[go: up one dir, main page]

CZ20014582A3 - Vysoce výkonný testovací systém - Google Patents

Vysoce výkonný testovací systém Download PDF

Info

Publication number
CZ20014582A3
CZ20014582A3 CZ20014582A CZ20014582A CZ20014582A3 CZ 20014582 A3 CZ20014582 A3 CZ 20014582A3 CZ 20014582 A CZ20014582 A CZ 20014582A CZ 20014582 A CZ20014582 A CZ 20014582A CZ 20014582 A3 CZ20014582 A3 CZ 20014582A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
specific
target
detection
protecting
sample
Prior art date
Application number
CZ20014582A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ301618B6 (cs
Inventor
Richard M. Kris
Stephen Felder
Original Assignee
Richard M. Kris
Stephen Felder
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richard M. Kris, Stephen Felder filed Critical Richard M. Kris
Publication of CZ20014582A3 publication Critical patent/CZ20014582A3/cs
Publication of CZ301618B6 publication Critical patent/CZ301618B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B01J2219/00315—Microtiter plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00547—Bar codes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596—Solid-phase processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00608—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617—Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00641—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being continuous, e.g. porous oxide substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00644—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being present in discrete locations, e.g. gel pads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B01J2219/00662—Two-dimensional arrays within two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká kompozic, zařízení a způsobů pro současné provádění více biologických nebo chemických testů, s použitím opakujících se skupin testů. Pro tento účel se používá určitý počet oblastí s navázanými definovanými skupinami kotevních generických molekul.
Dosavadní stav techniky
Tato přihláška je částečně pokračovací přihlášky US 09/218 166, která má datum podání 22.12.98, a která se tímto formou odkazu začleňuje do popisu v celém rozsahu. Tato přihláška požívá prioritu prozatímní přihlášky 60/068 291, podané 19.12.97 a přihlášky US 09/109 076, podané 02.07.98, které se taktéž obě začleňují do popisu formou odkazu.
Vynález se týká například kompozic, přístrojů a způsobů použitelných pro současné provádění většího množství biologických nebo chemických testů, který využívá skupin zkoušek. Při tom se využívá řada oblastí, z nichž každá obsahuje skupinu generických kotevních molekul. Tyto kotvy jsou spojeny s bífunkčnímí línkerovýmí molekulami, z nichž každá obsahuje část, která je specifická pro alespoň jednu kotvu a část, která je sondou, specifickou pro předmět zájmu. Výsledná řada sond se používá k analýze přítomnosti jedné nebo více cílových molekul, které interagují specificky s uvedenými sondami. Vynález se týká polí obsahujících řadu různých oblastí, které se od sebe liší povahou interakce molekul, mezi které patří, kromě jiných, hledání farmaceutických účinných látek, molekulární biologie, biochemie, farmakologie a diagnostická technologie v medicíně.
• · « · • · · «
Řada molekulárních sond uspořádaná na povrchu neboli „čipů“ je již používána při různých druzích biologických a chemických testů. Testy se provádějí za účelem stanovení nebo zjištění přítomnosti cílových molekul, o které je zájem a které interagují se sondami. Po té co se sondy vystaví působení cílových molekul za zvolených testovacích podmínek, detekční zařízení zjišťuje, zda cílová molekula ínteragovala s danou sondou.
Tyto systémy jsou užitečné při řadě screeningových metod pro získání informace o sondách nebo o cílových molekulách. Tak např. byly použity pro hledání peptidů potenciálních léčiv, která se váží k receptorů, o který je zájem, mezi jiným; pomocí těchto metod byly tes-továny vzorky např. na přítomnost genetických mutací, variant allel v populaci nebo na určitý patogen nebo na určitý kmen určitých patogenů, a pro mnohé další účely; dále ke studiu genové exprese, např. k identifikaci mRNA, jejichž exprese koreluje s některými fyziologickými stavy, vývojovými stavy nebo pokročilostí nemoci a tak pod.
Podstata vynálezu
Tento vynález řeší kompozice, přístroje a způsoby pro současné provádění většího počtu biologických nebo chemických testů a umožňuje rychlé provedení analýzy velkého počtu vzorků — např. vzorků od řady pacientů, pokud se má jednat o screeníngové testy, jejichž cílem je diagnóza, nebo pro testování řady potenciálních léčiv nebo terapeutických přísad a činidel, která se mají testovat při způsobu hledání léku. Je vyřešena také kombinace, která je vhodná pro detekci jednoho nebo více cílů ve vzorku. Tato kombinace zahrnuje povrch, který je tvořen řadou navzájem oddělených oblastí, které se mohou nazvat testovacími oblastmi, při čemž tyto oblasti jsou např. vytvořeny jako jamky, přičemž alespoň dvě z nich jsou v podstatě identické.
• ·
Každý povrch zahrnuje alespoň dvě, výhodně alespoň dvacet nebo více, např. alespoň asi 25, 50, 96, 864 nebo 1536 atd., v podstatě identických oblastí. Každá testovací oblast definuje prostor pro zavedení vzorku obsahujícího (nebo potenciálně obsahujícího) jeden nebo více cílů a obsahuje skupinu biologických nebo chemických testů. (Věty jako je „vzorek obsahující cíl“ nebo „detekovat cíl ve vzorku“ nejsou míněny tak, že by mezí tyto Činnosti nepatřily případy, kdy vzorek nebo stanovení (pokus o stanovení) nevedlo ke zjištění cílů nebo nebyl cíl detekován. V obecném smyslu, tento vynález zahrnuje matice, které slouží ke stanovení, zda cíl je obsažen ve vzorku nebo zda není obsažen ve vzorku.). Takováto matice zahrnuje generické „kotvy“, z nichž každá je spojena s bifunkční molekulou Iinkeru, která obsahuje první část specifickou pro kotvu a druhou část, která obsahuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden cíl nebo více cílů. Kombinace podle tohoto vynálezu se uvede do kontaktu se vzorkem obsahujícím jeden nebo více cílů, které po případě reagují s molekulou (molekulami) detektoru a poté se pomocí detekčního zařízení stanovuje jaké reakce mezi cílovými molekulami a sondami proběhly v testovacích oblastech, přičemž se získá alespoň jeden výsledek nebo více výsledků testu.
Vynález řeší způsoby a kompozice, které jsou zejména vhodné pro vysoce výkonné biologické testováni. V provedeních, která jsou zejména výhodná, se dá vynález používat pro vysoce výkonný screening pro hledání léčiv. Tak např. vysoce výkonný test se dá provést v mnoha (např. 100) 96 jamkových míkrodestičkách najednou. Každá jamka na destičce může obsahovat např. 36 různých testů provedených pomocí matice zhruba 36 kotev a Iinkerových párů. To znamená, 100 destiček, 96 jamek na destičku a každá jamka 36 testů, takže je možné dosáhnout celkového počtu 345 000 testů; např. každý z 9 600 různých kandidátů na léčivo se může testovat současně z hlediska 36 různých parametrů testu. Vysoce výkonný testovací
- 4 • · · · systém poskytuje mnohem více informací o každé látce, která je kandidátem na léčivo než při jednotlivých testech, kdy se zjišťuje pouze jediný parametr. Tak např. je možno při jednom zahajovacím vysoce výkonném screeningovém testu stanovit, zda uvedené navržené léčivo je selektivní, specifické a/nebo netoxické. Nevysoce účinné metody stanovení vyžadují extenzívní následné testování, pomocí kterého se zjišťují parametry pro každou látku, která je předmětem zájmu a která je kandidátem na léčivo v daném případě. Několik typů vysoce výkonných screeningových testů je popsáno např. v příkladech 15 - 17. Schopnost provést simultánně širokou řadu biologických testů a dosáhnout mnoha testů najednou (tj. při velmi vysokém počtu testů a velké rychlosti) představuje dvě důležité výhody vynálezu.
V jednom provedení se např. pomocí 96 jamkových DNA nosných destiček (Corning Costar) vyrobených z polystyrenu s povrchem chemicky upraveným pro navazování primárních aminů, jako jsou např. aminokyseliny nebo modifikované oligonukleotidy, je soubor 36 různých oligonukleotidů nanesen na povrch každé jamky každé desky, která má sloužit jako kotva. Tyto kotvy se pak mohou kovalentně napojit na chemicky upravený polystyren, přičemž stejných 36 kotev se dá použít pro veškeré screeníngové testy. Pro jeden konkrétní test je dán soubor íínkerů, který se dá použít k naprogramování povrchu každé jamky, aby byl specifický pro až 36 různých cílů nebo typů, které jsou předmětem zájmu testu. Pří tom se dá na každou z 96 jamek na každé destičce působit jiným vzorkem. Stejný soubor kotev se dá použít vícekrát a dá se přeprogramovat povrch každé jamky pro jiné cíle a jiné testy, které jsou předmětem zájmu nebo se dá použít několikrát se stejným souborem linkerů. Tato flexibilita a opakovatelná použitelnost představuje další výhody tohoto vynálezu.
• · · · · · · ···· · · · · « » ··«· ··· · • · ·· ·· ···· · · ····
Jedno provedení vynálezu představuje kombinace použitelná pro detekci jednoho nebo více cílů ve vzorku, přičemž toto provedení zahrnuje, před přidáním uvedeného vzorku,
a) povrch, obsahující řadu vzájemně oddělených oblastí, přičemž alespoň dvě z těchto oblastí jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast obsahuje
b) alespoň osm odlišných oligonukletidových kotev, z nichž každá je spojena s
c) bifunkčním linkerem, který má první část specifickou pro uvedenou oligonukleotidovou kotvu a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro uvedený cíl nebo pro uvedené cíle.
Jiným provedením podle vynálezu je kombinace použitelná pro detekci jednoho nebo více cílů ve vzorku, která zahrnuje, před přidáním uvedeného vzorku,
a) povrch, obsahující řadu navzájem oddělených oblastí, z nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast obsahuje
b) alespoň osm různých kotev, z nichž každá je spojena s
c) bifunkčním iinkerem, který má první část specifickou pro kotvu a druhou část, která obsahuje sondu, která je specifická pro uvedený cíl nebo cíle.
Podle dalšího provedení vynález řeší způsob detekce alespoň jednoho cíle, při kterém se uvádí do kontaktu vzorek, který obsahuje cíl nebo cíle s kombinací, která je popsaná shora, za
- 6 • · · · · · · · • · « · ·· ···· podmínek efektivních pro navázání uvedeného cíle nebo cílů na uvedenou kombinaci. Podle jiného provedení se řeší způsob stanovení exprimovaného vzorce RNA, při kterém se inkubuje vzorek, který obsahuje jako cíl nebo jako cíle alespoň dvě molekuly RNA s kombinací popsanou shora, přičemž alespoň jednou sondou v této kombinaci je nukleová kyselina (např. oligonukleotíd), který je specifický (tj. selektivní) pro alespoň jeden nebo více RNA cílů, za podmínek, které jsou efektivní pro specifickou hybridizací RNA cíle (cílů) se sondou (sondami). Další provedením je způsob pro identifikaci činidel (nebo podmínky (podmínek)), které modulují exprimovaný vzorec RNA, přičemž tento způsob je stejný jako způsob popsaný shora pro stanovení exprimovaného vzorce RNA, a dále zahrnuje srovnávání exprimovaného vzorce RNA, který je produkován za přítomnosti uvedeného činidla (nebo za podmínky nebo za podmínek) s exprimovaným vzorcem RNA produkovaným při jiných podmínkách.
Pomocí příkladu, obr. 1 a 2, jsou ilustrovány kombinace podle vynálezu a způsoby jejich použití k detekci mRNA cíle. Povrch vytvořený podle vynálezu, znázorněný na obr.2, obsahuje 15 identických testovacích oblastí; pří výhodném provedení podle vynálezu je každá z těchto testovacích oblastí vytvořena v jedné jamce míkrotítrové destičky. Každá z testovacích oblastí obsahuje šest různých kotev, zde označených jako Čísla 1 - 6. Obrázek 1 schematicky znázorňuje jednu z takovýchto kotev, kotvu 1, která je ve většině provedení podle vynálezu tvořena oligonukleotidem. Ke kotvě 1 je navázána molekula línkeru, v tomto případě linker 1, který zahrnuje dvě části. První část, která je specifická pro kotvu, je na tomto obrázku oligonukleotíd, který se může hybridizovat specificky vůči kotvě. Druhou částí, kterou je sonda specifická pro cíl zájmu - zde, cílová mRNA 1 - je na tomto obrázku znázorněna jako oligonukleotíd, který je hybridizovatelný s tímto cílem. Na tomto obrázku není • · · « a··· ··· · · · ·· ·· ·· ···· ·· ···· znázorněno, že každá ze zbývajících pěti kotev se může hybridizovat se svým vlastním linkerem přes část specifickou pro kotvu; každý linker může obsahovat část, která je tvořena sondou, specifickou pro např. mRNA odlišnou od (nebo stejnou jako) mRNA 1. Tato znázorněná ✓
kombinace se dá použít k testování až 15 různých vzorků současně na přítomnost mRNA 1 (nebo simultánně, pro mRNA cíle, které jsou specifické (programované) dalšími pěti sondami testu). Pří provádění testu se každý vzorek, který je v tomto případě vzorek RNA extraktu z, řekněme, jedné z 15 nezávislých buněčných linií, přidá v malém množství k jedné z oblastí nebo do jedné z jamek, a inkubuje se za podmínek, které jsou efektivní pro hybridizaci sondy a cíle. Za účelem stanovení, zda mRNA 1 je ve vzorku přítomna, se pomocí zařízení rozpozná, zda došlo nebo nedošlo k interakci specifické pro dané místo v každé oblasti tak, že se zjišťuje, zda je přítomen nebo není přítomen určitý signál. Pokud se buněčné linie inkubují za podmínek, ve kterých jejich mRNA jsou značeny in vivo pomocí určité značky a jestliže je ve vzorku přítomna mRNA 1, detektor zjistí signál vycházející ze značené mRNA na místě definovaném souborem kotva/ komplex sond 1. Alternativně může být mRNA přímo značena in vitro, což se děje před nebo po jejím přidáním k oblastem (k jamkám). Alternativně, jak je znázorněno na obr. 1, může být mRNA značena nepřímo před nebo po hybridizaci sondou, tj. inkubací RNA se značeným „detektorem“, což je oligonukleotid (cílově specifický oligonukleotid), který je komplementární k sekvencí jiné, než která má být rozpoznávána danou sondou. Ve znázorněném případě, je možné analyzovat současně až 15 vzorků. Vzhledem k tomu, že současně lze podle vynálezu analyzovat minimálně 20 nebo více např. až 1536 nebo více vzorků, jedná se o velice výkonný systém.
Termín „cíl“, jak je zde používán, znamená látku, jejichž přítomnost, aktivita a/nebo množství je potřeba zjistit, a která má afinitu pro danou sondu. Cíle se mohou vyrábět uměle nebo to mohou
- 8 • · být látky vyskytující se v přírodě. Také lze je použít jejich nezměněný stav nebo lze tyto cíle sledovat ve formě agregátu s jinými druhy. Cíle se dají navazovat, kovalentně nebo nekovalentně, na vazné členy, což lze činit přímo nebo přes specifické vázací látky. Příklady cílů, které se mohou používat pří tomto vynálezu, jsou mimo jiné, receptory (na vehíkula, tuky, buněčné membrány nebo různé jiné receptory); ligandy, agonísté nebo antagonisté, které jsou vázány na specifické receptory; polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a antiséra reagující se specifickými antigenovýmí determinanty (jako jsou specifická na víry, buňky nebo jiné materiály); léčiva; nukleové kyseliny nebo polynukleotidy (včetně mRNA, tRNA, rRNA, oligonukleotidů, DNA, virové RNA nebo DNA, ESTŮ, cDNA, PCR-zesílených produktů odvozených od RNA nebo DNA a mutací, variant nebo modifikací uvedených látek); proteiny (včetně enzymů jako jsou enzymy způsobující štěpení neurotransmitérů, proteázy, kinázy a pod.); nosiče enzymů; peptidy; kofaktory; lektiny; cukry; polysacharidy; buňky; buněčné membrány; organely; atd. A stejně tak může jít o molekuly nebo jiné látky, které mohou existovat komplexní, kovalentně vázané zesíťované nebo další jiné formě. Zde se používají termíny nukleová kyselina, polynukleotid, polynukleová kyselina a oligonukletid, což jsou termíny vzájemně zaměnitelné. Cíle se také dají označovat jako antí-sondy.
Výraz „sonda“, který je zde používán, je látka, např. molekula, která může být specificky rozpoznána určitým cílem. Typy potencionálních dvojíc sonda/cíl nebo cíl/sonda s navázanými dalšími částmi zahrnují také dvojice receptor/ligand; ligand/antilígand; interakce nukleových kyselin (polynukleotidů) mezi které patří DNA/DNA, DNA/RNA, PNA (peptidová nukleová kyselina)/nukleová kyselina; enzymy nebo jiné katalyzátory nebo jiné látky, se substráty, malými molekulami nebo efektorovými molekulami; atd. Příklady sond, které jsou např. uvažovány pro použití podle tohoto vynálezu, mimo • · · · ···· ·· ···· jiné, jsou organické nebo anorganické materiály nebo polymery, včetně kovů. chelatačních činidel nebo jiných sloučenin, které interagují specificky s kovy, plasty, agonisty a antagonisty pro buněčné membrány a jejich receptory, toxiny a venomy, virální epitopy, hormony (např. opíoídní peptidy, steroidy, atd.), receptory hormonů, lipidy (včetně fosfolipidů), peptidy, enzymy (jako jsou proteázy nebo kinázy), nosiče enzymů, kofaktory, léčiva, lektíny, cukry, nukleové kyseliny (včetně olígonukletidů, DNA, RNA, PNA nebo modifikované nebo substituované nukleové kyseliny), oligosacharidy, proteiny, enzymy, polyklonální a monoklonální látky, protilátky s jedním řetězcem nebo fragmenty uvedených látek. Polymerní sondy mohou být lineární nebo cyklické. Sondy mohou rozlišovat mezi fosforylovanými a nefosforylovanými proteiny, bud’ zdánlivou nebo skutečně odlišnou aktivitou nebo odlišným způsobem bandy. Sondy jako jsou lektiny mohou rozlišovat mezi glykosylovanými proteiny. Výrazy nukleová kyselina, polynukleotid, polynukleová kyselina a oligonukleotid jsou zde, jak jsou používány, zaměnitelné. Jakákoliv látka pospaná shora jako „sonda“ může sloužit také jako „cíl“ a naopak.
Podle vynálezu lze použít jakékoliv kompatibilní povrchy. Povrch (obvykle pevný) může být jakoukoliv varietou organických nebo anorganických materiálů nebo jejích kombinacemi, včetně např. formou příkladu, plastů jako jsou polypropylen nebo polystyren; keramiky; křemíku; (napojeného) oxidu křemičitého, křemene nebo skla, přičemž tyto povrchy mohou mít tloušťku např. mikroskopické skleněné folie nebo skleněného povlaku; papír jako např, filtrační papír; diazotovaná celulóza; nitrocelulózové filtry; silonové membrány; gelové vrstvy polyakrylamidového či jiného typu, například lehčené bublinkové fólie nebo Iehčené perličky, vyrobené z aerogelu, který je například ve formě vysoce porézní pevné látky, včetně filmů, které se připravují sušením vlhkého gelu jakýmkoliv známým způsobem. Substráty, které jsou průhledné, jsou vhodné pro provádění
- 10 testů, jejichž součástí je optická detekce. Ve výhodném provedení jsou plastové povrchy vícejamkové, např. se může jednat o tkáňové kultury tvořící kotouče, např. může jít o 24-, 96-, 256-, 384-, 864-, nebo 1536jamkové desky (např. může jít o upravené desky jako je Corning Costar DNA deska). Kotvy mohou být připojeny, např. vazbou, přímo na povrch nebo mohou být spojeny s jedním typem povrchu např. se sklem nebo mohou být umístěny do kontaktu s druhým povrchem např. uvnitř plastové „jamky“ na mikrotítrovou plošku . Tvar povrchu není kritický. Podle vynálezu se dá celý povrch vytvořit jako čtverec, obdélník nebo kruh nebo může být trojrozměrný, například může jít o částice lože, precipitáty, sraženiny, trubky, kuličky a pod.
Tak např. při výhodném provedení mohou být oblastmi jamky nebo jejich soubory umístěné na kotoučích, např. 24-, 96-, 256-, 384-, 864- nebo 1536- jamkové desky. Alternativně může jít o skleněné povrchy, které mohou být děleny takže mají např. 864 nebo 1536 oddělených jamek. Alternativně mohou tyto povrchy obsahovat oblasti, které nejsou nijak od sebe odděleny, nebo může jít o jamky. V takovém případě také může být povrch hladký, např. může jít o plastový kousek, sklo nebo papír a jednotlivé oblasti se mohou dále oddělit od sebe materiálem, který se nanese na tento povrch (např. plastový nebo skleněný materiál). Tento nanesený materiál potom odděluje od sebe jednotlivé oblasti. Povrch může také jíž být předem opatřen mřížkou nebo kotvami, nebo mohou být kotvy jíž napojeny na línkery před tím, než se jednotlivé oblasti od sebe oddělí. V jiném provedení mohou být mřížky kotev uvnitř každého regionu vytvořeny vzájemným oddělením prázdnými prostory na povrchu, přičemž v těchto oddělovacích prostorech nejsou žádné kotvy nebo může jít o oddělení chemickými bariérami jako je vosk nebo silikonové plasty, čímž se zabrání rozšiřování nanášených kapek. Podle dalšího provedení jsou oblasti definované jako trubičky nebo kanálky, kterými může protékat regulovaně tekutina, např. mohou být vytvořeny takto oblasti pro test
-11prováděný při průtoku tekutiny, jak je popsáno např. v publikaci Beattie et al (1995). Clin. Chem. 4, 700-706. Trubičky mohou mít libovolnou velikost, například mohou mít průměr jako kapiláry nebo větší, mohou umožňovat průtok kapalin nebo mohou být parciálně nebo úplně ucpány gelem, například agarózovým nebo polyakrylamídovým, kterým mohou být sloučeniny transportovány (mohou procházet, protékat nebo se mohou skrz něj Čerpat) například elektroforetícky. Ve výhodném provedení je trubice naplněna gelem a tento gel je aktivován, takže je schopen navazovat kotvy. Různé kotvy se nechají procházet gelem postupně, což umožňuje vytvoření lineárního uspořádání (matice) kotev uvnitř gelu. Linkery, cíle atd. se nechávají procházet gelem postupně. Oblasti uvnitř povrchu, nebo na povrchu a pod. se také mohou od sebe oddělit modifikací povrchu jako takového. Tak např. plastový povrch může obsahovat části vytvořené z modifikovaného nebo chemicky upraveného plastu, který může sloužit např. jako místa pro adici specifických typů polymerů (např. PEG se může připojit na polystyrénový povrch a pak chemicky upravit karboxylovými nebo aminovými skupinami, dvojnými vazbami, aldehydy a pod.). Alternativně může plastový materiál zahrnovat roztavené struktury jako např. vystupující výčnělky, které mohou sloužit jako základny pro navázání kotev. V jiném provedení mohou být oblasti tvořeny gelovýmí vrstvami, například polyakrylamidovýmí gelovýmí fóliemi nebo lehčenýmí fóliemi, které jsou na povrchu, například skleněném, uspořádány do požadované matice, nebo jsou vrstveny mezi dvěma povrchy, například mezi skleněnou a křemennou destičkou. Kotvy, linkery a podobně mohou být imobilizovány na povrchu těchto podložek nebo mohou být navázány uvnitř. Řada takovýchto uspořádání je odborníkům v oboru zřejmá a mnoho se jich dá získat rutinním způsobem, známými metodami. Relativní orientace testovacích regionů může mít řadu forem včetně, kromě jiných, paralelních nebo kolmých mřížek uvnitř čtverce nebo obdélníku nebo
- 12 ···· ··· · · » ·· ·· ·· ···· ·· ···· jiného tvaru, může jít o přímo prodloužené mřížky uvnitř kruhového nebo jiného povrchu nebo o lineární mřížky a tak pod.
Prostorově oddělené oblasti podle vynálezu jsou přítomny ve více kopiích. To znamená, že jsou přítomny alespoň dvě, výhodně alespoň dvacet nebo alespoň 24, 50, 96, 256, 384, 864, 1536, 2025 nebo více a pod. v podstatě identických, prostorově oddělených (separovaných) oblastí. Vyšší počet opakovaní oblastí může umožnit přes vyšší průchodnost rychlost provádění testu. V podstatě identické oblasti, jak jsou zde používány, znamenají oblasti, které obsahují identické nebo v podstatě identické mřížky kotev a/nebo komplexy kotva/linker. Termín v podstatě identické, jak je zde používán, znamená, že mřížka oblasti je vytvořena tak, že slouží v podstatě pro stejnou funkci jako jiná mřížka nebo oblasti v kontextu analýzy cílových látek ve smyslu vynálezu. Odlišnosti, které v podstatě neovlivní funkci, to je schopnost detekovat cíle, jsou např. drobné nedokonalosti u malých nukleotidů (vynechání/přidání/substituce) nebo oligo- nepřesnosti (slabší schopnost povrchu vázat linkery) a tak pod., které v rámci přesnosti testu výrazně neovlivňují výsledky, kterými je stanovení cílové látky nebo funkce.
Pochopitelně odborník v oboru pozná, že všechny oblasti na povrchu nemusí být v podstatě identické. Např. pokud jsou testovány dva různé soubory matic současně, může být výhodné zahrnout oba soubory matic na jediný povrch. Tak např. dva různé soubory matic mohou být uspořádány v podobě střídajících se pruhů, čímž se docílí srovnání mezi nimi. V jiném provedení může v praxi nastat požadavek zahrnout do testu jednu nebo dvě nebo více oblastí, které mohou být detekovány odlišným způsobem z jiné oblasti na povrchu a tím mohou být použity jako „registrační region (regiony)“. Tak např. registrační region může obsahovat oligonukleotidy nebo peptidy, které vykazují odlišný způsob fluorescence molekul, který může být rozpoznán
- 13 skenovacím detekčním zařízením jako „výchozí bod“ pro nastavení daných míst oblastí na povrchu.
Velikost a fyzikální oddělování testovacích oblastí nejsou nijak limitovány. Typickými oblasti jsou plochy asi 1 - asi 700 mm2, výhodně 1 až 40 mm2 a jsou od sebe odděleny mezerami o síle 0,5 až 5 mm. Jejich tvar se volí podle možností dané plochy. Ve výhodném provedení je vzdálenost oblastí asi 5 mm. Tak např. každá oblast může obsahovat obdélníkový rošt, s např. 8 řadami a 6 sloupci zhruba kruhových míst s kotvami, přičemž tato místa mají průměr asi 100 mikrometrů a jsou od sebe vzdálená asi 500 mikrometrů; takovéto oblasti mohou pokrývat asi 20 mm povrchu plochy. Větší a menší oblasti a plochy a větší nebo menší vzdálenosti od sebe jsou ovšem pochopitelně také možné a jsou součástí vynálezu.
Oblasti se mohou dále dělit tak, že veškeré kotvy uvnitř oblasti nebo některé kotvy uvnitř oblasti jsou fyzicky od sebe odděleny způsobem jako je např. zářez nebo důlek. Tak např. počet podoblastí v oblasti může být 10 až asi 100 nebo více nebo méně. Podle jednoho provedení oblast, která je jamka s 1536 jamkovým kruhem se dá jemněji rozdělit na menší jamky, např. asi 4 až asi 900, výhodně asi 16 až 36 jamek, čímž se vytvoří matice jamek uvnitř jamky. Víz obrázek 4. Takovýto vroubkovaný povrch má nižší tolerancí, která je vyžadovaná pro fyzické umístění jedné kotvy (nebo skupiny kotev) na určité přesné místo (lokalitu) a velikost plochy obsahující kotvy je jednotnější, čímž se dociluje lepší detekce cílů, které se váží na sondu.
Termín „kotva“, jak je zde používán, znamená jakoukoliv entitu nebo látku, např. molekulu (nebo „skupinu“ v podstatě identických takovýchto látek (viz např. obrázek 7)), která je spojena s (např. imobilizována navázána kovalentně nebo nekovalentně) s povrchem nebo která je součástí takového povrchu (např. části
- 14 • · • · chemicky změněné, nalézající se na plastovém povrchu) a která může podstoupit specifickou interakci nebo asociaci s linkerem nebo jinou látkou, jak je zde popsáno. Termín kotva/komplex linkerň, jak je zde používán, připadá v úvahy tehdy, když kotva a linker se kombinují prostřednictvím molekulární asociace specifickým způsobem. Interakce s linkerem může být buď íreversíbílní, jako je taková, která probíhá přes určité kovalentní vazby, nebo reversíbilní, jako je hybridizace nukleové kyseliny. Ve výhodném provedení je kotvou nukleová kyselina, která může být jakkoli dlouhá (např. může jít o oleonukleotid) nebo může být libovolného typu (např. DNA, RNA, PNA nebo PCR produkt RNA nebo DNA molekuly). Nukleová kyselina se dá modifikovat nebo chemicky upravit (např. pokud obsahuje přírodně se vyskytující nukleotidy jako je např. inosin; připojené různými známými vlastními zbytky jako je sulfamát, sulfamid, fosforothionát, metylfosfonát, karbamát atd. nebo semisyntetické molekuly, jako je např. konjugát DNA-streptavidin atd.). Výhodné jsou nukleové kyseliny s jedním řetězcem. Kotvou může také být peptid nebo protein. Tak např. může jít o polyklonální nebo monoklonální protilátku molekulu nebo fragment této molekuly nebo této protilátky nebo o protilátku s jedním řetězcem nebo její fragment, která se váže specificky k částí linkeru, kterým je antigen nebo molekula protilátky; v jiné obměně může být kotvou peptid a část linkeru, která se váže k tomuto peptídu může být tvořena protilátkou nebo podobně. V dalším provedení může být kotvou lektin (jako je konkanavalin, a nebo aglutíníny z organizmu jako je Límulus, podzemníce olejná, fazol zlatý, fazol, obilné klíčky atd.), které jsou specifické zejména pro cukry. V dalším provedení může být kotvou organická molekula, jako je molekula modifikovaná nebo chemicky změněný plastový polymer, který může sloužit např. jako stadium specifické chemické syntézy oligonukleotidu v pevné fázi. V tomto případě se chemicky změněný plast distribuuje jako mřížka na diskrétních chemicky změněných místech, která jsou vytvořena integrálně do plastového povrchu
- 15 kombinace při procesu výroby. V jiném provedení může kotva mít výhodu specifické preferenční vazby mezi kovovými ionty, např. Ni, Zn, Ca, Mg atd. a určitými konkrétními proteiny nebo chelatačními činidly. Tak např. kotvou může být polyhistidin a částí specifickou pro kotvu, která představuje linker, může být nikl, který je napojen přes nikl přes chelatační činidlo na cílově specifickou sondu. Alternativně může být chelatační činidlo kotvou a polyhistidin může být Částí spojenou se sondou. Alternativně může být kotvou anorganická látka. Může to být např. kov jako je vápník nebo hořčík a částí linkeru, která je specifická pro kotvu může být vhodné chelatační činidlo jako je EDTA nebo EGTA, přičemž toto chelatační činidlo je připojeno k sondě, která je specifická pro určitý cíl. Odborník v oboru snadno rozpozná, že jako kotvy mohou být použity nejrůznější molekuly, kterých je velké množství a tyto obecné typy se také diskutují ve spojení s cíly a sondami.
