kPa. Každé ošetření se opakuje čtyřikrát na parcelkách o dvou řadách (vzdálenost mezi řádkami 0,86 m) o délce jednoho bloku 7,6 m. Dospělci Leptinotarsa decemlineata a larvy byli počítáni bez poškozování listů na celé délce (15,2 m) řádky v jedné parcelce.

Výsledky, jak jsou uvedeny na obr. 3, ukazují, že surová směs sloučenin Ia a Ib má signifikantně synergický efekt při společném použití s prostředkem NOVODOR™ na bramborách. Při 0,2 1/ha NOVODOR™ lze, zaznamenat.potlačení z 21 % a při 20 g/ha surové směsi sloučenin Ia a Ib se dosáhne potlačení ze 13 %. Když se pak použije kombinace prostředku NOVODOR™ se surovou směsí sloučenin Ia a Ib ve stejných koncentracích, dosáhne se potlačení z 81 %. Obdobně aplikací 40 g/ha samotné surové směsi sloučenin Ia a Ib se dosáhne 28% potlačení, aplikací 0,2 1/ha samotného NOVODORu™ dojde k 21% potlačení a při kombinovaném použití těchto prostředků při stejných koncentracích vzroste procento potlačení na hodnotu 81 %. Kromě toho společná aplikace 20 g/ha surové směsi sloučenin Ia a Ib a 0,4 1/ha NOVODORu™ umožní dosáhnout potlačení z 88 %.

Uložení mikroorganismů

Podle Budapeštské dohody o ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení byly v mezinárodní sbírce s adresou Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Regional Research Center (NRRL), 1815 University Street, Peroria, Illinois, 61604, USA, uloženy následující kmeny Bacillus thuringíensis:

π

Kmen_Sbírkové číslo _Datum uložení

EMCC-0077	NRRL	B-21090	10.5.1993
EMCC-0078	NRRL	B-21091	10.5.1993
EMCC-0079	NRRL	B-21092	10.5.1993
EMCC-0080	NRRL	B-21093	10.5.1993
EMCC-0081	NRRL	B-21094	. 10.5.1993 ,
Kmeny	byly uloženy za	podmínky	, že přístup ke kulturám
bude umožněn	v průběhu řízení o této	patentové přihlášce jen
s povolením	Commisioner of	Patents	and Trademarks podle 37
C.F.R. §§ 14	a 35, U.S.C	§ 122.	Depozita představují v
podstatě čisté kultury	každého	uloženého kmene. Jsou
přístupná, pokud to požadují	zákony cizích zemí, pro ty: země,

ve kterých byl podán analog předmětné přihlášky nebo kde byla podána přihláška z ní odvozená. Tomu je však třeba rozumět tak, že přístupnost depozita-v-tomto'Smyslu neznamená licenci k využívání předmětu vynálezu při¹omezení patentových práv, udělených vládním ro2uhodnutím.

Vynález zde popsaný a chráněný není omezen jen na rozsah konkrétních provedení, která jsou uvedena v popisu, nebo tato provedení jsou míněna jako ilustrace několika aspektů vynálezu. Jakékoliv ekvivalentní provedení patří do rozsahu vynálezu. Také různé modifikace, které může z popisu vynálezu vyvodit osoba znalá oboru, spadají do rozsahu patentových nároků, zejména do razsahu_ závislých nároků. _______

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kmen Bacillus thuríngiensis, u kterého v podstatě veškerá pesticidní účinnost je v supernatantu z jeho fermentace.
2. 2. Kmen Bacillus thuríngiensis podle nároku 1, vybraný ze skupiny zahrnující kmen EMCC-0077 , který má indentifikační charakteristiky NRRL B-21090 nebo mutanty tohoto kmenu, kteří mají v podstatě tytéž vlastnosti jako EMCC-0077, kmen EMCC-0078, který má indetifikační charakteristiky NRRL B-21091 nebo mutanty tohoto kmenu s vlastnostmi v podstatě stejnými jako EMCC 0078, kmen EMCC-0079, který má indentifikační charakteristiky jako NRRL B-21092, nebo jeho mutanty s vlastnostmi v podstatě stejnými jako EMCC-0079, kmen EMCC-0080, který má indentifikační charakteristiky NRRL B-21093 nebo jeho mutanty v podstatě stejných vlastností jako EMCC-0080 a kmen EMCC-0081 s identifikačními charakteristikami NRRL B-21094, nebo jejich mutanty, kteří mají v podstatě stejné vlastnosti jako EMCC-0081.
3. 3. Kmen podle nároku l, u kterého pesticidní látka, která má účinnost proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera a která působí společně s různými pesticidy rodu Bacillus, je obsažena v supernatantu z jeho fermentace.
4. 4. Kmen podle nároku 3, jehož účinná látka má strukturu:

   kde je aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl(, alkyl(C_1-10)ester, arylester, přičemž uvedený aryl je vybraný ze skupiny zahrnující- benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, ^ci-
5. 5 alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalkinyl, glycinyl a fenylglycinyl,

