CZ20023223A3 - Metabolity s agonisty/antagonisty estrogenu - Google Patents

Description

Metabolity agonisty/antagonisty estrogenu

Oblast techniky

Vynález se týká sloučenin, které jsou savčími metabolity (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu. Sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné jako standardy při analytických stanoveních a jako terapeutická činidla.

Dosavadní stav techniky

Farmakologicky je (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol (PPTN) agonistou/antagonistou estrogenu, který je popsán v US patentu č. 5 552 412. Agonista/antagonista estrogenu je sloučenina, která ovlivňuje některé z receptorů, které ovlivňuje estrogen, avšak nezbytně ne všechny, a v některých případech antagonizuje nebo blokuje estrogen. Takové látky jsou také známy jako selektivní modulátory receptoru estrogenu ·( ŠERM) . Agonisty/antagonisty estrogenu mohou být také označovány jako antiestrogeny, ačkoliv u některých receptorů estrogenu vykazují stejnou estrogenní aktivitu. Agonisty//antagonisty estrogenu tedy nejsou látkami, které jsou obvykle označovány jako čisté antiestrogeny. Antiestrogeny, které mohou působit také jako agonisty, jsou označovány jako antiestrogeny typu I. Antiestrogeny typu I aktivují receptor estrogenu, aby se po prodlouženou dobu pevně vázal v jádru, přičemž však dochází k porušení doplňování receptorů (Clark et al., Steřoids 1973, 22: 707; Capony et al., Mol. Cell. Endocrinol. 1975, 3, 233).

Sloučeniny podle vynálezu jsou metabolity PPTN a má sé za to, že vykazují významnou farmakologickou účinnost, _t která se podobá účinnosti rodičovské sloučeniny, PPTN, nebo je shodná.

<5

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou savčí metabolity agonis. ty/antagonisty estrogenů, PPTN.

ř -*

J Předmětem vynálezu jsou dále farmaceutické kompozice, jejichž podstata spočívá v tom, že obsahují metabolit PPTN nebo jeho optický nebo geometrický isomer nebo farmaceuticky vhodnou sůl, N-oxid, ester, kvartérní amoniovou sůl kterékoliv z těchto entit a farmaceuticky vhodný nosič, vehikulum nebo ředidlo.

Předmětem vynálezu je dále způsob léčení choroby, jehož podstata spočívá v tom, že se podává účinné množství metabolitu PPTN, který vykazuje farmakologickou účinnost, nebo jeho farmaceuticky vhodné soli, N-oxidu, esteru nebo ^ť kvartérní amoniové soli. Metabolity PPTN jsou účinné, přičemž podstatně snižují průvodní riziko nežádoucích účinků ^s spojených s podáváním estrogenů.

Předmětem vynálezu jsou dále kity pro použití uživatelem při léčení choroby. Kit obsahuje a) savčí metabolit , PPTN a popřípadě b) instrukce popisující způsob používání metabolitu PPTN za účelem léčení choroby. Instrukce mohou § také uvádět, že kit je určen pro léčení choroby za podstatně .-3» sníženého průvodního rizika nežádoucích účinků spojených s podáváním estrogenů.

Dále jsou’ předmětem vynálezu kity pro použití jako analytické standardy při měření metabolitů PPTN nebo jeho farmaceuticky vhodných solí, N-oxidů, esterů a kvarterních amoniových solí. Tyto kity obsahují v podstatě čistou formu metabolitu PPTN a kontejner pro tento metabolit.

Předmětem vynálezu je dále použití savčích metabolitů PPTN nebo jejich farmaceuticky vhodných solí, N-oxidů, esterů a kvarterních amoniových solí pro výrobu léčiva.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn reprezentativní HPLC radiochromatogram metabolitů PPTN v moči myší po perorálním podání. Na vertikální ose je vynesena radioaktivita (počet impulzů/min, cpm). Na horizontální ose je vynesena retenční doba (min).

Na obr. 2 je znázorněn reprezentativní HPLC radiochromatogram metabolitů PPTN ve výkalech myší po perorálním podání. Na vertikální ose je vynesena radioaktivita (počet impulzů/min, cpm). Na horizontální ose je vynesena retenční doba ¹(min).

Na obr. 3 je znázorněn reprezentativní HPLC radiochromatogram cirkulujících metabolitů PPTN u myší po perorálním podání. Na vertikální ose je vynesena radioaktivita (počet impulzů/min, cpm). Na horizontální ose je vynesena retenční doba (min).

Na obr. 4A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce XI. Na obr. 4B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu XI; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 5A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce XII. Na obr. 5B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu XII; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 6A je znázorněno fragmentační schéma meta-.

bolitu vzorce XXI. Na obr. 6B jsou znázorněna hmotnostní _f spektrální data metabolitu XXI; na vertikální ose je vynesen ř , relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 7A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce XIV. Na obr. 7B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu XIV; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 8A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce VI. Na obr. 8B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu VI; na vertikální ose je vynesen £ relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

s?

Na obr. 9A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce II. Na obr. 9B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu II; na vertikální ose je vynesen _f relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 10A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce XVI. Na obr. 10B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu XVI; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

tt · · · ·

Na obr. 11A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce X. Na obr. 11B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu X; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/naboj (m/z).

Na obr. 12A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce XVII. Na obr. 12B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu XVII; na vertikální ose je ‘ vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 13A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce IV. Na obr. 13B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu IV; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 14A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce XV. Na obr. 14B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu XV; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 15A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce V. Na obr. 15B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu V; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 16A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce XIII. Na obr. 16B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu XIII; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 17A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce IX. Na obr. 17B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu IX; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Na obr. 18A je znázorněno fragmentační schéma metabolitu vzorce VIII. Na obr. 18B jsou znázorněna hmotnostní spektrální data metabolitu VIII; na vertikální ose je vynesen relativní podíl a na horizontální ose je vynesen podíl hmotnost/náboj (m/z).

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Předmětem vynálezu jsou metabolity PPTN. Tyto metabolity odpovídají sloučeninám obecného vzorce I

nebo -NH(CH₂)₃COR₆;

R₅ představuje vodík, CH₃, glukuronovou kyselinu nebo

SO₃H;

R₂, R₃, R₄ a R₇, které jsou stejné nebo různé, jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z vodíku a 0R₅; a •í ·· '·· ·· ·» ··»· ·· · · · · ·« * • · · · ······ · ·

Rg představuje skupinu -OH, -NHCH₂COOH, glukuronovou kyselinu nebo skupinu -NHCH₂CH₂SO₃H, přičemž:

a) pokud R·^ představuje skupinu vzorce nebo -NH(CH₂)₃COOH a

b) R₂ představuje skupinu OH nebo OCH₃ představují vodík, nebo pokud Rj^ má význam uvedený v odstavci a) a

c) R₂ a R₇ představují vodík a R₃ .představuje skupinu OH nebo OCH₃, potom R₄ nepředstavuje vodík.

Jako přednostní sloučeniny je možno uvést sloučeniny obecného vzorce I, kde

R^ představuje skupinu vzorce

nebo -NH(CH₂)₃COR₆;

r₅ představuje vodík nebo skupinu CH₃;

R₂, R₃, R₄ a R₇, které jsou stejné nebo různé, jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z vodíku a 0R₅; a

Rg_r představuje skupinu -OH nebo -NHCH₂COOH;

přičemž:

• · ··· ··>·· • · · · · · • 9 9 99 9 9 9 9

9 9

a) pokud R·^ představuje skupinu vzorce nebo -NH(CH₂)₃COOH a

b) R₂ představuje skupinu OH nebo OCH₃ a představují vodík, nebo pokud R₃ má význam uvedený v odstavci a) a

c) R₂ a R₇ představují vodík a R₃ představuje skupinu OH nebo OCH₃, potom R₄ nepředstavuje vodík.

Jako přednostní metabolity PPTN lze například uvést sloučeniny uvedené v tabulce I.

Tabulkal

Přednostní metabolity PPTN

O c 1 o o	(II)
hota fGi Cr	(lil)
X)	•

.i t» by fc%

«· '· · ί· · · Β ·«Β Β • · <· · Α Α Α · ’ΒΒ BA·· Β Β <· • !,·. Β Α ··· Α Β Β Β • Β Β · ·'··>

• Β ,'·· (Β'Β ,· · ·· ho₃s-o

(XX)

Glu-0

(XXI)

HO

(XXII)

O-Glu

COOH (XXIII)

Glu-O

(XXIV)

!·· · 4 V Μ · β 4 4 4 4 4 4 -4 4 ,4

4 4 4 4 4 4 4 4 · • 4 4 .4 4 » 4 44 · 4 · 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 44 44 .4 4 44 .44

Jako ještě výhodnější metabolity PPTN lze například uvést sloučeniny uvedené v tabulce II.

Tabulka II

Přednostní metabolity PPTN

• «

·· ·*♦ *0 ··»· «0 · « • 0 · <♦00 «5

0% ♦ · · · • · · ·

0 0·· • · ·

0· 0«

0 0 t 0 • Λ

Předmětem vynálezu jsou v podstatě čisté metabolity PPTN popsané výše.

Následující pojmy, kterých se v textu používá, jsou definovány dále uvedeným způsobem, pokud není uvedeno j inak.

Do rozsahu pojmu léčení spadá také preventivní (například profylaktické) a paliativní léčení.

Pod pojmem subjekt se rozumí živočich, jako člověk, kterého lze léčit za použití sloučenin, kompozic, způsobů a kitů podle tohoto vynálezu. Pokud není konkrétně uvedeno pohlaví, do rozsahu tohoto pojmu spadají subjekty mužského i ženského pohlaví. Přednostními subjekty jsou postmenopauzální ženy.

Jako nežádoucí účinky spojené s estrogenem je možno uvést citlivost prsu, rakovinu prsu, meteorismus, bolest hlavy, zvýšenou srážlivost krve a menstruační krvácení u žen. Nevyvažovaná estrogenová terapie zvyšuje riziko karcinomu endometria. Ženy dlouhodobě léčené extrogeny mohou být ohroženy ve zvýšené míře, kterou konkurenční progestiny nesnižují (N. Engl. J. Med. 1995: 332, 1589). Jako nežádoucí účinky estrogenu u mužů lze uvést zvýšenou srážlivost krve, gynekomastii, feminizaci a snížené libido.