Počet kotev v testovací oblasti může být nejméně 2, výhodně od asi 8 do asi 900 (méně nebo více je také možno), výhodnější je, aby jich bylo 8 až asi 300 a ještě výhodnější mezi 30 a asi 100 (např. asi 64). V některých výhodných provedeních je použito 16, 36, 45 nebo 100 kotev/testovací oblast pro povrch s 96 testovacími oblastmi (např. jamkami) nebo asi 9, 16 nebo 25 kotev/testovací oblast pro povrch s 384 testovacími oblastmi (např. jamkami). Ve většině provedeních má každá kotva v testovací oblastí oproti ostatním kotvám v mřížce odlišnou specífitu. Nicméně dvě nebo více kotev může pokrývat stejnou specifitu a veškeré kotvy také klidně mohou být identické. V jednom provedení, ve kterém je zahrnuta kombinace hodně velkého počtu testovacích oblastí (např. asi 864, 1536 nebo více) tak, že se zároveň provádí velký počet testů, může být zájem testovat takové vzorky, že se pro každý vzorek požaduje pouze velmi omezené množství parametrů (např. asi 2, 4, 6 nebo 9). Jinými slovy, pro
- 16 • · · · kombinace zahrnující hodně velké pocty oblastí, může být výhodné mít pouze 2 až 9 kotev na oblast.
Fyzikální oddělení a relativní orientace kotev v nebo na testovací oblastí nejsou omezeny. Obvykle je vzdálenost mezí kotvami asi 0,003 až asi 5 milimetrů nebo menší, výhodně mezí kotvami asi 0,003 až asi 5 milimetrů nebo menší, výhodně mezi asi 0,03 a asi 1. Vzdáleností mezí kotvami (a plochami) mohou být také vetší nebo menší. Kotvy mohou být uspořádány v libovolné orientaci jedna vůči druhé i vůči hranicím jednotlivých oblastí. Tak např. mohou být uspořádány v dvourozměrné orientaci, jako např. ve čtverci, obdélníku, šestiúhelníku nebo v jiném geometrickém tvaru, nebo v kruhovém tvaru, přičemž kotvy v takovém případě směřují od středu v radiálních liniích nebo v soustředných kruzích. Kotvy také mohou být uspořádány v jednorozměrném, lineárním tvaru. Tak např. oligonukleotidy se mohou hybridizovat ve specifických pozicích podél DNA nebo RNA sekvence, čímž tvoří supramolekulární uspořádání, nebo v lineárním uspořádání při průchodu gelem. Alternativně mohou být kotvy také uloženy v mřížkovité nebo žebříčkovité formaci. (Viz. obr. 6). Tak např. kotvy mohou být uloženy jako dlouhé rovnoběžné linie, které leží jedna vedle druhé. Vzdálenost mezí nimi nebo délka každé této linie mohou být různé podle nejíepší cesty k získání jednoduchého rozpoznatelného vzorce jako je žebříček, mřížka a pod., přičemž první a třetí linie může být dvakrát tak dlouhá jako zbytek, nebo může být jedna linie vypuštěná, atd. Jedna prázdná linie navíc se může umístit po poslední linii, aby se odlišila jedna testovací oblast a žebříčkovitý nebo mřížkovitý tvar se může opakovat v oblastech úspěšných testů.
V jednotlivých oddělených testovacích jamkách (testovacích oblastech) nebo v oddělených testovacích místech, nemusí být uspořádání kotev vždy ve stejné pozici. Výraz „testovací pozice“ je používán tak, že označuje místa, na kterých lze na povrchu provádět • · • · • · ·«
- 17 • · * ι· · »· · test, a na která se nanášejí testované vzorky. (Tyto pozice mohou být určeny možností umístění oddělených kapek testovaného vzorku nebo umístění jamek nebo pomocí jakýchkoliv oddělovacích prostředků, určujících jednotlivou testovací jamku nebo tvořících mnohojamkovou desku.) Uspořádání kotev samo o sobě např. žebříčkovítý nebo mřížkovitý tvar oíígonukleotidových kotev) se používá tehdy, kdy je třeba umístit každou jednotlivou kotvu na přesném místě do daného tvaru - např. jako je v případě, že jednotlivé linie jsou uspořádány žebříěkovitě a jednotlivá pozice je rozpoznávána vůči ostatním liniím svou polohou. Z tohoto důvodu první kotva nemusí být na první hraně jednoho rohu každé testovací pozice. První kotva se nalezne na základě rozpoznání rozložení, což je výhodnější než pokud se nalézá na základě pozice, kterou mají vzájemnou vůči sobě pro jednotlivá testovací místa. Vzhledem k tomu, že plocha využívaná každou testovací pozicí (např. plocha kapky nebo plocha jamky) je dostatečně velká, aby byla schopna obsahovat alespoň jednu celou jednotku opakovaných vzorů kotev, každý testovací bod testuje vzorek dodaný do jedné testovací pozice na všechny cíle, které jsou specifikovány (mřížkovítým nebo žebříěkovitým) uspořádáním, přičemž toto uspořádání leží uvnitř plochy testovací pozice.
Kotvy uvnitř každé testovací oblastí nemusí být umístěny v přesné nebo dokonce fixní pozici. Tak např. každá kotva může být připojena k částici, korálku nebo podobně, přičemž se předpokládá, že uvnitř testovací oblasti může být pozice náhodná. Umístění každé kotvy může být determinováno použitím např. detekovatelné jmenovky. Tak např. může být molekula linkeru specifická pro každý typ kotvy a může být značená různou fluorescenční, liminiscenění a podobnou značkou. Pozice částice, která obsahuje konkrétní dvojici linker/kotva se přitom může identifikovat povahou signálu, který vyzařuje linker, např. excitačním nebo emisním spektrem. Odborník v oboru může připravit řadu linkerů s množstvím různých takových připojených * ♦ »· *« · · « 9 » · 9 · » ** t » · · 9 >
- 18 ·· ·♦ « · ’ • » * · t c · « • · · ·· ·♦ „značek“, přičemž každá má odlišitelné spektrum. Alternativně mohou být kotvy značeny přímo. Tak např. každý typ kotvy může být značen značkou, která fluoreskuje různým spektrem, které se liší od značky jiných typů nebo kotev. Alternativně se mohou částice nebo perličky navzájem od sebe lišit velikostí nebo tvarem. Jakékoliv značení a detekční metody zde popsané se dají prakticky použít. Tak např. fluorescence se dá zjišťovat zobrazovacím systémem založeným na velké CCD, skenovacím fluorescenčním mikroskopem nebo řadičem buněk aktivovaným fluorescenčně (FACS).
Kotvy mohou interagovat nebo se mohou spojovat specificky s jednou Částí - s částí specifickou pro kotvu - s molekulou linkeru. Termínem „interagovat“ nebo „spojovat“ se zde míní, že dvě látky nebo sloučeniny (např. kotva nebo část linkeru specifická pro kotvu, testovací část a její cíl, nebo cíl a hlásič specifický pro cíl) jsou spojeny (např. navázány, svázány, hybridizovány, připojeny, nataveny, kovalentně navázány nebo jiným způsobem spojeny) jedna s druhou tak, že je to dostačují pro provedení zamýšlených testů. Termínem „specifický“ nebo „specificky“, se zde míní, že dvě složky (např. kotvy nebo oblasti linkeru specifické pro kotvu, testovací části a jejích cíle nebo cíl a cílově specifický hlásič) se váží selektivně jedna k druhé a v nepřítomnosti jakékoliv chránící techniky, ne obecně s jinými složkami, které nejsou určeny k navázání na předmětné komponenty. Vyžadované parametry k dosažení specifických interakcí se mohou zjistit rutinním způsobem, např. použitím běžných metod známých v oboru.
Pro nukleové kyseliny např. odborník v oboru může experimentálně stanovit znaky (jako je délka, složení hlavní části a stupeň komplementarity), které budou schopny nukleovou kyselinu (např. oligonukleotidovou kotvu) hybridizovat s jinou nukleovou kyselinou (např. částí linkeru specifickou pro kotvu) za podmínek • * · * • · « • · · • · · · • · ·
- 19 přesně zvolených tak, aby se minimalizovali nespecifické hybridizace s jinými látkami nebo molekulami (např. jiné oligonukleotidové linkery). Obvykle se DNA nebo jiná nukleokyselinová sekvence kotvy, části Iinkeru, nebo detekčního oligonukleotidů jeví dostatečnou komplementaritu, aby se její partner k navázání byl schopen hybrídízovat za selektivních přesných podmínek a Tm bude v oblastí 10° až 20° C nad pokojovou teplotou (např. asi 37°C). Obecně může mít oligonukleotidová kotva od asi 8 do asi 50 nukleotidů, výhodně asi 15, 20, 25 nebo 30 oligonukleotidů. Jak je zde používáno, „vysoce přesné hybridizační podmínky“ znamená, že jsou to jakékoliv podmínky, za kterých se projeví hybridizace, která se uskuteční alespoň v 95 %, výhodně v 97 až 100 %, nukleotidové komplementarity (identity) mezi dvěma nukleovými kyselinami. Nicméně v závislosti na požadovaném účelu, mohou být hybridizační podmínky voleny tak, že vyžadují menší komplementaritu, např. asi 90 %. 85 %, 75 %, 50 % atd. Mezi hybridizační reakční parametry, které mohou variovat patří koncentrace soli, pufru, pH, teplota, doba inkubace, množství a typ denaturačního prostředku, který je přítomen např. formamidu atd. (viz např. Sambrook at al.( 1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.) Vols. 1- 3, Cold Spring Harbor Press, New York; Hames et al. (1985). Nucleíc Acid Hybrídízatíon, IL Press; Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevír Sciences Publíshíng, Inc.,New York). Např. nukleová kyselina (např. linker oligonukleotidů) se může přidat do testovací oblasti (např. jamky vícejamkové destičky - ve výhodném provedení je to 96 nebo 384 nebo vícejamková destička) v objemu, který se pohybuje od 0,1 do asi 100 nebo více μΐ (ve výhodném provedení asi 1 až asi 50 μΐ, nejvýhodnějí kolem 40 μΐ), při koncentraci, která se pohybuje v oblasti od asi 0,01 do asi 5 μΜ (ve výhodném provedení asi 0,01 μΜ), v pufru jako je např. 6X SSPET (0,9 M NaCI, 60 mM NaH2PO4, 6 mM EDTA a 0,05 % Tritonu X100), a hybridizuje se s vazným partnerem (např.oligonukleotidovou kotvou nebo povrchem) po dobu asi 10 minut a asi až alespoň 3 hodin
- 20 (ve výhodném provedení je to nejméně asi 15 minut) při teplotě, která se pohybuje v oblasti od asi 4°C do asi 37°C. (ve výhodném provedení při pokojové teplotě). Podmínky se mohou volit tak, aby umožňovaly vysoký výtěžek a reakční rychlost při řešení podle vynálezu, reakční podmínky se přibližně shodují s fyziologickými podmínkami.
Volba jiných typů látek nebo molekul (např. polypeptidy, lektiny atd.), které mohou např. sloužit jako kotvy nebo jako části linkerů a reakčních podmínek, které jsou vyžadovány pro dosažení určitých specifických interakcí s příslušnými vaznými partnery, jsou rutinní a jsou běžné v oboru (například jak je popsáno v publikacích Niemeyer et al (1994). Nucl. Acids Res. 22, 5530-5539; Fodor et ai (1996). U.S.Patent 5 510 270; Pirrung et al (1992), U.S. Patent No. 5 143 854). Mezi inkubační parametry patří pufry, koncentrace solí, pH, teplota, doba inkubace, přítomnost nosiče a/nebo činidla nebo podmínek ke snížení nespecifických interakcí atd. Tak např. do testovací oblasti (např. jamky, vícejamkové destičky ve výhodném provedení 96 nebo 384 jamkové nebo větší), která obsahuje jako kotvy protilátky, se mohou přidat anti-protilátky (antigeny nebo protilátkově specifické sekundární protilátky) v objemu, který se pohybuje v oblasti od asi 0,1 do asi 100 nebo více μΐ (ve výhodném provedení asi 1 až asi 50 μΐ, nejvýhodněji asi kolem 40 μΐ), při koncentraci v oblasti od asi 10 pM do asi 10 nM (ve výhodném provedení asi 1 nM), v pufru jako je např. 6X SSPE-T, PBS nebo fyziologická solanka a inkubuje se s kotvami na povrchu po dobu 10 minut až alespoň 3 hodiny, (ve výhodném provedení nejméně asi 15 minut) při teplotě, která se pohybuje od asi 4°C do asi 45°C (ve výhodném provedení asi 4°C). Pro peptidové kotvy je výhodná délka asi 5 až asi 20 aminokyselin.
V některých provedeních vynálezu může každá kotva v uspořádání interagovat s specifickou částí (pro určitou kotvu) jejího odpovídajícího línkeru na v podstatě stejný stupeň jako reaguje jiná
- 21 » · · · kotva v tomto uspořádání, pokud jsou zvoleny určité reakční podmínky. Tato skutečnost může zajistit, že specifika kotev, je v podstatě jednotná pro linker a tudíž i pro jednotlivé testovací oblasti.
Kotvy uvnitř testovací oblastí mohou být umístěny „genericky“, kdy každá kotva může interagovat s jedním nebo více různými linkery, přičemž každý z linkerů má Část specifickou pro kotvu, ale s různou „sondovou testovací“ částí; takže při tomto jednom uspořádání generických kotev se mohou použít k programování nebo k definování souboru různých testů. Pružná povaha takového generického uspořádání kotev se dá ilustrovat s odkazem na obr. 1 a 2. Obrázek 2 ilustruje povrch, který zahrnuje 15 testovacích oblastí, přičemž každá z těchto oblastí obsahuje uspořádání 6 různých kotev, které jsou v tomto příkladě představovány oligonukleotidy. Obrázek 1 schematicky znázorňuje jednu z těchto (oligonukleotidových) kotev, kotvu 1, která se v kontaktu s linkerem 1, který zahrnuje jednu část, která je specifická pro kotvu 1 a druhou část, která je specifická pro cílovou mRNA 1. Alternativně jedna z nich může být substituovaná, např. linkerem 2, který podobně jako linker 1, obsahuje část specifickou pro kotvu 1, ale který zahrnuje druhou část, která je specifická pro cílovou mRNA 2 místo cílové mRNA 1. Takže, kotva 1 se může použít ke specifikací (nebo programování nebo definicí nebo determinování) testů pro buď pro dva nebo více různých cílových mRNA. Způsob generování a navazování vysoce výkonných uspořádání oligonukleotidů nebo peptidů může být drahý, může spotřebovat velmi dlouhou dobu a/nebo fyzicky obtížný. Schopnost použít předem zformované uspořádání kotev k programování řady různých sond % uspořádání sond je v případě tohoto vynálezu velkou výhodou.
Přestože je na obr. 2 znázorněno uspořádání generických kotev pro oligonukleotidové sondy, identické uspořádání kotev by se také mohlo použít k programování uspořádání jiných sond, např.
receptorů proteinů (viz např. obr. 3). Je jasné, že je v tomto případě možné obrovské množství permutací, které je dáno počtem typů interakcí kotva/linker, např. komplexnější vrstva „sendvičová“ nebo „nesených sond“ jako jsou kombinace protein/protilátka. Tudíž povrch kotev podle tohoto vynálezu sám o sobě, nabízí nové výhody.
V jednom z možných provedeních podle tohoto vynálezu mohou interagovat kotvy s línkery reverzíbílně; tudíž generický soubor kotev se může opětně používat k programování řady souborů testů. Tak např. oligonukleotídová kotva se může oddělit od oligonukleotidové části linkerů např. tím, že se povede zahřátí, které způsobí, že dva oligonukleotidy disociují a může dojít potom k navázání druhého linkeru. Schopnost opětného použití určitého uspořádání kotev, které může být drahé, jeho příprava může spotřebovat mnoho času a/nebo může být fyzikálně obtížné toto uspořádání připravit, je další velkou výhodou tohoto vynálezu.
Kotva nemusí nutně interagovat s linkerem. Tak například kotva může být spojena (přímo nebo nepřímo) s detekovatelnou molekulou, jako je fluorochrom a může tímto způsobem sloužit k lokalizaci plošky v mřížce, např. za účelem přenesení informace mezí povrchem a detektorem. Alternativně může být kotva značená známým množstvím detekovatelných molekul tak, aby to mohlo sloužit k vnitřní kvantifikací markéru, např. pro účely kalibrace.
Termín „linker“ jak je zde používán znamená bifunkční látku, která zahrnuje první část (nebo skupinu nebo část), která je specifická pro zvolenou (označenou) kotvu nebo podsoubor kotev („specifické pro kotvu“) a druhou část, která je sondou specifickou pro cílový zájem („specifická pro cíl“). Tyto dvě části linkeru se mohou napojit přes kovalentní nebo nekovalentní vazbu a mohou být připojeny přímo nebo přes mezičlen.
- 23 • * · · # · · · ·· · ···
Chemická povaha částí línkeru, specifické pro kotvu, je pochopitelně funkcí kotvy nebo kotev, s kterými interaguje. Tak například, jestliže kotvou je oligonukleotíd, tak částí línkeru, která interaguje s touto kotvou může být, např. peptid, který se váže specificky k olígonukleotídu, nebo nukleová kyselina, která může účinně a specificky hybridizovat s touto částí za zvolených přesných hybridizačních podmínek. Touto nukleovou kyselinou může být např. oligonukleotíd, DNA, RNA, PNA, PCR produkt, nebo substituovaná nebo modifikovaná nukleová kyselina (např. obsahující nepřírodně se vyskytující nukleotid jako je např. inosin; napojený přes různé známé vazby a můstky jako je sulfamát, sulfamid, fosforotionát, metylfosfonát, karbamát; nebo semisyntetická molekula jako je DNAstreptavidin nový konjugát atd.). Výhodné jsou molekuly s jedním řetězcem. Část linkeru, která je specifická pro oligonukleotidovou kotvu může obsahovat asi od 8 do asi 50 nukleotidů v délce, výhodně asi 15, 20, 25 nebo 30 nukleotidů. Jestliže kotvou je protilátka, částí linkeru, která interaguje s touto protilátkou může být např., protilátka, antigen nebo menší fragment jedné z takových molekul, který může interagovat specificky s kotvou. Látky nebo molekuly, které interagují s jinými typy kotev, popsanými shora a které mohou sloužit jako částí línkeru specifické pro kotvu, jsou v oboru dostatečně známé a mohou být navrženy pomocí obvyklých postupů (např. viz shora).
Chemická povaha části linkeru specifické pro cíl je, pochopitelně, funkcí cíle, pro který je tato sonda navržena a s kterým interaguje. Tak např. jestliže cílem je určitá mRNA, částí linkeru specifickou pro cíl může být, např. oligonukleotíd, který se váže specificky k cíli, ale ne k rušivým RNA nebo DNA za zvolených hybridizačních podmínek. Odborník v oboru může s pomocí metod, které byly vyvinuty v oboru, rozpoznat experimentálně znaky jakéhokoliv nukleotidu, který bude hybridizovat optimálně s cílem,
- 24 přičemž se dodrží minimálně hybridizace s nespecifickými, interferujícími DNA nebo RNA (např. viz shora). Obecně je délka oligonukleotidové sondy použité k rozpoznání cílové mRNA přítomné na pořadí velkého přebytku necílových RNA může být od asi 8 do asi 50 nukleotidů, výhodně asi 18, 20, 22 nebo 25 nukleotidů.
Nukleotidová sonda pro použití při biochemickém testu, pří kterém není velké pozadí konkurenčních cílů, může být kratší. Pomocí postupů vyvinutých v oboru (např. počítačový program BLAST), mohou sekvence oligonukleotidových sond být voleny tak, aby nebyly vzájemně příbuzné a aby nebyly podobné potenciálně interferujícím sekvencím ve známých genetických databázích. Výběr hybridizačních podmínek, který umožní specifickou hybridizaci oligonukleotidové sondy na nějakou RNA se může povést na základě rutiny, pomocí způsobu, které jsou známy v oboru (např. viz shora). Tak např. cílová RNA /např.celá RNA nebo mRNA extrahovaná z tkání nebo rostoucích buněk (a po případě zpracovaná působením činidla podle potřeby) v jakékoliv nádobě, jako např. v jamce nebo ve vícejamkové mikrotitrové destičce (např. 96 nebo 384 nebo více jamek)/ se dá přidávat k testovací oblasti obsahující oligonukleotidové sondy v určitém uspořádání (viz shora) v pufru jako je 6X SSPE-T nebo jiné, popřípadě obsahující činidlo k redukcí nespecifické vazby (např. asi 0,5 mg/ml degradované DNA lososa nebo sledě nebo RNA kvasinek), a ínkubuje se při empiricky stanovené teplotě po dobu v rozmezí mezi asi 10 minutami a nejméně 18 hodinami (ve výhodném provedení asi 3 hodiny). Délka navázaného řetězce s hybridizaci může být stejná nebo menší v porovnání s délkou použitou při spojování kotev s částí Iinkeru specifickou pro kotvu. Navržení a použití jiných typů sond je také věcí rutiny a znalostí v oboru, např. jak je diskutováno shora.
v
Části specifické pro cíl a části specifické pro kotvu použitého Iinkeru se mohou připojit (navázat, asociovat) jakýmkoliv způsobem kovalentními nebo nekovalentními vazbami, přičemž není • « • ·
I
- 25 tento způsob podstatný pro vynález. Tyto dvě části se mohou napojovat přímo nebo přes molekulu meziproduktu. V jednom z možných provedení jsou v obou částech linkeru oligonukleotidy, které mohou být napojeny kovalentními vazbami jako jsou např. fosfodiesterové vazby, čímž vytvoří jednu kolíneární nukleovou kyselinu. V dalším provedení, ve kterém část specifická pro kotvu je oligonukleotid a část specifická pro cíl je receptor, např. receptor proteinu, se tyto dvě Částí mohou spojit pomocí interakce biotinové a streptavidínové molekuly, což je ve formě příkladu znázorněno na obrázku 3. Mnoho variací takovýchto vazeb je známo (např. viz Niemeyer et al (1994). NAR 22. 5530-5539). Alternativně mohou být tyto dvě části spojeny přímo, např. oligonukleotid může být amidován a pak navázán přímo (např. zesíťován) k peptidu nebo proteinu amidickou vazbou nebo může být připojen k membránovému členu pomocí amidické vazby nebo tukové vazby. Způsoby k vytvoření takovýchto kovalentních nebo nekovalentních vazeb jsou obvyklé a snadno se optimalizují, což je věcí rutiny odborníka v oboru.
Po spojení dvou látek (např. inkubací dvou nukleových kyselin, dvou proteinů, proteinů plus nukleové kyseliny nebo jiných ) a vznikne komplex (jako je např. komplex kotva/linker) může být tento výsledný komplex po případě dále zpracován (např. promýván) aby se odstranily nevázané látky (např. línkery), přičemž se používá podmínek, které jsou empiricky stanovitelné, aby se předešlo specifickým nežádoucím interakcím, ale aby se odstranily nespecificky navázané materiály. Tak např. reakční směsi se mohou promývat jednou až desetkrát za stejných nebo podobných podmínek, které byly používány při tvorbě komplexů (např. komplexu kotva/linker).
Kombinace podle tohoto vynálezu se mohou vyrobit rutinním způsobem, s použitím známé technologie.
- 26 Některé typy povrchů, které se mohou používat při vynálezu, jsou snadno dostupné od komerčních dodavatelů. Ve výhodném provedení je to povrch 96-, 384- nebo 1536 jamkových mikrotitrových destiček jako jsou např. prodávané modifikované destičky od Corning Costar. Alternativně jde o povrchy, na nichž jsou vytvořeny jamky, které zahrnují odsazení nebo důlky a dají se formovat míkrozpracováním látek jako je hliník nebo ocel, přičemž se připravuje tavenina, pak mikroínjekční plastové nebo podobné materiály, které se do formy nastřikují a vzniká struktura jak je např. znázorněna na obr. 4. Alternativně je takováto struktura na obr. 4 opatřena skleněnými, plastovými, keramickými nebo podobnými doplňky, např. mohou tam být tři elementy jako jsou ty, které jsou znázorněny na obr. 5: první sekce se nazývá separační val, (obr. 5a), přičemž tyto vály jsou vytvořeny mezi jednotlivými jamkami pro vzorky; druhá sekce zvaná podrozdělovač (obr. 5b), která tvoří pododdíly nebo další důlky v každé testovací jamce a třetí sekce zvaná báze (obr. 5c), která tvoří základnu destičky a nižší povrch testovacích jamek. Separátor může být např. tvořen kouskem materiálu jako je silikon s otvory, které jsou proraženy skrz tento materiál tak, že každý otvor netvoří okraje testované jamky, když se spojí všechny tři části. Podrozdělovačem může být např. tenký kousek materiálu např. křemíku, vytvarovaný do podoby sítě nebo jemného síta. Tato báze může být kouskem plochého materiálu, např. skla např.v tvaru nižší Části typické mikrodesticky používané pro biochemické testy. Horní Část povrchu báze může být plochá, jak je znázorněno na obr. 5c, nebo může být vytvořena s vymezeními, které jsou vytvarovány jako podrozdělovaěe a zajišťují vytvoření pododdílů nebo důlku uvnitř každé jamky pro vzorek. Uvedené tři části mohou být spojeny běžnými způsoby, např. způsoby používanými k sestavení křemíkových výrobků.
Oligonukleotidové kotvy, linkerové skupiny nebo detektory se mohou syntetizovat běžnou technologií, např. s použitím komerčních
- 27 9 · · · · «· · • · · · · · .· · · · » * ♦ · « · · · · · · ·· · · ···· · · » · · * syntetizérů oligonukleotidů a/nebo navazováním subfragmentů, které již byly takto syntetizovány. V jednom možném provedení podle vynálezu se vytvoří kotvy na bázi nukleových kyselin, jako např. oligonukleotidové kotvy a mohou se umístit na nebo uvnitř povrchu testovací oblastí a připevnit tam jakoukoliv obvyklou technikou včetně fotolítografie nebo chemického síťového nanesení, které se může provádět technologií inkoustové tiskárny, kapilárně rastrováním nebo pomocí čipu s kanálky na tekutinu, elektrochemickým vytvořením vzoru pomocí soustavy elektrod, přikládáním jehly nebo trubičky nebo denaturací, která následuje po ozařování nebo zahřívání na filtrech (viz např. Rava et al (1996). U.S. Patent No. 5 545 531; Fodor et al (1996).
U.S. Patent No. 5,510,270; Zanzucchi et al (1997). U.S. Patent No.
643 738; Brennan (1995). U.S. Patent No. 5 474 796; PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070). Kotvy se mohou přemístit na vrchol povrchu testovací oblasti nebo mohou být např. v případě lože z polyakrylamidového gelu uloženy uvnitř povrchu takovým způsobem, že některé kotvy vyčnívají z povrchu a jsou přístupné interakcím s linkerem. Ve výhodném provedení jsou vytvořené oligonukleotidové kotvy substituovány v poloze 5' volnou aminoskupinou, přičemž jsou rozpouštěny při koncentraci, která se dá empiricky rutinním způsobem zjistit (např. asi 1 μΜ) v pufru jako je 50 mM fosfátový pufr, pH 8,5 a 1 mM EDTA a nanášeny pomocí zařízení Pixus nanojet dispenser (Cartesian Technologies) v kapičkách asi 10,4 nanolítrů na konkrétní zvolená místa uvnitř testovací jamky, jejíž horní povrch je čerstvě upraven, a tvořen suchou DNA vazebnou destičkou (Corning Costar).
V závislosti na relativním poměru oligonukleotidového připojení a odpařování, může být požadováno, aby byla udržována vlhkost v jamce po dobu celé přípravy. Podle jiného provedení mohou být oligonukleotidové kotvy syntetizovány přímo na povrchu testovací oblasti s použitím běžných metod, jako je např. světlem aktivované odstranění chránění z prodlužovaných oligonukleotidových řetězců (např. ve spojení s použitím maskování na určitém řízeném místě) nebo
- 28 • · · · « «· ···· · · · · · » vytvoření soustavy nanolitrových kapiček deaktivující sloučeniny s použitím mikrotryskové zařízení Nanojet dispenser. Např. se může provést odstranění chránění ze všech rostoucích sekvencí, které mají být určeny k navázání jednoho nukleotidu a potom tento nukleotid přidat k celému povrchu.