   R₂ je aminoskupina nebo alkyl

   R-j je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl(C₁__1Q), alkyl() ester, arýlester, v němž aryl je vybraný ze skupina zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, (C-^) alkoxy, methylamino, dimethylamino, thionyl, methylthionyl, kyano, nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů,__a_cetátů,__uhliči.tanů nitrátů, cóž^sak neznamená omezení na tyto soli, je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (Cj-Iq), alkyl(C₁_₁₀) ester, arylester v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, (C-_L_₅)alkoxy, nebo jejich soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

   R₅ je vodík, methoxy, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl ^ř alkyl (<2^_ ₁₀) ester, arylester, v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen a (C₁_₅)alkoxy,

   R₆ je vodík, aminoskupina,. hydroxyskupina, alkyl.

   (^C1-1(P' alkyl (^ci-io) ester, (C-_L_₅) alkoxy

   Ry je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (^c1-1q)' alkylester, arylester, v němž aryl je zvolen ze skupiony zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, (C^_^Jalkoxy, nebo jejich soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což vsak neznamená omezení na tyto soli,

   Rg je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl alkyl (^ci-io) ester, arylester v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl nebo. halogenbenzoyl, halogen, (C_1-5)alkoxy, methylamino, dimenthylamino, thionyl, methylthionyl, kyano nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

   R_g je aminoskupina nebo alkyl a

   R_lo je amino, hydroxy, alkyl (Ο_1-10),alkyl (C₁_₁₀) ester, arylester, v němž aryl je vybraný ze skupiny, zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, (Ci_₅)alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalanyl₂_glycinyl a fenylglycinyl.

   '5. Kmen ’podle nároku 4, v jehož účinné látce je Rj aminokyselinový zbytek, vybraný ze skupiny zahrnující alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalanyl, glycinyl a fenylglycinyl.
6. 6. Kmen podle nároku 4, v jehož účinné látce je R₁₀ aminokyselinový zbytek, vybraný ze skupiny zahrnující alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalanyl, glycinyl a fenylglycinyl.
7. 7. Kmen podle fc- strukturu:

   nároku _ 4, jehož účinná látka má

   Ia: R,R^,R₂,R₃=H

   Xb: R,R_x,R₂=H, R₃=OH
8. 8. Způsob potírání hmyzích škůdců druhů řádu Coleoptera, vybraných ze skupiny zahrnující Leptinotarsa decemlineata, Ips calligraphus, Dendroctonus frphtalis., Ě-p-i-iachna-varivaBtiš á~PópilTia japon.ica, při kterém še na škůdce působí účinným’'množstvím pesticidní kompozice, která obsahuje (a) látku, která má pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera a působí spolu s různými pesticidy produkovanými mikroorganismy rodu Bacillus, přičemž v podstatě veškerá pesticidní účinnost uvedeného kmene je v supernatantu z uvedené fermentace a (b) pesticidně účinný nosič.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t i m , že účinná látka má strukturu (I) kde:

   R^ je aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl(C₁_₁₀), alkyl(C₁__1Q)ester, arylester, přičemž uvedený aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, ^ci_5 alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalkinyl, glycinyl a fenylglycinyl,

   R₂ í^e aminoskupina nebo alkyl (^ci_io)'

   R₃ je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl(0_1-10), alkyl(C₁__1Q) ester, arylester, v __němž. aryl ._j_e.

   --vybraný ze skupina zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, ***™**·dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen,{C_1-5), alkoxy, methylamino, dimethylamino, thionyl, methylthionyl, kyano, nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli, ^r4 í^e vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (^C1-1C))' ^alJ<yl() ester, arylester v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, (C-^Jalkoxy, nebo jejich soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což vsak neznamená omezení na tyto soli,

   R₅ je vodík, methoxy, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl alkyl _1Q) ester, arylester, v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující

   7 ''x v* j-b ~~ w — al oi UJJCllčUy x _t dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen a (C₁_₅)alkoxy,

   Rg je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl ^^cl-ioh alkyl (^ci-iq) ester, (C_x_₅) alkoxy

   Ry je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (^c]-]_ch' alkyl (C^·^ )ester, arylester, v němž aryl je zvolen ze skupiony zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, (C₁_^)alkoxy, nebo jejich soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což vsak neznamená omezení na tyto soli,

   Rg je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (Ci_₁₀)( alkyl (^ci_yo^ ester, arylester v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl nebo halogenbenzoyl, halogen, (C₁_c_i) alkoxy, methylamino, dimenthylamino, thionyl, methylthionyl, kyano nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