Pod pojmem postmenopauzální ženy se rozumí nejen ženy v pokročilém věku po menopauze, ale také ženy, kterým byla provedena hysterektomie nebo u kterých byla z určitého jiného důvodu potlačena tvorba estrogenů, jako ženy dlouhodobě léčené kortikosteroidy, ženy trpící Cushingovým syndromem nebo dysgenezí pohlavních žláz.

Pod pojmem rakovina prsu se rozumí maligní proliferace buněk duktálního nebo lobulárního epithelu prsu.

Pod pojmem glukuronová kyselina se rozumí substituent, který je převáděn na metabolit nebo na rodičovskou sloučeninou za vzniku za vzniku metabolitu z fáze II konjugační reakce glukuronidace. Glukuronová kyselina reaguje se zbytkem kyseliny nebo alkoholu nebo fenolu na metabolitu nebo rodičovské sloučenině za vzniku glukuronidu. Tento glukurodinový substituent je ve vzorcích uváděn pod zkratkou Glu nebo Glukuronid.

Kyselina sírová je substituent, který je převáděn na metabolit nebo převáděn na rodičovskou sloučeninu za vzniku metabolitu z fáze II konjugační reakce sulfatace. Kyselina sírová reaguje ze zbytkem alkoholu nebo fenolu na metabolitu nebo rodičovské sloučenině za vzniku sulfátu.

Pod pojmem společné podávání se v souvislosti s kombinací metabolitu PPTN a další sloučeniny nebo dalších sloučenin rozumí, že tyto složky je možno podávat společně jako kompozici nebo jako část stejné jednotkové dávkovači formy. Do rozsahu pojmu společné podávání také spadá oddělené podávání metabolitu PPTN a další sloučeniny nebo dalších sloučenin v rámci stejného terapeutického programu nebo režimu. Uvedené složky kombinace nemusí být nutně podávány ve stejnou dobu, ale v případě potřeby mohou. Do rozsahu pojmu společné podávání tudíž například spadá

· podávání metabolitu PPTN a další sloučeniny ve formě oddělených dávek nebo dávkovačích forem, prováděné ve stejnou dobu. Do rozsahu pojmu společné podávání také spadá oddělené podávání prováděné v různou dobu, a to v jakémkoliv pořadí. Pokud je to vhodné, pacientu může být podána jedna nebo více složek terapie ráno a jedna nebo více zbývajících složek večer.

Odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že některé sloučeniny podle vynálezu obsahují jeden nebo více atomů, které mohou být v konkrétních stereochemických, tautomerních nebo geometrických konfiguracích, což dává vznik stereoisomerům, tautomerům, regioisomerům a konfiguračním isomerům.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají všechny takové isomery a jejich směsi. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají hydráty a solváty sloučenin podle vynálezu.

Do rozsahu vynálezu mj. také spadají sloučeniny značené isotopy, které jsou identické se sloučeninami obecného vzorce I až XXV až na to, že v nich je jeden atom nebo více atomů nahrazeno atomem s atomovou hmotností nebo hmotnostním číslem odlišným od atomové hmotnosti nebo hmotnostního čísla s jakým se obvykle nacházejí v přírodě. Jako příklady isotopů, které je možno začlenit do sloučenin podle tohoto vynálezu je možno uvést isotopy vodíku, uhlíku, dusíku, kyslíku, fosforu, síry, fluoru a chloru, jako je ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸0, ¹⁷0, ³¹P, ³⁵S, ¹⁸F a ³⁶C1. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají sloučeniny podle vynálezu a jejich farmaceuticky vhodné soli nebo jejích proléčiva, které obsahují výše uvedené isotopy a/nebo jiné isotopy jiných atomů. Sloučeniny podle vynálezu značené určitými isotopy, například sloučeniny značené radioaktivními isotopy, jako ³H nebo ¹⁴C, jsou užitečné při zkouškách distribuce léčiva nebo substrátu v tkáních. Zvláštní přednost se dává tritiovaným isotopům tj. ^JH, a C isotopům, ···· jelikož je lze snadno připravovat a detekovat. Nahrazením těžšími isotopy, jako deuteriem, tj. ²H, je možno dosáhnout určitých terapeutických výhod vyplývajících z vyšší metabolické stability, například prodloužení poločasu in vivo nebo snížení potřebných dávek, čemuž se za určitých okolností dává přednost. Sloučeniny obecného vzorce I až XXV podle tohoto vynálezu a jejich proléčiva značené isotopy lze obvykle připravovat způsoby popsanými v příkladech provedení nebo o sobě známými způsoby. ¹⁴C-PPTN lze připravovat způsoby, které jsou popsány a doloženy příklady v US patentu 5 552 412, při nichž se reagenty neznačené isotopy nahradí snadno dostupnými reagenty značenými isotopy. .. ..

Metabolitů PPTN v podstatě čisté formě nebo ve směsích o známém složení je možno používat jako analytických standardů pro metabolické studie in vitro nebo in vivo nebo jako meziproduktů při chemické syntéze nebo biosyntéze nových chemických entit. Tyto metabolity mohou být izolovány jako pevné látky nebo v roztocích.

Má se za to, že sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné při léčení chorob. Jako příklady chorob nebo stavů, při jejich léčení mohou být sloučeniny podle vynálezu užitečné, je možno uvést osteoporosu, rakovinu prsu, hyperlipidemii, atherosklerosu, Alzheimerovu chorobu, kataraktu, ztrátu libida, sexuální dysfunkce u samců, rakovinu tlustého střeva, kožní vrásky, autoimunitní choroby, alopecii, akné, kardiovaskulární choroby, kataraktu, diabetes, endometriosu, sexuální dysfunkce u samic, hyperglykémii, obezitu, obsedantně kompulzivní poruchu, premenstruační syndrom, karcinom prostaty, benigní hyperplasii prostaty, pulmonární hypertenzi, reperfuzní poškození, reumatoidní artritidu, osteoartritidu, seboreu, senilní gynekomastii, deficienci testosteronu a stavy responživní na zvýšení testosteronu, Turnérův syndrom, fibrózu dělohy, atrofickou vaginitidu, inkontinen• · ···· • · ci, rakovinu dělohy, hirsutismus, bulimii, anorexii, hypoaktivní sexuální touhu, poruchu sexuální vzrušivosti, dyspareunii a vaginismus a dále podporu hojení ran. Tyto sloučeniny také mohou být užitečné při zvyšování frekvence orgasmu, léčení prolapsu, snižování vaginálního pH, léčení infekcí močových cest, léčení nebo prevenci mrtvice, infarktu myokardu, akutního nebo chronického selhání ledvin, okluzní choroby periferních artérií a Raynaudova fenoménu a léčení rakoviny vaječníků, jater, slinivky a desmoidní rakoviny, gliomu a karcinomu renálních buněk. Způsoby léčení jedné nebo více z výše uvedených chorob nebo stavů spočívají v podávání účinného množství metabolitu PPTN.

Při způsobech léčení podle vynálezu je metabolit subjektu možno podávat přímo, nebo metabolit může v organismu vzniknout prostřednictvím metabolismu. Například je metabolit podle vynálezu možno efektivně podat za účelem léčení choroby nebo stavu tak, že se danému subjektu podá množství PPTN, a po tomto podání prostřednictvím metabolismu v organismu subjektu vznikne požadovaný metabolit. Kromě toho se způsoby podávání a dávkování PPTN mohou podle potřeby měnit tak, aby se dosáhlo požadované in vivo koncentrace a rychlosti produkce metabolitu.

Metabolity PPTN je při léčení jednoho nebo více výše uvedených stavů možno používat v kombinaci (při společném podávání odděleně nebo ve stejné farmaceutické kompozici) s PPTN a statiny, jako je simvastatin, popsaný v US patentu 4 444 784; pravastatin, popsaný v US patentu 4 346 227; cerivastatin, popsaný v US patentu 5 502 199; mevastatin, popsaný v US patentu 3 983 140; velostatin, popsaný v UŠ patentu 4 448 784 a 4 4540 171; fluvastatin, popsaný v US patentu 4 739 073; kompaktin, popsaný v US patentu 4 804 770; lovastatin, popsaný v US patentu 4 231 938; dalvastatin, popsaný ve zveřejněné evropské • 9

patentové přihlášce 738 510 Al; fluindostatin, popsaný ve zveřejněné evropské patentové přihlášce 363 934 Al; atorvastatin, popsaný v US patentu 4 681 893; atorvastatin kalcium, popsaný v US patentu 5 273 995; dihydrokompaktin, popsaný v US 4 450 171; ZD-4522, popsaný v US patentu 5 260 440; bervastatin, popsaný v US patentu 5 082 859 a NK-104, popsaný v US patentu 5 102 888. Metabolity PPTN je také možno používat v kombinaci s bisfosfonátovými sloučeninami, jako alendronovou kyselinou, alendronátem, cimadronátem, klodronovou kyselinou, klodronátem, 1-hydroxy-3-( 1-pyrrolidinyl)propyliden-l,1-bisfosfonovou kyselinou, etidronovou kyselinou, ibandronátem, neridronátem, olpadronátem, pamidronátem, piridronátem, risedronátem, tiludronátem a zolendronátem. Kromě toho je metabolity PPTN možno používat v kombinaci s látkami zvyšujícími cyklický guanosin 3 ' ,5'-monofosfát, jako je sildenafil (citrátová sůl l—[[3— -(6,7-dihydro-l-methyl-7-oxo-3-propyl-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl)-4-ethoxyfenyl]sulfonyl]-4-methylpiperazinu).

Farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami sloučenin podle vynálezu je možno získat ze samotných sloučenin nebo z jakýchkoliv jejich esterů. Takovými solemi jsou farmaceuticky vhodné soli, kterých se často používá ve farmaceutické chemii. Je možno připravovat například soli s anorganickými nebo organickými kyselinami, jako jsou kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina jodovodíková, sulfonové kyseliny, jako je například kyselina naf.talensulfonová, kyselina methansulfonová a kyselina toluensulfonová, dále kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná, kyselina vinná, kyselina disírová, kyselina metafosforečná, kyselina jantarová, kyselina mravenčí, kyselina ftalová, kyselina mléčná apod., nejvýhodněji s kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou citrónovou, kyselinou benzoovou, kyselinou maleinovou, kyselinou octovou a kyselinou propionovou.

·« • ·

Sloučeniny podle vynálezu popsané výše je možno podávat ve formě farmaceuticky vhodných solí. Tyto soli se účelně připravují způsoby, které jsou obvyklé v organické chemii, například reakcí sloučenin podle vynálezu s vhodnými kyselinami, jako jsou kyseliny popsané výše. Soli vznikají rychle a ve vysokých výtěžcích při nízkých teplotách a často se připravují pouze tak, že se sloučenina izoluje z vhodné kyselé promývací kapaliny použité v závěrečném stupni syntézy. Solitvorná kyselina se rozpustí ve vhodném organickém rozpouštědle nebo vodně-organickém rozpouštědle, jako například alkanolu, ketonu nebo esteru. Když se naproti tomu má sloučenina podle vynálezu získat ve formě volné báze, izoluje se tato volná báze ze závěrečného stupně promývání bázickou kapalinou, tak jak je to v praxi běžné. Při přednostní přípravě hydrochloridů se postupuje tak, že se volná báze rozpustí ve vhodném rozpouštědle a vzniklý roztok se důkladně vysuší, například molekulárním sítem, a poté se jím nechá probublávat plynný chlorovodík.

Dávka sloučeniny podle vynálezu, která se má podat člověku, semení v poměrně širokém rozsahu a její posouzení je v pravomoci ošetřujícího lékaře. Je třeba poznamenat, že může být nutné přizpůsobit dávku sloučeniny, pokud se sloučenina podává ve formě soli, jako je laurát, tj. v tom případě, když má solitvorná skupina značnou molekulovou hmotnost. Obvyklé rozmezí účinné dávky sloučenin podle vynálezu je od asi 0,001 do asi 200 mg/den. Přednostní rozmezí účinné dávky leží od asi 0,01 do 100 mg/den. Často je samozřejmě praktické rozdělit denní dávku podávané sloučeniny do několika dílčích dávek, které se podávají v různých hodinách během dne. V každém daném případě však bude množství podávané sloučeniny závislé na takových faktorech, jako je rozpustnost účinné složky, použitý prostředek a cesta podávání.

·· ·· «· ·*··

Způsob podávání sloučenin podle vynálezu nemá rozhodující význam. Sloučeniny podle vynálezu mohou být absorbovány v zažívacím traktu, ale v případě potřeby je možno je podávat perkutánně nebo perrektálně ve formě čípků. Jako obvyklé typy kompozic je možno uvést tablety, žvýkací tablety, tobolky, roztoky, parenterální roztoky, pastilky, čípky a suspenze. Kompozice se obvykle zpracovávají tak, aby obsahovaly denní dávku, nebo účelně zlomky denní dávky, tj. na jednotkové dávkovači formy. Takovou jednotkovou formou může být tableta, tobolka nebo vhodný objem kapaliny.

Obecně se všechny kompozice vyrábějí způsoby obvyklými ve farmaceutické chemii a/nebo se izolují při in vivo nebo in vitro metabolických reakcích, jako jsou způsoby popsané dále'. Rodičovská sloučenina, PPTN, se připravuje způsoby, které jsou popsány a/nebo ilustrovány příklady v US patentu č. 5 552 412. Metabolity je možno syntetizovat přímo nebo je vytvořit in vitro nebo in vivo enzymatickými nebo metabolickými reakcemi, jako jsou způsoby popsané v příkladech provedení.

Formulační postupy jsou o sobě známé a jsou například popsány v Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, PA., 19. vydání, 1995. Farmaceutické kompozice, kterých je možno používat podle tohoto vynálezu, mohou mít formu sterilních roztoků nebo suspenzí v apyrogenních kapalinách, potahovaných tobolek, čípků, lyofilizovaných prášků, transdermálních náplastí nebo jiných známých forem.

Tobolky se připravují tak, že se sloučenina smíchá s vhodným ředidlem, a vhodným množstvím vzniklé směsi se naplní tobolka. Jako obvyklá ředidla je možno uvést inertní práškovité látky, jako je škrob nejrůznějších druhů, prášková celulosa, zejména krystalická a mikrokrystalická celulosa, ·· ···· ·· ·· · · ·· • · · • · · ··· ·*

4* « · · • · · • · * • ·

4 · • · · · * * « · • 4 ·» cukry, jako je fruktosa, mannitol a sacharosa, obilninová mouka a podobné jedlé prášky.

Tablety se vyrábějí přímým lisováním, granulací za vlhka nebo suchou granulací. Takové prostředky obvykle kromě účinné sloučeniny obsahují ředidla, pojivá, mazadla a rozvolňovadla. Jako typická ředidla je například možno uvést různé typy škrobu, laktosu, mannitol, kaolin, fosforečnan vápenatý, síran vápanetý, anorganické soli, jako je chlorid sodný a práškový cukr. Také se může použít práškovítých derivátů celulosy. Jako pojiv se v tabletách může použít takových látek, jako je škrob, želatina a cukry, jako je laktosa, fruktosa, glukosa apod. Účelné jsou také přírodní a syntetické pryskyřice, jako například klovatina, algináty, methylcelulosa, polyvinylpyrrolidin apod. Jako pojivá mohou také sloužit polyethylenglykol, ethylcelulosa a vosky.

Tabletovací hmoty mohou obsahovat mazadla zabraňující ulpívání tablety nebo razidla v lisovadle. Mazadla se volí ze souboru kluzných pevných látek, jako je mastek, stearan hořečnatý a stearan vápenatý, kyselina stearová a hydrogenované rostlinné oleje.

Rozvolňovadla působí jako látky, které po navlhčení usnadňují rozpad tablety, přičemž dojde k uvolnění účinné sloučeniny. Takové látky zahrnují škroby, jíly, celulosy, alginy a pryskyřice. Může se například používat zejména kukuřičného a bramborového škrobu, methylcelulosy, agaru, bentonitu, dřevní celulosy, práškovíté přírodní houby, katexových pryskyřic, kyseliny alginové, guarové gumy, citrusové vlákniny a karboxymethylcelulosy, jakož i natriumlaurylsulfátu.

Tablety se často obalují cukry, které působí jako ochucovadla a těsnicí látky, nebo potahují filmotvornými ochrannými činidly za účelem modifikace rozpouštěcího profilu tablety. Sloučeniny podle vynálezu je také možno zpracovávat na žvýkací tablety. Při tom se, jak je to běžně zavedeno v praxi, používá velkých množství látek s příjemnou chutí, jako je mannitol.

Když se má sloučenina podle vynálezu podávat jako čípek, používá se při výrobě vhodných farmaceutických prostředků obvyklých základů. Tradičním základem pro čípky je kakaové máslo, které je možno modifikovat přídavkem vosků tak, aby se jeho teplota tání nepatrně zvýšila. V širokém rozsahu?se k tomuto účelu.používá s vodou mísitelných základů.pro čípky, které obsahují zejména polyethylenglykoly o různé molekulové hmotnosti.

Účinek sloučenin podle vynálezu je možno odložit nebo prodloužit vhodnou formulací. Tak například je možno vyrobit pomalu se rozpouštějící pelety s obsahem sloučenin podle vynálezu, které se začlení do tablet nebo tobolek.

Tuto techniku je možno zlepšit tak, že se vyrobí pelety s několika různými rychlostmi rozpouštění a tobolky se plní směsí takových pelet. Tablety nebo tobolky je možno potahovat filmem, který odolává rozpouštění po předem určenou dobu. I parenterální prostředky je možno modifikovat tak, aby působily delší dobu, když se sloučenina rozpustí nebo suspenduje v Olejovitém nebo emulgovaném vehikulu, které umožňuje pouze pomalou dispergaci v séru.

Pod označením proléčiva se rozumějí sloučeniny, které jsou in vivo transformovány na sloučeniny podle vynálezu. K této transformaci může dojít prostřednictvím různých mechanismů, jako je hydrolýza v krvi. Podrobné pojednání o použití proléčiv lze nalézt v publikaci T. Hibuchi a W. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, sv. 14 A. C. S. Symposium Series a Bioreversible Carriers in

- 25 Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Například pokud sloučeniny podle vynálezu obsahují funkční skupinu karboxylové kyseliny, proléčiva mohou obsahovat skupinu esteru vytvořenou nahrazením vodíkového atomu ve skupině kyseliny skupinou, jako alkylskupinou s 1 až 8 atomy uhlíku, alkanoyloxymethylskupinou se 2 až 12 atomy uhlíku, 1-(alkanoyloxy)ethylskupinou se 4 až 9 atomy uhlíku, 1-methyl-l-(alkanoyloxy)ethylskupinou s 5 až 10 atomy uhlíku, alkoxykarbonyloxymethylskupinou se 3 až 6 atomy uhlíku, l-(alkoxykarbonyloxy)ethylskupinou se 4 až 7 atomy uhlíku, 1-methyl-l-(alkoxykarbonyloxy)ethylskupinou s 5 až 8 atomy uhlíku, N-(alkoxykarbonyl)aminomethylskupinou se 3 až 9 atomy uhlíku, l-(N-(alkoxykarbonyl)amino)ethylskupinou se 4 až 10 atomy uhlíku, 3-ftalidylskupinou, 4-krotonolaktonylskupinou, gamma-butyrolakton-4-ylskupinou, di-N,N-alkylaminoalkylskupinou s 1 až 2 atomy uhlíku v každé z prvních dvou alkylových částí a 2 až 3 atomy uhlíku ve zbývající alkylové části (jako je β-dimethylaminoethylskupina), karbamoylalkylskupinou s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylové části, Ν,Ν-dialkylkarbamoylalkylskupinou s 1 až 2 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, piperidino-, pyrrolidinonebo morfolinoalkylskupinou se 2 až 3 atomy uhlíku v alkylové části.