Rutinním způsobem lze také generovat peptidové, proteinové, lektínové, chelatačne vytvořené, plastové nebo jiné typy kotev nebo linkerových skupin a kotvy se mohou umisťovat na nebo uvnitř povrchů, přičemž se může použít libovolné dostupné technologie (viz Fodor et al (1996). U.S. Patent No. 5,510,270; Pirrung et al (1992). U.S. Patent No. 5,143,854; Zanzucchi et al (1997). U.S. Patent No. 5,643,738; Lowe et al (1985). U.S. Patent No. 4,562,157; Níemeyer et al (1994). NAR 22, 5530-5539).
Při některých provedeních podle vynálezu se používají popsané kombinace v řadě rastrovacích metod a/nebo pro získání informace o úrovni, aktivitě nebo struktuře sond nebo cílových molekul. Takovéto testy jsou nazývány Multi Array Plate Screen (MAPS) metody nebo testy a povrchy obsahující matice nebo kotvy nebo kotvy plus sondy, které se používají pro tyto testy jsou označovány MAPS matice nebo MAPS destičky.
Složky reakční směsi, testy nebo řádkovací metody se mohou spolu v různém pořadí kombinovat. Tak např. kotvy, Iínkery a cíle se mohou sestavovat postupně nebo cíle a Iínkery v přítomností nebo absenci hlásičů, se mohou sestavit v roztoku a pak uvést do kontaktu s kotvami.
Podle jednoho z možných provedení podle vynálezu jde o způsob detekce alespoň jednoho cíle, při kterém se:
• » « · • · ·
- 29 • ·
a) uvádí do kontaktu vzorek, který může obsahovat uvedený cíl nebo uvedené cíle s bifunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro oligonukleotidovou kotvu a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro uvedený cíl nebo uvedené cíle, za podmínek účinných k získání prvního produktu hybridizace mezi uvedeným cílem nebo uvedenými cíly a uvedeným linkerem.
b) uvádí se do kontaktu první hybridizační produkt s kombinací za podmínek účinných k získání druhého hybridizačního produktu, který je produktem hybridizace mezi uvedeným prvním produktem hybridizace a uvedenou kombinací, přičemž uvedená kombinace zahrnuje, před přidáním prvního produktu hybridizace,
1) povrch obsahující množství oddělených oblastí, z nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje
2) alespoň 8 různých oligonukleotidových kotev,
c) uvádí se do kontaktu zmíněný první produkt hybridizace nebo uvedený druhý produkt hybridizace se značenou detektorovou sondou a
d) detekuje se uvedená detekční sonda.
Každý test nebo každý postup dále popsaný se dá provádět takovým způsobem, že se dosahuje vysokých počtů testů, přičemž velký počet vzorků (např. tak velké množství jako asi 864, 1036, 1536, 2025 nebo více v závislosti na počtu oblastí v kombinaci) se může testovat na každé destičce nebo na povrchu rychle a souběžně. Dále
- 30 mnoho destiček nebo povrchů se dá zpracovat najednou. Např. při způsobech hledání nových účinných látek se velké množství vzorků, z nichž každý zahrnuje látku, která je kandidátem na účinnou látku (např. člen knihovny kombinační chemie, jako jsou varianty malých molekul, peptidů, olígonukleotidy nebo jiné látky) se může přidat k oddělené oblasti kombinace, jak je popsaná nebo se může přidat k biologickému nebo k biochemickému vzorku, které jsou pak přidávány do jednotlivých oblastí kombinace a inkubovány se soustavou sond, umístěných v oblasti. Testy se v takovém případě dají provádět s každým vzorkem. S přihlédnutím k současnému nástupu a pokračujícímu vývoji mikrodestiček o vysoké hustotě testovacích míst, DNA testovacích zařízení a metod jako je laserová technologie k přípravě a získávání dat z takovýchto hustých mikrodestiček, technologie využívající robotů a díky zlepšenému způsobu nakládání, promyšleným detekčním systémům a softwaru k zpracování dat mohou metody podle vynálezu být používány k screeningu nebo analýze tisíců a desítek tisíc nebo více sloučenin denně.
Tak např. provedení, při kterém sondami jsou olígonukleotidy, může být testována pro účely diagnostiky nukleová kyselina nebo může jít o polynukleotidový screening (např. test na vazbu nebo jiný test), přičemž se může zpracovat velký počet vzorků na přítomnost různých genetických variací nebo defektů (např.polymorfísmus nebo specifické mutace spojené s chorobami jako je cystická fibróza. Viz např. Iitia et al (1992). Molecular and Cellular Probes 6, 505-512)); Může jít o testy na patogenní mikroorganismy (jako jsou bakterie, viry, prvoci, jejichž hostiteli jsou živočichové včetně lidí nebo rostliny) nebo může jít mRNA transkripční schémata, která jsou diagnostická pro určité fyziologické stavy nebo choroby. Soubory sond na bázi nukleových kyselin zahrnují části, které obsahují ESTy (včetně kopií plné délky) mohou být použity k hodnocení transkripčních vzorů, které produkují buňky, od kterých jsou ESTy
- 31 • · · · odvozeny (nebo jiné). Sondy na bázi nukleových kyselin mohou také detekovat peptidy, proteiny nebo proteinové domény, které se vážou specificky na určité sekvence nukleových kyselin (a naopak).
V dalším provedení se dá kombinace podle vynálezu použít k monitorování biochemických reakcí jako je např. interakce proteinů, nukleových kyselin, malých molekul nebo podobně - např. účinnosti nebo specifiky interakcí mezí antigeny a protilátkami; nebo receptorů (jako jsou např. přečištěné receptory nebo receptory vázané k buněčným membránám) a jejich ligandů, antagonistů nebo agonístů; nebo enzymů (jako jsou proteázy nebo kinázy) a jejich nosičů nebo pro stanovení nebo k zvýšení nebo k snížení množství nosiče, který je převeden na produkt; a zrovna tak v mnoha jiných dalších případech. Takového biochemické testy se dají použít k charakterizací vlastností sondy nebo cíle nebo jako fáze pro skreeningové testy. Tak např. prohledávání vzorků na přítomnost určitých proteáz (např. proteáz uplatňujících se při srážení krve jako jsou proteázy Xa a Vila) se mohou tyto vzorky testovat na kombinace, ve kterých jsou sondy fluorogenních substrátů specifické pro každou proteázu jednotlivě. Pokud se cílová proteáza váže k substrátu a štěpí jej, substrát bude fluoreskovat což je obvyklým výsledkem, např. štěpení a separace mezí dvěma páry k přenosu energie a signál takto může být detekován. V jiném případě při testování vzorků na přítomnost určité kinázy (kináz) (např. Src, tyrosínové kinázy nebo ZAP70) se mohou testovat vzorky obsahující jedno nebo více kináz na kombinacích, ve kterých jsou sondami peptidy, které jsou selektivně fosforované jednou z kináz, o které máme zájem. S pomocí metod, které jsou rozpoznatelné na základě znalostí z oboru a rutinně stanovitelných podmínek se vzorky mohou inkubovat s řadou substrátů ve vhodném pufru a s nutnými kofaktory, při čemž se empiricky stanoví doba této inkubace. (Při některých testech např. pro biochemické výzkumy faktorů, které regulují aktivitu kináz, o které máme zájem, můžeme aktivitu každé
- 32 • · · ·
kinázy upravit tak, že každý substrát se fosforuje podobným způsobem.) Po dalším ošetření (např. promytím) každého reakčního produktu při empiricky stanovených podmínkách za účelem odstranění kináz a nežádoucích reakčních složek (popřípadě) se mohou fosforylované substráty detekovat např. inkubací s detekovatelnými reakčnímí činidly jako jsou např. fluoresceínem značené antífosfotyrosinové nebo antífosfoserínové protilátky (např. při koncentraci asi 10 μΜ nebo větší nebo menší) a signál se může detekovat. V jiném případě se může provádět test na schopnost navazování. Tak např. domény SH2 jako jsou GRB2 SH2 nebo ZAP70 SH2 se mohou testovat na matici sond vhodně fosforylovaných peptidů; nebo se může testovat krevní sérum na matici určitých receptorů za účelem zjišťování přítomnosti imunitních nedostatečností. Také testy na navázání enzymů se mohou provádět v tomto maticovém formátu. Kombinace podle vynálezu se může také použít k detekci enzymových mutantů, které jsou buď více nebo méně aktivní než jejich divoké příbuzné formy nebo pro hledání řady činidel včetně herbicidů a pesticidů.
MAPS testy se mohou provádět ke kvantifikací (měření, množství) aktivních cílů ve vzorku, přičemž sonda není plně využitá, to znamená, ne více než asi z 90 % přístupných sondovacích míst se naváže (nebo reaguje nebo hybridizuje) s cílem. Za těchto podmínek se může cíl kvantifikovat, protože máme více cílů, bude mít za následek větší obsazení sond. Na druhé straně za podmínek, kdy přes 90 % dostupných sond je obsazených nebo se naváže, nebude už dále růst množství navázaných cílů z jejich koncentrací. Jakékoliv zde zmíněné typy cílů se mohou kvantifikovat tímto způsobem. Tak např. příklad 6 popisuje kvantifikaci oligonukleotidových cílů. Dále tento příklad demonstruje, že dokonce pokud je cíl přítomen ve velkém přebytku (např. pokud je přítomen v takových množstvích, že nasycuje velké množství přístupných sond v matici sond MAPS) se může přidáním
- 33 • « známých množství neznačených cílů k vazné směsi kvantifikovat za „citlivost posunů“ reakce, čímž se umožní měřit takováto velká množství cílů.
V dalším provedení se mohou kombinace podle vynálezu použít k hledání činidel, která modulují interakci cílů a daných sond. Např. jakékoliv Činidlo může modulovat i interakcí cíle se sondou tím, že přímo ínteraguje nebo nepřímo interaguje s některou sondou, cílem nebo komplexem vytvořeným cílem a sondou dohromady. Modulace může mít řadu forem včetně, nikoliv však výlučně, zvyšování nebo snižování vazebné afinity k cíli pro danou sondu, zvyšování nebo snižování rychlosti jakou se cíl a sonda váží, konkurenční nebo nekonkurenční inhibice vazby sondy a cíle, nebo zvyšování nebo snižování aktivity sondy nebo cíle, které může v některých případech vést ke zvýšení nebo ke snížení interakce sonda /cíl. Těmito činidly mohou být činidla uměle připravená nebo to mohou být látky vyskytující se v přírodě. Také mohou být takováto činidla používána v nezměněném stavu nebo ve formě agregátu s jinými typy látek. Dále mohou být tato činidla připojena kovalentně nebo nekovalentně k vazebnému členu, což může být buď přímé připojení nebo mohou být tato připojení provedena přes specifickou vazebnou látku. Tak např. k identifikací potenciálních „krevních srážedel“ nebo činidel, která interagují s některým stupněm kaskády proteáz, které způsobují srážení krve, směsi proteáz, o které je zájem a které mohou být testem hledány z řady kandidátů na toto činidlo a dále testovány na aktivitu jak je shora popsáno. Jiné příklady činidel, která mohou být využita v tomto vynálezu jsou velmi různé a zahrnují pesticidy a herbicidy. Příklady 16 a 17 popisují vysoce výkonné testy na činidla, která selektivně inhibují specifické kinázy nebo na selektivní inhibitory interakce mezi SH2 doménami a fosforylovanými peptidy.
V jiném provedení se kombinace podle vynálezu mohou používat k hledání činidel, která modulují vzorec genové exprese. Lze použít např. matici oligonukleotidů, která může identifikovat mRNA jednotlivých typů, jejichž vzorec exprese ze souboru genů koreluje s určitými fyziologickými stavy nebo vyvíjejícími se stádií nebo s chorobným stavem („korelující“ geny, RNA nebo expresní vzorce). Termínem „koreluje“ nebo „korelující“ je míněno, že syntézní vzorec RNA je spojen s určitým fyziologickým stavem buňky, ale není to nutně vždy tak, že exprese dané RNA je zodpovědná za určitý fyziologický stav nebo je jeho příčinou. Tak např. může se identifikovat malý podsoubor takových mRNA, které jsou exprimovány, pozitivně a/nebo negativně konvertovány v buňkách, což slouží jako model pro určitý chorobný stav. Tento proměnlivý projev exprese, pokud je srovnáván se stejnou expresí u normálních buněk, které nevykazující patologický fenotyp, může sloužit jako indikátor nemoci nebo chorobného stavu („indikátor“ genů, RNA nebo expresní vzorce). Termíny „korelující“ a „indikátor“ se mohou používat tak, že se mohou mezi sebou zaměnit. Tak např. buňky, které jsou ošetřovány promotorem nádorů jako je forbol myristát mohou vykazovat expresi genů, která je podobná té, která je pozorovatelná při časných stádiích růstu nádorů. V jiném modelu rakoviny, se používá buněk myšího ínzulínomu (např., buněčná linie TGP61), které při infíkaci adenovírem vykazují zvýšení exprese např. c-Jun a MIP-2, přičemž exprese domácích genů, jako GAPDH a L32 zůstává v podstatě neovlivněna.
Činidla, která po uvedení do kontaktu s buňkou modelu určité nemoci, buď přímo nebo nepřímo a buď in vivo nebo in vitro (např.v tkáňové kultuře) modulují expresní vzorec indikátoru, mohou působit jako terapeutické prostředky nebo účinné látky na organismy (např. lidi nebo zvířata nebo rostliny) trpící touto chorobou. Činidla také mohou modulovat expresní vzorce tím, že se uvádějí přímo do kontaktu s nukleovou kyselinou, např. in vitro (testovací trubička),
- 35 • · · · · • · · * · · ·· expresního systému. Výraz „modulovat“, jak je zde používán, znamená působit zvyšování nebo snižování množství a/nebo aktivity molekuly nebo podobně, která je součástí měřitelné reakce. Kombinace podle vynálezu se mohou použít pro screening takovýchto činidel. Tak např. řada buněk (např. z modelu nemoci) se dá uvést do kontaktu s řadou činidel (např. po dobu od 10 minut až do 48 hodin nebo i více) a s použitím rutinních v oboru dobře známých metod (např. komerčně dostupných souprav) lze extrahovat celou RNA nebo mRNA. Pokud je to žádoucí zesílí se množství RNA standardními procedurami jako je RT-PCR zesílení, které může být použito (viz např. Innis et al es., (1996) PCR Protocols: A Guide to Methods in Amplification, Academie Press, New York). Extrakty (nebo namnožené produkty z těchto extraktů) se mohou nechat působit (např. společnou inkubací) na řadu v podstatě identických matic, které zahrnují sondy pro vhodný indikátor různých RNA a jejich činidla, která jsou spojená se změnou expresního vzorce těchto indikátorů, se mohou v takovém případě identifikovat. Příklad 15 popisuje testovací systém s vysokou výkonností, jehož účelem je hledat sloučeniny, které mohou změnit expresi genů, které jsou v korelaci s určitými chorobnými stavy.
Podobně se mohou rozpoznávat činidla, která modulují expresní vzorce spojené s určitými fyziologickými stavy nebo vývojovými stádií. Takováto Činidla se mohou vyrobit uměle nebo může jít o látky vyskytující se v přírodě, včetně faktorů prostředí jako jsou látky, které vznikají při embryonálním vývoji, nebo které se uplatňují při regulaci fyziologických reakcí nebo látky důležité pro zemědělskou výrobu jako jsou pesticidy nebo herbicidy. Také může jít o činidla, která jsou využitelná v nezměněném stavu nebo jsou využitelná ve formě agregátů s jinými typy látek. Tato činidla mohou být připojena v takovém případě kovalentně nebo nekovalentně k nosnému členu, což může také být přímé nebo přes specifické látky, které umožňují navázání nebo můstek.
• ·
- 36 • · · ·
Dalším provedením podle vynálezu je souprava, vhodná k detekci alespoň jednoho cíle ve vzorku, která zahrnuje:
a) povrch, obsahující velké množství navzájem oddělených oblastí, z nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, každá oblast zahrnuje alespoň 8 různých kotev (oíigonukleotid nebo jeden z dalších typů zde popsaných a
b) nádobu obsahující alespoň jednu bifunkční molekulu linkeru, která má první část specifickou pro alespoň jednu uvedenou kotvu (kotvy) a druhou část, která obsahuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden uvedený cíl (cíle).
V jednom provedení se řeší povrch jako v a) shora a soubor instrukcí pro napojování alespoň jedné z uvedených kotev k bifunkční molekule linkeru, který má první část specifickou pro alespoň jednu uvedenou kotvu a druhou část, která obsahuje sondu, která je specifická alespoň pro jeden cíl. Tyto instrukce mohou zahrnovat např. (nikoliv však výlučné) popis každé z kotev na povrchu, indikaci jak mnoho kotev je na povrchu a kde na povrchu jsou umístěny a návod na vytvoření specifických připojení (asociací, vazbu atd.) linkeru ke kotvám. Tak např. pokud kotvami jsou oligonukleotidy, instrukce mohou zahrnovat sekvenci každé kotvy, z které praktik může navrhnout komplementární skupinu linkerů specifickou pro danou kotvu, aby docílil specifickou interakci s (např. hybridizační) kotvami; jestliže kotvami jsou peptidy, instrukce mohou zahrnovat informaci např. o tom, které protilátky specificky interagují s danými peptidy. Tyto instrukce mohou také zahrnovat návod k asociaci kotev a linkerů, např. reakční podmínky, činidla pro hybridizaci (nebo jiný typ spojení) jako
je teplota a doba inkubace, podmínky a činidla pro odstranění nepřipojených molekul (např. lázně) a pod. Dále mohou kromě toho instrukce také informovat o vytvoření a použití jakýchkoliv typů kontrolních linkerů zde diskutovaných a o metodách např. ke kvantitativnímu stanovení, normalizací, „jemnému doladění“ nebo kalibraci testů, které se mají provádět s danými kombinacemi. Tyto instrukce mohou zahrnout také jakékoliv parametry, podmínky nebo provedení, která jsou uvedena v přihlášce, které mohou všechny být provedeny rutinně s běžnými postupy, které jsou známy odborníkovi z oboru.
Jak je diskutováno v této přihlášce, praktik může napojit k povrchu podle vynálezu, obsahujícímu danou matici (nebo matice) kotev, širokou řadu typů linkerů, čímž naprogramuje jakýkoliv soubor sond. Kromě toho může praktik odstranit určitý soubor linkerů z povrchu podle vynálezu a přidat k němu jiný soubor linkerů (buď stejný nebo odlišný od prvního souboru), což umožní, že daný povrch se může několikrát opakovaně používat. Tato flexibilita a opakovatelná použitelnost představuje další výhody řešení podle vynálezu.
V dalším provedení mohou být kombinace podle vynálezu použity k mapování ESTŮ (Expressed Sequence Tags). To znamená, že testy MAPS mohou být použity k rozpoznání, které ze skupin ESTŮ, pokud tam nějaké jsou, byly generovány z různých (nebo Částečně se překrývajících) částí stejného genu (stejných genů), a které, pokud tam jsou nějaké, jsou nové. Obr. 18, 19, 20 a 21 ilustrují takový test, přičemž v tomto případě jde o stanovení, které ESTy, pokud že jsou nějaké, ze 16 jsou „navázány“ k běžnému genu. První stupeň testu (viz obr. 18) spočívá v sestavení matic, ve kterých každý z ESTŮ, které se mají stanovovat, je reprezentován alespoň jednou oligonukleotidovou sondou, která tomu odpovídá. Nějaký počet matic ekvivalentních (nebo větší než) určitý počet ESTŮ, které se mají hledat, je rozloženo
- 38 • to • · ···· ··· · to » to· ·· ·· ···· toto ···· v oddělených oblastech (např. v jamkách) povrchu; v ilustračním případě povrch kombinace zahrnuje 16 jamek, z nichž každá obsahuje matici v 16 různých oligonukleotidů specifických pro EST, očíslovaný 1-16. Oligonukleotid, který „koresponduje“ EST (je „specifický pro EST“) je jedním, který je dostatečně komplementární k ESTu tak, že za zvolených přesných hybridizačních podmínek bude oligonukleotid hybrídizovat specificky s tímto ESTem, ale ne s jinými ESTy, se kterými není spojen. Nukleotid korespondující s nějakým ESTem tohoto typu, se může vázat specificky (za optimálních podmínek) ke kódujícímu nebo nekódujícímu řetězci cDNA syntetizovanému z genu, ze kterého byl EST původně generován nebo k mRNA syntetizované z genu, z kterého byl původně EST generován.Faktory, které se mají řešit při navrhování oligonukleotidů a hybridizační parametry, které se mají optimalizovat za účelem dosažení specifické hybridizace, jsou diskutovány v této přihlášce na jiných místech. Za účelem sestavení matic se připravují molekuly linkeru, z nichž každá zahrnuje skupinu specifickou pro jednu z kotev generické matice plus skupiny obsahující oligonukleotidovou sondu, která koresponduje s jedním z ESTŮ, které se mají mapovat; a linkery jsou připojeny ke kotvám, jak je popsáno na jiných místech přihlášky. V následujícím stupni se alikvotní podíl vzorku obsahujícího směs nukleových kyselin (např. mRNA nebo jednu řetězcovou nebo denaturovanou cDNA), který může obsahovat sekvence, které jsou komplementární k jedné nebo více oligonukleotidových sond, přidá ke každé z oblastí (jamek), které obsahují maticí sond; pak se směs inkubuje za podmínek stanovitelných optimálně rutinním způsobem, čímž se umožní nukleové kyselině, aby se navázala na komplementární sondy. Jestliže je několik sond specifických na EST komplementárních k různým částem jedné nukleové kyseliny, musí potom se nukleová kyselina váže na každé takovéto místo v matici, na kterém jsou tyto sondy umístěny.
- 39 ·♦ ·* ·· • ♦ · · f> · · • »·>· · o · • · fc · ř · 4 · t · · · « · · ·«* «> «· ·· ···· *· ··»·
V následném stupni se různé detektory oligonukleotidů (v ilustračním příkladě jsou to detektory označované jako # 1 až 16) přidá ke každé oblasti (jamce) (víz obr. 19). Detektor nukleotidů se navrhne pro každé ESTy, které se mají mapovat. Každý detektor specifický pro EST odpovídá jiné (alespoň částečně se nepřekrývající) části EST než sonda oligonukleotidů, takže se sondy a detektory oligonukleotidů mezi sebou neinterferují. Tak např. ESTy označené na obr. 21, které korespondují s ESTy 1, 2 a 6 obrázků 18 - 20. Obr. 21 ukazuje, že ESTy #1 a #2 byly oba získány z genu X (jsou „navázány“), přičemž EST #6 byl získán z různých, nepříbuzných genů. Jestliže alíkvoty příkladu obsahující směs mRNA, včetně toho, který je generován v genu X, jsou inkubovány s maticí sond, znázorněnou na obr. 18 - 20, dojde k tomu, že mRNA genu X bude za optimálních podmínek hybrídízovat na místě, kde jsou sondy 1 a 2 ale nebude hybrídízovat na místech se sondou 6. (Pochopitelně každá mRNA musí být přidávána v molárním přebytku počítáno na sumu sond, se kterými může hybridizovat.) Pokud se přidá detektor oligonukleotidů 1 k oblastí (jamce) 1 bude hybridizovat s genem s mRNA genu X, která je vázána na místě 1 a 2 matice sond, ale nebude hybridizovat na místě 6. Podobně, jestliže detektor oligonukleotidů 2 bude přidán k další jamce - řekněme jamce #2 - bude se také vázat na místech 1 a 2, ale nebude na místě 6. Tímto způsobem se dá determinovat ve vysoké rychlosti, které ESTy jsou navázány, tj. kód pro části stejného genu a které ESTy jsou nové nebo odlišné. Jako hypotetický příklad jsou na obr. 20 znázorněny první 3 ESTy kódující části stejného genu, posledních 5 ESTŮ kódujících části jiného genu a zbylé ESTy, které by se neměly navazovat. Podmínky hybrídízace, popř. promývací stupně, metody detekce a pod. jsou diskutovány na jiných místech této přihlášky ve vztahu k jiným testům MAPS. Za účelem ověření údajů o vzniklých vazbách získaných MAPS testem se dají uskutečnit PCR reakce s použitím párů ESTově specifických oligonukleotidových sond jako sense a antí-sense primérů. Každý pár navázaných ESTŮ by měl
- 40 ·· Φ* *· ·Φ ir, «·· » · · Φ «··« *·«»· » » * »< t ·*«**·£ · · ♦ · · • · » · « Φ » * · » ·» *» ·· »·*· ·Φ «·»· poskytovat jako výtěžek PCR produkt. Je třeba poznamenat, že tyto párové PCR testy se dají provádět za účelem stanovení vazeb přímo bez použití navazovacích testů MAPS; nicméně mnoho reakcí by vyžadovalo, a každý primér EST by měl být syntetizován jako sense a antísense řetězce. V ilustrovaném případě by bylo vyžadováno 180 takových reakcí.
Podle jednoho aspektu se vynález týká způsobu stanovení, které ze souborů ESTŮ jsou komplementární k dané nukleové kyselině, při kterém se
a) inkubuje imobilizovaná matice oíígonukleotidových sond, alespoň jedna z kterých odpovídá každému uvedenému ESTu, s testovacím příkladem, který může obsahovat určitou uvedenou nukleovou kyselinu, za účelem získání hybridizačního produktu mezi uvedenými oligonukleotidovými sondami a uvedenou nukleovou kyselinou,
b) inkubuje uvedený hybridizační produkt s detektorem oligonukleotidu, který koresponduje s nějakým ESTem, se kterým koresponduje jedna z vedených oíígonukleotidových sond, ale který je specifický pro jinou Část EST, než uvedená oligonukleotídová sonda a
c) detekuje se která oligonukleotídová sonda z uvedené matice je označena uvedeným detektorem oligonukleotidu, přičemž uvedená matice oíígonukleotidových sond se imobilizuje na oblasti tvořené kombinací, přičemž uvedená kombinace zahrnuje
1) povrch obsahující určité množství oddělených v podstatě identických oblastí, ekvivalentní počtu
- 41 • * • · · · ·· · • 9 · · · « • · ···· ·· ····
ESTŮ, které se mají studovat, přičemž každá oblast zahrnuje
2) určitý počet různých kotev ekvivalentních k určitému počtu ESTŮ, který se má studovat, přičemž každá kotva je spojena s
3) bífunkČním línkerem, který má první část, specifickou pro kotvu a druhou část, která obsahuje oligonukleotidovou sondu, která koresponduje alespoň s jedním s uvedených ESTŮ.
V dalším aspektu se vynález týká způsobu jako shora, při kterém jeden nebo více z uvedených ESTŮ může být komplementární k uvedené nukleové kyselině a kde každý z uvedených ESTŮ zahrnuje dvě různé oligonukleotidové sekvence, z nichž první definuje oligonukleotidovou sondu korespondující s uvedeným ESTem a druhá definuje detektor oligonukleotidu korespondující s uvedeným ESTem, při kterém se
a) uvádí do kontaktu vzorek, obsahující molekuly uvedených nukleových kyselin s alespoň jednou oblastí kombinace, při Čemž uvedená oblast obsahuje maticí oligonukleotidových sond, alespoň jedna z nichž koresponduje s každým z uvedených ESTŮ,
b) inkubuje se uvedený vzorek s uvedenou oblastí, čímž se umožní molekulám uvedené nukleové kyseliny navázat se na uvedené oligonukleotidové sondy specifické korespondující s určitými ESTy, které jsou komplementární k části uvedené nukleové kyseliny, • · ·
- 42 c) inkubuje se zmíněná oblast obsahující molekuly uvedené nukleové kyseliny navázané na jednu nebo více uvedených oligonukleotidových sond specifických korespondující s EST s detektorem oligonukleotidu, který koresponduje s ESTem, se kterým je daná jedna oligonukleotídová sonda uvedené matice je spojena, čímž se naváže detektor oligonukleotidu k molekulám nukleových kyselin, které se již navázaly na uvedenou olígonukleotidovou sondu nebo na jinou oligonukleotidovou sondu, které jsou komplementární k uvedené nukleové kyselině,
d) detekuje se přítomnost uvedeného detektoru oligonukleotidů, čímž se identifikuje, která z oligonukleotidových sond korespondujících s EST z dané matice je komplementární k části nukleové kyseliny, která se váže na uvedenou sondu pro oligonukleotid korespondující s EST, čímž se identifikuje, které ESTy jsou komplementární k dané nukleové kyselině, přičemž uvedená matice oligonukleotidových sond je imobilízována na oblasti kombinace, která zahrnuje
1) povrch obsahující určitý počet oddělených, v podstatě identických oblastí, ekvivalentních k určitému počtu ESTŮ, které se mají studovat, přičemž každá oblast obsahuje
2) určitý počet odlišných kotev ekvivalentních k určitému počtu ESTŮ, které se mají studovat, přičemž každá kotva je spojena
- 43 ··· *··· · · · > «···· · · · « · · I · » * « « · ···« « *9·· ·«· ··· • 4 * * · » · · · · ·· «···
3) bifunkčním linkerem, který má část specifickou pro kotvu a druhou část, která obsahuje oligonukleotidovou sondu, která koresponduje s alespoň jedním z uvedených ESTŮ. Komponenty testu pro mapování EST se mohou sestavovat v libovolném pořadí. Tak např. kotvy, linkery a ESTy se mohou sestavovat sekvenčně; nebo línkery a ESTy za přítomností nebo v nepřítomností hlásičů, se mohou sestavovat v roztoku a pak přidat ke kotvám.