   R_g je aminoskupina nebo alkyl (C₁__lo) a

   R_lo je amino, hydroxy, alkyl (C₁_₁₀),alkyl (^ci_pq) ester, arylester, v němž aryl je vybraný ze skupiny.,, -zahrnující 'benzoyl, nitrobenzoyl, a halogenbenzoyl,’'' halogen, ) alkoxy dinitrobenzoyl nebo zbytek být alanyl, valinyl, leucinyl, glycinyl a fenylglycinyl a aminokyseliny, kterým může isoleucinyl, fenylalanyl, (b) pesticid produkovaný mikroorganismem rodu Bacillus.
10. 10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t í m , že účinná látka má strukturu:

    Ia: R,R_lfR₂,R₃=H

    Ib: R,R_lřR₂=H, R₃=OH
11. 11. Způsob potenciace pesticidní účinnosti pesticidů, produkovaných mikroorganismy rodu Bacillus vyznačující se tím, že se na škůdce působí pesticidní kompozicí zahrnující (a) látku, která má pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera a působí spolu s různými pesticidy produkovanými mikroorganismy rodu Bacillus, přičemž v podstatě veškerá pesticidní účinnost uvedeného kmene je v supernatantu z uvedené fermentace a (b) pesticidně účinný nosič v-•množství-,- dos:ta-těcném/-pgo—potéňeiaě-i—pesticidní^-účinnosti uvedeného .pesticidu, -.produkovaného mikroorganismy rodu Bacillus.
12. 12. Způsob získávání v podstatě čisté látky, která má pesticidní účinnost proti škůdcům řádu Coleoptera a která působí spolu s různými pesticidy, produkovanými mikroorganismy rodu Bacillus, proti škůdcům vyznačující se tím, že se tato látka získává ze supernatantu fermentační směsi kmene Bacillus thuringiensis, přičemž v podstatě veškerá pesticidní účinnost uvedeného kmene je v supernatantu uvedené fermentační směsi přičemž se:

    (a) kultivuje na vhodném mediu kmen Bacillus thuringiensis, u něhož je v popds/tatě veškerá pesticidní účinnost v supernatantu z fermentace uvedeného kmene, (b) oddělí se supernatant z (a) a (c) izoluje se v podstatě čistá účinná látka ze supernatantu ze stupně (b).
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se t i m , že účinná látka má strukturu (I) kde:

    R-j_ je aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl(C

    1-10'' alkyltCj^^g)ester, arylester, přičemž uvedený aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, ^ci-5 alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalkinyl, glycinyl a fenylglycinyl,

    R₂ je aminoskupina nebo alkyl

    R₃ je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl(C₁__1Q), alkyl(c₁_₁₀) ester, arylester, v němž aryl je vybraný ze skupina zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl. dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen,(C₃_₅), alkoxy, methylamino, dimethylamino, thionyl, methylthionyl, kyano, nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

    R₄ je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (^cl~io)' ^alkyl(Ci_₁₀) ester, arylester v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, (C₃_^)alkoxy, nebo jejich soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

    R₅ je vodík, methoxy, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (ε₃_₁₀), alkyl ester, arylester, v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen a (C₃_₅)alkoxy,

    R₆ je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (^cl-io7 alkyl ester, (0_1-5) alkoxy

    R₇ je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl (^cl-io)' alkyl(c₁_₁₀)ester, arylester, v němž aryl je zvolen ze skupiony zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl •a—ha-logenbenzOyr; Halogen', (^1-5Alkoxy, nebo jejích soli, včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

    Rg je vodík, aminoskupina, hydroxyskupina, alkyl alkyl aster, arylester v němž aryl je vybraný ze skupiny zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl nebo halogenbenzoyl, halogen, (C^_₅)alkoxy, methylamino, dimenthylamino, thionyl, methylthionyl, kyano nebo jejich soli včetně fosfátů, sulfátů, acetátů, uhličitanů a nitrátů, což však neznamená omezení na tyto soli,

    R_g je aminoskupina nebo alkyl (C-^θ) a ¢, ^Rio 3^{e aitlino}' hydroxy, alkyl (C₁__1Q)„alkyl (C₁_₁₀) ester, arylester, v němž aryl je vybraný ze skupiny, zahrnující benzoyl, nitrobenzoyl, dinitrobenzoyl a halogenbenzoyl, halogen, (C₁_₅)alkoxy, nebo zbytek aminokyseliny, kterým může být alanyl, valinyl, leucinyl, isoleucinyl, fenylalanyl, glycinyl a fenylgiycinyl.
14. 14. Způsob podle nároku 1, vyznačuj xcíse tím, že účinná látka má strukturu