Podobně, pokud sloučeniny podle vynálezu obsahují funkční skupinu alkoholu, je proléčiva možno připravovat tak, že se atom vodíku skupiny alkoholu nahradí skupinou, jako alkanoyloxymethylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkanoylové části, 1-(alkanoyloxy)ethylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkanoylové části, 1-methyl-l-(alkanoyloxy ) ethylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkanoylové části, alkoxykarbonyloxymethylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, N-alkoxykarbonylaminomethylskupinou • ·· * • · • ·· • to ·· s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, sukcinoylskupinou, alkanoylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, a-aminoalkanoylskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, arylacylskupinou a a-aminoacylskupinou nebo α-aminoacyl-a-aminoacylskupinou, kde každý α-aminoacylový zbytek je nezávisle zvolen ze souboru zahrnujícího zbytky přírodních L-aminokyselin, P(O)(OH)₂, -P(0)(Oalkyl)2 s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí a glykosylskupinu (tj. zbytek vzniklý odstraněním hydroxyskupiny z hemiacetalu sacharidu).

Pokud sloučeniny podle vynálezu obsahují funkční skupinu aminu, je proléčiva možno připravovat tak, že se atom vodíku skupiny aminu nahradí skupinou, jako skupinou R^x-karbonyl, R^xO-karbonyl, NR^XR^X'-karbonyl, kde R^x a R^X' představuje každý nezávisle alkylskupinu s 1 až 10 atomy uhlíku, cykloalkylskupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, benzylskupinu, nebo R^x-karbonyl představuje přírodní α-aminoacylskupinu nebo přírodní a-aminoacyl-přírodní α-aminoacylskupinu, -C(OH)C(O)OY^X, kde Y^X představuje vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo benzylskupinu; -C(OY^XO)Y^X1, kde Y^Y0 představuje alkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a Y^X1 představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, aminoalkylskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo mono-N- nebo di-N,N-alkylaminoalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, -C(Y^X2)Y^X3, kde Y^X2 představuje vodík nebo methylskupinu a Y^X3 představuje mono-N- nebo di-N,N-alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, morfolinoskupinu, piperidin-l-ylskupinu nebo pyrrolidin-l-ylskupinu.

Pod pojmem účinné množství se rozumí množství sloučeniny, které je schopné léčit konkrétní choroby a patologické stavy. Konkrétní dávka sloučeniny podávanou podle vynálezu se samozřejmě stanoví na základě okolností • · daného případu, jako je například podávaná sloučenina, způsob podávání, stav subjektu a závažnost léčeného patologického stavu.

Předmětem vynálezu jsou také výhodně kity určené pro použití uživatelem za účelem léčení choroby. Takový kit obsahuje a) farmaceutickou kompozici, která obsahuje agonistu/antagonistu estrogenů a farmaceuticky vhodný nosič, vehikulum nebo ředidlo; a popřípadě b) instrukce, které popisují způsob použití farmaceutické kompozice při léčení konkrétní choroby. Instrukce také mohou obsahovat informaci, že kit je určen pro léčení choroby za podstatně sníženého průvodního rizika nežádoucích účinků spojených s podáváním estrogenů.

Kit, kterého se používá pro účely tohoto vynálezu, zahrnuje obalový prostředek pro oddělené dávkovači formy, jako rozdělenou lahvičku nebo rozdělené foliové balení. Obalový prostředek (kontejner) může mít jakýkoliv obvyklý tvar nebo formu a vyrábí se z farmaceuticky vhodných materiálů, a může jím být například papírová nebo kartónová krabička, skleněná nebo plastová lahvička nebo nádobka, uzavíratelný sáček (například pro udržování zásoby tablet, které se umisťují do jiného kontejneru) nebo blistrové balení jednotlivých dávek, které se z blistru vytlačují podle terapeutického schématu. Volba kontejneru závisí na formě dané dávkovači formy (například kapalné suspenze se obvykle nebalí do konvenčních kartónových krabiček). Je pravděpodobné, že dávkovači formy na trhu budou baleny ve více než jednom kontejneru. Například tablety mohou být baleny v lahvičce, která je uložena v krabičce.

Jako příklad takového kitu je možno uvést tzv. blistrová (protlačovací) balení. V obalovém průmyslu jsou blistry dobře známy a ve velkém měřítku se jich používá pro • ·· · balení farmaceutických jednotkových dávkovačích forem (tablet, tobolek apod.). Blistry obvykle sestávají z listů relativně tuhého materiálu potaženého folií z přednostně transparentního plastického materiálu. Během balicího procesu se v plastické folii vytvarují dvorce. Dvorce mají velikost a tvar balených tablet nebo tobolek. Poté se do dvorců umístí tablety nebo tobolky a na opačnou stranu (vzhledem ke směru v němž byly vytvořeny dvorce) plastické folie se připevní list relativně tuhého materiálu. Výsledkem je, že tablety nebo tobolky jsou uzavřeny ve dvorcích mezi plastickou folií a listem. Pevnost listu jepřednostně taková, že tablety nebo tobolky je možno z biistru vyjímat tak, že se rukou zatlačí na dvorec, přičemž otvor v listu vznikne v místě dvorce. Tablety nebo tobolky je možno vyjímat výše popsanýln postupem.

Do blízkosti tablet nebo tobolek je vhodné umístit pomůcku usnadňující kontrolu odebírání dávkových forem z balení. Tato pomůcka může mít podobu čísel, která odpovídají dnům režimu, v němž mají být tablety brány. Jako další příklad je možno uvést kalendář, jako První týden, pondělí, úterý ... atd., Druhý týden, pondělí, úterý ... atd. Další varianty takových pomůcek jsou zcela zřejmé. Denní dávku je možno podávat ve formě jediné tablety nebo tobolky nebo ve formě několika pilulí nebo tobolek, které se berou v daný den.

Podle jiného konkrétního provedení se používá dávkovače léků (dispenzéru) uzpůsobeného pro dávkování denních dávek v určitou dobu v zamýšleném pořadí. Dávkovač je přednostně vybaven pomůckou usnadňující odebírání dávkových forem, pokud to napomáhá zvyšování kompliance s režimem.

Jako příklad pomůcky usnadňující kontrolu odebírání dávkových forem je možno uvést mechanické počítadlo oddělených denních dávek. Jiným přikladen takové pomůcky je mikročipová ·· k

k ·· parně t napájená z baterie spojená s displejem s tekutými krystaly nebo zvukovým upomínacím signálem, který například ukazuje datum, kdy byla odebrána poslední dávka a/nebo připomíná kdy se má brát další dávka.

Ve světle tohoto popisu a připojených patentových nároků budou odborníkům v tomto oboru zřejmé určité modifikace. Takové modifikace spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Všechny citované publikace a patenty jsou uvedeny náhradou za přenesení jejich obsahu do tohoto textu.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Používané zkratky mají následující významy:

HOAc kyselina octová

Ph fenyl

BuLi n-butyllithium

Et₂O diethylether

NBS N-bromsukcinamid

DMF dimethylformamid

AIBN azodiisobutyronitril

Me methyl

EtOH ethanol

THN tetrahydronaftalen ·· «

·· • « • · · · · • · · · · • ······ ····

Příklad 1

Vazba k receptoru estrogenů

Vazebná afinita estrogenů a metabolitu PPTN se měří za použití následujícího protokolu:

cDNA klonování lidského ERa

Kódující region lidského ERa se klonuje RT-PCR z mRNA lidských buněk nádoru prsu za použití PCR systému Expand(^R) High Fidelity PCR System podle pokynůvýrobce (Boehringer-Mannhaim, Indianapolis, IN, USA). PCR produkty se klonují do pCR2.1 TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlšbad, CA, USA) a sekvenují. Každý region kódující receptor se subklonuje do savčího expresního vektoru pcDNA3 (Invitrogen, Carlšbad, CA, USA).

Exprese savčích buněk

Receptorové proteiny jsou nadexprimovány v buňkách 293T. Tyto buňky odvozené od buněk HEK293 (ATCC, Manassas, VA, USA) se modifikují, aby stabilně exprimovaly velký T antigen, a tedy mohly replikovat plasmidy, které obsahující SV40 počátek replikace, na vysoký počet kopií. Buňky 293T se transfekují buď hERa-pcDNA3 nebo hERp-pcDNA3 za použití lipofektaminu podle pokynů výrobce (Gibco/BRL, Bethesda, MD, USA). Buňky se sklidí ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS) obsahujícím 0,5mM EDTA 48 hodin po transfekči. Buněčné pelety se promyjí jednou PBS/EDTA. Lysáty celých buněk se připraví homogenizací v TEG pufru (50mM Tris, pH 7,4, l,5mM EDTA, 50mM chlorid sodný, 10% glycerol, 5mM DTT, 5 μ9/πι1 aprotinin, 10 μ9^1 leupeptin, 0,1 mg/ml Pefabloc (Pentapharm, AG, Basilej, Švýcarsko) za použití homogenizátoru Dounce. Extrakty se 2 hodiny při 4°C centrifugují při 100

000 x g a supernatanty se shromáždí. Celková koncentrace proteinu se stanoví za použití reakčního činidla BioRad (BioRad, Hercules, CA, USA).