V jiném aspektu se vynález týká způsobu stanovení, který z řady ESTŮ je komplementární k dané nukleové kyselině, při kterém se,
a) ínkubuje soubor bifunkčních oligonukleotidových linkerových molekul, z nichž každá obsahuje první část, což je sonda, korespondující s alespoň jedním z uvedených ESTŮ a druhou část, která je specifická pro oligonukleotidovou kotvu, s testovaným vzorkem, který může obsahovat uvedenou nukleovou kyselinu, za účelem získání prvního hybrídízačního produktu mezí uvedenými olígonukleotidovýmí sondami a uvedenou nukleovou kyselinou,
b) ínkubuje první hybridizační produkt s imobilizovanou maticí oligonukleotidových kotev, přičemž každá kotva oligonukleotidu koresponduje s částí specifickou pro kotvu alespoň jedné uvedené molekuly Iinkeru, čímž se vytvoří druhý hybridizační produkt, který obsahuje uvedené kotvy, uvedené oligonukleotidové sondy a uvedené nukleové kyseliny a
- 44 • · · ·
• · » * · · · • · · · · · · · ·· *···
c) inkubuje buď uvedený první nebo uvedený druhý hybridizační produkt s oligonukleotidovým detektorem, který koresponduje s ESTem, s kterým koresponduje uvedená oligonukleotidová sonda, ale který je specifický pro jinou část ESTu, než je uvedená oligonukleotidová sonda a
d) detekuje se, které oligonukleotídové sondy z uvedené matice jsou označeny zmíněným oligonukleotidovým detektorem, přičemž uvedená matice kotev oligonukleotidů se imobilizuje na oblasti kombinace, která obsahuje
1) povrch obsahující určitý počet vzájemně oddělených v podstatě identických oblastí ekvivalentních počtu ESTŮ, které se mají studovat, přičemž každá oblast obsahuje
2) určitý počet různých kotev ekvivalentních ESTŮ, které se mají studovat.
Pochopitelně shora zmíněné metody pro mapování ESTŮ se dají použít k mapování testovaných sekvencí (např. polynukleotidů) na jakékoliv nukleové kyselině, o kterou je zájem. Tak např. se dá stanovit, jestli dva nebo více klonovaných DNA fragmentů nebo cDNA map patří stejné genomické DNA. Takovýto postup by mohl přispět např. k objasnění struktury dlouhých, komplexních genů. Podobným způsobem se dá stanovit, zda je jedna nebo více sekvencí, které jsou vzájemně propleteny nebo mapy kódujících sekvencí, příslušná ke stejné genomické DNA. Takovéto stanovení by se mohlo používat např. při diagnostických testech k rozlišení mezi normálními a chorobnými • ·
- 45 • · · · » · · ···· ····· · · · ·· · • · · · · · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· · · ···« · · · · · * stavy, které jsou charakterizovány odlišně spředenými sestavami. Mnoho dalších aplikací těchto mapovacích metod je evidentní těm, kteří se zabývají tímto oborem.
V dalším aspektu se vynález týká způsobu stanovení, které z řady polynukleotidů jsou komplementární k dané nukleové kyselině, kde jeden nebo více uvedených polynukleotidů může být komplementární k uvedené nukleové kyselině a kde každý z uvedených polynukleotidů obsahuje dvě různé oligonukleotidové sekvence, z nichž první definuje oligonukleotidovou sondu, korespondující s uvedeným polynukleotidem a druhý definuje detektor oligonukleotidu korespondující s uvedeným polynukleotidem, při kterém se
a) uvádí do kontaktu vzorek, který zahrnuje molekuly uvedených nukleových kyselin s alespoň jedním regionem dané kombinace, přičemž tento region obsahuje matici oligonukleotidových sond, z nichž alespoň jedna odpovídá každému z uvedených polynukleotidů,
b) inkubuje uvedený vzorek s uvedeným regionem, čímž se umožní molekulám uvedené nukleové kyseliny navázat se na uvedené oligonukleotidové sondy, odpovídající uvedenému polynukleotidů, které jsou komplementární k Částem uvedené nukleové kyseliny,.
c) inkubuje uvedený region, obsahující molekuly uvedené nukleové kyseliny, vázané na jednu nebo více oligonukleotidových sond, odpovídajících polynukleotidů, s detektorovým oligonukleotidem, které odpovídají polynukleotidů, se kterým koresponduje konkrétní jedna z oligonukleotidových sond uvedené matice, čímž se naváží detektorové oligonukleotidy na molekuly nukleových # * 4« « · · · • · · « * · «a ·« • · · » « • · · · kyselin, které jsou již navázány na danou oligonukleotidovou sondu nebo na jiné oligonukleotidové sondy, které jsou komplementární uvedené nukleové kyselině,
- 46 • · · ·» · » · ·
d) detekuje se přítomnost uvedených detektorových oligonukleotídů, Čímž se identifikuje, které oligonukleotidové sondy, odpovídající polynukleotidu, z uvedené matice jsou komplementární Částem nukleové kyseliny, která se váže k uvedené dané oligonukleotidové sondě, odpovídající polynukleotidu, a tím se identifikuje, které polýnukleotidy jsou komplementární k uvedené dané nukleové kyselině, přičemž uvedená matice kotev oligonukleotídů se mobilizuje na oblasti kombinace, která obsahuje
1) povrch obsahující určitý počet vzájemně oddělených, v podstatě identických oblastí ekvivalentních počtu polynukleotidů, které se mají studovat, přičemž každá oblast obsahuje
2) určitý počet různých kotev, ekvivalentních polynukleotídům, které se mají studovat, přičemž každá kotva je ve spojení s
3) bifunkčním íinkerem, který má první část specifickou pro kotvu a druhou část, která obsahuje oligonukleotidovou sondu, která odpovídá nejméně jednomu z uvedených polynukleotidů.
• · · ♦ • » a
- 47 9 tí • · • · · ·
Podle dalšího aspektu vynálezu zahrnují shora uvedené způsoby k mapování ESTŮ nebo jiných polynukleotidů dále ještě odstraňování nenavázaných podílů vzorku mezi jedním nebo více stupni.
V dalším provedení podle vynálezu se jeden nebo více RNA cílů, o které jde (např. mRNA nebo jiných typů RNA) převádí na cDNA reverzní transkríptázou a tyto cDNA se potom hybrídízují na maticí sond. Tento typ testů je ilustrován schematicky na obr. 8. RNA extrakty (nebo čištěná mRNA) se připravují z buněk nebo tkání jak je zde popsáno. Reverzní transkriptáza a oligonukleotidové priméry, které jsou specifické pro tyto RNA, o které je zájem, se pak přidají k vzorku RNA a s použitím podmínek, které jsou v oboru známy a způsobu, které se mohou provést rutinně i optimalizovat, se generuje první řetězec cDNA. Termín specifický primér znamená, že je to takový, který je dostatečně komplementární k mRNA, o který je zájem, při navázání na tuto RNA za zvolených přísně hybridizačních podmínek a může být rozpoznán reverzní transkríptázou, ale který se neváže na nežádoucí nukleové kyseliny (viz shora např. diskuse o vhodných reakčních podmínkách k dosažení specifické hybridizace). Reziduální RNA - mRNA, které nebyly rozpoznány specifickými priméry a/nebo jinými typy kontaminujících RNA v RNA extraktu, jako jsou např. tRNA nebo rRNA - se mohou odstranit jakoukoliv varietou ríbonukleáz nebo chemickými postupy, jako je např. působením alkalické látky, odštěpující zadní jednoduchý řetězec cDNA, která se v podstatě uvede do kontaktu s maticí MAPS. Použití reverzní transkriptázy v tomto způsobu minimalizuje potřebu extenzivního nadměrného manipulování s RNA, která může být senzitivní k degradaci nukleázami a tak se s ní pracuje velmi špatně. Dále přídavná specifika, které se dosahuje specifickými priméry reverzní transkriptázy, dodává testu další vrstvu specifičnosti.
« ·
- 48 ···* ··· ··· ·· ·· ·· ···· ·· ····
Shora popsané cDNA se mohou popřípadě také namnožit před hybridizací, čímž se zesílí signál matice sond. Priméry oligonukleotidové reverzní transkriptázy popsané shora mohou obsahovat na 5'zakončení sekvence (které mohou být zhruba 22 - 27 nukleotidů dlouhé), které specifikují iniciační místa pro RNA polymerázu (např. T7, T3 nebo SP2 polymerázu nebo podobně).
V příkladě znázorněném na obr. 8 byl přidán T7 promotor sekvence k příměru reverzní transkriptázy. Místo rozpoznávající polymerázu se vkládá do cDNA a pak slouží jako rozpoznávací místo pro řadu transkripcí vhodnou RNA polymerázou (in vitro transkripce neboli IVT). Popřípadě se může mRNA, která byla takto generovaná, namnožit nebo zesílit dále s použitím PCR a vhodných primérů nebo cDNA sama o sobě se může také zesilovat. Způsoby transkripce a PCR jsou rutinní a v oboru jsou dostatečně známé.
Flexibilita PCR umožňuje mnoho variant způsobu podle vynálezu. Při jednom provedení tvoří jeden nebo oba priméry, které se používají k zesilování cíle, chemická úprava, která umožňuje specifické nebo nespecifické připojení výsledného PCR produktu k pevnému podkladu. Takovou chemickou úpravou může být například 5’-amidace, která umožňuje vazbu k povrchu podkladu jako jsou například destičky Costar’s DNA Bínd Plates, (například takových, které jsou modifikovány N-oxysukcínímidesterem) nebo maleínanhydrídem potažené destičky jako jsou Reactí-Bind plates od firmy Pierce, Rockford, IL). Způsoby vytváření oligonukleotídů jsou rutinní a v oboru známé. PCR produkt, zahrnující takový modifikovaný primér, může být navázán k jakémukoliv požadovanému podkladu, včetně pevného podkladu, například k vnitřním stěnám mikrotitrové jamky, tělískům (například nemagnetickým nebo nemagnetickým tělískům) nebo k jakýmkoliv povrchům zde popsaným. Pochopitelně může být PCR primér také navázán na podklad dříve, než se iniciuje PCR reakce. Několik cyklů PCR se může opakovat bez promývání, ale
- 49 • · · · s přebytkem navázaného priméru, aby výsledný produkt zůstal navázaný k podkladu. Toto připojení zesílené cílové sekvence usnadňuje promytí (nebo čištění) cíle, buď před jeho uvedením do kontaktu (například hybrídizaci s tímto povrchem) s podkladem obsahujícím kotvy a/nebo linkery, nebo po jeho uvedení do tohoto kontaktu s následným uvolněním z takového povrchu. V jiném provedení může jeden nebo oba priméry, používané pro zesílení cíle, obsahovat jedno nebo více míst pro restrikční enzym, která umožňují zavedení restrikčních míst, přiléhajících buď ke konci (nebo k jeho blízkosti) cílové sekvence, která je hledána. Restrikční místa se mohou dodat do zesíleného cíle pomocí PCR buď před jeho uvedením do kontaktu (například za účelem hybridizace s tímto povrchem) s podkladem obsahujícím kotvy a/nebo linkery, nebo po jeho uvedení do tohoto kontaktu. Restrikční místo(místa), zavedené(á) například tímto způsobem, mohou usnadnit klonování zesíleného cíle, poskytnutím klonovacích míst, která sousedí s cílovou sekvencí. Restrikční místa také mohou usnadnit čištění zesílené sekvence. Tak například se může jedno nebo několik restrikčních míst umístit v PCR priméru mezi cílově specifickou sekvenci a chemickou úpravu, která umožňuje připojení k podkladu. Po PCR zesílení nějakého cíle pomocí modifikovaného PCR priméru a navázání k podkladu přes chemickou úpravu se může kombinace promýt a pak rozštěpit v restrikčním místě (v několika restrikčních místech), Čímž se uvolní promytý cíl. Víz například obrázek 23.
Pří způsobech popsaných shora se pochopitelně dají použít jiná štěpitelná místa než jsou místa pro restrikční enzymy, například se dá použít peptid, který se pak štěpí specifickou proteázou, nebo se dá použit jiný komponent, který se dá štěpit a/nebo uvolnit fyzikálními, chemickými a/nebo jinými prostředky.
• · · · · ·
V jiném provedení obsahuje nejméně jeden z primérů, který se používá k zesílení cíle, sekvenci (která nemusí nutně být přítomna v cíli), která je specifická pro, například, pro cílově specifický hlásič nebo detekční linker.
Shora uvedené modifikace príméru mohou být pochopitelně použity spolu s jakoukoliv požadovanou kombinaci, a mohou se přidat do zesíleného produktu v jakékoliv fází testu.
Shora popsaný způsob, při kterém se mRNA cíle převedou na cDNA působením reverzní transkriptázy a/nebo se zesílí pomocí PCR před testováním na MAPS destičkách, se dá použít místo standardního MAPS testu pro jakoukoliv soustavu testů založených na RNA, která je shora popsaná.
V jiném provedení podle vynálezu se jeden nebo více cílů na bázi nukleových kyselin, o které je zájem, hybridizují se specifickými polynukleotidovými chránícími fragmenty a podrobí se nukleázové ochranné proceduře a tyto chrání fragmenty, které jsou hybridizované s cílem (s cíly), o který(é) je zájem, se pak testují na destičkách MAPS. Jestliže je cílem zájmu RNA a ochranným fragmentem je DNA, může nukleázová ochrana při MAPS testu (NPAMAPS) snížit náročnost na nadměrnou manipulaci s RNA, která může být citlivá na degradací kontaminujícími nukleázami, a tím může způsobovat těžkosti při manipulaci. V takovéto NPA-MAPS testu jsou sondami v matici oligonukleotidy o stejném zřetězení jako cílové nukleové kyseliny, o které je zájem, což je výhodnější než když jsou k nim komplementární jak je tomu ve standardním MAPS testu. Jedním příkladem testu NPA-MAPS je příklad, který je schematicky znázorněn na obr. 9.
- 51 ····· ·· · ·· « * · · · · · · · « · · · ♦ · · · ··· ··· • · ·· · · ···· ·· ····
Při testu NPA-MAPS může být cílem zájmu jakákoliv nukleová kyselina např. genomická DNA, cDNA, virová DNA nebo RNA, rRNA, tRNA, mRNA, oligonukleotidy, nukleové kyselinové fragmenty, modifikované nukleové kyseliny, syntetické nukleové kyseliny nebo podobně. Ve výhodném provedení podle vynálezu je používán způsob, který testuje jeden nebo více cílových mRNA, které jsou přítomny v tkáni nebo extraktu buněčné RNA. Vzorek, který obsahuje cíl (nebo cíle) zájmu se nejprve hybridízuje za zvolených přesných podmínek (viz shora diskuse o vhodných reakčních podmínkách pro dosažení specifické hybridizace) s jedním nebo více ochrannými fragmenty. Ochranným fragmentem je polynukleotid, který může být např. RNA, DNA (včetně PCR produktu), PNA nebo modifikované nebo substituované nukleové kyseliny, které jsou specifické pro část nukleové kyseliny, která je cílem zájmu. Termínem „specifický“ ochranný fragment je míněn polynukleotid, který je dostatečně komplementární k příslušnému zvolenému vaznému partnerovi, aby se za přesných zvolených podmínek navázal, ale aby se nenavazoval k ostatním nukleovým kyselinám, o které není zájem. Ochranný fragment může mít délku nejméně 10 nukleotidů, výhodně má délku 50 až asi 100 nukleotidů nebo je asi tak dlouhý jako celá cDNA. Ve výhodném provedení jsou ochranné fragmenty jednořetězcové DNA oligonukleotidy. Ochranné fragmenty specifické pro 100 cílů nebo více mohou vznikat jednou hybrídizacní reakcí. Po hybrídízací se vzorek ošetří směsí jedné nebo více nukleáz tak, aby zničily v podstatě všechny nukleové kyseliny s výjimkou ochranných fragmentů, které byly hybridizovány s nukleovými kyselinami, o které je zájem a (po případě) s částmi cílových nukleových kyselin, které byly hybridizovány a chráněny před napadením nukleázou v průběhu procedury nukleázového chránění (jsou ve zdvojeném hybridu). Např. jestliže vzorek obsahuje buněčný extrakt, nežádoucích nukleových kyselin, jako jsou genomické DNA, tRNA, rRNA a mRNA, které jsou jiné než cílové, mohou být tyto látky v podstatě v tomto stupni
- 52 • · • · zničeny. Jakákoliv varieta nukleáz se dá v tomto případě použít a to včetně pankreatických RNA z nukleázy fazolí, SI nukleázy, RNAzy A, ribonukleázy TI, exonukleázy III nebo pod., podle povahy hybridizovaných komplexů a podle nežádoucích nukleových kyselin, které jsou přítomny ve vzorku. RNAza H se může např. použít pro odstranění zbytkové navázané RNA na DNA chránícím fragmentu. Reakční podmínky pro tyto enzymy jsou velmi dobře známé a mohou být optimalizovány empiricky. Také lze použít chemických postupů jako je např. alkalická hydrolýza RNA. Jak je požadováno, vzorky mohou být zpracovány dále známými způsoby, pomocí kterých se odstraní nehybridizovaný materiál a/nebo se inaktivují odstraněné zbytkové enzymy (např. extrakcí fenolem, srážením, filtrací na koloně atd.). Proces hybridizace, který je následován nukleázou digescí a (popřípadě) chemickou degradací, se nazývá nukleázová chránící procedura; tyto chránící procedury již byly popsány (viz např. Lee et al (1978). Meth. Enzymol. 152 633-648. Zinn et al (1983). Cell 34, 865-879.). Vzorky se zpracují nukleázovou ochranou, pak následuje (popřípadě) procedura inaktivace nukleáz a pak se uvedou do kontaktu s maticí sond MAPS a provedou se obvyklé kroky testu na MAPS. Navázané chránící fragmenty se mohou detekovat hybridizací, za účelem značení cílově specifických hlásičů, jak je pospáno zde pro standardní MAPS testy, nebo mohou být chránící fragmenty samy o sobě značeny, kovalentně nebo nekovalentně, pomocí detekovatelné molekuly.
Ve výhodném provedení se přímo značí chránící fragment, což je lepší než když se značí hybridizací s cílově specifickým hlásičem. Tak např. hlásič je navázán na ochranný fragment pomocí interakce ligand - antiligand, např. streptavidinový enzymový komplex se přidá k biotinylovanému chránícímu oligonukleotidu. V jiném případě se ochranný fragment modifikuje chemicky (např. přímou kopulací koňské peroxidázy (HRP) nebo fluorescenčního barviva) a
- 53 • ·
tato chemická modifikace se detekuje, buď s pomocí části nukleové kyseliny chránícího fragmentu nebo bez ní (např. po štěpení modifikace řekněme enzymaticky nebo chemicky). V jakékoliv ze shora uvedených metod se ochranný fragment značí před nebo po hybridizaci s korespondující molekulou linkeru.
Za účelem kontroly, že nukleázová ochranná procedura funguje správně, tj. že nehybridizované nukleové kyseliny byly digestovány jako nežádoucí, se dá navrhnout jeden nebo více ochranných fragmentů, který by obsahoval anti-sense (nehybridizovaný) segment, který by se štěpil nukleázou v případě, že procedura pracuje správně. Přítomnost nebo absence takového opačně fungujícího kontrolního fragmentu se pak dá stanovovat komplementární hybridizaci, značenou detekční sondou nebo anti-sense dílem chránícího fragmentu, který může být jako takový značen, kovalentně nebo nekovalentně, pomocí detekovatelné molekuly. Tato kontrola se může provádět před tím, než je vzorek uveden do kontaktu s maticí sond, nebo jako část testů MAPS jako takových. Příkladem takového kontrolního testu je test popsaný v příkladu 15. Pochopitelně vzhledem k tomu, že různé značení se může snadno rozpoznat (např. fluory s různým absorpčním spektrem) je v tomto testu zahrnuto několik možných různých značených olígonukleotídů. Dále se dá v průběhu vývoje testu použít standardní nukleázový chránící test, který využívá analýzy gelovou elektroforézou, Čímž se ověří, že chránící fragmenty jsou využity a uplatňují se dle očekávání.
Po detekci cílů se může signál detekční sondy (například HRP-značené) eliminovat (například denaturací, zabitím, ochlazením, supresí, blokováním), promytím destiček se odstraní veškeré zbytky reakčních činidel, aktivních látek nebo pufrů, které by mohly rušit následující krok (například denaturačnim činidlo), a pak se to co zůstalo může detekovat odlišnou detekční sondou (například opět • · • * · ·
- 54 značenou HRP). Po aplikaci denaturace signálu se může v kterékoliv fázi testu provést navázání odlišné sondy se stejnou signální skupinou. Použití dvou různých fluorescenčních sond a dvoubarvé detekce je možné i bez denaturace či blokování signálu.
NPA-MAPS testy se mohou použít ke kvantifikací množství cíle ve vzorku. Pokud se přidá chránící fragment ve velkém molárnim přebytku oproti cíli za účelem dosažení zcela kompletního průběhu hybridizační reakce, množství chránícího fragmentu, které zůstává po stupni nukleázové ochrany, bude ovlivněno tím, jak mnoho cíle je přítomno ve vzorku. Příkladem takové reakce pro kvantitativní stanovení jsou příklady 12 a 13.
NPA-MAPS testy se mohou použít k implementaci jakýchkoliv metod, popsaných shora, které využívají MAPS testů.
Ve výhodném provedení se polynukleotidové chránící fragmenty měří hmotnostním spektrometrem, což je výhodnější než na MAPS destičkách. V nejvýhodnějším provedení se v průběhu hybridizace nebo v průběhu stupňů nukleázové digesce nenavazují žádné polynukleotídy (připojené) k pevnému povrchu. Po hybridízací se hybridizační cíl degraduje, např. nukleázou nebo chemickým zpracováním, přičemž se odštěpí chránící fragment ve stejném poměru v jakém byl hybridizován s cílem. Alternativně se dá postupovat tak, aby se odštěpila (jednořetězcová) hybridizační část cíle, nebo se vytvoří duplex hybridízací cíle a chránícího fragmentu, který se dále analyzuje. Vzorky, které se mají analyzovat, se oddělí od zbytku hybridizační a nukleázové směsi (např. srážením etanolem nebo adsorpcí nebo afinitní chromatografii atd.), eluují nebo se rozpustí a vstříknou se do hmotnostního spektrometru opakovači tryskou pro vysoký výkon. Ve výhodném provedení, které se mají analyzovat (např. ochranné fragmenty) adsorbují k povrchu a analyzují se laserovou
desorpcí, přičemž se používá velmi dobře známých metod z oboru. Pro dosažení vysoké citlivosti se použije spektrometru Fourier Transform Mass Spectrometry (FTMS) nebo jiného podobného zařízení vyspělé techniky, tak aby se mohl detekovat fragment množství na úrovni femtomolů nebo méně.
Ochranné fragmenty, které se mají v jednom nebo více vzorcích detekovat se mohou navrhnout tak, aby poskytovaly jediný signál pro hmotnostní spektrometr, který se používá. V jednom z možných provedení každý z ochranných fragmentů má stejnou molekulovou hmotnost po hybridizaci a ošetření nukleázou, a jejich molekulové hmotnosti a ionizační vlastnosti a průběh fragmentace jsou dostatečné k měření jejich koncentrace. Aby se dosáhlo zvýšení senzitivity a zlepšila se analýza komplexních směsí, mohou se chránící fragmenty modifikovat (např. se mohou připravovat jejich deriváty) pomocí chemických skupin, které se volí tak, aby poskytovaly čistý jednotný signál. Tak např. každý ochranný fragment se může přeměnit na derivát působením jiné přírodní nebo nepřírodní aminokyseliny, která se připojí přes amidovou vazbu na oligonukleotidový řetězec v jedné nebo více polohách podél hybridizační části řetězce. S pomocí hmotnostního spektrometru o vhodné energií se projeví fragmentace na amidových vazbách, uvolní se charakteristické části aminokyselin. Tento typ přístupu, pří kterém se používají chemické skupiny s moderovanou velikostí (zhruba o molekulové hmotnosti 80 - 200) se používá pří hmotnostní spektrometrii zakončení a je žádoucí, neboť molekuly o této velikosti se obecně snadněji detekují. V jiném příkladě se chemická modifikace organické molekuly s definovaným spektrometrickým signálem jako je tetraalkylamoniová skupina, která může být např.odvozena od jiné molekuly, jako je např. aminokyselina. V jiném případě je pozitivní nebo negativní iontový signál zesilován reakcí s jakýmkoliv počtem činidel. Tak např. ke zvýšení detekce pozitivního iontu se dá použít reakce pyriliové soli (jako je např.2-4• · · ···· « ····· ·· · ·
- 56 ···· ··· ··· ** ·· ·· ···· «· 1191 diethenyl, 6-etyl-pyryliumtetrafluorborát nebo mnoho dalších) s aminem, čímž se vytvoří pyridinové soli; lze také použít jakákoliv jiná podpůrná činidla, která pozitivně ovlivní funkční skupiny (viz např. Quirke et al (1994). Analytical Chemistry 66, 1302-1315). Podobně se může uvést do reakce jakýkoliv počet v oboru známých činidel, který podporuje vytvoření negativního iontu. Chemická modifikace se může detekovat pochopitelně buď po odštěpení od nukleové kyseliny nebo při asociaci s nukleovou kyselinou. Umožněním každého chránícího fragmentu, aby byl identifikován odlišným způsobem, je také možné testovat (např. provádět screening) velký počet různých cílů (např. 2, 6, 10, 16 nebo více odlišných cílů) v jediném testu. Mnoho takových testů se dá provádět rychle a snadno, pomocí vynálezu se takovéto testy nebo soubory testů mohou provádět, neboť se dosahuje vysokého výkonu, jak je zde definováno.
Pokud jde o případy, kdy se oligonukleotidy detekují přímo pomocí jejich hmotnosti nebo v případě, že se použijí vzácná molekulární zakončení, signály každé molekuly, která se má detekovat, lze plně charakterizovat v čistých preparátech o známých koncentracích. To umožňuje pro každý signál kvantifikovat (měřit, kvantitativně stanovit) přesně. Pro každou molekulu, která se má detekovat pomocí hmotnostní spektrometrie se nemůže intenzita a profil vždy předem předpovědět přesně. Tato tendence molekul k ionizací, citlivost všech chemických vazeb uvnitř molekuly na fragmentaci, stupeň, ve kterém se každý fragment multiplikuje nebo na jeden nebo dva náboje se pro všechny komplexy může předpovědět. Nicméně při použití určitého daného zařízení se stálou energií a s určitou charakteristikou zpracování vzorku jsou intenzita a profil signálu velmi reprodukovatelné. Z těchto důvodů lze charakterizovat pro každou sondu signál pomocí čistých standardů a signál, který poskytuje experiment lze velmi přesně kvantifikovat.
- 57 • «
Podle jednoho aspektu se vynález týká způsobu detekce jedné nebo více nukleových kyselin, o které je zájem analyzovat, při kterém se podrobí vzorek obsahující nukleové kyseliny, o které je zájem analyzovat, nukleázové ochraně jedním nebo více chránícími fragmenty a detekci hybridízovaného duplexu molekul nebo chráněné nukleové kyseliny nebo chránícího fragmentu, pomocí hmotnostní spektrometrie.
Způsoby analyzování nukleových kyselin hmotnostní spektrometrií jsou v oboru dobře známé. Víz např. Alper et al (1998). Science 279,2044-2045 and Koster, U.S.Pat. No. 5,605,798.
Kromě toho, že lze využít řadu vysoce výkonných testů shora pospaných, je evidentní pro odborníka v oboru, že lze využívat i mnoha dalších.
Výhodou k používání multisondových testů je schopnost začlenit řadu „kontrolních“ sond do každé matice sond, která se podrobuje stejným reakčním podmínkám jako funkční experimentální sondy. Tak např. každá oblast v matici může obsahovat pozitivní a/nebo negativní kontroly. Termín „pozitivní kontrolní sonda“ se zde používá v takovém významu, že znamená kontrolní sondu, která je známá např. tím, že výrazně ínteraguje s cílem nebo ínteraguje s cílem v kvantitativním nebo kvalitativně známým způsobem, čímž působí jako (interní) standard pro interakci sonda/cíl. Takováto sonda může např. kontrolovat hybridizační účinnost. Termín „negativní kontrolní sonda“ se zde používá tak, že má význam kontrolní sondy, které mohou např. kontrolovat hybridizační specifitu. Jako příklady typů kontrol, které se dají použít za předpokladu, že se provádí test, při kterém se používá matice oligonukleotidových sond k screeningu na činidla modulující expresi souboru korelativních genů na určitou chorobu. Jako interní normalizační kontrola pro proměnné jako je počet
- 58 • · tttt·· rozložených buněk u každého vzorku, spotřeba mRNA nebo hybridizaění účinnost může matice sond zahrnovat sondy, které jsou specifické pro jednu nebo více základních hladin nebo konstitutivních domácích genů, jako jsou strukturální geny (např. aktin, tubulin nebo jiné) nebo DNA vazné proteiny (např. transkripcí regulující faktory nebo jiné), jejíchž exprese se neočekává, že by měla být modulována činidly, která se testují. Dále aby se zjistilo, zda Činidla, která se testují, způsobují nežádoucí vedlejší efekty, jako je např. usmrcování buněk nebo toxicita, může obsahovat matice sondy, které jsou specifické pro geny, které jsou známé tím, že jsou indukovány jako součást procesu apoptózy (programované smrti buněk) nebo které jsou indukovány za podmínek poranění buněk (např. proteiny tepelného šoku) nebo buněčnou toxicitu (např. geny p450).
V matici mohou být za účelem „jemného doladění“ zahrnuty také jiné kontrolní sondy, aby se jemně doladila citlivost testu. Tak např. pokud se jedná o test na činidla, která modulují produkci mRNA spojených s určitým chorobným stavem. Jestliže předchozí analýza indukovala, že jedna z korelativních mRNA (řekněme mRNA-A) v souboru je produkována v takto velkých množstvích ve srovnání s jinými, že její signály vyzařují jiné mRNA, mohou se linkery nastavit na „jemné ladění“ testu tak, aby byly vyrovnány síly těchto jednotlivých signálů. „Blokované linkery“, které zahrnují oligonukleotidové sekvence specifické pro kotvu, navržené na mRNAA cíl, ale kde chybí sekvence specifická pro sondu, se mohou přidat k roztoku směsí určitých cílově specifických Iínkerů a tak snížit citlivost testu vůči této mRNA. Vhodné poměry blokovaných a neblokovaných linkerů se dají stanovit rutinním způsobem, konvenčními metodami, které mohou provést odborníci v oboru.
Jemné ladění testu pro určitý cíl zředěním aktivního elementu neaktivním elementem se také může provést v jiných fázích • to to* • to • · ·· ····
- 59 ·« «··· testu. Tak například se může provést na úrovni detekce zředěním značeného, cílově-specifického hlásiče inaktivním cílověspecifickým hlásičem, například takovým, který má stejnou cílověspecifickou skupinu (například oligonukleotidová sekvence), ale bez signalizační entity nebo s deaktivovanou nebo ínaktivní formou signalizační entity. Termín signalizační entita, jak je zde používán, znamená značení, charakteristický zbytek, molekula nebo jakákoliv látka, která emituje detekovateíný signál nebo je schopna takový signál generovat. Může to být například fluorescenční molekula, liminiscenční enzym nebo jakákoliv varianta signalizační entity, která je zde zmíněna. V mimořádně výhodném provedení se dá jemné doladění provést ve stupni, ve kterém se uvádí do kontaktu komplex, obsahující cíl, s detekčním linkerem (detekční linkery jsou popsány dále, například v části popisu, která se týká detekčních metod, využívajících vrstvené komplexy, příklad 23 a obrázek 24.). Soubor detekčních linkerů se dá navrhnout například tak, aby se dosáhlo jemného vyladění citlivosti na každý jednotlivý cíl, hledaný v testu.Tak například jestliže o určitém cíli je známo, že je přítomen ve vzorku ve velmi vysokých koncentracích, může se detekční linker pro tento cíl zředit empiricky-stanovitelným množstvím blokovaného detekčního linkeru, který obsahuje skupinu, specifickou pro tento cíl (například oligonukleotidovou sekvencí), ale neobsahuje žádnou skupinu, specifickou pro hlásící Činidlo (reportér), nebo obsahuje skupinu, specifickou pro skupinu, specifickou pro hlásící činidlo, která byla jíž předem navázána na ínaktivní hlásící činidlo. To znamená, že místo skupiny, specifické pro hlásící činidlo, může tato skupina chybět nebo jí může být zabráněno (například blokováním) v interakci (například hybridizaci) s hlásícím činidlem. Toto jemné ladění bývá někdy označováno jako zeslabování.
Příklady, které se mají testovat v testu podle vynálezu mohou být jakékoliv cíle shora popsané, nebo jiné. Kapalné vzorky, • ♦ 0 0
- 60 • ♦ · »91 • · *000 0 0 0 ·0 « které se mají testovat, mohou mít jakýkoliv vhodný objem a velikost testované oblasti se může pohybovat od asi 100 nanolitrů do asi 100 mikrolitrů. Ve výhodném provedení se tekuté kapky asi 1 mikrolitrů nanášejí do každé jamky z 1536 jamkového mikrotitrové destičky. Vzorky se mohou umístit do kontaktu s maticemi sond pomocí jakéhokoliv typu metody vhodné pro vysoce výkonnou analýzu, např. pípetování, nastříkávání pomocí replíkačních jehlových zařízení. Vzorky se inkubují za podmínek (např. koncentrace solí, pH, teplota, doba inkubace, atd. viz shora) efektivní k dosažení vazby nebo jiné stabilní interakce sondy a cíle. Tyto podmínky jsou stanovitelné rutinním způsobem. Po inkubaci se vzorky popřípadě ještě nějak ošetří (např. promyjí), aby se odstranil nenavázaný cíl, pomocí podmínek, které jsou determinovány empiricky se ponechají specifické interakce, ale odstraní se nespecificky vázaný materiál. Tak např. vzorky se mohou promýt mezi jednou až desetkrát nebo víckrát stejným nebo poněkud více přesně stanoveným roztokem, který se používá k dosažení vazby sonda/cíl.
Vzorky obsahující cílové RNA, např. mRNA, rRNA, tRNA, virovou RNA, celkovou RNA, se mohou připravovat jakýmkoliv typem způsobu. Tak např. buněčné kultury in vitro, ze kterých se extrahuje mRNA se mohou umisťovat na povrchu oblastí jako jsou individuální jamky nebo míkrotítrové destičky. Po případě tyto buňky mohou po dosažení žádané buněčné hustoty, být ošetřeny činidlem podle potřeby, jako je stimulační činidlo nebo potenciální terapeutický prostředek, které se může přidat do buněk jakýmkoliv známým způsobem, např. s replikačním jehlovým nástrojem (jako jsou jehly dostupné od firmy Beckman 96 nebo 384) pipetováním nebo ink-jet podáním a inkubují se s buňkami po vhodnou dobu např. 15 minut a až 48 hodin, v závislosti na povaze testu. Celková RNA, mRNA atd. extrakty z tkání nebo buněk z in vitro nebo in vivo zdroje se mohou připravit rutinním způsobem • ·
- 61 * 9 * • · » »· • » • · · >· * · » «
1 9 > « · r • 6 · ·· » * i » * · « · ♦ Φ * • 99 *
9 · · 9i · metodami, které jsou známy v oboru (např. komerčně dostupnými soupravami).
Popřípadě mohou nukleové kyseliny, které jsou schopny hybrídízace s RNA, o kterou je zájem analyzovat, použít pro specifickou sondu (tj. genomíckou DNA, rRNA, tRNA nebo mRNA, které maskují alespoň jednu parciální sekvenční homologíi s RNA, o kterou je zájem. Ty mohou být alespoň Částečně odstraněny ze vzorku RNA před zpracováním vzorku s nukleázovou ochranou (NP) před podrobením vlastní hybrídízace. Nukleová kyselina („chránící fragment“, která může být např. RNA, DNA nebo PNA), která je komplementární k alespoň jedné části RNA, o kterou je zájem a jejíž sekvence se částečně nebo úplně překrývají s těmi, které má sonda, které jsou specifické pro RNA, o kterou je zájem analyzovat, se zavádějí v přebytku do vzorku a inkubují se za přesně zvolených hybridizačních podmínek, ve kterých tento chránící fragment hybridizuje specificky s RNA, o kterou je zájem analyzovat (viz shora diskusi o vhodných reakčních podmínkách). V tomto stupni se mohou přidat chránící fragmenty specifické pro jakoukoliv ze všech RNA, o které je zájem (např. asi 100 nebo více). Po hybridizaci se na vzorek působí směsí jedné nebo více nukleáz tak, aby se zničily v podstatě všechny nukleové kyseliny s výjimkou částí každé RNA, o kterou je zájem analyzovat, která je komplementární k chránícímu fragmentu (fragmentům) nebo s výjimkou duplexů vytvořených mezi chránícími fragmenty a chráněnou RNA. V následném stupni se chránící fragment (fragmenty) mohou eliminovat z takových duplexů denaturací duplexů a digescí pomocí vodného enzymu, který degraduje chránící fragment (y), přičemž ponechá chráněnou RNA v podstatě netknutou. Lze použít jakýkoliv typ nukleázy např.shora diskutovaný stupeň digesce včetně např. pankreatické RNAzy, nukleázy z fazole, RNAzy H, Sl nukleázy (za podmínek digesce s vysokou nebo nízkou koncentrací soli), RNAzy A, ribonukleázy TI, exonukleázy III, exonukleázy VII, RNAzy
- 62 ···· · · · · · · • · ·· ·· ···· ·· ····
CL3, RNAzy PhyM, Rnase U2, a pod. podle povahy hybridizačních komplexů a nežádoucích nukleových kyselin přítomných ve vzorku. Reakční podmínky pro tyto enzymy jsou velmi dobře známé v oboru a lze je optimalizovat empiricky. Jak je požadováno, vzorek se může ošetřit známými způsoby, aby se odstranil nehybrídizovaný materiál a/nebo ínaktívovaly nebo odstranily rezíduální enzymy (např. fenolíckou extrakcí, srážením, kolonovou filtrací atd.). Ošetřené vzorky se pak uvedou do kontaktu s maticí sond. Za účelem kontroly specifické hybridizace a následné nukleázové ochrany se jeví jako užitečné, když se použijí značené chránící fragmenty, které jsou součástí této reakční směsi. Za účelem kontroly, že procedura nukleázové ochrany správně funguje, tj. že se nehybridizované nukleové kyseliny spotřebovávají tak, jak je to žádoucí, se může navrhnout jeden nebo víc chránících fragmentů, které obsahují opačné (nehybridizující) segmenty, které by měly být štěpeny nukleázami, pokud test správně pracuje. Přítomnost nebo nepřítomnost opačných fragmentů se může stanovit hybridizaci s komplementární, značenou sondou, nebo opačnou částí ochranného fragmentu, který jako takový může být značen detekovatelnou molekulou.
Pro mnoho způsobů podle tohoto vynálezu může být značený (navázaný) jakýkoliv postup, který je dobře známý v oboru a/nebo který je popsán kdekoliv zde v přihlášce (např. pro detekcí fragmentů nukleázové ochrany). Tak např. cílové molekuly se mohou kopulovat přímo nebo nepřímo s chemickými skupinami, které poskytují signál pro detekci, jako jsou chemoluminiscenční molekuly, nebo enzymy, které katalyzují produkci chemoluminiscenčních molekul, nebo fluorescenčních molekul jako je fluorescein nebo cy5 nebo se může řešit pomocí takového typu fluorescenčních molekul, které využívají chelatované lantanidy, nebo radioaktivní sloučeniny. Alternativně se cíle mohou značit poté, co již zreagovaly se sondou jedním nebo dvěma cílově specifickými hlásiči (např. protilátky, • · · ·
- 63 olígonukleotidy jak jsou znázorněny na obr. 1 nebo jakýkoliv obecný typ molekul diskutovaný shora ve spojení se sondami a cíli).
Jedním typem fluorescenční molekuly může projevovat nahoru převádějící fosforescencí (t.j světélkování, při kterém látka absorbuje záření o dlouhé vlnové délce, například infračervené, a je tímto zářením excitována, načež vlivem excitace emituje záření o kratší vlnové délce, například viditelné světlo). Jelikož fosforescencní látky tohoto nahoru převádějícího typu absorbují delší vlnové délky než většina potenciálně rušivých materiálů, přítomných obvykle v analyzovaných vzorcích, umožňují tyto nahoru převádějící fosforescencia oproti fosforescenčním látkám, absorbujícím kratší vlnové délky, omezit rušení, způsobené materiálem vzorku. Úzké emisní spektrum většiny nahoru převádějících fosforescenčních látek také umožňuje současnou detekci záření většího počtu odlišných nahoru převádějících fosforescenčních látek. Nahoru převádějící fosforescencia jsou v oboru dobře známé a obvyklé. Patří mezi ně například ionty kovů vzácných zemin, například yterbium (Yb), erbium (Er), thulium (Tm) a praseodym (Pr), zejména ve formě oxysulfidových solí. Bylo již popsáno asi 80 nebo více nezávisle detekovatelných, nahoru převádějících fosforescenčních látek. (Víz například Bíological Agent Detection and Identification, duben 27-30, 1999, DARPA, Bíological Warfare Defense, Defense Sciences Office. FosforescenČní látky se mohou popřípadě navázat na jakýkoliv povrch, například na mikrokuličku nebo na latexové zrno. Stejně jako ostatní fluorescenční značení, mohou se nahoru převádějící fosforescencia detekovat jakýmkoliv převedením energie do značení (nebo modulací značením), které na dostatečně blízkém linkeru, cíli nebo hlásiči. Kromě toho se nahoru převádějící fosforescencia mohou, stejně jako jiní signalizující entity zde popsané, použít ke kvantitativnímu stanovení množství cíle a mohou se použít v jakékoliv variantě zde • · • ·
- 64 popsaného způsobu, například k detekci nukleázových chránících fragmentů.
Nahoru převádějící fosforescencia se pochopitelně mohou použít k detekci cílů, které jsou na povrchu rozmístěny jakýmkoliv způsobem, například k detekcí cílů (včetně nukleázových chránících fragmentů), které jsou navázány přímo na povrch, dále těch, které jsou navázány přímo na maticí různých olígonukleotídů na povrchu, nebo které jsou navázány přes bifunkění linkery ke kotvám (různé nebo v podstatě identické), rozloženým na povrchu v podstatě rovnoměrně, či v jakémkoliv požadovaném obrazci či tvaru. Lze použít jakýkoliv povrch, například průtočný systém, nebo pevný povrch například na povrch perličky. Tyto perličky, používané při uvedených testech podle vynálezu, mohou být libovolného typu, například vyrobené z libovolného materiálu, magnetického nebo nemagnetického, přičemž v jednom testu mohou být používány perličky v podstatě stejné, nebo různé co do velikostí a/nebo tvarů.
Dá se také použít řada dalších detekčních komplexních postupů sendvičového typu. Tak např. cíle se mohou hybridizovat s bífunkční molekulou obsahující první skupinu, která je specifická pro cíl a druhou skupinu, která může být rozpoznána běžnými (tj. stejnými) hlásícími Činidly, např. značeným polynukleotidem, protilátkou nebo podobně. Bífunkční molekuly se mohou navrhnout tak, že mohou být použity při testu s jakýmkoliv známým hlásičem.
Pro jakékoliv varianty způsobu podle vynálezu se dají použít ke značení (napojení charakteristického zbytku) různé detekční způsoby komplexního sendvičového typu. Tak například cíl může interagovat, například formou hybridizace, s bífunkční (nebo multifunkční) molekulou (tzv. detekčním Iinkerem) obsahujícím první skupinu, která je specifická pro cíl, a druhou skupinu, která je • ·
- 65 specifická pro hlásící činidlo. Termín specifický pro, jak je zde používán ve smyslu interakcí, například s sond a cílů. Termín hlásící činidlo, jak je zde používán, znamená značený polynukleotid, protilátku nebo jakýkoliv obecný typ molekuly, diskutované zde v souvislostí se sondami a cíly. Tyto dvě skupiny detekčních línkerů mohou rozpoznat příslušné vazebné partnery (ínteragovat nebo asociovat s nimi), jakýmíkolív způsoby, shora diskutovanými v souvislostí se sondami a cíly. Detekční linker může také obsahovat jiné sekvence, například sekvence, které jsou specifické pro cíl ale jsou odlišné (nepřesahující) od cílově-specifické skupiny odpovídajícího Iinkeru, navázaného na kotvu. Jakákoliv sekvence, přítomná v detekčním Iinkeru, může sloužit jako rozpoznávací sekvence pro detekční sondu nebo hlásící činidlo. Ve výhodném provedení je detekčním linkerem polynukleotid.
Detekční linkery se dají navrhovat tak, že se v matici může použít libovolný požadovaný počet obecných hlásičů. Tak například se dá navrhnout soubor detekčních linkerů tak, aby každý detekční linker byl specifický pro jiný cíl, ale obsahoval vazné místo pro stejný (obecný) cíl, nebo pro jedno z omezeného počtu hlásících činidel. Schopnost použít omezený počet hlásících činidel (například j edno), pro značení více různých cílů v jediném testu poskytuje výhodu snížených nákladů a nižších pozadí. Pochopitelně detekční kombinace linker/hlásíč se dá použít k detekci cílů, které jsou rozmístěny jakýmkoliv způsobem na povrchu, například jak je popsáno shora při popisu typů uspořádání cílů, které se dají detekovat pomocí nahoru převádějících fosforescenčních látek.
Ve většině výhodných provedení se detekční linkery dají navrhnout tak, aby detekovaly nukleázové chránící fragmenty takovým způsobem, aby chránící fragmenty, které byly nukleázou z kontroly překrývajících se sekvencí v průběhu nukleázového chránícího
• ·
- 66 postupu (jak je popsán v příkladu 15), byly preferenčně označeny. Tento typ detekce je schematicky znázorněn na obrázku 24. V tomto provedení obsahuje detekční linker první funkční skupinu, která je specifická pro cíl, a druhou funkční skupinu, která je specifická pro běžnou kontrolní přečnívající sekvencí, která je ve výhodném provedení na startu testu přítomna v podstatě ve všech nukleázových chránících fragmentech. Pokud, jak je to žádoucí, kontrolní přečnívající sekvence se odštěpí od nukleázového chránícího fragmentu již v průběhu nukleázové chránící reakce, a cílově-specifická skupina detekčního linkeru se pak nenaváže a zůstane funkční pro další hybridizaci. Na druhé straně, pokud se kontrolní přečnívající sekvence od chránícího fragmentu neodštěpí (například z důvodů neúplné digesce nukleázy v průběhu nukleázové chránící procedury), obě specifické funkční skupiny detekčního linkeru (skupina specifická pro cíl a skupina specifická pro kontrolní přečnívající sekvenci) budou hybridizovat s chránícím fragmentem a nebudou pro další hybridizaci funkční. Ve výhodném provedení se komplexy obsahující nukleázové chránící fragmenty a navázané detekční linkery potom hybridizují v dalším kroku na hlásící činidlo, které obsahuje signalizující entitu (například fluorochrom, hapten, enzym nebo jakoukoliv další molekulu, nesoucí detekovatelný signál nebo entitu, generující signál) a funkční skupinu (např. oligonukleotíd), která je specifická pro skupinu detekčního linkeru, specifickou pro kontrolní přečnívající sekvencí. Hlásící činidlo je výhodně vázáno a značeno komplexy, ze kterých je již před tím kontrolní přečnívající sekvence nukleázového chránícího fragmentu odštěpena (t.j. komplexy, ve kterých je skupina detekčního linkeru, specifická pro kontrolní přečnívající sekvenci, přístupná pro další hybridizaci s hlásícím činidlem).
Řada dalších obměn sendvičových detekčních postupů je odborníkovi v oboru již zřejmá.
• · • · · · • ·
- 67 ···· ··« · *• · ·· ·· ···· · · ····
Způsoby, kterými se mohou cíle inkubovat s cílově specifickými hlásiči za podmínek účinných pro dosažení vazby nebo jiných stabilních interakcí, jsou stanovitelné rutinním způsobem (viz shora). Tak. např. fluorescenční oligonukleotidové hlásiče (při koncentraci asi 10 nM až asi 1 μΜ nebo více, výhodně asi 30 nM v pufru jako je 6X SSPE-T nebo v jiných) se mohou inkubovat s navázanými cíli po dobu mezi asi 15 minutami a 2 hodinami nebo více (výhodně asi 30 až 60 minut) při teplotě mezi asi 15° C a asi 45° C (výhodně asi při pokojové teplotě). Po inkubaci se mohou vzorky po případě ještě ošetřit (např. promýt) za účelem odstranění nenavázaných cílově specifických hlásičů, za pomoci podmínek, které jsou stanovitelné empiricky, čímž se ponechají specifické interakce nedotčeny, ale odstraní se nespecificky vázaný materiál. Tak např. vzorky se dají promýt jednou až desetkrát nebo vícekrát za stejných nebo za přesných podmínek, než jsou ty, které byly dosaženy k získání vazby cíl/hlásič.
Zakončení značením pomocí cílově specifického hlásiče se může také použít na přídavné vrstvě, kterou se dosahuje specifika k původní hybridizacní reakci. Např. v případě, kdy cílově specifický oligonukleotidový hlásič je zacílen na jiné Částí sekvence cílové nukleové kyseliny, než je oligonukleotidová sonda nebo pří kterém sonda a hlásičové protilátky mohou rozpoznat různé epitopy cílového antigenu. Dále zakončení s cílově specifickými hlásiči může umožnit „ladění“ senzitivity reakce. Tak např. jestliže cílová mRNA, která je částí korelativního exprimovaného vzorce, je exprimována ve velice nízkých množstvích, hladina signálu se může zvýšit (zesílení signálu) hybridizací vázaného cíle s několika (např. asi 2 až asi 5 nebo více) cílově specifickými oligonukleotidovými hlásiči, z nichž každý hybridizuje specificky s jinou částí cílové mRNA.
• * • · * ·
- 68 • · » · · · · ·· ·· ·· ··
Schopnost detekovat dva typy označení nezávisle umožňuje další typ kontroly MAPS testů. Některé (např. asi 10 až asi 100 %) linkery navržené na konkrétní místa kotev (obr. 7 ukazuje tři typická místa kotev, kde každé obsahuje řadu v podstatě identických kotev (A, B nebo C)) mohou mít značku (např. fluor) připojenou k jednomu konci. Tak např. rhodamín nebo Cy5 fluor se může připojit na 5' zakončení línkeru. Takové modifikované linkery jsou označovány jako „kontrolní linkery“. Poté co byla směs linkerů a kontrolních linkerů asociována s kotvami a vzorek obsahující cíl byl inkubován s výslednou maticí sond, lze použít cílově specifický hlásič, nesoucí jiný fluor (např. fluorescein nebo jiné detekovatelné značení jako je chemoluminiscenční) nebo lze také použít cíl přímo značený fluorem nebo jinou detekční značkou); a poměr dvou signálů se dá v takovém případě stanovit. Přítomnost kontrolních linkerů umožňuje kalibraci řady funkčních (např. schopných interagovat s linkery) kotev uvnitř a mezi testovanými oblastmi (tj. testy kapacity každého místa matice na schopnost navázat cíl, za účelem normalizace signálů) slouží jako základ pro kvantifikaci množství navázaného cíle, pomoc při lokalizaci kotev na určité místo a/nebo poskytuje pozitivní kontrolu, např. v případě, kdy není žádný signál jako výsledek nepřítomnosti cíle ve vzorku. V jednom možném provedení podle vynálezu se také může použít dvou různé značených (např. fluoroforem) molekul k detekci různých populací cílových molekul; nicméně schopnost rozpoznat přítomnost cílů oddělenými signály umožňuje použít jeden typ značení pro různé cílové molekuly.
Schopnost detekovat značení nezávisle (například fluorescenčním značením, které odlišitelné vlnové délky, jako je například fluorescein a rhodamin, nebo různé nahoru převádějící fosforescenční látky) umožňují způsob podle vynálezu flexibilně obměňovat. Tak například každý ze dvou nebo více cílů může být přímo nebo nepřímo značen, jeho vlastním, jedinečně detekovatelným * » • « *·
- 69 ··· · · · »·» • * · » ·· ·♦*· · · · « » · značením. To umožňuje navíc k (nebo místo), například identifikaci pozice lokalizovaného cíle na povrchu, nebo identifikaci cíle podle velikosti perliček, na kterých je cíl lokalizován, detekovat cíle na bázi znaků, specifických pro tato značení (například barva emitovaného světla). V jiném provedení podle vynálezu se dá na jednom místě v rámci oblasti detekovat nezávisle více cílů. Tak například na místě, které je definováno jednou skupinou (v podstatě shodných) kotev, se dají detekovat dva i více cílů (např. 2, 3, 4, 5, 6 nebo více). To znamená, že se dá použít soubor linkerů, z nichž každý má část, specifickou pro tutéž kotvu a část specifickou pro jiný cíl. Pokud se použije soubor například čtyř takových linkerů, mohou se všechny čtyři tyto linkery navázat na členy skupiny kotev na jednom místě, což umožňuje, aby se na tomto místě vázaly různé cíle. Pokud je každý z těchto cílů značen (přímo nebo nepřímo) jiným, odlišitelným značením, může výzkumník stanovit přítomnost každého z těchto cílů na tomto místě nezávisle. Z tohoto důvodu se matice například pěti kotev (skupin kotev) v oblasti dá použít ve scénáři, popsaném shora, k detekci až dvaceti různých cílů. Takový test je ilustrován v příkladech 24 a 25. Podobně se dá větší množství cílů (80 nebo více) detekovat nezávisle, když se každý jednotlivý typ kotvy rozmístí, nikoliv na jedno místo, ale v jakékoliv potřebné podobě na pevném povrchu, jako je například povrch perličky nebo v průtočném zařízení. Pří tom se pro poskytnutí informace o identitě cíle nebo o identitě skupiny cílů se dá použít jiných znaků, například velikost perličky nebo rozložení.
V jiném provedení podle vynálezu se „kotvy“, které jsou specifické pro cíl (cíle), o které je zájem nespojují s linkery, ale spíše se asociují přímo s cíli; cíl(e) na druhé straně může interagovat po případě s cílově-specifickým hlásičem (hlásiči). Cíle, ať již jsou značené nebo neznačené, se dají detekovat kteroukoliv z řady projedu, které jsou rutinní a známé v oboru (viz např. Fodor et al(1996).
* ·
- 70 U.S.Pat.No. 5,510,270; Pirrung et al(1992). U.S.Pat.No. 5,143,854; Koster (1997). U.S.Pat.No.5,605,798; Hollis et al (1997) U.S.Pat.No5,653,939; Heller (1996). U.S.Pat.No.5,565,322; Eggers et al (1997). U.S.Pat.No. 5,670,322; Lipshutz et al (1995). Bio Techniques 19,442-447; Southern (1996). Trends in Genetics 12,110115). Detekční metody, které zahrnují detekce založené na enzymech, kolorimetrické metody, SPA, radiografií, hmotnostní spektrometrii, elektrické metody, detekci absorbance nebo luminiscence (včetně chemiluminiscence nebo elektroluminiscence) a detekci z rozkladu světla, např.z mikroskopických částic, se používají jako konečné. Detekce se také dá provádět pomocí fluorescenčních značení, např. zobrazováním pomocí CCD nebo fluorescenční mikroskopií (např. skenováním nebo souosým fluorescenčním mikroskopem) nebo spojení skenovacího systému CCD maticí nebo fotonásobičovou trubicí nebo použitím technologie založené na detekci matic (např. povrchový potenciál každé desetimikronové části testovací oblasti se může detekovat nebo úvaz do povrchové plazmové rezonance, čímž se získá dostatečná přesnost pro měření). Alternativně může matice obsahovat značku (např. sondu na bázi přenosu energie elektronového páru, jako např. je fluorescein a rhodamin), které mohou být detekovány tím, že dochází k přenosu energie (nebo modulací) značení na linker, cíl nebo hlásič. Mezi použitelné detekční systémy založené na fluorescenci jsou intenzita fluorescence, polarizace fluorescence (FP), časově odložená fluorescence, přenos fluorescenční rezonanční energie a homogenní časově odložená fluorescence (HTRF). Analýza opakujícího se grafu se dá provést analýzou grafu (přičemž se najde vhodný skok nebo linie pro každý specifický značený cíl je pozice vůči jiným liniím nebo vrcholům) následně se pak může provést kvantifikace intenzity těchto značení. Zařízení na grafy a počítačový software pro analýzu jedno nebo dvourozměrných matic jsou rutinně vytvářeny a/nebo komerčně dostupné (např. viz Rava et al(1996). U.S.Patent No. 5,545,531).
- 71 Způsoby výroby použití matic podle vynálezu, včetně přípravy povrchů oblastí jako jsou ty, které jsou zde popsány, syntéza čištěných a připojení a sestavování látek, jako jsou zde kotvy, linkery, sondy a detekční sondy zde popsané a detekce a analýza značených nebo specificky zakončených látek jsou popsány zde a jsou velmi dobře známou technologií. Kromě toho jsou tyto metody popsány v odkazech citovaných shora, viz např. v patentech, které byly uděleny firmám Affymax, Affymetríx, Nanogen, Protogene, Spectragen, Millípore and Beckman (jejichž produkty použitelné pro vynález jsou dostupné); standardní příručky molekulární biologie a vědecké knihy o proteinech, včetně těch, které byly citované shora a Cozette et al(1991). U.S.Pat.5,063,081; Southern (1996), Current Opinion in Biotechnology 7, 85-88; Chee et al (1996). Science 274, 610-614; and Fodor et al (1993). Nátuře 364, 555-556.
Stručný popis vyobrazení na výkresech
Obr. 1 znázorňuje navržené schéma pro oligonukleotidy, ve kterých linker 1 obsahuje část, která je specifická pro kotvu 1 a jinou část (sondu), která je specifická pro cílovou mRNA 1 a ve které značená detekční sonda 1 je specifická pro sekvenci cílové mRNA 1, která je odlišná od sekvence cílově specifické části linkeru.
Obr. 2 znázorňuje povrch, který zahrnuje 15 testovacích oblastí, z nichž každá zahrnuje matici šesti oligonukleotidových kotev.
Obr. 3 znázorňuje návrh linkeru pro test na vazbu receptorů, ve kterém se část linkeru specifická pro kotvu asociuje se sondovou částí (receptorový protein) přes biotinovou a streptavidinovou molekulu a ve kterém ligand specifický pro receptor je značen fluorescenčně značenou molekulou. B: biotin. SA: streptavidin. Rec: receptorový protein. Ligand: přírodní nebo • *
- 72 • · · · syntetický ligand pro daný receptor. *: fluorescenčně značená molekula připojená k ligandu.
Obr. 4 znázorňuje povrch, který zahrnuje 21 testovacích obastí, z nichž každá je dále podrozdělena na 16 podoblastí (identity, zdvojení).
Obr. 5a, 5b a 5c ilustrují tři kousky, z nichž může být sestaven povrch, jak je znázorněn na obr. 4. Obr. 5a představuje separátor jamek; obr. 5b představuje podrozdělovač a obr. 5c představuje bázi.
Obr. 6 představuje dvě testovací oblasti, z nichž každá zahrnuje lineární matici sond (nebo kotev), které jsou v „grafu“ podobné formaci.
Obr. 7 schématicky znázorňuje testovací oblast zahrnující 3 kotvy (A, B a C), z nichž každá je přítomna v řadě kopií („skupina“). Umístění každé skupiny kotev se nazývá „místo“.
Obr. 8 znázorňuje test, ve kterém jsou cDNA generovány specifickou reversní transkriptázou a testovány destičkách MAPS.