Zkouška kompetice o vazebná místa

O

Schopnost PPTN metabolitů inhibovat vazbu [ H]-estradiolu se měří zkouškou kompetice o vazebná místa za použití aktivního uhlí potaženého dextranem (viz Leake,

R. E., Habib, F., 1987, Steroid hormone receptors: assay and characterization, editoři B. Green a R., E. Leake, Steroid Hormones a Practical Approach,,IRL Press Ltd., Oxford, 67 až . 92). Extrakty buněk 293T exprimujících buď hERa nebo hERP se . inkubují za přítomnosti rostoucích koncentrací metabolitu PPTN a stálé koncentrace [³H]-estradiolu (141 ^Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA, USA) v 50mM TrisHCl, pH 7,4, l,5mM EDTA, 50mM NaCl, 10% glycerolu, 5mM DTT, 0,5 mg/ml β-laktoglobulinu v konečném objemu 0,2 ml. Všechny metabolity PPTN se rozpustí v dimethylsulfoxidu nebo vodném rozpouštědle. Konečná koncentrace receptorů je 50pM s 0,5nM [³H]-estradiolem. Po 16 hodinách při 4°C se přidá aktivní uhlí potažené dextranem (20 μΐ). Po 15 minutách při teplotě místnosti se aktivní uhlí odstraní centrifugací. Radioaktivní ligand v supernatantu se měří ve scintilačním čítači. Pokud není uvedeno jinak, pocházejí všechna reakční činidla od firmy Sigma (St. Louis, MO, USA).

Příklad 2

Inhibice růstu lidských buněk nádoru prsu in vitro

Antiproliferační účinky metabolitu PPTN in vitro se zkoušejí za použití dvou linií lidských buněk nádoru prsu: první linií jsou buňky MCF-7, které obsahují ER i receptory progesteronu (PgR) a druhou linií jsou buňky MDA-MB-231, ·· které postrádají ER a PgR a umožňují stanovení účinku, který je nezávislý na ER mechanismu. Účinek metabolitů PPTN na růst těchto různých buněčných linií se stanoví tak, že se buňky 6 dní inkubují s různými koncentracemi agonisty/antagonisty estrogenů. Antiproliferační účinky se potom zjistí přímým spočítáním buněk.

Příklad 3

Biosyntéza metabolitů PPTN u myší

-Připraví se dávka Á⁴C-PPTN jako suspenze v 0,5% (hmotn.) methylcelulose o koncentraci asi 0,898 mg/g. Aplikační roztok se zkouší dvojmo před a po aplikaci. Metabolity PPTN se stanoví vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s detekcí radioaktivity a identifikují kapalinovou chromatografií s hmotnostní spektrometrií/hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS).

Při této zkoušce na skupině myší CD-I (N = 9/pohlaví, 25 až 30 g) se podávání provádí perorální sondou. Zvířata se chovají ve skupinách po třech (3/pohlaví) v klecích pro metabolické zkoušky Nalgene^^R^ (Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA) umožňujících oddělené shromažďování moči a výkalů. Trubice sondy se před podáním a po podání zváží, aby se stanovila skutečná dávka podaná každému zvířeti. Moč, výkaly a oplachy z klecí se 7 dní kvantitativně shromažďují do vzorkových kontejnerů určených pro jednotlivé klece 0-24, 24-48, 48-72, 72-96, 96-120, 120-144 a 144-168 hodin po podání. V různých okamžicích se zaznamenává hmotnost moči, výkalů a oplachů. Vzorky moči a výkalů se rozdělí a až do analýzy skladují ve tmě při -20°C. Druhé skupině zvířat (N = 6/pohlaví, 25 až 30 g) se perorální sondou podá sloučenina, aby bylo možno identifikovat cirkulující metabolity. Z této skupiny se vždy 1 a 4 hodiny po podání 3 zvířata každého pohlaví usmrtí a krev se shromáždí do heparinizovaných zkumavek.

Moč (asi 3 ml z poolu 0-48 hodin) od každé skupiny se centrifuguje a supernatant se přemístí do čisté zkumavky a pod atmosférou dusíku za použití odpařováku zkoncentruje. Zbytek se rozpustí v asi 1 ml mobilní fáze pro HPLC. Alikvot (80 až 100 μΐ) se bez dalšího čištění nastříkne na sloupec pro HPLC. Fekální homogenáty (asi 2 g) z období 0 až 72 hodin po podání se shromáždí na bázi hmotností shromažďovaných v každém časovém intervalu a vzorky se zředí acetonitrilem (6 ml). Výsledná suspenze se přes noc míchá magnetickým míchadlem a centrifuguje. Supernatant se oddělí a extrakce se opakuje za použití methanolu (6 ml) a směsi methanolu a vody (50 : 50, 6 ml). Všechny supernatanty se spojí a malé alikvoty se spočítají. Organické rozpouštědlo se odpaří za použití zařízení Turbo Vap. Zbytek se rozpustí v asi 1 ml směsi methanolu a octanu amonného (1 : 1).

Alikvot (20 až 50 μΐ) se nastříkne na HPLC. Shromážděná plasma (2 ml, 1 a 4 hodiny) se zředí 4 ml acetonitrilu a vysrážený protein se oddělí centrifugací. Peleta se promyje dalšími 2 ml acetonitrilu a oba supernatanty se spojí a zkoncentrují v odpařováku. Zbytek se rekonstituuje v 500 μΐ směsi methanolu a octanu amonného (1 : 1). Alikvot (100 μΐ) se nastříkne na HPLC.

HPLC se provádí za použití kvarterního čerpadla Hewlett Packard HP1100 a autosampleru (Hewlett Packard, Palo alto, Kalifornie, USA) vybaveného detektorem radioaktivity (β-RAM, In/US Systems, lne., Tampa, FL, USA) na sloupci Beckman Ultrasphere^^R^ C-18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μιη) (Beckman Coulter, lne., Fullerton, CA, USA) za použití binární směsi lOmM octanu amonného (rozpouštědlo A) a methanolu (rozpouštědlo B). Mobilní fázi nejprve tvoří směs rozpouštědla A a rozpouštědla B v poměru 80 : 20, která se naprogramuje . ·· ·· ·'· ·*. ···· Λ'» · '· · '· · · · · * ·: .. ...·.· · • · · . · · ··· · · · · • · · · · · ·.. .. .... .. ,·· ·· ·· ·· tak, aby se poměr A : B lineárně během 30 minut změnil na poměr 20 : 80, který se poté během 5 minut změní na poměr 5 : 95, který se dalších pět minut udržuje. Složení mobilní fáze se během 5 minut vrátí na výchozí. Systém se před dalším nastříknutím nechá asi 15 minut ekvilibrovat. Všechny analýzy se provádějí při průtoku 1,0 ml/min.

Metabolity se kvantifikují tak, že se změří radioaktivita v jednotlivých pících, které se oddělí pomocí HPLC za použití detektoru radioaktivity. Detektor radioaktivity poskytne sourhnný výpis v počtech impulzů za minutu (CPM) a procentech radioaktivně,značené látky a také přehled píků. Detektor radioaktivity pracuje V čítacím režimu homogenní kapalinové scintilace a k výtokovému proudu se po UV detekci rychlostí 3 ml/min přidává scintilační koktejl kompatibilní s mobilní fází.

Metabolity se identifikují na zařízení Finnigan TSQ 7000 LC/MS/MS (Thermo Quest, San Jose, CA, USA). Výtokový proud z HPLC kolony se rozdělí a asi 50 μΐ/min se přes pneumaticky asistované elektrosprejové rozhraní zavádí do iontového zdroje hmotnostního spektrometru pro ionizaci za amosférického tlaku. Zbývající výtokový proud se zavádí do průtokové cely detektoru radioaktivity. Odezva detektoru je zaznamenávána v reálném čase datovým systémem hmotnostního spektrometru, který současně poskytuje data o detekci radioaktivity a hmotnostní spektrometrická data. Zpoždění při odezvě mezi dvěma detektory je asi 0,2 min, přičemž hmotnostní spektrometrická odezva je zaznamenána dříve. Elektrosprejové rozhraní funguje při asi 4000 V a hmotnostní spektrometr pracuje v pozitivním módu. Provedou se zkoušky kolizně indukované disociace (CID) za použití plynného argonu při srážkové energii asi 30 až asi 40 eV a tlaku kolizního plynu asi 306,6 mtorr.

·· ····

- 35 Příklad 4

Biosyntéza metabolitů PPTN u lidí

Připraví se ¹⁴C-PPTN (tartrátová sůl) se specifickou aktivitou asi 1,93 mCi/mmol.

Pro studii se vyberou normální zdraví muži ve věku 18 až 45 let. Subjekty se do zařízení dostaví asi 12 hodin před aplikací a za nepřetržitého lékařského dozoru v něm setrvají alespoň 576 hodin po aplikaci. Subjekty zůstanou nalačno alespoň 12 hodin- a podá· se jim jediná dávka ¹⁴C-PPTN ekvivalentní asi 20 mg volné báze (asi 80 ^Ci/subjekt).

Dávka se podá otevřeně v ranních hodinách. O 4 hodiny později se subjektům poskytne standardní jídlo. Aplikační formulace se připraví tak, že se radioaktivně značený PPTN suspenduje ve vodě. Během prvních čtyř hodin po podání léčiva se pacienti zdrží lehání, jídla nebo pití nápojů obsahujících kofein nebo sycených oxidem uhličitým.

Pro účely identifikace metabolitů se 24 a 48 hodin po aplikací odeberou vzorky krve v množství, které je dostatečné pro získání 20 ml plasmy. Všechny vzorky se označí a ihned zmrazí.

Vzorky plasmy (20 ml) od každého subjektu odebrané 24 a 48 hodin po podání se smísí se 40 ml acetonitrilu, vortexují a sonikují. Výsledná směs se centrifuguje a supernatanty se odstraní. Pelety se smísí s 5 ml acetonitrilu a vzniklá směs se centrifuguje. Oba supernatanty se spojí a pod atmosférou dusíku zkoncentrují do sucha. Zbytky se rekonstituují ve 300 μΐ směsi methanoiu a vody v poměru 1:1a centrifugujί, aby se odstranily nerozpustné látky. 100μ1 alikvoty se nastříknou do kolony pro HPLC. Metabolisty PPTN extrahované ze vzorků plasmy se identifikují HPLC ·*· ··

s detekcí radioaktivity a LS/MS/MS postupem popsaným výše v příkladu 3.