Obr. 9 znázorňuje test, který využívá postupu nukleázové ochrany (NPA-MAPS test). Vzorek RNA se připraví z buněk nebo z tkáně a je představován tenkou vlnovitou čárou. Ke vzorku RNA se přidá skupina polynukleotidových fragmentů, což je znázorněno tlustou tmavou a světlou čarou. Tmavá část ochranných fragmentů reprezentuje segmenty, které jsou komplementární ke specifické RNA cíle a hybridizují se s těmito cíli. Světlá část představuje opačnou část: sekvence, které nejsou komplementární k tomuto cíli. Ochranné fragmenty jsou přidávány v přebytku. Po hybridizaci všech dostupných φ · φ · • φ
- 73 cílů s chránícími fragmenty se na vzorek působí vhodnou směsí nukleláz a chemicky se tak zničí nežádoucí nehybridizované RNA a nehybridizované polynukleotidy. Tak např. nukleáza Sl může zničit jakoukoliv jednořetězcovou DNA, která je přítomna. Z toho plyne, že přebytečný chránící fragment je hydrolyzován tehdy, pokud se jedná o opačný nehybridizovatelný díl tohoto fragmentu. RNA se může hydrolyzovat ríbonukláz včetně ribonukleázy H a/nebo zahřátím vzorku v zásaditém prostředí. Zůstává soubor štěpených ochranných fragmentů, který odráží, jak mnoho cílových RNA bylo přítomno ve vzorku. Zbylé ochranné fragmenty se měří pomocí MAPS hybridizačního testu.
Obr. 10 znázorňuje hybridizacní specifitu při MAPS testu.
Obr. 11 znázorňuje kinetiku navazování kotvy s linkerem.
Obr. 12 znázorňuje test MAPS dvou oligonukleotidových cílů.
Obr. 13 znázorňuje kvantifikaci posunu senzitivity.
Obr. 14 znázorňuje stanovení teploty tkání pro 4 kombinace oligonukleotidových linkerů/kotva.
Obr. 15 znázorňuje mRNA test prováděný pomocí NPAMAPS.
Obr. 16 znázorňuje rozpouštěcí křivku NPA-MAPS.
Obr. 17 znázorňuje test pro detekci peptidů obsahující fosfotyrozinové zbytky.
Obr. 18 znázorňuje první stupeň testu na map ESTy. Sestavení linkeru odpovídající každému z ESTŮ, který se má mapovat na matricích generických kotev na MAPS destičce. Na povrch každé ze 16 jamek mikrodestičky se připojí linkery obsahujících 16 různých olígonukleotídových sond, uspořádané v matricí 4x4. První místo má oligo 1, které je komplementární k částí první EST sekvence a tak je na 16 ESTech, které se mají testovat.
cDNA nebo mRNA generované z genů, ze kterých byly ESTy získány, se přidají k všem 16 jamkám a umožní se hybridizace za vhodných podmínek. Na základě toho cDNA nebo mRNA, které obsahují jednu ze 16 EST sekvencí, bude připojena s místem, kde je komplementární sonda.
Obr. 19 znázorňuje následný stupeň v testu, kdy se mají mapovat ESTy: přidání detektorových oligonukleotidů k destičce MAPS. Každá jamka destičky obdrží oligonukleotidový receptor, který odpovídá jednomu z ESTŮ, které se mají mapovat. Každým detektorovým oligonukleotidem je oligonukleotid navázaný na molekulu, používanou pro detekci, např. fluorescein, pokud se používá fluoresceinové zobrazování. Každý oligonukleotidový detektor je komplementární k jednomu z ESTŮ, ale odlišný od sondy specifické pro EST tak, že sonda a oligonukleotidový detektor, které jsou komplementární k jednomu ESTu se mohou oba vázat zároveň.
Po promytí se přidá ke každé jamce jeden oligonukleotidový detektor, jak je značeno na obrázku. To znamená, oligonukleotidový detektor se sekvencemi komplementární k prvnímu ESTu se přidá k první jamce atd.
Obr. 20a a 20b znázorňují výsledky testu na mapu ESTŮ zobrazenou na obr. 18 a 19. Po hybridizaci oligonukleotidového
- 75 detektoru a promytí za vhodných podmínek se 16 jamek mikrodestičky zobrazí pomocí CCD fluorescenčního zobrazovače. Obr. 20a ukazuje upravené výsledky. Očekává se, že každý EST-specifický oligonukleotidový detektor by měl značit mRNA nebo cDNA drženou korespondující EST-specifickou sondou. Tak např. sonda 5 tak tomu je v případě těchto dat, se všemi značeními detekčních oligonukleotidu sestavené sondy. Kromě toho první tři oligonukleotidové detektory každé značené cDNA nebo mRNA jsou přidrženy prvními třemi sondami, což ukazuje, že tyto sekvence leží podél stejného genu. Podobně posledních pět ESTŮ se projevuje tak, že jsou spojeny. Vazby, které vyplývají z těchto dat, jsou uvedeny graficky na obr. 20b.
Obr. 21 znázorňuje uspořádání sond oligonukleotidových detektorů a ESTŮ #1, 2 a 6 znázorněných na obr. 18 až 20.
Obr. 22 znázorňuje test s vysokou výkonností.
Obr. 23 znázorňuje způsob přípravy zesíleného cíle.
Obr. 24 znázorňuje test s detekčními línkery a hlásícími činidly.
Obr. 25 znázorňuje použití různých prášků.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 Hybridizační specifita (víz obrázek 10)
A generická destička MAPS byla vyrobena s použitím zařízení s tryskami, systém Pixus (Cartesian Technologies, lne., Irvine, CA), aby se získala v každé jamce mikrotitrové destičky identická síť DNA. Všechny oligonukleotidy byly koupeny od Biosource International (Camarillo, CA).
♦ · ♦ · • · · • · · » ·
V případě této destičky bylo vytvořeno sedm různých oligonukleotidových kotev v každé jamce, a to v uspořádání, které je znázorněno jako Klíč (levá strana obrázku). Každý oligonukleotid byl nanesen jako 10 nanolitrová kapička ve dvou tečkách, oddělených ze 2 μΜ roztoku, obsahujícího 500 mM fosforečnanu sodného o pH 8,5 a 1 mM EDTA, do jamek DNA vazebné destičky (Corning Costar), a ponechán uschnout. Po přilnutí byly jamky zablokovány 50 mM pufru Tris pH 8, a pak byl oligonukleotid, který se kovalentně nenavázal k povrchu, vymyt 0,1% SDS v 5x SSP pufru.
K omyté destičce byly přidány fluorescenčně značené oligonukleotidové linkery a byly ponechány hybridizovat v 6x SSPE s 0,1% Tritonu X-100 při pokojové teplotě po dobu třiceti minut. Tento postup je výhodný pro připojení linkerů. Oligonukleotidové linkery byly v průběhu syntézy substituovány cy5- a byly komplementární v segmentech o 25 bázových párech ke specificky kotveným oligonukleotidům. Sekvence sedmi kotev a linkerů byly následující (všechny znázorněny mezi 3' až 5'):
#1 Kotva*: SEQ ID: 1
TCCACGTGAGGACCGGACGGCGTCC
Linker ** SEQ ID: 2
GTCGTTTCCATCTTTGCAGTCATAGGATACTGAGTGGACGCCGTCCGG
TCCTCACGTGGA
RNA model (myš C-jun): SEQ ID: 3
CTATGACTGCAAAGATGGAAACGACGATACTGAGTTGGACCTAACAT
TCGATCTCATTCA
Detekční oligonukleotid*** SEQ ID: 4
TGAATGAGATCGAATGTTAGGTCCA #2 Kotva*:
CACTACGGCTGAGCACGTGCGCTGC
SEQ ID: 5
- 77 Linker** SEQ ID: 6
CTAGGCTGAAGTGTGGCTGGAGTCTGCAGCGCACGTGCTCAGCCGTA
GTG
RNA model (myš MIP-2): SEQ ID: 7
AGACTCCAGCCACACTTCAGCCTAGGATACTGAGTCTGAACAAAGGC
AAGGCTAACTGAC
Detekční oligonukleotid*** SEQ ID: 8
GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG #3 Kotva*: SEQ ID: 9
GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG
Linker** SEQ ID:10
ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGCGCTCCCACAACGCTCGACCG
GCG
RNA model (myš GAPDH): SEQ ID: 11
CCTTCATTGACCTCAACTACATGGTGATACTGAGTGGAGAAACCTGCC AAGTATGATG AC
Detekční oligonukleotid *** SEQ ID: 12
GTCATCATACTTGGCAGGTTTCTCC #4 Kotva*: SEQ ID:13
GAACCGCTCGCGTGTTCTACAGCCA
Linker** SEQID:14
CTACCGAGCAAACTGGAAATGAAATTGGCTGTAGAACACGCGAGCGG
TTC • *
- 78 RNA model (myš L32 protein): SEQ ID: 15
ATTTCATTTCCAGTTTGCTCGGTAGGATACTGAGTGAGTCACCAATCC
CAACGCCAGGCT
Detekční oligonukleotíd***
AGCCTGGCGTTGGGATTGGTGACTC #5 Kotva* :
CTCGTTCCGCGTCCGTGGCTGCCAG
Linker**
CTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAG #6 Kotva*:
CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC
Linker**
CGGACTGTGGTACCATGCCGACCG #7 Kotva*:
CGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG
Linker**
CGAAGAGATGCATAACGCGGCGCCG
SEQ ID:16
SEQ ID:17
SEQ ID: 18
SEQ ID:19
SEQ ID:20
SEQ ID:21
SEQ ID:22
Vysvětlivky:
* Kotvy byly syntetizovány pomocí spaceru C12s amidem na zakončení 5' ** Linkery byly syntetizovány pomocí Cy5 navázaného na zakončení 5' • ·
- 79 • · · · *** Oligonukleotidové detektory byly syntetizovány s použitím biotinu, navázaného na zakončení 5'
Do každé jamky byl přidán buď jeden linker nebo byla směs linkerů v celku (jak je znázorněno na obrázku). (Do jamky označené všechny byla přidána směs všech sedmi linkerů.). Po následné inkubaci a trojím promytí 5 x SSP byl získán pomocí zobrazovače Tundra (IRI, St. Catherínes, Ontario) fluorescenční obraz, znázorněný v pravé části obrázku. Jak je možno vidět, linkery se samy sestavily na povrchu podle specifické asociace s komplementárními, jím příslušnými, kotvami.
Tento proces se opakuje s tím rozdílem, že se do každé jamky umístí osm kotev a s nimi se následně výhodně spojí linkery. Celý postup se opakuje s 36, 64 atd. různými kotvami v každé jamce na 24, 96, 384, 864 nebo 1536 jamkové destičce.
Příklad 2 Kinetika navazování (viz obrázek 11)
Na obrázku je znázorněna rychlost hybridizace Cy5-substituovaného linkeru číslo 1 s komplementární kotvou pro různé koncentrace linkeru. Generická destička MAPS byla připravena podle obrázku 1, s tím rozdílem, že kotva 1 byla navázána na Čtyři místa v každé jamce. Inkubace byly prováděny při pokojové teplotě v 5x SSP s 0,1% Tweenu-20, jamky byly promyty 3 krát s použitím 5x SSP, a byla měřena navázaná fluorescence. Fluorescenční obraz byl získán pomocí zařízení Tundra, pozadí bylo odečteno a pro každou tečku uvnitř každé jamky byla pomocí softwaru Tundra vypočtena integrovaná intensita. Vyneseny jsou i průměr a standardní odchylka pro uvedenou integrovanou intensitu u čtyř teček uvnitř každé ze dvou duplikátních jamek.
• ·
- 80 • · · · ·· · ·· ·
Příklad 3 Fluorescenční linker
A generická destička MAPS se připraví s použitím jednoho kotvícího oligonukleotidu natečkovaného buď po 1 tečce na jamku (horní dvě řady), po 4 tečkách na jamku (následující čtyři řady) nebo po 16 tečkách na jamku (nižší dvě řady), podle metod, které jsou diskutovány shora. Do každé jamky se komplementárně naváže fluorescenčně značený linker, s použitím výhodného postupu popsaného v příkladu 1. Fluorescenční obraz byl po promytí získán pomocí zobrazovače Tundra. Intenzita fluorescence každé tečky informuje, do jaké míry je každý funkční linker přístupný hybrídizaci s cílem. Intenzita signálu teček je při opakované detekci vysoce reprodukovatelná.
Příklad 4 Křivky kinetiky navazování.
Do destiček, připravených podle postupu, popsaného v příkladu 3, se přidají různé koncentrace cílového oligonukleotidu. Linker, který je asociován, obsahuje 25-merní sekvenci komplementární k části cíle. Cíl se přidá v 5x SSC s 0,05% SDS v celkovém objemu buď 30 nebo 100 mikrolitrů, a destička se zakryje a inkubuje při 50° C přes noc. Po hybrídizaci cíle k připojenému linkerů se cíl visualízuje pomocí výhodného postupu s použitím chemoluminíscence. Přidá se bíotinylovaný detekční olígonukleotid, obsahující a 25-merní sekvencí komplementární k oddělené Části cíle (ne ke stejné části komplementární k linkerů) v koncentrací 30 nM. Bíotinylovaný detektor se může přidávat po dobu 30 minut po vypláchnutí přebytečných nenavázaných cílů, nebo se může přidat spolu s cílem a ponechat přes noc k hybrídizaci. Po navázání detektoru se povrch opláchne dvakrát pomocí 5x SSC, jednou pomocí 1 x SSP obsahujícího 0,1% Tweenu-20 a 1% PEG (SSPTP), a při pokojové teplotě se přidává po dobu 5 hodin zředěný (1:50 000) roztok 250 pg/ml křenové peroxidázy konjugované se streptavidinem (HRP:SA, od Pierce, Rockford, 111.) v SSPTP. Jamky se promyjí čtyřikrát pomocí SSPTP, a jednou opláchnou,
- 81 • · • · načež se inkubují s činidlem Super Signál Ultra (Pierce). Po několika minutách se získá luminiscenční obraz například pomocí zařízení Tundra. Tento obrázek se může akumulovat v CCD matici po dobu pěti minut. Nízké hladiny cíle se mohou visualizovat v některých jamkách při koncentraci cíle až tak malé, jako ~5 x 10'13 M; Intenzita signálu se obecně stává nasycenou při koncentraci ~1O10 M. Intenzita signálu teček je při opakované detekci vysoce reprodukovatelná.
Příklad 5 Test dvou oligonukleotidů (viz obrázek 12)
Křivka navazování ukazuje případ, kdy MAPS hybridizační test, při použití výhodného protokolu z postupu diskutovaného shora, byl aplikován pro dva různé cílové oligonukleotidy. Generická destička MAPS byla připravena se čtyřmi různými kotvícími oligonukleotidy, z nichž každý byl natečkován čtyřikrát uvnitř každé jamky. Na druhé a čtvrté kotvě byly oligonukleotidové komplementární linkery sestaveny přímo na povrchu, jak je popsáno. Do každé jamky byly přidány dva cíle v uvedené koncentraci do 40 mikrolitrů jak je popsáno, a inkubovány při 50° C přes noc. Množství každého navázaného cíle bylo visualizováno připojením biotinylovaného detekčního oligonukleotidů specifického pro každý cíl s následným chemolumíníscenčním zobrazením HRP.SA, jak je popsáno. Na nižším panelu byla intensita vyzařování stanovena kvantitativně. Ve všech případech obrázků v liniích mezí šípkami, znázorněnými na horním panelu, byl pro naskenování intenzity použít software, který je součástí zařízení Tundra Imager. Pro nejnižší koncentrace cíle, 1,1 pM, ukazují naskenované obrazy každé tečky Gaussovu křivku tvaru píku, definovanou jamkou, přičemž u vzorku úplně vlevo, kde byla koncentrace cíle nulová, nejsou na pozadí viditelné žádné rozpoznatelné píky.
- 82 • · · · · · ····
Příklad 6 Posun sensitivity (viz obrázek 13)
Hybridizacní test MAPS se dá použít pro měření koncentrace souboru oligonukleotídů, pomocí navázání k povrchu a značení. Tento pracovní postup je vhodný pro ty olígonukleotídy, které jsou v menší nebo nízké koncentrace. Dva vzorky lze odlišit v takovém případě i tehdy, pokud jeden vzorek obsahuje více oligonukleotídů, protože bude více vázat. Na druhé straně, jestliže koncentrace cílového oligonukleotídů je pro daný povrch nasycená (t.j. jestliže je dostatečně vysoká, aby obsadila všechna vazebná místa), pak v případě, že se koncentrace zvýší, nemůže se žádný další navázat, takže množství nelze změřit. Nicméně, křivky navazování cíle se mohou posunout přidáním neznačeného konkurujícího ligandu. Data charakterizující rovnováhu a průběh navazování se získají pro čtyři různé oligonukleotidové cíle, z nichž všechny nasycují povrch (t.j. dosahují maximálního navázání) při koncentraci zhruba 3 nM. Přidáním neznačených konkurujících cílů do všech jamek se rovnováha navazování značeného oligonukleotídů posune takže se při nižší koncentraci naváže méně cílového oligonukleotídů a hladina, při které při které se dostavuje nasycení se posune na vyšší hodnotu koncentrace. Tak se mohou přidat konkurenční oligonukleotidy, konkurující například cílům 1 a 3, ale nekonkurující například cílům 2 a 4. Takto se posunou sensitivity testů pouze pro cíle 1 a 3. Touto cestou se dají měřit koncentrace oligonukleotidových cílů ve značném rozsahu v jedné testovací jamce, jestliže je známo očekávané relativní množství oligonukleotídů.
Data se mohou kvantifikovat, jak je vysvětleno shora, pro navazování jednoho z oligonukleotidových cílů. Obrázek 13 ukazuje kvantitativně, že přidání konkurenčního oligonukleotídů při testu posunuje křivky navazování, zkoumané při tomto testu pro určitý cíl, k vyšším koncentracím.
- 83 Příklad Ί Teplota tání čtyř sond (viz obrázek 14) je vynesena závislost většího množství čtyř různých fluorescenčně značených oíígonukleotidových linkerů, specificky hybridizovaných na kotvy olígonukleotidů při MAPS testu, na rostoucí teplotě. Tyto čtyři oligonukleotidy byly nejprve ponechány hybridizovat pří 50° C po dobu 1 hodiny pří koncentraci 300 nM. Pak byly jamky vymyty SSC bez sond, a bylo změřeno navázané množství fluorescencí, jak je popsáno shora (50° C). Pak byly povrchy inkubovány při 55° C po dobu 30 minut a byla změřena intenzita navázané fluorescence, což se provedlo stejně pro všechny teploty, které jsou uvedeny.
Příklad 8
Byly přímo srovnávány dvě detekční metody, následujícím postupem: k destičce MAPS, na které jsou ve formě čtyřech teček na jednu jamku navázány čtyři oligonukleotidové kotvy, se přidají dva oligonukleotidy do každé jamky, přičemž oba včetně kovalentně připojených cy5 skupin nebo oba obsahující biotinovou skupinu. Provede se epifluorescenční měření, jak je popsáno v části o prohlížení a měření fluorescenčních linkerů. Chemolumíníscenční měření se provede tak, jak je popsáno pro MAPS test s použitím následného přidáni HRP:SA a chemolumíníscenčního substrátu. Generované signály jsou zhruba srovnatelné. Nicméně, pro geometrii mikrodestiček, které obsahují vály, oddělující jednotlivé jamky, a popřípadě bublinky tekutiny nebo rozhraní tekutin, mohou odrazy v epifluorescenčních obrazech působit rušivě na interpretaci dat.
Příklad 9 Chemolumíníscenční produkty
Srovnává se použití dvou výrobků, dostupných jako chemoluminiscenční substráty pro křenovou peroxidázu, pro MAPS test. Destička MAPS se připraví postupem, uvedeným pro příklad 8, a inkubuje se s
- 84 • · · · · •··· ·· ···· biotinylovaným oligonukleotidovým linkerem. Pak se přidá buď alkalická fosfatáza, navázaná na streptavidin (AlkPhos:SA) nebo HRP.SA, načež následuje promývání s přídavkem buď CDP-Star (Tropix) do jamky spolu s AlkPhos:SA nebo ECLPlus do jamky s HRP:SA. Pro účely značení západních teček je navrhováno výrobci použiti SA navázaných enzymů a substrátů. Tyto dvě (jak jamka, tak í další přístupné substráty) se mohou obě použít k umožnění oligonukleotidové hybridizace na MAPS destičkách.
Příklad 10
Rychlost současného systému pro analýzu pomocí MAPS byla testována tak, že se připravila MAPS destička se čtyřmi různými oligonukleotidovými kotvami na jamku, z nichž každý byl natečkován čtyřikrát na jamku, s vydlážděním (vzdálenost střed-střed) 0,6 mm. Pak se hybridizuje buď cy5-navázané linkery nebo biotinylované linkery a provede se detekce a skenování, jak je uvedeno shora. Při tomto epifluorescenčním měření je rychlost vyšší (dláždění by mohlo být patrně zmenšeno). Při chemoluminiscenční detekci nejsou sousední tečky úplně odděleny, takže se musí řešit oddělení jednotlivých píků jednoznačně přepočtem hodnot počítačem.
Příklad 11 Protokol testu při použití nukleázové ochrany.
Pří testu, ve kterém se mají zjišťovat optimální podmínky pro hybridizaci a nukleázové působení pro postup při nukleázové ochrany, při použití soupravy Nuclease Protection Test kit od firmy Ambion (Austin, Texas). Tím se stanoví podmínky, pufry a enzymy. V jednom ze tří pufrů se připraví osm vzorků. Hyb Buff 1 je 100% Hybridizační pufr (Ambion); Hyb Buff 2 je 75% Hybridizační pufr a 25% hybridizační rozpouštěcí pufr (Ambion); a Hyb Buff 3 je 50% směs všech. Byl syntetizován 70-merní oligonukleotid, který obsahoval 60 zbytků komplementárních k hledané mRNA (Biosource International, Camarillo, CA) a byl značen
- 85 • · pomocí psoralenfluoresceinu (Schleicher a Schuell, Keene, NH) s použitím protokolu, jak je doporučen pro značení psoralenbiotinem firmou Ambion. Zjednodušeně řečeno, ochranný fragment byl zředěn na koncentraci 50 pg/ml ve 20 pí TE pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8), vařen 10 minut, a rychle ochlazen ledovou vodou. Byly přidány čtyři pl 130 pg/ml. Dále byl přidán psoralenfluorescein v DMF a vzorek byl osvětlen 45 minut při 40° C ručně drženým dlouhovlnným LTV zdrojem. Volný psoralenfluorescein byl odstraněn extrakcí nasyceným butanolem. Použitá mRNA byla GAPDH anti-sense mRNA, připravená z anti-sense plasmidu (pTRI-GAPDH-myší anti-sense kontrolní šablona (Anti-sense Control Template) od firmy Ambion) s použitím T7 promotoru a soupravy MaxiScript (Ambion). Krátký chránící fragment je 60-merní komplementární část syntetizovaná odděleně a značená podobně. Tyto sekvence chránících fragmentů byly v pokusu následující:
Chránící fragment plné délky: SEQ ID: 23
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCAC CACCAACTGCTTGCT TGTCTAA
Krátký chránící fragment: SEQ ID: 24
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCAC
CACCAACTGCTT
Hybridizace se provede míšením chránících fragmentů při koncentraci 20 nM s GAPDH mRNA pří koncentrací 60 nM v 10 μΐ finálního objemu po dobu dvou hodin při 22 °C nebo při 37 °C . Po hybridizaci bylo přidáno 200 μΐ směsi nukleáz podle instrukcí výrobce (název použité soupravy: Ambion Nuclease Protectíon Kít, použité ředění směsí nukleáz bylo 1:200) a inkubace byla prováděna opakovaně pří stejných teplotách po dobu 30 minut. Hydrolýza byla pak zastavena hybrídizačním ínhíbíČním pufrem (Ambion), a olígonukleotidy byly vysráženy a promyty ethanolem. Pak bylo přidáno 10 μΐ gelového pufru lx (Ambion) a olígonukleotidy byly odděleny • · • C · ·
- 86 na a 15% TBE urea gel. Gel byl míchán v tekutém pufru 30 minut, umístěn na plastovou destičku a byl zobrazen pomocí Tundry s použitím fluoresceinových filtrů pro selekci excitačně emitovaných vlnových délek. Obrázek byl akumulován na CCD matici po dobu 2 minut. Nej lepší se ukázaly být ty podmínky, kdy vzorky byl ínkubovány v Hyb Buff 2 pří 37 °C nebo v Hyb Buff 3 pří 22 ° C. V těchto vzorcích nezůstal žádný detekovatelný chránící fragment plné délky a bylo viditelné signifikantní množství Části chránícího fragmentu plné délky o zřetelně stejné velikostí, jakou má krátký chránící fragment.
Příklad 12 Test na mRNA pomocí NPA-MAPS. (víz obrázek 15)
Byl použit celý protokol NPA-MAPS, s použitím podmínek pro hybridizaci a nukleázy podobným zpracováním jako je popsán v příkladu 11. Pro tento test byly připraveny vzorky. Všechny obsahovaly stejné množství 70-merního oligonukleotidového chránícího fragmentu a různá množství GAPDH mRNA. Hybridizované vzorky byly 10 μΐ v 50% hybridizačního pufru a 50% rozpouštěcího pufru obsahující 0,08 mg/ml Yeast RNA (Ambion) byly zahřívány na 90 °C po dobu 6 minut, krátce odstředěny, zahřátý na 70 °C po dobu 5 minut, ponechány ochladit na 19 °C a ínkubovány po dobu 19 hodin. Pak bylo přidáno ke každému vzorku 200 μΐ směsí nukleáz a ponecháno působit po dobu 30 minut pří 19 °C.
Z každého vzorku byl odebrán alíkvotní podíl 60 μΐ pro test MAPS. Byly přidány 2 μΐ 10N NaOH a 2 μΐ 0,5 M EDTA a vzorek byl zahřát na 90 °C po dobu 15 minut, na 37 °C po dobu 15 minut, a pak ponechán usadit při pokojové teplotě 20 minut. Pak byly vzorky neutralizovány pomocí 2 μΐ 10M HCl a bylo k nim přidáno 12 μΐ 20x SSC, obsahujícího 2M HEPES o pH 7,5 a 200 nM biotinylovaného detekčního oligonukleotidu, specifického pro příslušný chránící fragment spolu s 1 μΐ 10% SDS. Vzorky byly míchány, zahřátý na 80° C po dobu 5 minut a 35 μΐ alikvoty každého vzorku byly odpipetovány do dvou jamek na destičce MAPS (každý vzorek byl rozdělen do dvou testů, prováděných duplicitně na jedné MAPS destičce).
• «
- 87 • · · * · • · 4 4 4 4 4
4 4 4 4 * • · 4444 · 4 444«
Destička byla před tím připravena podle standardního MAPS protokolu, s použitím vlastního sestavovaného linkeru specifického pro určitý chránící fragment, vždy navázaného na CY5. Destička MAPS byla zakryta a inkubována při 50 °C přes noc, načež byla provedena detekce a luminiscence jak je popsáno. K poslednímu vzorku nebyly pří tomto testu přidány žádné nukleázy, což sloužilo jako kontrola, která umožňuje visualízovat, jak by byl samotný chránící fragment detekován na MAPS. Na nižší části obrázku je zobrazena naskenovaná intenzita (jak byla analyzována zobrazením horní řady jamek). Množství GAPDH mRNA, přítomných ve vzorku (to je množství v každém aíikvotním opakování v jamce na MAPS destičce) je uvedeno na obrázku.
Oligonukleotidy, použité na MAPS destičkách, byly následující:
Kotva*: SEQ ID: 25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
Linker** SEQ ID: 26
CTTGAGTGAGTTGTCATATITCTCGGATACTGAGTGCGCTCCCACAAC
GCTCGACCGGCG
Chránící fragment SEQ ID: 27 (komplementární myší anti-sense mRNA pro GAPDH) CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCAC CACCAACTGC TTGCTTGTCTAA
Detekční oligonukleotid*** SEQ ID: 28
- značený na zakončení 5' biotinem AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT • · « • 9
- 88 4 4 » · • · « » • 9
4 44 4 4
Vysvětlivky:
* Kotvy byly syntetizovány pomocí C12 spaceru s amidem na zakončení 5' ** Linkery byly syntetizovány pomocí Cy5, napojeného na zakončení 5' *** Detekční olígonukleotídy byly syntetizovány bíotínem, napojeným na zakončení 5'
Příklad 13 Rozpouštěcí charakteristiky, NPA-MAPS (viz obrázek 16)
Data diskutovaná v příkladu 12 a zobrazená na obrázku 15, byla kvantifikována a vynesena jako rozpouštěcí charakteristiky. Průměrné a standardní odchylky pro všech osm míst dvou duplicitních jamek jsou vyneseny pro každou koncentraci mRNA. Křivka navazování je znázorněna v superpozici ve formě:
Frakční navázání = Maximální navázání* 1/(1 + IC5o /L) kde Maximální navázání je maximum navázání při nasycení,
Frakční navázání je množství navázané při koncentraci ligandu L, a IC50 je koncentrace ligandu, pří které je Frakční navázání rovno polovině Maximálního navázání. Znázorněná tečkovaná křivka na obrázku, získaná s nej vhodnější hodnotou IC50 = 4,2 femtomolů, má průběh vyznačený na obrázku.
Příklad 14 NPA-MAPS test GÁPDH mRNA v úplném RNA extraktu myších jater.
Úplný extrakt myší RNA se testuje na GAPDH mRNA s použitím NPA-MAPS testu a jako křivka se vynese se rozpouštěcí charakteristika. Úplný extrakt RNA z myších jater se připraví pomocí soupravy Qiagen. RNA se vysráží v 70% EtOH působením 0,5M octanu hořečnatého a
- 89 • * · ·»· · · · · ♦ « ··«· ··· ··· • · » * ·· ···· · * ···· resuspenduje se v 10 μΐ 5x SSC s 0,05% SDS s 1,8 nM chránícího fragmentu. Tímto chránícím fragmentem, který se přidává, je oligonukleotid, o délce 70 bází, z nichž 60 bází je komplementárních k myšímu GAPDH. Buď se použije fragment komplementární k myší GAPDH mRNA (chránící fragment), nebo se použije komplement k sekvenci jako negativní kontrola (antí-sense fragment).