Příklad 5

Izolace a identifikace myších metabolitů PPTN

Biosyntéza metabolitů PPTN se provádí způsobem popsaným v příkladu 3. Myším se podá dávka 20 mg/kg. Shromažďují se moč a výkaly od jedné skupiny myší. U druhé skupiny se provede aplikace, shromáždí se krevní vzorky a izolují se a identifikují cirkulujícímetabolity. Výsledky této zkoušky jsou znázorněny na obr. 1 až 18. Na obr. 1 až 3 jsou znázorněny reprezentativní radiochromatogramy metabolitů v moči, výkalech a cirkulujících metabolitů. Reprezentativní hmotnostní spektrální data jsou spolu se strukturou, která byla metabolitům izolovaným pomocí HPLC přiřazeny, jsou uvedena na obr. 4 až 18.

Schéma 1

9 ·»·

Příklad 1 ·· · · · • » 0 0 · · ·*· ·* ··

1-{2-[4-(6,7-Dimethoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidin

Roztok 6,75 g (0,025 mol) l-(2-(4-bromfenoxy)ethyl) pyrrolidinu ve 250 ml diethyletheru se pod atmosférou dusíku ochladí na -78 °C a přidá se k němu několik mililitrů tetrahydrofuranu, aby se udržel čirý roztok. K tomuto roztoku se přikape 16,7 ml 1,6M n-butyllithia, přičemž se teplota udržuje pod -70°C. Vzniklá směs se 1 hodinu míchá při_-78^oC, načež se k ní během 1 hodiny, kdy se teplota udržuje pod -70°C, přikape roztok 5 g (0,024 mol) 6,7-dimethoxy-l-tetralonu ve 25 ml tetrahydrofuranu. Výsledná směs se 2,5 hodiny míchá při -78°C a poté rozloží přídavkem 100 ml 2M kyseliny chlorovodíkové. Směs se nechá zahřát na teplotu-místnosti a její pH se přídavkem 5M hydroxidu sodného upraví na 7. Diethyletherová vrstva se oddělí a vodná vrstva se extrahuje 4 x ethylacetátem. Diethyletherová vrstva a ethylacetátové vrstvy se spojí, vysuší síranem sodným a odpaří na 9 g surového produktu, který se přečistí na 400 g silikagelu za použití směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 95 : 5 jako elučního činidla, aby se odstranil tetralon a poté směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 85 : 15, jako elučního činidla. Získá se 3,3 g produktu.

NMR (CDC1₃) ppm: (1,97, bs, 4H), (2,55, m, 2H) , (2,84, t, 2H), (2,98, bs, 4H), (3,19, S, 2H), (3,68 s, 3H) , (3,84, S, 3H), (4,31, S, 2H), (5,93, t, 1H), (6,59, s, 1H) , (6,73, s, 1H), (6,90 d, 2H), (7,25 d, 2H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 379,8

Výchozí látky:

6,7-dimethoxy-l-tetralon (Aldrich, Milwaukee, WI, USA) l-[2-(4-bromfenoxy)ethyl]pyrrolidin (Aldrich, Milwaukee, WI

USA)

• ·

P ř í klad 2

1—{2—[4—(2-Brom-6,7-dimethoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidin

K roztoku 6 g (0,016 mol) {2-[4-(6,7-dimethoxy-3,4dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu ve 200 ml dimethylformamidu se pod atmosférou dusíku při teplotě místnosti přikape roztok 2,8 g (0,016 mol) N-bromsukcinimidu ve 20 ml dimethylformamidu. Ke vzniklé směsi se přidá azodiisobutyronitril (100 mg). Reakční směs se 1 hodinu míchá, poté zředí vodou a extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se vysuší síranem sodným a odpaří. Získá se 7 g produktu, kterého se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

NMR (aceton-dg) ppm: (1,73, m, 4H), (2,55, m, 4H), (2,80, m, 4H), (3,48, S, 3H), (3,80, s, 3H), (4,15, S, 3H), (6,24, S, 1H), (6,84, S, 1H), (7,00, d, 2H), (7,13, d, 2H)

Hmotnostní spektrum (rodičovský+1): 458

Příklad 3

1—{2—E 4—(6,7-Dimethoxy-2-fenyl-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyljpyrrolidin

Směs 7 g (0,015 mol) l-{2-[4-(2-brom-6,7-dimethoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 5,6 g (0,047 mol) fenylboronové kyseliny, 620 mg (0,00054 mol) tetrakis(trifenylfosfin)palladia a 7,6 g (0,072 mol) uhličitanu sodného ve 500 ml ethanolu se 10 hodin pod atmosférou dusíku zahřívá ke zpětnému toku. Ethanol se odpaří a ke zbytku se přidá voda a ethylacetát. Ethylacetátová vrstva se oddělí, vysuší síranem sodným a odpaří na 9 g surového produktu ve formě oleje. Tento olej se přečistí na 600 g silikagelu za použití směsi dichlormethanu a methanolu • ·

9

- 39 v poměru 9 : 1 jako elučního činidla. Získá se 3,6 g produktu .

NMR (aceton-d₆) ppm: (1,74, m, 4H), (2,60, bs, 2H), (2,71, m, 2H), (2,85, m, 6H) , (3,48, s, 3H), (3,82, S, 3H) , (4,10, t, 2H), (6,35 S, IH), (6,80 - 7,16, m, 10H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 456

Příklad 4

1- {2- [ 4-(6,7-Dimethoxy-2-fenyl-1,2,3,4-tetrahydronaftalen-1-yl)fenoxy]ethyl)pyrrolidin

Roztok 3,6 g (0,0079 mol) 1-{2-[4-(6,7-dimethoxy-2-fenyl-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 10 ml 2M kyseliny chlorovodíkové, 30 ml vody a 100 ml ethanolu obsahující 1,9 g hydroxidu palladnatého na uhlíku se 15 hodin třepe v Parrově zařízení za tlaku vodíku 206 843 Pa. Reakční směs se přefiltruje, aby se odstranil katalyzátor a z filtrátu se odpaří ethanol. Ke zbytku se přidá 5M hydroxid sodný, kterým se pH vodné vrstvy upraví na 8. Vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se vysuší a odpaří. Získá se 3,0 g produktu ve formě žlutého oleje.

NMR (aceton-dg) ppm: (1,65, m, 4H) , (1,74, m, IH), (1,90, d,

IH), (2,20,	m,	IH), (2,53,	bs,	4H) ,	(2,63, t, 2H)	, (3,00, m,
2H), (2,53,	d,	IH), (3,60,	s,	3H) ,	(3,80, s, 3H),	(3,93, t,
2H), (4,20,	d,	IH), (6,35,	d,	2H) ,	(6,45, s, IH),	(6,53, d,
2H), (6,68,	s,	IH), (7,10,	m,	3H) .

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 458

Příklad 5

6-Fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2,3-diol a směs 3-methoxy-7-fenyl-8-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu a 3-methoxy-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu

Roztok 2 g (0,0044 mol) l-(2-[4-(6,7-dimethoxy-2-fenyl-1,2,3,4-tetrahydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 80 ml kyseliny octové a 80 ml 48% vodné kyseliny bromovodíkové se pod atmosférou dusíku 2 hodiny-zahřívá na 90C. Reakční směs se v ledové lázni ochladí na 0’C, načež se její pH přídavkem 30% vodného hydroxidu amonného upraví na 10. Vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy se vysuší a odpaří na 1,6 g surového produktu. Tento produkt se přečistí na 120 g silikagelu za použití směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 99 : 1, poté 99 : 5, poté 90 : 10 a poté 85 : 15. Získá se 520 mg směsi 3-methoxy-7-fenyl-8-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu a 3-methoxy-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu.

NMR (aceton-d₆) ppm: (1,05, m, 1H), (1,24, d, 1H), (1,76, bs, 5H), (2,20, m, 1H), (3,00, m, 4H), (3,31, d, 1H), (3,82, S, 3H), (4,05, t, 2H), (4,18, d, 1H), (6,34, m, 3H), (6,53, d, 2H), (6,78, S, 1H), (7,85, d, 2H), (7,15, m, 3H), (8,20, bs, 1H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 444 a poté 180 mg 6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2,3-diolu.

NMR (aceton-d₆) ppm: (1,65, m, 4H), (2,20, m, 1H), (2,50, m, 4H), (2,80, m, 4H), (2,95, m, 1H), (3,50, d, 1H), (3,95, t, 2H), (4,05, d, 1H), (6,33, m, 2H), (6,60, d, 2H) , (6,66, s, • ·

1H), (6,84, d, 2H), (7,10, m, 3H), (7,55, s, 2H) Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 430 Teplota tání 132 až 134°C

Schéma 2

Příklad 6

7-Hydroxy-6-methoxy-1-tetralon

Roztok 10 g (0,048 mol) 6,7-dimethoxy-l-tetralonu ve 100 ml kyseliny octové a 100 ml 48% vodné kyseliny bromovodíkové se 7 hodin zahřívá na 95 °C. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti a nalije do vody. Vodná směs se extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se vysuší a odpaří na 12 g surového produktu, který se přečistí na 1200 g silikagelu za použití 10% diethyletheru v dichlormethanu jako elučního činidla. Získá se 7,5 g produktu o teplotě tání 147 až 148°C (v literatuře uváděna teplota tání 148 až 152°C, Journal of Organic Chemistry, 33, 1968, str. 508).

NMR (CDClg) ppm; (2,09, m, 2H) , (2,58, m, 2H), (2,85, m,

2H), (3,90, s, 3H) , (5,50, bs, 1H), (6,64, s, 1H), (7,55, S, 1H)

Hmotnostní spektrum; (rodičovský+1): 193

Výchozí látka: 6,7-dimethoxy-l-tetralon (Aldrich, Milwaukee, WI, USA)

.. . P ř í- klad 7

7-Benzyloxy-6-methoxy-3,4-dihydro-2H-naftalen-l-on

Směs 4,5 g (0,0233 mol) 7-hydroxy-6-methoxy-l-tetralonu, 5,4 g (0,032 mol) benzylbromidu a 10 g (0,072 mol) uhličitanu draselného ve 150 ml acetonu se přes noc zahřívá ke zpětnému toku, poté ochladí a nalije do vody. Vodná směs se extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátové vrstva se vysuší síranem sodným a odpaří. Získá se 7 g surového produktu. Po vykrystalování z diethyletheru se získá 4,13 g produktu ve formě bílé pevné látky o teplotě tání 110 až 111’C.

NMR (CDClg) ppm: (2,09, m, 2H), (2,55, t, 2H), (2,87, t,

2H), (3,90, s, 3H), (5,14, s, 2H), (6,65, S, 1H), (7,25 7,45, m, 5H), (7,58, s, 1H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 283

Příklad 8

1-{2-[4-(7-Benzyloxy-6-methoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidin

Způsobem popsaným v příkladu 1 se z 5,13 g (0,0182 mol) 7-benzyloxy-6-methoxy-3,4-dihydro-2H-naftalen-l-onu, 13,63 ml 1,6M n-butyllithia v hexanu a 5,16 g (0,019 mol) l-(2-(4-bromfenoxy)ethyl)pyrrolidinu získá 3,5 g titulního produktu.

NMR (CDC1₃) ppm: (2,05, bs, 4H), (2,30, m, 2H), (2,74, t,

2H), (3,10 - 3,40, m, 6H), (3,90, s, 3H), (4,45, bs, 2H), (4,95, s, 2H), (5,90, t, 1H), (6,58, s, 1H), (6,74, s, 1H), (6,80, d, 2H), (7,10, d, 2H), (7,25, m, 5H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 456

Pří k 1 a d 9

1-{2-[4-(7-Benzyloxy-2-brom-6-methoxy-3,4-dihydronaftalen-1-yl)fenoxy]ethylJpyrrolidin

Způsobem popsaným v příkladu 2 se z 2,47 g (0,0054 mol) l-{2-[4-(7-benzyloxy-6-methoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethylIpyrrolidinu, 965 mg (0,0054 mol) N-bromsukcinamidu a 90 mg azodiisobutyronitrilu v 50 ml dimethylformamidu získá 2,37 g titulního produktu.

NMR (CDC1₃) ppm: (1,90, bs, 4H), (2,69, S, 4H) , (2,88, bs, 4H), (3,10, t, 2H), (3,83, t, 2H), (4,83, s, 2H) , (6,20, s, 1H), (6,65, s, 1H), (6,90, d, 2H)', (7,00, d, 2H) , (7,21, m, 5H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 536

Příklad 10

1-{2-[4-(7-Benzyloxy-6-methoxy-2-fenyl-3,4-dihydronaftalen-1-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidin

Způsobem popsaným v příkladu 3 se z 2,37 g (0,0044 mol) 1-{2-[4-(7-benzyloxy-2-brom-6-methoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 1,35 g (0,011 mol) fenyl44

boronové kyseliny, 153 mg (0,13 mol) tetrakis(trifenylfosfin)palladia a 1,88 g (0,017 mol) uhličitanu sodného v 50 ml ethanolu získá 1,38 g titulního produktu

NMR (CDC1₃) pprn: (1,83, bs, 4H), (2,70, m, 6H) , (2,86, m,

2H), (2,96, m, 2H), (3,90, s, 3H), (4,14, t, 2H) , (6,37, s,

1H) , (6,65 - 7,30, m, 15H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 532

Příklad 11

3-Methoxy-7-fenyl-5-[ 4- (2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol ’

Směs 1,38 g (0,0026 mol) l-{2-[4-(7-benzyl-6-methoxy -2-fenyl-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 1,46 g hydroxidu palladnatého na uhlíku, 4 ml 2M kyseliny chlorovodíkové, 15 ml vody a 100 ml ethanolu se 36 hodin při 50°C třepe v Parrově zařízení za tlaku vodíku 206 843 Pa. Reakční směs se přefiltruje, aby se odstranil katalyzátor a z filtrátu se odpaří ethanol. Hodnota pH se 1M hydroxidem sodným upraví na 8 a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se vysuší d odpaří.

Získá se 640 mg titulního produktu.

NMR (CDC1₃) ppm: (1,80, d, 1H), (1,95, bs, 4H), (2,10, m,

1H), (2,85 - 3,20, m, 7H), (3,30, d, 1H), (3,88, S, 3H), (4,14, t, 2H), (6,30, d, 2H) , (6,43, s, 1H) , (6,50, d, 2H) , (6,68, S, 1H), (6,80, m, 2H), (7,18, m, 3H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 444

2- OMe, 1-OH metabolit a 3-OH, 2-OMe metabolit je možno syntetizovat způsobem znázorněným ve schématech 4 a 5.

3- Methoxy-6-feny1tetrahydronaftalen-2-olový metabolit je možno syntetizovat způsobem znázorněným ve schématu 5

Schéma 3

Příklad 12

1-{2- [ 4=(5,6-Dimethoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethylIpyrrolidin

Způsobem popsaným v příkladu 1 se z 10 g (0,048 mol) 5,6-dimethoxytetralonu, 33,4 ml 1,6M n-butyllithia v hexanu a 13,5 g 1-(2-(4-bromfenoxy)ethyl)pyrrolidinu získá 6,5 g titulního produktu.

NMR (CDClg) ppm: (1,90, bs, 4H), (2,31, m, 2H) , (2,87, t, 2H), (2,90, bs, 4H) , (3,10, bs, 2H), (3,78, S, 3H) , (3,82, s, 3H), (4,28, brs, 2H), (5,90, s, 1H) , (6,63, d, 1H) , (6,70, d, 1H), (6,90, d, 2H), (7,22, d, 2H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 379,8 ····

Výchozí látka: 5,6-dimethoxytetralon (viz Organic Process Research & Development, 1999, 3, 71 až 72)

Příklad 13

1— < 2—[4-(2-Brom-5,6-dimethoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidin

Způsobem popsaným v příkladu 2 se z 5,33 g (0,14 mol) l-{2-[4-(5,6-dimethoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyljpyrrolidinu, 2,5 g (0,014 mol) N-bromsukcinamidu a 230 mg azodiisobutyronitrilu v 50 ml dimethylformamidu získá6,25 g titulního produktu.

NMR (CDC1₃) ppm: (1,96, bs, 4H), (2,90, m, 6H), (3,05, t,

2H), (3,15, t, 2H), (3,80, S, 6H), (4,30, t, 2H), (6,35, d,

1H), (6,53, d, 1H), (6,95, d, 2H), (7,10, d, 2H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 5458

Příklad 14

1-{2-[4-(5,6-Dimethoxy-2-fenyl-3,4-dihydronaftalen-1-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidin

Způsobem popsaným v příkladu 3 se z 6,25 g (0,0136 mol) 1— < 2—[4—(2-brom-5,6-dimethoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 4,16 g (0,034 mol) fenylboronové kyseliny, 472 mg (0,41 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)palladia a 5,78 g (0,054 mol) uhličitanu sodného ve 200 ml ethanolu získá 6,3 g titulního produktu

NMR (CDC1₃) 2H), (2,90, 2H), (6,53, 2H), (7,05, ppm: (1,80, bs, 4H), (2,65, bs, 4H) , t, 2H), (3,00, t, 2H), (3,83, s, 6H) d, 1H), (6,60, d, 1H), (6,74, d, 2H) m, 5H) (2,73, t, (4,08, t, (6,95, d,

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 456 • (·

Příklad 15

1-{2-[4-(5,6-Dimethoxy-2-fenyl-1,2,3,4-tetrahydronaftalen-1-y 1) fenoxy]ethyl}pyrro1idin

Způsobem popsaným v příkladu 4 se z 6,3 g (0,0138 mol) l-{2-[4-(5,6-dimethoxy-2-fenyl-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 7,7 g (0,055 mol) hydroxidu palladnatého na uhlíku, 5 ml 2M kyseliny chlorovodíkové a 10 ml vody ve 100 ml eethanolu získá 5,06 g titulního produktu. NMR (aceton-d₆) ppm: (1,95, bs, 4H), (2,70, m, 1H), 2,85, bs, 4H), (2,95, m, 1H) , (3,20, bs, 2H), (3,38, bs, 2H) , (3,78, s, 3H), (3,82 (s, 3H), (4,40, bs, 2H), (6,43, d, 1H) , (6,74, d, 1H), (6,85 - 7,15, m, 7H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+l): 458

Příklad 16

6-Fenyl-5-[4-(2-Pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaf talen-1 , 2-diol a směs 2-methoxy-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-1-olu a l-methoxy-6-methyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu

Způsobem popsaným v příkladu 5 se z 2,3 g (0,005 mol) 1-{2-[4-(5,6-dimethoxy-2-fenyl-1,2,3,4-tetrahydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 80 ml kyseliny octové a 80 ml 48% vodné kyseliny bromovodíkové získá 650 mg směsi 2-methoxy-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl] -5,6,7,8-tetrahydronaftalen-l-olu a l-methoxy-6-methyl-5[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu

NMR (CDC13)	ppm:	(1,88, bs,	6H)	, (2,10, m, 1H)	, (2,84, bs,
1H), (3,00,	bs,	2H), (3,25,	dt,	1H), (3,35, d,	2H), 3,85 (s,
3H), (4,10,	bs,	2H), (4,25,	d,	1H), (6,25 - 6,	88, m, 8H),

·· ···« ··· (·· • (· · (7,15, m, 3H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 444 a 140 mg 6-fenyí-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-l,2-diolu.

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 430

Schéma 4

OCH₂Ph OCH₂Ph

2-OMe, 6Ph, THN-l-ol

Příklad 17

5-hydroxy-6-methoxy-1-tetra1on

Způsobem popsaným v příkladu 6 se z 10 g (0,048 mol) 5,6-dimethoxy-l-tetralonu, 100 ml kyseliny octové a 100

.. » · · · · · • · <· « · ··· · · ř .

ϊ · · · * ·,..·· ·· ·* ml 48% vodné kyseliny bromovodíkové získá 7 g titulního produktu o teplotě tání 163°C.