RNA vzorky s chránícími fragmenty se zahřívají na 90 °C po dobu 5 minut, a provedou se hybrídízace přivedením vzorku na teplotu 70° C a ponecháním pomalu ochladit na pokojovou teplotu přes noc. Přidá se Sl nukleáza (Promega) při zředění 1:10 ve 30 μΐ 1 x Sl nukleázového pufru (Promega) na 30 minut při 19° C, načež se reakce zastaví 1,6 μί 10N NaOH a 2,7 μΐ 0,5 M EDTA. Vzorky se zahřívají na 90° C po dobu 15 minut a poté na 37° C po dobu 15 minut, aby se denaturovaly a zničila se RNA, neutralizují přidáváním 1,6 μί 10M HCl, a inkubují na destičkách MAPS přes noc v 5 x SSC spolu s 0,05% SDS doplněným 200 mM HEPES pH 7,5, ke kterému je přidáno 30 nM biotinylovaného detekčního oligonukleotídů. Oplachování a vizualizace SA-HRP se provádí, jak bylo popsáno. Velikost signálu klesá podle toho, jak klesá množství myší RNA ve vzorku (ve vzorcích je obsaženo 500, 170, 50, 5 nebo 0,5 pg totální myší RNA. Současně se testují dva kontrolní vzorky, do kterých nebyla přidána žádná Sl nukleáza. Signál je vidět pouze pro komplementární chránící fragment.
Použité oligonukleotidy:
Pro anti-sense kontrolu (stejné oligonukleotidy jako v příkladě 12):
Kotva* : SEQ ID: 25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
Linker**
SEQ ID: 26
CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATACTGAGTGCGCTCCCACAAC GCTCGACCGG CG
Chránící fragment SEQ ID: 27 (komplementární k myší antisense mRNA pro GAPDH) CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCAC CACCAACTGC TTGCTTGTCTAA
Detekční oligonukleotid*** SEQ ID: 28
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT
Pro Sense GAPDH mRNA vzorky:
Kotva*: SEQ ID: 25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
Linker** SEQ ID: 29
ATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGATACTGAGTGCGCTCCCACAAC
GCTCGACCGGCG
Chránící fragment (komplementární k myší mRNA pro GAPDH): SEQ ID: 30
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGACAATCTTGAGTGAGTTG TCATATTTCT CGGCTTGTCTAA
Detekční oligonukleotid ** SEQ ID: 31
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAG
Vysvětlivky:
Kotvy byly syntetizovány s použitím spaceru C12 s amidem na zakončení 5'
- 91 ** Linkery byly syntetizovány s použitím Cy5, navázaného na zakončení 5' *** Sondy byly syntetizovány s použitím bíotínu, navázaného na zakončení 5'
Příklad 15 Test MAPS využívající nukleázovou ochranu s kontrolami.
mRNA se extrahuje z myších jater nukleázová ochrana se provede v podstatě tak, jak je popsáno v příkladu 14, jen s tím rozdílem, že CADPH specifický chránící fragment zahrnuje 60 nukleotidů, které jsou » komplementární myší GAPDH, za kterými následuje 15 přesahujících nukleotidů na zakončení 3' fragmentu, které nejsou komplementární k cíli. Po hybridizaci a nukleázové digesci se zbylý chránící fragment hybridizuje na destičce MAPS, jak je naznačeno v příkladu 14, jen s tím rozdílem, že se pro detekci imobilizovaného chránícího fragmentu použijí dva různé oligonukleotidové detekční fragmenty. Jeden detekční fragment je komplementární k GAPDH-specifické část chránícího fragmentu, a druhý, kontrolní, je komplementární k 15 bázové přečnívající část chránícího fragmentu. Každý detekční fragment se používá na jiném replíkátu vzorku (t.j., v různých jamkách), takže oba detekční fragmenty mohou být značeny stejnou detekční molekulou. V tomto příkladu jsou oba fragmenty značeny pomocí HRP. Bez přidání nukleázy jsou signály z obou detekčních fragmentů viditelné, zatímco když se provede nukleázová digesce, je detekovatelný jen signál, odpovídající GAPDH sekvencím. Velikost GAPDH-specifického signálu se sníží s přihlédnutím k signálu, který je pozorován v nepřítomnosti nukleázové digesce, neboť chránící fragment se přidává v přebytku, počítáno na množství přítomné GAPDH mRNA. To umožňuje, aby bylo množství GAPDH mRNA omezeno na ochrannou hybridízací, takže množství vytvořeného dvouvláknového hybridu (a proto • ·
- 92 množství chránícího fragmentu, který chráněn před nukleázou) odráží množství mRNA. Pokud není přítomna v reakční směsi žádná mRNA, nedetekuje se, pokud se přidají nukleázy, žádný signál. Shora uvedená zjištění ukazují, že hybridizační a digestivní stupně testu se projevují, jak je potřebné.
Pokud se při tomto testu použijí chránící fragmenty, korespondující s větším množstvím cílů, pak každý z chránících fragmentů může obsahovat přesahující část, ve které je stejných 15 bází. To umožňuje použít jeden detekční fragment pro testování ostatních přesahujících částí pro všechny vzorky.
Příklad 16 Transkripční screeníngový test na sloučeniny, které mohou změnit expresi genů, souvisejících s chorobným stavem.
Používá se buněčná linie, odvozená od lidského nádoru. Byla zjištěna vyšší hladina exprese 30 genů než u normálních buněk. (To znamená, těchto 30 genů je používaných k produkci mRNA více, než je tomu u normálních buněk, a tak se produkuje protein, pro který představují tyto geny instrukce. Transkripční test měří, jak mnoho se tyto geny používají, tím způsobem, že měří, jaké je přítomno množství mRNA pro každý gen.) S použitím nukleázové ochrany pří testu na destičkách MAPS (NPA-MAPS) se testuje 8800 chemických sloučenin, aby se vidělo, zda růst buněk v přítomností těchto sloučenin, může redukovat expresí některých ze 30 korelujících genů bez ovlivnění exprese šesti normálních (konstitutivních, neboli domácích) genů. Jakákoliv sloučenina, která má tento účinek, může být v budoucnu užitečná při vývoji farmaceutických prostředků k léčení tohoto typu nádoru.
Do každé jamky ve 100 96ti-jamkových polystyrénových destiček se přidá asi 10 000 až 100 000 buněk, které es pak nechají růst 2 dny, dokud nepokryjí povrch každé jamky. V 8 jamkách každé destičky jsou buňky ponechány růst bez přísad. Ke zbývajícím 88 jamkám každé destičky se
- 93 • · přidají různé chemické sloučeniny tak, aby mohl být testován účinek každé sloučeniny samostatně. Do 100 destiček, používaných najednou, se tak dá testovat, nebo screeningem hledat, 8800 sloučenin. Buňky rostou 24 hodin za přítomnosti testovaných sloučenin, a pak se buňky sklidí pro test. Buňky v každé destičce se ošetřují podle instrukcí pro získání RNA ve vzorku z 96-jamkových destiček (například pomocí soupravy Qiagen RNeasy 96 kít). Po přípravě RNA se kvantitativně stanoví množství každé z 36 různých druhů mRNA pomocí přístupu NFA-MAPS, včetně 30 korelativních genů a 6 normálních domácích genů. 36 DNA oligonukleotidové chránící fragmenty, každý korespondující s jedním z genů, o které je zájem, se přidají do každé jamky a ponechají se hybridizovat za přesně zvolených podmínek s jím příslušnými cílovými mRNA sekvencemi. Pak se přidá SI nukleáza, aby se zničil přebytek nehybridizované DNA, a vzorky se chemicky ošetří, aby se zničila také RNA. Ponechán je oligonukleotidový chránící fragment pro každý ze 36 genů v množství, které je úměrné tomu, jak mnoho mRNA bylo v ošetřených buňkách přítomno v každém vzorku.
Sto 96-jamkových destiček, z nichž každá zahrnuje matici skupin 36 různých oligonukleotidových kotev v každé jamce, se připraví přidáním 36 různých oligonukleotidových linkerů do každé jamky. Línkery sestavené na povrchu každé jamky, mění generické destičky na MAPS destičky, obsahující specifické sondy pro každý ze 36 oligonukleotidových chránících fragmentů. Každý linker má Část specifickou pro jednu z 36 kotev a část, specifickou pro segment jednoho ze 36 chránících olígonukleotidů. Z každé jamky ze 100 vzorkových destiček, se oligonukleotidový vzorek přidá do korespondující jamky ze 100 MAPS destiček. Po hybridizaci za přesně zvolených podmínek a detekci oligonukleotidu pro každý cíl se přidá chemoluminiscenční enzym, tak aby každé specifické místo každé jamky zářilo podle toho, jaké množství mRNA bylo přítomno ve vzorku. Jakékoliv jamky, které vykazují snížená množství korelativních genů a nemají žádný vliv na 6 domácích genů, jsou zajímavé. Sloučeniny přidané k buňkám « ·
- 94 v těchto vzorcích představují možné výchozí body pro vývoj protinádorových účinných látek.
Příklad 17 Indukovaná a konstitutivní genová exprese
RNA byla připravena v podstatě jak je opsáno v příkladu 14, z jater myší, které byly buď neinfikované (kontrola) nebo byly jednu hodinu po infikování (infikované) adenovirem. Na každý vzorek bylo použito 60 pg jaterní RNA, vzorky byly připraveny duplicitně. Každá testovací jamka obsahovala tři sady duplicitních míst, odpovídající třem genům popsaným shora. Každé místo obsahovalo kotvu, navázanou k linkeru, který obsahoval sondu, komplementární k chránícímu fragmentu, korespondujícímu s jedním ze tří genů. Nukleázová ochrana byla provedena při MAPS testu v podstatě jak je popsáno na obrázku 12, a obrazy byly získány a skenovány jak je popsáno. Pro každý ze tří mRNA cílů jsou znázorněny řady získaných obrazových dat a naskenované intensity pro duplicitní jamky. Tato čísla získaná přes skenované linie, se integrují do hodnot intensit a vypočtou se standardní odchylky pro každý případ (n = 4). Domácí gen, GAPDH, který se podle očekávání neměl měnit, vykazoval mírné, 1,3-násobné, zvýšení u infikovaného vzorku, které nebylo statisticky průkazné. Transkripce MIP-2 a C-jun byla zvýšena 4 a 6-krát. Tato zjištění ukazují, že dva geny, MIP-2 a C-jun, vykazují ve srovnání s kontrolou - konstitutivně exprimovaným genem - GAPDH - zvětšenou expresi jako odpověď na infekci adenovirem,.
Příklad 18 Enzymový test, vhodný pro hledání sloučenin, které selektivně inhibují tyrosínové nebo serinové kinázy (viz příklad 17)
Kinázy jsou enzymy, které spojují fosfát s proteiny. Bylo prokázáno mnoho případů stimulace růstu normálních a neoplastických buněk. Odtud plyne, že sloučeniny, které inhibují specifické kinázy (ale ne všechny kinázy) se mohou použít k testování, zda jsou tyto kinázy součástí patologického jevu, a jestliže je tomu tak, slouží jako výchozí body pro
- 95 tttt · · farmaceutický vývoj. Například, pět tyrosinových kináz, které se podílejí na stimulaci růstu buněk nebo na regulaci zánětlivých odpovědí, jsou src, lek, fyn, Zap70 a yes. Každá kináza má nosič, a tyto nosiče jsou částečně identifikovány jako krátké peptidy, které obsahují tyrosin. Některé kinázové specifíty se překrývají, takže různé kínázy mohou fosforylovat některé peptidy stejně, ale některé přednostně. Pro uvedených pět kináz bylo vybráno 36 peptidových nosičů, které vykazují spektrum specifických a překrývajících se specifít.
Používají se 96ti-jamkové destičky; každá jamka obsahuje 36 generických oligonukleotidových kotev. Připraví se 36 linkerů, kterými se převedou generické oligonukleotidové matice (s pouhými kotvami) na matice obsahující peptidové nosiče. Uvedených 36 peptidových nosičů bylo syntetizováno a každý byl kovalentně navázán, například amidovou vazbou, na oligonukleotid obsahující 5' aminoskupinu. Oligonukleotidy obsahují sekvence, které se specificky hybridizují s kotvami. Tyto útvary o struktuře peptid/oligo linkery byly sestaveny na povrchu přidáním do všech jamek MAPS destiček.
Pro sereening bylo přidáno do každé jamky pět kináz při vhodných koncentracích (tak, aby rychlostí fosforylace nosičů byly co nejvíce vyrovnané), vždy spolu s jednou z 8800 různých sloučenin, které se měly testovat. Sloučeniny byly testovány na schopnost přímo ínhibovat isolované enzymy. Množství fosforylace každého peptidů v maticí se detekovala přidáním značených protilátek, které váží jen peptidy, které jsou fosforylované na tyrosinu. Jakékoliv jamky, které vykazují snížení fosfotyrosinové tečky, ale ne všech teček, jsou zajímavé. Sloučeniny, které byly přidány do této jamky, mohou být testovány dále, s co největší selektivitou, jaká je možná na inhibitory některé z testovaných kináz.
Schéma testu je znázorněno na horní části panelu na obrázku 17. Připraví se chimérická linkerová molekula, ve které je zahrnut • toto·
- 96 to# ·· ·· oligonukleotid, obsahující 25 párů bází, komplementární k jedné z kotev, křížově navázán k peptidovému nosiči tyrosin fosfokinázového enzymu. Tento chimérický oligopeptidový nosič se sestavuje na matici oligonukleotidových kotev, přičemž se k fosforylaci peptidové části chiméry použije kinázový enzym a po proběhnutí enzymatické reakce se kvantitativní stupeň fosforylace peptidu stanoví antífosfotyrosinovýmí nebo antífosfoserínovými protilátkami s připojenou detekcí ťluoroforu nebo enzymu.
Výsledky testu jsou zobrazeny na nižším panelu. Homobífunkční síťovací činidlo, DSS (Pierce), bylo použito k navázání 5' aminoskupiny oligonukleotidového linkeru k N-zakončení peptidu, syntetizovaného pomocí fosforylovaného tyrosinu. Sekvence peptidu v jednopísmenovém kódu byla: TSEPQpYQPGENL (SEQ ID: 32), kde pY znamená fosfotyrosin. Tato chiméra byla bud’ přímo dále použita nebo byla nejprve upravena její reakce na pH 14 po dobu 60 minut, aby se parciálně hydrolyzovala fosfátová skupina od tyrosinu. Fosforylované nebo parciálně defosforylované chimérické molekuly byly sestaveny na komplementárních molekulách kotev na destičce MAPS při znázorněných koncentracích, po dobu jedné hodiny. Po promytí a blokování jamky působením 0,3% BSA v SSPTP byly přidány antifosfotyrosínové protilátky křížově navázané k HRP (protilátka 4610 z Upstate Bíotechnology, Lake Placíd, NY) ve zředěném (1:3000) roztoku v SSPTP po dobu 1 hodiny, a množství navázané protilátky se detekovalo pomocí chemolumíníscenčního podkladu, (substrát Super Signál Blaze). Znázorněný obrázek byl akumulován na CCD matici 1 minutu. Podle očekávání byly v množství fosfátu, navázaného k oligopeptidu, pozorovány rozdíly. Tento rozdíl je základem pro test měření, jak aktivní je soubor kináz, pokud se na něj působí různými možnými inhibitory.
- 97 • ·
Příklad 19 Test kinetiky navazování pro detekci selektivních inhibitorů interakce SH2 domén a fosforylovaných peptidů
SH2 domény slouží jako zásobní podjednotky některých růstově regulačních proteinů. Domény se váží k fosfotyrosínu, obsahujícímu proteiny nebo peptídy s neúplnou specífítou. To znamená, že některé fosfotyrosínové peptidy se váží specificky k jednomu z menšího počtu SH2 proteinů, zatímco jiné se váží divoce k mnoha SH2 proteinům.
Pro tento test se linkery fosforylují peptidy, kovalentně navázané k oligonukleotidům. Peptidové skupiny se volí pro jejich schopnost, vázat se ke skupině vybraných SH2 proteinům. Linkery konvertují generické destičky MAPS na destičky s ligandy, specifickými pro skupinu SH2 proteinů. Tak se generuje sto 96-jamkových MAPS destiček nesoucích ligandy. Proteiny se izolují a značí se například fluorescenční molekulou cy5.
Pokud se hledají inhibitory SH2 domén/fosfopeptidové interakce, tak se přidá ke každé jamce ze 100 96-jamkových MAPS destiček skupina značených SH2 proteinů, a do každé jamky se přidá jiná testovaná sloučenina. Takto se dosáhne toho, že se individuálně testuje vliv každé sloučeniny na interakci SH2 proteinů s jejích fosfopeptídovými ligandy. Pří testu se měří fluorescence navázaných SH2 proteinů, spojených s každým povrchově vázaným peptidovým línkerem. Pro jakoukoliv jamku, znázorňující sníženou fluorescencí některých teček, ne však všech teček, kde může být přidaná sloučenina dále testována jako nadějný potenciální selektivní inhibitor blokování SH2 .
Příklad 20 Vysoce výkonný screening (víz obr. 22)
Vyobrazeny jsou destičky MAPS pro vysoký výkon, na kterých je demonstrována detekce signálu z 96 jamek v jednom experimentu.
- 98 ···· · · · · · · ·· ·· ·· ···· ·· ····
Hybridizace se stejným oligonukleotidem byla měřena v 16 opakováních v 80 jamkách. Jak je zobrazeno, reprodukovatelnost 1280 hybridizačních testů byla velmi vysoká. Krajní levý a krajní pravý sloupec slouží jako kontroly ke standardizaci signálu pro různé koncentrace oligonukleotídů.
Podobným způsobem se dá testovat 16 různých oligonukleotídů v každé jamce, a tento test opakovat v 80 různých jamkách destičky. Pochopitelně, dá se testovat i větší počet oligonukleotídů nebo různých sond, (např. 100 nukleotidových sond) v každé jamce, a mnoho destiček se dá testovat současně (např. 100 destiček, jako jsou 96ti jamkové mikrotitrové destičky). Velký počet testů, které se dají provádět na každém vzorku (např. v každém z posledních případů asi 100 různých testů) a velký počet vzorků se dá testovat současně (např. v posledně jmenovaném případě 96 x 100, nebo 9 600 různých vzorků), čímž se dosáhne vysokého výkonu testování.
Příklad 21 Příprava zesíleného cíle (viz Obrázek 23)
Na pevný podklad (například perličky nebo reakční nádoby) se naváže PCR primér (primér jedna), což se provede pomocí chemické modifikace, která se zavede na 5' zakončení olígonukleotidového príméru. Tento primér obsahuje 5' až 3', chemickou modifikací, místo pro restrikční enzym a sekvenci, která je komplementární k hledanému cílí (například cDNA kopie mRNA, která je předmětem zájmu). Cíl se zesílí pomocí PCR s použitím PCR primérů s připojeným primérem jedna a primérem dvě, které obsahují 5' a 3', sekvence specifické pro detekční oligonukleotid a sekvenci, která je komplementární k jiné části cíle, než je primér jedna. Po PCR zesílení se zesílená DNA promyje, aby se odstranil přebytek reakčních činidel a uvolní se z pevného podkladu odštěpením pomocí restrikčního enzymu, specifického pro zmíněné restrikční místo na primérů jedna. Zesílený primér se tak uvolní do kapalné fáze. K deaktivaci restrikčního enzymu a k denaturaci dvouvláknového DNA produktu se dá použít zahřívání a/nebo
- 99 • · chemické působení. Uvolněné molekuly jednovláknové cílové DNA se pak mohou uvést do kontaktu s povrchem, obsahujícím kotvy a/nebo linkery a cíl se může detekovat pomocí detekčních oligonukleotidů, komplementárních k specifickým detekčním sekvencím v priméru dvě.
Příklad 22 Příprava zesíleného cíle
Na pevný podklad (například perličky nebo reakční nádoby) se naváže PCR primér (primér jedna), což se provede pomocí chemické modifikace, která se zavede na 5' zakončení oligonukleotidového priméru. Tento primér obsahuje 5' až 3' chemickou modifikaci, peptidovou sekvenci, kteráje štěpitelná proteázou a sekvenci, kteráje komplementární k hledanému cíli (například cDNA kopie mRNA, kteráje předmětem zájmu). Míst peptidů lze také použít jakýkoliv jiný člen, který se dá specificky štěpit. Po PCR zesílení, jak je popsáno například v příkladu 21, se PCR produkt, který je stále navázán na pevný podklad, denaturuje a (popřípadě) promyje, přičemž se ponechá za jednovláknovou molekulou, navázanou na podklad. Promytá, navázaná molekula se pak může štěpit a uvolnit (například působením vhodné proteázy) a uvede se do kontaktu s povrchem, který obsahuje kotvy a/nebo linkery. Alternativně se může řetězec zesíleného cíle, který se uvolní po denaturací, uvést do kontaktu s povrchem, obsahujícím kotvy a/nebo linkery. V jiném případě se může uvádět do kontaktu pouze jeden řetězec zesíleného cíle (například hybridizovaný) s línkerem, čímž se eliminuje konkurence hybrídizace z protilehlého řetězce a sníží se pozadí. Linker se pak dá navrhnout tak, aby byl specifický pro jeden oba řetězce zesílených cílových řetězců.
Příklad 23 Test s detekčními linkery a hlásícím činidlem (viz Obrázek 24)
Vzorek, obsahující mRNA, kteráje předmětem zájmu, se podrobí nukleázové chránící proceduře, přičemž se používá jako chránící fragment
- 100 oligonukleotíd, který obsahuje cílovou specifickou skupinu a kontrolní přesahující skupinu, která není komplementární k mRNA. Pokud je to žádoucí, může se kontrolní přesahující skupina po nukleázové digescí odštěpit, jak je znázorněno v levé části obrázku, nebo přesahující část nepodléhá digescí, jak je to znázorněno v pravé částí obrázku. Výsledné nukleázové chránící fragmenty se hybridizují na detekční linker, který obsahuje skupinu, specifickou pro cíl, a skupinu, specifickou pro kontrolní přesahující skupinu. V testu, znázorněném v levé části obrázku, zůstává kontrolní přesahující skupina detekčního linkeru nehybridizovaná; a v kontrastu s tím, v testu, znázorněném v pravé části obrázku, se kontrolní přesahující skupina detekčního linkeru hybridizuje na reziduální kontrolní přesahující sekvenci chránícího fragmentu. V následujícím kroku testu se hlásící činidlo, obsahující skupinu schopnou interagovat se skupinou, specifickou pro kontrolní přesahující skupinu, nechává interagovat s komplexy. V testu, znázorněném v levé části obrázku, se hybridizuje hlásící činidlo se skupinou detekčního linkeru, specifickou pro kontrolní přesahující sekvenci, která zůstala přístupná pro hybridizaci a komplex se pak detekuje například pomocí signalizační entity na hlásícím činidle. Na rozdíl od toho v testu, znázorněném v pravé části obrázku, není hlásící činidlo schopno se navázat na komplex, neboť komplementární sekvence nejsou pro hybridizaci přístupné, a tak s tímto komplexem není spojen žádný signál.
V mnoha z těchto testů podle vynálezu může hlásící činidlo interagovat s jakoukoliv sekvencí, přítomnou v detekčním linkeru, bez omezení na sekvenci, specifickou pro kontrolní přesahující sekvenci.
Příklad 24 Více fluorescenčních látek (viz obrázek 25)
Na obrázku 25 je znázorněna oblast, rozdělená na pět lokalit, A až E. Každá lokalita zahrnuje jinou skupinu v podstatě identických kotev, kotvy A až E. Na kotvy v lokalitě A jsou hybridizovány čtyři různé typy linkerů,
• ·
- 101 z nichž každý obsahuje skupinu, specifickou pro kotvu A. Nicméně každá z těchto kotev obsahuje skupinu, specifickou pro jiný cíl: pro cíl 1, 2, 3 nebo 4. Proto se po hybridizaci cílů na komplexy kotva/linker cíle naváží na lokalitě A. Podobně mohou být čtyři různé typy linkerů hybridizovány na lokalitě B, přičemž každý linker obsahuje skupinu, specifickou pro kotvu B, ale jejích skupiny, specifické pro cíle, jsou specifické pro cíle 5,6,7 nebo 8. Podobným způsobem jsou cíle 9 až 12 spjaty s lokalitou C, cíle 13 až 16 s lokalitou D a cíle 17 až 20 s lokalitou E. Jestliže každý z těchto cílů je značen (přímo nebo nepřímo) jiným, nezávisle detekujícím fluorogenem, jako je například nahoru převádějící fosforescenční látka, lze nezávisle detekovat všech 20 cílů na pěti indikovaných lokalitách.
Příklad 25 Test ve vysoce výkonné podobě
V tomto příkladu se používá transkripční test podle vynálezu pro detekci a kvantifikaci změn v genové expresi, a to ve formátu, upraveném pro vysoce výkonný screening. Veškeré kroky v testu se provádějí roboticky. Rutinní promývání není explicitně popsáno. Veškeré reakce se provádějí konvenčními postupy, které jsou buď v oboru známé, nebo jsou zde popsány.
Na 96-jamkových míkrotítrových destičkách se špičatými jamkami, se nechají v množství 50 000 až 150 000 buněk na jamku růst lidské monocyty THP-1. Tyto buňky jsou buď neoŠetřeny, nebojsou rozděleny pomocí 12myristátu-13-acetátu forbolu (dále zkratka PMA od anglického názvu phorbol 12-myrístate 13-acetate) po dobu 48 hodin, načež následuje aktivace lipopolysacharidem (LPS) po dobu 4 hodin. Po ošetření se buňky rozloží v guanidinisothiokyanátu a zmrazí do dalšího použití. mRNA se získá pomocí streptavidinových paramagnetických částic, ke kterým je navázán biotin-poly dT. Alternativně se získá Celá RNA extrakcí trojitým reakčním činidlem (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Vzorky, obsahující buď mRNA nebo celkovou RNA se podrobí nukleázové chránící • ·
- 102 • · ·· » · · > · · · · » · · 4 proceduře, přičemž se použije jako DNA chránících fragmentů směs třinácti 60-merních jednovláknových oligonukleotidů, z nichž každý obsahuje 5' až 3', 25-mer, specifický projeden z třinácti cílů, které se hledají (GAPDH,
IL-1, TNF-α, katepsin G, cox-2, cyklin-2, vimetin, LD-78-β, HMG-17, osteopontin, β-thromboglobin, angiotensin nebo aktin); 10-merní spacer; 25-mer specifický pro běžnou oligonukleotidovou detekční sondu; a 15-merní běžnou kontrolní přesahující sekvenci.m RNA se tím převede na stechiometrické množství odpovídajícího DNA chránícího fragmentu, který slouží jako cíl v testu. Kontrolní experimenty, při kterých se tyto odpovídající DNA chránící fragmenty inkubují se sondou, specifickou pro kontrolní přesahující sekvenci, ukazují, že podle očekávání se při nukleázové digesci ukazuje, že v odpovídajících chránících fragmentech jsou přítomny v podstatě jen sekvence, specifické zvolené mRNA cíle, o které je zájem při testu, jak je to požadováno.
Povrchy se připraví způsobem podle vynálezu. V každé z 96-jamkových DNA-navazovacích destiček se vytvoří matice šestnáctí různých 25-merních oligonukleotidových kotev. Používá se čtrnáct různých druhů kotev.
V každém ze tří rohů matice se použije jeden druh kotvy a na ostatních lokalitách matice se použije 13 různých druhů kotev, přičemž na každé lokalitě je vždy jen jediný druh. Kotvy se pak hybridizují v definovaném kolmém uspořádání, s 60-merními oligonukleotidovými linkery, z nichž každý obsahuje, 5' až 3', 25-mer, který odpovídá jednomu ze třinácti hledaných cílů, 10-merní spacer a 25-mer, specifický pro jednu z kotev.
Tím se dosáhne toho, že v každé z mnoha 16-ti místných matic je každý ze třinácti cílově-specifických linkerů lokalizován v definované pozici (na stejném místě) matice. Ilustrace takového kolmého uspořádání je na obrázku 18. Linkery, odpovídající GAPDH, konstitutivně exprimující domácí gen, sloužící jako vnitřní normalizační kontrola, jsou v každé matici znázorněny na třech místech. Kontrolní experimenty ukázaly, že linkery, stejně jako chránící fragmenty a detektorové oligonukleotidy použité v experimentu, vykazují požadovanou specífítu.
- 103 • · ·ν » · · » · · · ·
I · · * • · 9 1 ·· ··
Vzorky obsahující směsi odpovídajících chránících fragmentů připravené podle shora uvedeného popisu, se hybridizují na matice entit kotva/linker. Používají se vzorky, odvozené od indukovaných kultur. Přítomnost a množství hybrídízovaných chránících fragmentů na každém místě matice se pak detekuje hybrídízací se značenými detektorovými oligonukleotidy. Za účelem normalizace velikosti signálu na každém místě se detektorové oligonukleotidy zředí vhodným množstvím blokovaných oligomerů, jak je zde popsáno. Síla signálu v každém místě se zpracovává a získané hodnoty se normalizují na kontrolní GAPDH signály. Získané údaje jsou podle výsledků v osmi opakováních se stejným vzorkem reprodukovatelné, a stejně tak u vzorků, připravených ze tří nezávislých pokusů, provedených v různých dnech. Přehled relativních četností třinácti transkriptů při jednom experimentuje znázorněn v následující tabulce.