NMR (CDC1₃) ppm: (2,09, m, 2H), (2,67, t, 2H), (2,90, t,

2H), (3,92, S, 3H), (5,70, bs , 1H), (6,80, d, 1H) , (7,68, d, 1H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 193

Výchozí látka: 5,6-dimethoxytetralon (viz Organic Process Research & Development, 1999, 3, 71 až 72)

P ř í k ladí 8

5-Benzyloxy-6-methoxy-3,4.-dihydro-2H-naf talen-l-on

Způsobem popsaným v příkladu 7 se z 4,5 g (0,024 mol) 5-hydroxy-6-methoxy-l-tetralonu, 5,4 g (0,031 mol) benzylbromidu a 10 g (0,072 mol) uhličitanu draselného ve 100 ml acetonu získá titulní produkt (5,13 g) ve formě bílé pevné látky o teplotě tání 90°C (po krystalizaci z diethyletheru) .

NMR (CDC1₃) ppm: (2,10, m, 2H), (2,55, t, 2H) , (2,88, t, 2H), (3,88, S, 3H), (5,11, S, 2H), (6,63, S, 1H) , (7,20 7,45, m, 5H), (7,60 s, 1H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 283

Příklad 19

1-{2-[4-(5-Benzyloxy-6-methoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrro1idin

Způsobem popsaným v příkladu 1 se z 10 g (0,3555 mol) 5-benzyloxy-6-methoxy-3,4-dihydro-2H-naftalen-l-onu, 9,88 g (0,366 mol) 1-(2-(4-bromfenoxy)ethyl)pyrrolidinu a 13,63 ml 1,6M n-butyllithia v hexanu získá 4,3 g titulního produktu.

NMR (CDC1₃) ppm: (1,90, bs, 4H) , (2,20, m, 2H), (2,78, t, 2H), (2,90, bs, 2H), (3,10, bs, 1H), (3,84, S, 3H) , (4,26, t, 2H), (4,98, S, 2H), (5,86, t, 1H), (6,65, d, 1H) , (6,74, d, H), (6,88, d, 2H), (7,25, d, 2H), (7,28 - 7,50, m, 5H)

Příklad 20

1-{2-[4-(5-Benzyloxy-2-brom-6-methoxy-3,4-dihydronaftalen-1-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidin

Způsobem popsaným v příkladu 2 se z 4,3 g (0,0094 mol) 1-{2-[4-(5-benzyloxy-6-methoxy-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 1,68 g (0,0094 mol) N-bromsukcinamidu a 156 mg azodiisobutyronitrilu v 50 ml dimethylformamidu získají 4 g titulního produktu.

NMR (CDC1₃) ppm: (1,95, bs, 4H), (2,75, t, 2H) , (2,90, t,

2H), (3,00, bs, 4H), (3,10, bs, 2H), (3,80, s, 3H) , (4,33,

S, 2H), (6,35, d, 1H), (6,57, d, 1H), (6,93, d, 2H) , (7,15 7,30 (m, 5H)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 536

Příklad 21

1-{2-[4-(5-Benzyloxy-6-methoxy-2-fenyl-3,4-dihydronaftalen-1-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidin

Způsobem popsaným v příkladu 3 se ze 4,0 g (0,0075 mol) 1-{2-[4-(5-benzyloxy-2-brom-6-methoxy-3,4-dihydronaftalen -1-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 2,28 g (0,186 mol) fenylboronové kyseliny, 259 mg (0,224 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)palladia, 3,7 g (0,03 mol) uhličitanu sodného ve 150 ml ethanolu získá 3,2 g titulního produktu.

NMR (CDC13) 4H), (2,95,	ppm: (1 m, 4H),	,84, bs, 4H), 2,83 (m,	2H), (2,74, m,
(3,84,	S, 3H),	(4,10,	t,	2H) ,	(5,03, s,
2H), (6,55,	d, 1H),	(6,65,	d, 1H),	(6,75,	d,	2H) ,	(6,90 -

.·· ·>· · .· ··

7,50, m, 12Η)

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 532

Příklad 22

2-Methoxy-6-feny1-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-l-ol

Způsobem popsaným v příkladu 11 se z 3,2 g (0,007 mol) l-{2—[4-(5-benzyloxy-6-methoxy-2-fenyl-3,4-dihydronaftalen-l-yl)fenoxy]ethyl}pyrrolidinu, 3,4 g hydroxidu palladnatého na uhlíku , ,10 ml 2M kyseliny chlorovodíkové, 30 ml vody a 100 ml ethanolu získá 2,2 g produktu.

Hmotnostní spektrum: (rodičovský+1): 444 l-Methoxy-6-fenyltetrahydronaftalen-2-olový metabolit je možno syntetizovat způsobem znázorněným ve schématu

Claims (6)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Metabolit (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu zvolený ze souboru sestávajícího ze sloučenin vzorce a jejich stereoisomerů, tautomerů, regioisomerů a konfiguračních isomerů; a jejich farmaceuticky vhodných solí.

2. Sloučeniny podle nároku 1 pro použití pro léčení choroby zvolené ze souboru sestávajícího z osteoporosy, rakoviny prsu, hyperlipidemie, atherosklerosy, Alzheimerovy choroby, katarakty, ztráty libida, sexuálních dysfunkcí u samců, rakoviny tlustého střeva, kožních vrásek, autoimunitních chorob, alopecie, akné, kardiovaskulárních chorob, katarakty, diabetes, endometriosy, sexuálních dysfunkcí u samic, hyperglykémie, obezity, obsedantně kompulzivní poruchy, premenstruačního syndromu, karcinomu prostaty, ·· ···· benigní hyperplasie prostaty, pulmonární hypertenze, reperfuzního poškození, reumatoidní artritidy, osteoartritidy, seborey, senilní gynekomastie, deficience testosteronu a stavů responzivních na zvýšení testosteronu, Turnérova syndromu, fibrózy dělohy, atrofické vaginitidy, inkontinence, rakoviny dělohy, hirsutismu, bulimie, anorexie, hypoaktivní sexuální touhy, poruchy sexuální vzrušivosti, dyspareunie, prolapsu, infekcí močových cest, mrtvice, infarktu myokardu, akutního nebo chronického selhání ledvin, okluzní choroby periferních artérií Raynaudova fenoménu, rakoviny vaječníků, jater, slinivky a desmoidní rakoviny, gliomu a karcinomu renálních buněk nebo pro podporu hojení ran, zvyšování frekvence orgasmu nebo snižování vaginálního pH.

3. Použití metabolitů (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu obecného vzorce I

R^ představuje skupinu vzorce ó' ' cV nebo -NH(CH₂)₃COR₆;

představuje vodík nebo CH₃;

R₂, R₃, R₄ a R₇, které jsou stejné nebo různé, jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z vodíku a 0R₅; a

Rg představuje skupinu -OH nebo -NHCH₂COOH, přičemž;

I

a) pokud Rj představuje skupinu vzorce nebo -NH(CH₂)₃COOH a

b) R₂ představuje skupinu OH nebo OCH₃ a R₃ a R₇ představuj i -vodík, nebo pokud R-^ má význam uvedený v odstavci a) a

c) R₂ a Ry představují vodík a R₃ představuje skupinu OH nebo OCH₃, potom R₄ nepředstavuje vodík;

a jejich optických isomerů, stereoisomerů, regioisomerů nebo konfiguračních nebo geometrických isomerů nebo tautomerů, nebo jejich farmaceuticky vhodných solí pro výrobu léčiva pro léčení chorob zvolených ze souboru sestávajícího z osteoporosy, rakoviny prsu, hyperlipidemie, atherosklerosy, Alzheimerovy choroby, katarakty, ztráty libida, sexuálních dysfunkcí u samců, rakoviny tlustého střeva, kožních vrásek, autoimunitních chorob, alopecie, akné, kardiovaskulárních chorob, katarakty, diabetes, endometriosy, sexuálních dysfunkcí u samic, hyperglykémie, obezity, obsedantně kompulzivní poruchy, premenstruačního syndromu, karcinomu prostaty, benigní hyperplasie prostaty, pulmonární hypertenze, reperfuzního poškození, reumatoidní artritidy, osteoartritidy, seborey, senilní gynekomastie, deficience testosteronu a stavů responzivních na zvýšení • · · · ’· · testosteronu, Turnérova syndromu, fibrózy dělohy, atrofické vaginitidy, inkontinence, rakoviny dělohy, hirsutismu, bulimie, anorexie, hypoaktivní sexuální touhy, poruchy sexuální vzrušivosti, dyspareunie, prolapsu, infekcí močových cest, mrtvice, infarktu myokardu, akutního nebo chronického selhání ledvin, okluzní choroby periferních artérií Raynaudova fenoménu, rakoviny vaječníků, jater, slinivky a desmoidní rakoviny, gliomu a karcinomu renálních buněk nebo pro podporu hojení ran, zvyšování frekvence orgasmu nebo snižování vaginálního pH.

4. Použití podle nároku 2, kde metabolitem je sloučenina zvolená ze souboru sestávajícího ze sloučenin vzorce . · · a jejich stereoisomerů, tautomerů, regioisomerů a konfiguračních isomerů, a jejich farmaceuticky vhodných solí.

5. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se tím, že obsahuje metabolit (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu obecného vzorce I (I) nebo -NH(CH₂)₃COR₆;

R₅ představuje vodík nebo CH₃;

R₂, Rg, R₄ a R₇, které jsou stejné nebo různé, jsou zvoleny ze souboru sestávajícího z vodíku a 0R₅; a

R₆ představuje skupinu -OH nebo -NHCH₂COOH, přičemž:

a) pokud R-^ představuje skupinu vzorce nebo -NH(CH₂)₃COOH a

b) R₂ představuje skupinu OH nebo OCH₃ a R₃ a R_? představují vodík, nebo pokud R·^ má význam uvedený v odstavci a) a

c) R₂ a R₇ představují vodík a Rg představuje skupinu OH nebo OCHg, potom R₄ nepředstavuje vodík;

nebo jeho optický isomer, stereoisomer, regioisomer nebo konfigurační nebo geometrický isomer nebo tautomer, nebo jeho farmaceuticky vhodnou sůl a farmaceuticky vhodný nosič, vehikulum nebo ředidlo.

6. Farmaceutická kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že obsahuje metabolit (-)-cis-6-fenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-l-ylethoxy)fenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu zvolený ze souboru sestávajícího ze sloučenin vzorce