Tabulka relativních intenzit (105 buněk/jamku)
Gen Kontrolní indukované Koeficient
průměr CV(n=16) průměr CVÍn-16) intenzity
GAPDG 10110 7 % 9833 9 % 0.97
IL-1 527 36 % 8124 38 % 15,40
TNF 229 35 % 2249 36 % 9,80
GAPDH 9591 11 % 10031 17 % 1,05
Katepsín G 10394 31 % 19648 46 % 1,89
COX-2 415 39 % 3557 25 % 8,58
Cyklín-2 1728 23 % 2960 25 % 1,71
Vimetin 25641 25 % 71074 20 % 2,77
LD78 1298 39 % 13437 20 % 10,35
HMG-17 8286 19 % 2405 20 % 0,29
Osteopontin 5604 42 % 19053 46 % 3,40
Tromboglobulin -53 - 31761 23 % > 100
GAPDH 10299 13 % 10136 12 % 0,98
Angiotensin 3575 28 % 6561 31 % 1,84
Áktin 12741 27 % 21802 23 % 1,71
(kontrola) 108 - 234 - -
• · * * • · · • · · • · ·♦»· • · * • « « · « • · , * · • · * · »· ··
- 104 #·
Příklad 26 Algoritmus pro počítačové zpracování dat z více matic
Výhodný algoritmus hledá pozici všech míst na MAPS destičce a automaticky vypočítává metodou nejlepšího výběru nej pravděpodobnější amplitudu signálu v každém místě, které poskytuje data. Výhodně je tento algoritmus implementován pro počítač.
- Vybere se Část zobrazených dat, okénko 40x40, obsahující hodnotu intenzity pro jednotlivý pixel (prvek v obrázku) zobrazené matice, který zahrnuje první jamku, která se má zkoumat.
- Definuje se funkce, která vypočítává očekávanou intenzitu na pozici každého pixelu, přičemž se používá 16 neznámých. Tyto neznámé jsou:
- amplitudy v každém ze 13 odlišných bodů mikromatice (to je, jak jasné jsou skutečné signály na každé pozici v DNA matici). Protože ze 16 (=4x4) míst v každé jamce je 13 různých a ostatní představují duplikáty některých cílů.
- x - odchylka a y - odchylka, které definují přesnou pozici matice
4x4 v konkrétní jamce.
- intenzita pozadí obrázku matice v jamce.
Tato funkce vyhodnocuje pro pozici každého pixelu vzdálenost mezi pixelem a každým místem, a přičítá k intenzitě, pozorované na každém pixelu, určitou hodnotu, způsobenou povahou jednotlivého místa, přičemž tuto hodnotu vypočítává násobením amplitudy v daném místě hodnotou, která je funkcí závislosti odezvy impulsu na vzdálenosti pixelu od místa.
Pro daná zobrazení se používá funkce odezvy impulsu, která je definována součtem Gaussových a Lorentzových směrodatných (konstantních) odchylek.
- 105 • · ·» · · ···· ·· ····
- Zahájí se rychlé úpravy hodnot pro danou jamku odhadem hodnot těchto parametrů. Při tom se vypočítává průměrná intenzita obrázku pro každou ze 16 oblastí obrázku, ve které se očekává testovací místo. Úbytek hodnoty při určité poloze na každé koordinátě a empiricky se tak získají konstanty pro úpravu hodnoty v určité vzdáleností. Pak se matematickým přepočtem pomocí těchto konstant upraví výsledky ze 16 míst s 13 různými amplitudami. Pro pozadí a odchylky se použijí jakkoliv malá čísla.
- Optimalizují se upravené hodnoty (pro 16 neznámých) úpravou křivky. Konkrétně byla použita metoda nelineární regrese pomocí nejmenších čtverců podle Marquardta, přičemž se pro uvedených 16 neznámých získá 40x40=1600 rovnic (Pochopitelně ne všechny rovnice jsou lineárně nezávislé).
- Použije se hodnota chyb x a y, vypočtených pro danou jamku, k přesnějšímu odhadu, jak je umístěn rastr v další jamce mikrodestičky. Ta se očekává ve vzdálenosti 9 milimetrů na koordinátě od sousední jamky (vzdálenost získána převedením počtu pixelů podle zvětšení, které používá daný zobrazovací systém). Vzhledem k tomu, že vzdálenost mezi jamkami je vůči velikosti destičky malá, použití lokálních odhadů pozice je nejpřesnější.
- Pomocí zlepšeného odhadu pozice se definuje menší ploška obrázku pro zpracování signálů z pixelů z další jamky, a to 30x30. To výrazně zrychlí proces zpracování hodnot.
Jdi na stupeň 2 a opakuj pro každou jamku.
Z předchozího popisu může odborník v oboru snadno pochopit podstatné vlastnosti vynálezu, a aniž by se odchýlil od myšlenky vynálezu a
- 106 «·· ···· ·«·» i í z ** t · i ί z ,* ·» · «·· ··· w· « · « · · · · · ·· ···· aniž by vybočil z jeho rozsahu, může uskutečnit různé obměny a modifikace vynálezu, aby jej přizpůsobil různému použití a různým podmínkám .
Bez dalšího propracování to může odborník, který ovládá obor, dle našeho mínění provést a jen s použitím předchozího popisu může využít vynález v celém rozsahu. Popsaná výhodná provedení byla míněna pouze ilustrativně, a ne jako omezení popisu v jakémkoliv směru.
Celý popis všech aplikací, patentů a publikací, citovaných shora a veškerá jejich vyobrazení jsou tímto včleněny do popisu formou odkazu.

Claims (48)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    - 107 Vl/ oá©04 - 44 £ 2.
    1. Způsob detekce alespoň jednoho cíle, při kterém se:
    a) uvádí vzorek, který může tento cíl nebo více cílů obsahovat, do kontaktu s kombinací, která před přidáním vzorku zahrnuje:
    i) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje ii) alespoň osm různých oligonukleotidových kotev, z nichž každá je ve spojení s iii) bifunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro oligonukleotidovou kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro uvedený(é) cíl(e), přičemž cílem(ly) je(jsou) chránící fragment(y) aje(jsou) před uvedením vzorku se zmíněnou kombinací do kontaktu, zesílen(y) pomocí PCR, za podmínek pří kterých se uvedený cíl účinně váže na tuto kombinací,
    b) uvádí do kontaktu kombinace a jakékoliv navázané cíle se značenou detekční sondou a
    c) provede se detekce na uvedené detekční sondě.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cíl(e) se zesiluje(í) pomocí dvou PCR primérů, přičemž jeden z nich nebo oba z těchto primérů upravené
    - 108 • · · · • ·· « · «« · • · · · · « • · » · · · ··· » · c · · ···· ·· ·«· · obsahuje(í) chemickou modifikaci, která priméru umožňuje navázat se na pevný povrch.
  3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cíl(e) se zesiluje(í) pomocí dvou PCR primérů, přičemž jeden z nich nebo oba z těchto primérů nich obsahuje(í) alespoň jedno místo štěpítelné restríkčním enzymem.
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cíl(e) se zesíluje(í) pomocí dvou PCR primérů, přičemž jeden z nich nebo oba z těchto primérů nich obsahuje(í) alespoň jednu peptidovou sekvencí, která může být štěpena proteázou.
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cíl(e) se zesiluje(í) pomocí dvou PCR primérů, přičemž jeden z nich nebo oba z těchto primérů nich obsahuje(í) alespoň jednu sekvenci, která je specifická pro uvedenou detekční sondu.
  6. 6. Způsob detekce alespoň jednoho cíle, při kterém se
    a) vzorek, který může obsahovat alespoň jeden cíl, uvádí do kontaktu s kombinací, která před přidáním uvedeného vzorku obsahuje
    í) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje ii) alespoň osm různých oligonukleotidových kotev, z nichž každá je ve spojení s iii) bifunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro oligonukleotidovou kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro uvedený(é) cíl(e), upravené
    - 109 • · · · • · · · · * · · · · ♦ «· ···· za podmínek při kterých se uvedený cíl účinně váže na tuto kombinaci,
    b) uvedená kombinace a každý navázaný cíl uvádí do kontaktu se značenou detekční sondou, a
    c) detekuje se uvedená značená detekční sonda, přičemž uvedená značená detekční sonda obsahuje nahoru převádějící fosforescenční chemickou skupinu.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedená kombinace a všechny navázané cíle se uvádějí do kontaktu s alespoň dvěma detekčními značenými sondami, z nichž každá obsahuje jinou nahoru převádějící fosforescenční chemickou skupinu.
  8. 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedeným(i) cílem(ly) je(jsou) nukleázový(é) chránící fragment(y).
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedená kombinace a jakékoliv navázané cíle se uvádějí do kontaktu s nejméně dvěma značenými detekčními sondami, z nichž každá obsahuje jinou nahoru převádějící fosforescenční chemickou skupinu.
  10. 10. Způsob detekce alespoň jednoho cíle, pří kterém se
    a) vzorek, který může obsahovat alespoň jeden cíl, uvádí do kontaktu s kombinací, která před přidáním uvedeného vzorku obsahuje
    i) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje upravené
    - 110 0 · · • · • · «00 • » ···» · · ·0·0 ii) alespoň osm různých oligonukleotidových kotev, z nichž každá je ve spojení s iii) bifunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro olígonukleotídovou kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro uvedený(é) cíl(e), za podmínek pří kterých se uvedený cíl účinně váže na tuto kombinaci,
    b) uvedená kombinace a každý navázaný cíl uvádí do kontaktu s detekčním linkerem, který zahrnuje skupinu, specifickou pro uvedený cíl a skupinu, specifickou pro hlásící činidlo, které interaguje s uvedeným detekčním linkerem, a které obsahuje signalizační entitu,
    c) na uvedený detekční linker se nechá působit uvedené hlásící činidlo,
    d) detekuje se uvedená signalizační entita.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedeným(i) cílem(ly) je(jsou) nukleázový(é) chránící fragment(y).
  12. 12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále:
    b) se uvedená kombinace a veškeré navázané cíle uvádějí do kontaktu s alespoň dvěma detekčními linkery, z nichž každý obsahuje skupinu specifickou pro jeden z uvedených cílů a skupinu specifickou pro běžné hlásící činidlo, upravené
    - 111 • · · ·
    c) uvedené detekční linkery se uvádějí do kontaktu s uvedeným běžným hlásícím činidlem, které interaguje s uvedenými linkery, a který obsahuje signalizační entitu, a
    d) detekuje se uvedená signalizační entita.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedenými cíly jsou nukleázové chránící fragmenty.
  14. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedené signalizačními entity obsahují nahoru převádějící fosforescenční chemickou skupinu.
  15. 15. Způsob detekce alespoň dvou RNA, při kterém
    a) se vzorek, který může obsahovat uvedené RNA, Ínkubuje se dvěma nebo více chránícími fragmenty za podmínek, při kterých se uvedené chránící fragmenty mohou hybridizovat s uvedenými RNA, přičemž každý uvedený chránící fragment obsahuje běžnou 3' přesahující sekvenci, která není specifická pro uvedené RNA,
    b) uvedený ínkubovaný vzorek se podrobí působení jedné nebo více nukleáz, které jsou schopny dígestovat nukleové kyseliny kromě Částí uvedených chránících fragmentů, jenž jsou hybrídízovány s uvedenými RNA a popřípadě částí uvedených RNA, které jsou hybridizovány,
    c) odstraní se nukleové kyseliny kromě uvedených chránících fragmentů, které jsou hybridizovány s uvedenými RNA, čímž se získá vzorek, obsahující chránící fragmenty,
    d) uvedený vzorek, obsahující chránící fragmenty, se uvádí do kontaktu s kombinací, která před přidáním uvedeného vzorku obsahuje upravené
    i) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje ií) alespoň osm různých oligonukleotidových kotev, z nichž každá je ve spojení s iii) bifunkěním linkerem, který má první Část, která je specifická pro oligonukleotidovou kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden z uvedených chránících fragmentů, za podmínek při kterých se uvedený cíl může vázat na tuto kombinaci,
    e) uvádí se do kontaktu uvedená kombinace a veškeré chránící fragmenty s alespoň dvěma detekčními linkery, z nichž každý obsahuje skupinu, specifickou projeden z uvedených chránících fragmentů a skupinu, specifickou pro uvedenou běžnou 3' přesahující sekvenci,
    f) uvedené detekční linkery se uvedou do kontaktu s hlásícím Činidlem, které je specifické pro uvedené běžné hlásící činidlo, a které obsahuje signalizační entitu, a
    g) uvedená signalizační entita se detekuje
  16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená signalizační entita obsahuje nahoru převádějící fosforescenční chemickou skupinu.
  17. 17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že alespoň jeden uvedený detekční linker se zředí blokovaným detekčním linkerem.
    upravené • 4
    - 113 4444 44 4 44 «
  18. 18. Způsob detekce alespoň jednoho cíle na bázi nukleové kyseliny, při kterém
    a) vzorek, který může obsahovat alespoň jeden uvedený cíl, se uvede do kontaktu s nukleázovým(í) chránícím(i) fragmentem(ty), specifíckým(í) pro alespoň jeden uvedený cíl a schopný se na něj navázat, výsledný vzorek se vystaví působení nukleázy, schopné dígestovat zbývající jednovláknové nukleové kyseliny, a pak se výsledný vzorek uvede do kontaktu s kombinací, která před přidáním uvedeného vzorku obsahuje
    i) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje ii) alespoň osm různých oligonukleotidových kotev, z nichž každá je ve spojení s iii) bifunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro oligonukleotidovou kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden z uvedených chránících fragmentů,
    b) uvedená kombinace a veškeré navázané nukleázové chránící fragmenty se uvedou do kontaktu s alespoň jedním detekčním linkerem, který obsahuje první skupinu, specifickou projedenu z navázaných nukleázových chránících fragmentů a druhou skupinu, specifickou pro hlásící činidlo, a
    e) uvedený(é) detekční linker(y) se detekuje(í).
  19. 19. Způsob podle nároku 18, při kterém že uvedené hlásící činidlo interaguje s alespoň jedním uvedeným linkerem a obsahuje signalizační entitu, přičemž se při tomto způsobu dále upravené • · · · • · ·
    - 114 d) uvádí do kontaktu alespoň jeden detekční linker s uvedeným hlásícím činidlem, a
    e) signalizační entita se detekuje.
  20. 21. Způsob pro detekcí alespoň dvou cílů na bází nukleové kyseliny při kterém:
    a) vzorek, který může obsahovat alespoň jeden uvedený cíl, se uvede do kontaktu s nukleázovými chránícími fragmenty, specifickými pro alespoň jeden uvedený cíl a schopný se na něj navázat, výsledný vzorek se vystaví působení nukleázy, schopné digestovat zbývající jednovláknové nukleové kyseliny, a pak se výsledný vzorek uvede do kontaktu s kombinací, která před přidáním uvedeného vzorku obsahuje
    i) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje ii) alespoň dvě různé oligonukleotidové kotvy, z nichž každá je ve spojení s iii) bífunkčním línkerem, který má první část, která je specifická pro kotvu, a druhou Část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden z uvedených chránících fragmentů, za podmínek při kterých se uvedené chránící fragmenty mohou vázat na tuto kombinaci,
    b) uvedená kombinace a veškeré navázané nukleázové chránící fragmenty se uvedou do kontaktu s alespoň dvěma detekčními linkery, z nichž každý obsahuje první skupinu, specifickou projeden z navázaných upravené
    -115• · · · * · · · «·· · • · · · ·· «··· · · nukleázových chránících fragmentů a druhou skupinu, specifickou pro běžné hlásící činidlo, a
    c) uvedené detekční linkery se detekují.
  21. 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedené hlásící Činidlo interaguje s alespoň jedním detekčním línkerem a obsahuje signalizační entitu, přičemž dále
    d) se uvádí do kontaktu alespoň jeden detekční linker s uvedeným hlásícím činidlem, a
    e) signalizační entita se detekuje.
  22. 23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že kotvy jsou oligonukleotidové kotvy.
  23. 24. Způsob detekce nejméně dvou hledaných cílů na bázi nukleových kyselin ve vzorku, které tyto cíle mohou obsahovat, při kterém
    a) se vzorek, který může obsahovat uvedené RNA, inkubuje se dvěma nebo více chránícími fragmenty za podmínek, při kterých se uvedené chránící fragmenty mohou hybridizovat s uvedenými RNA, přičemž každý uvedený chránící fragment obsahuje běžnou 3' přesahující sekvenci, která není specifická pro uvedené RNA,
    b) uvedený inkubovaný vzorek se podrobí působení jedné nebo více nukleáz, které jsou schopny digestovat nukleové kyseliny kromě částí uvedených chránících fragmentů, jenž jsou hybridizovány s uvedenými RNA a popřípadě částí uvedených RNA, které jsou hybridizovány, upravené
    -116• · · · β · • · ···· ·· «···
    c) odstraní se nukleové kyseliny kromě uvedených chránících fragmentů, které jsou hybridizovány s uvedenými RNA, čímž se získá vzorek, obsahující chránící fragmenty,
    d) uvedený vzorek, obsahující chránící fragmenty, se uvádí do kontaktu s kombinací, která před přidáním uvedeného vzorku obsahuje
    í) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje ii) alespoň osm různých oligonukleotidových kotev, z nichž každá je ve spojení s iii) bifunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden z uvedených chránících fragmentů, za podmínek při kterých se uvedené chránící fragmenty mohou vázat na tuto kombinaci,
    e) uvádí se do kontaktu uvedená kombinace a veškeré chránící fragmenty s alespoň dvěma detekčními linkery, z nichž každý obsahuje skupinu, specifickou projeden z uvedených chránících fragmentů a skupinu, specifickou pro uvedenou běžnou 3' přesahující sekvencí.
  24. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že dále
    f) se uvedené detekční linkery se uvedou do kontaktu s hlásícím činidlem, které je specifické pro uvedené běžné hlásící činidlo, a které obsahuje signalizační entitu, a
    g) uvedená signalizační entita se detekuje upravené
    - 117 -
  25. 26. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že kotvami jsou oligonukleotidové kotvy.
  26. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že jeden nebo více detekčních linkerů se zředí blokovaným detekčním linkerem.
  27. 28. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že nejméně jedna uvedená kotva je ve spojení s bifunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro jiný nukleázový chránící fragment.
  28. 29. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že uvedené kotvy jsou disociovány od bifunkčních linkerů, které jsou specifické pro jiný cíl.
  29. 30. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že kombinace obsahuje velký počet oblastí a způsob má vysokou účinnost.
  30. 31. Kit pro detekci alespoň jednoho cíle na bázi nukleové kyseliny ve vzorku, který obsahuje
    a) alespoň jeden nukleázový chránící fragment, specifický pro alespoň jeden uvedený cíl, ale ne pro jakoukoliv oligonukleotidovou kotvu v kítu,
    b) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje alespoň dvě různé oligonukleotidové kotvy,
    c) nádobu, obsahující alespoň jednu bifunkční linkerovou molekulu, která má první část, která je specifická pro kotvu, a druhou část, upravené
    -118která zahrnuje sondu, kteráje specifická pro alespoň jeden z uvedených chránících fragmentů a při detekci se na něj váže
    d) Alespoň jeden detekční linker, který má první část specifickou projeden z uvedených nukleázových fragmentů a druhou část, specifickou pro hlásící činidlo.
  31. 32. Kít pro detekcí nejméně jednoho cíle na bází nukleové kyseliny ve vzorku, který obsahuje:
    a) alespoň jeden nukleázový chránící fragment, specifický pro alespoň jeden z uvedených cílů, ale ne pro žádný další oligonukleotíd v uvedeném kitu,
    b) alespoň jeden bifunkční linker, která má první část, kteráje specifická pro oligonukleotidovou kotvu, a druhou část, kteráje specifická pro alespoň jeden z uvedených chránících fragmentů a při detekci se na něj váže a
    c) alespoň jeden detekční linker, který má první část specifickou projeden z uvedených nukleázových fragmentů a druhou část, specifickou pro hlásící činidlo.
  32. 33. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že každá oblast obsahuje alespoň osm různých kotev.
  33. 34. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že každá oblast obsahuje alespoň osm různých kotev.
  34. 35. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že každá oblast obsahuje alespoň osm různých kotev.
    upravené
    -119• ·
  35. 36. Způsob pro detekci alespoň jednoho cíle na bázi nukleové kyseliny při kterém:
    a) vzorek, který může obsahovat alespoň jeden uvedený cíl, se uvede do kontaktu s alespoň jedním nukleázovým chránícím fragmentem, specifickým pro alespoň jeden uvedený cíl a schopný se na něj navázat, výsledný vzorek se vystaví působení nukleázy, schopné dígestovat jednovláknové nukleové kyseliny, a pak se výsledný vzorek uvede do kontaktu s kombinací, která před přidáním uvedeného vzorku obsahuje
    i) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje ii) alespoň dvě různé oligonukleotidové kotvy, z nichž každá je ve spojení s iii) bifunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden z uvedených chránících fragmentů, za podmínek pří kterých se uvedené chránící fragmenty mohou vázat na tuto kombinaci,
    b) uvedená kombinace a veškeré navázané chránící části se uvedou do kontaktu s alespoň jedním detekčním linkerem, který obsahuje první skupinu, specifickou pro jednu z navázaných chránících částí a druhou skupinu, specifickou pro hlásící činidlo, a
    c) uvedené detekční linkery se detekují.
    upravené
    - 120 » ·
  36. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že uvedené hlásící činidlo ínteraguje s alespoň jedním uvedeným detekčním linkerem a obsahuje signalizační entitu, přičemž dále
    d) se uvádí do kontaktu alespoň jeden detekční linker s uvedeným hlásícím činidlem, a
    e) signalizační entita se detekuje.
  37. 38. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že každá oblast obsahuje alespoň osm různých kotev.
  38. 39. Způsob pro detekci alespoň jednoho cíle při kterém
    a) se vzorek, který může obsahovat alespoň jeden uvedený cíl, uvede do kontaktu s kombinací, která před přidáním uvedeného vzorku obsahuje
    i) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje ií) alespoň dvě různé oligonukleotidové kotvy, z nichž každá je ve spojení s iii) bífunkčním linkerem, který má první část, která je specifická pro kotvu, a druhou část, která zahrnuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden z uvedených cílů, za podmínek při kterých se uvedené cíle mohou vázat na tuto kombinaci, upravené
    - 121 přičemž dvě či více kotev, které jsou umístěny v alespoň jednom místě oblasti, jsou(je) asociovány(o) s různými bifunkčnéími linkery, které jsou specifické pro různé cíle.
  39. 40. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že dále
    b) se uvedená kombinace a veškeré navázané cíle uvedou do kontaktu s alespoň jedním detekčním linkerem, který obsahuje první skupinu, specifickou pro alespoň jeden z navázaných cílů a druhou skupinu, specifickou pro hlásící činidlo.
  40. 41. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že se dále
    c) zmíněná kombinace a jakékoliv z navázaných cílů uvedou do kontaktu s alespoň jednou detekční sondou.
  41. 42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že se první detekční sonda váže na první cíl, navázaný na kombinaci na prvním místě, druhá detekční sonda váže na druhý cíl, navázaný na kombinací na stejném místě, a první i druhá detekční sonda se detekují současně nebo postupně.
  42. 43. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedený(é) cíí(e) je(jsou) nukleázový(é) chránící fragment(y), specifický(é) pro hledanou(é) nukleovou(é) kyselinu(y).
    upravené
    - 122 • ·
  43. 44. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že uvedený(é) cíl(e) je(jsou) nukleázový(é) chránící fragment(y), specifický(é) pro hledanou(é) nukleovou(é) kyselinu(y).
  44. 45. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že uvedený(e) cíl(e) je(jsou) nukleázový(e) chránící fragment(y), specifícký(é) pro hledanou(é) nukleovou(é) kyselínu(y).
  45. 46. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že každá oblast obsahuje alespoň osm různých kotev.
  46. 47. Kit podle nároku 31, vyznačující se tím, že každá oblast obsahuje alespoň osm různých kotev.
  47. 48. Kit podle nároku 31, vyznačující se tím, že dále obsahuje
    e) jednu nebo více nukleáz, které jsou schopny dígestovat jednovláknovou nukleovou kyselinu a/nebo RNA řetězec v duplexu DNA/RNA.
  48. 49. Kit podle nároku 31, vyznačující se tím, že dále obsahuje
    a) alespoň jeden nukleázový chránící fragment, specifický pro alespoň jeden uvedený cíl, ale ne pro jakoukoliv oligonukleotidovou kotvu v kitu,
    b) povrch, obsahující více prostorově oddělených oblastí, nichž alespoň dvě jsou v podstatě identické, přičemž každá oblast zahrnuje alespoň dvě různé oligonukleotidové kotvy,
    c) nádobu, obsahující alespoň jednu bifunkční linkerovou molekulu, která má první část, která je specifická pro kotvu, a druhou, část, upravené
    - 123 • · * která zahrnuje sondu, která je specifická pro alespoň jeden z uvedených chránících fragmentů a při detekci se na něj váže
    d) Alespoň jeden detekční linker, který má první část specifickou projeden z uvedených nukleázových fragmentů a druhou část, specifickou pro hlásící činidlo,
    e) jednu nebo více nukleáz, schopných digestovat jednovláknovou nukleovou kyselinu a/nebo RNA řetězec v duplexu
CZ20014582A 1999-06-21 2000-06-21 Zpusob detekce alespon jednoho cíle CZ301618B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/337,325 US6238869B1 (en) 1997-12-19 1999-06-21 High throughput assay system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20014582A3 true CZ20014582A3 (cs) 2002-04-17
CZ301618B6 CZ301618B6 (cs) 2010-05-05

Family

ID=23320079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20014582A CZ301618B6 (cs) 1999-06-21 2000-06-21 Zpusob detekce alespon jednoho cíle

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6238869B1 (cs)
EP (2) EP1847619A3 (cs)
JP (3) JP2003504011A (cs)
KR (1) KR100749185B1 (cs)
CN (1) CN1390263B (cs)
AU (1) AU775659B2 (cs)
CA (1) CA2377567C (cs)
CZ (1) CZ301618B6 (cs)
EA (1) EA007338B1 (cs)
HK (1) HK1052536A1 (cs)
MX (1) MXPA01013355A (cs)
NO (1) NO20016261L (cs)
WO (1) WO2000079008A2 (cs)

Families Citing this family (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207369B1 (en) * 1995-03-10 2001-03-27 Meso Scale Technologies, Llc Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US5989835A (en) * 1997-02-27 1999-11-23 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
JP4663824B2 (ja) * 1996-12-31 2011-04-06 ハイ スループット ジェノミクス インコーポレイテッド 多重化分子分析装置および方法
US7117098B1 (en) 1997-02-27 2006-10-03 Cellomics, Inc. Machine-readable storage medium for analyzing distribution of macromolecules between the cell membrane and the cell cytoplasm
US20100105572A1 (en) * 1997-12-19 2010-04-29 Kris Richard M High throughput assay system
US20030039967A1 (en) * 1997-12-19 2003-02-27 Kris Richard M. High throughput assay system using mass spectrometry
US20030096232A1 (en) * 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
US6458533B1 (en) * 1997-12-19 2002-10-01 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system for monitoring ESTs
US7253435B2 (en) * 1999-04-15 2007-08-07 Millipore Corporation Particles with light-polarizing codes
GB2364704B (en) * 1999-04-15 2004-07-14 Virtual Arrays Inc Combinatorial chemical library supports having indicia at coding positions and methods of use
US20030134330A1 (en) * 1999-04-15 2003-07-17 Ilya Ravkin Chemical-library composition and method
US20030166015A1 (en) * 1999-04-15 2003-09-04 Zarowitz Michael A. Multiplexed analysis of cell-substrate interactions
US6908737B2 (en) * 1999-04-15 2005-06-21 Vitra Bioscience, Inc. Systems and methods of conducting multiplexed experiments
US20030207249A1 (en) * 1999-04-15 2003-11-06 Beske Oren E. Connection of cells to substrates using association pairs
US20030129654A1 (en) * 1999-04-15 2003-07-10 Ilya Ravkin Coded particles for multiplexed analysis of biological samples
GB9922971D0 (en) * 1999-09-29 1999-12-01 Secr Defence Reaction system
AU1075701A (en) * 1999-10-08 2001-04-23 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly
DE10000629C5 (de) * 2000-01-10 2010-06-02 november Aktiengesellschaft, Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren zur Identifizierung einer auf einen festen Körper aufgebrachten Markierung
US7338773B2 (en) * 2000-04-14 2008-03-04 Millipore Corporation Multiplexed assays of cell migration
EP1164201A1 (en) * 2000-06-14 2001-12-19 Facultés Universitaires Notre-Dame de la Paix Reverse detection for identification and/or quantification of nucleotide target sequences on biochips
JP2004501665A (ja) * 2000-07-03 2004-01-22 ゼオトロン　コーポレイション 光生成試薬を用いて化学反応を行なうためのデバイスおよび方法
US20030118486A1 (en) * 2000-07-03 2003-06-26 Xeotron Corporation Fluidic methods and devices for parallel chemical reactions
US6913879B1 (en) 2000-07-10 2005-07-05 Telechem International Inc. Microarray method of genotyping multiple samples at multiple LOCI
US6900013B1 (en) * 2000-08-25 2005-05-31 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization
AU2001285219A1 (en) * 2000-08-24 2002-03-04 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization
US20040185464A1 (en) * 2000-09-15 2004-09-23 Kris Richard M. High throughput assay system
US7182853B2 (en) * 2000-09-22 2007-02-27 University Of Dayton Redox control/monitoring platform for high throughput screening/drug discovery applications
JP2004537712A (ja) 2000-10-18 2004-12-16 バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド 多重細胞分析システム
US6905881B2 (en) 2000-11-30 2005-06-14 Paul Sammak Microbead-based test plates and test methods for fluorescence imaging systems
US7776571B2 (en) * 2000-12-12 2010-08-17 Autogenomics, Inc. Multi-substrate biochip unit
AU2002229435B2 (en) * 2001-01-25 2007-06-07 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
JP2002251091A (ja) * 2001-02-27 2002-09-06 Konica Corp 画像定着装置および画像形成装置
US20020168663A1 (en) * 2001-02-27 2002-11-14 Phan Brigitte Chau Methods for DNA conjugation onto solid phase including related optical biodiscs and disc drive systems
EP2465943A3 (en) 2001-03-16 2012-10-03 Kalim Mir Linear polymer display
US20020146745A1 (en) * 2001-04-03 2002-10-10 Surromed, Inc. Methods and reagents for multiplexed analyte capture, surface array self-assembly, and analysis of complex biological samples
EP1377828A4 (en) * 2001-04-10 2006-11-15 Childrens Medical Center METHODS OF ANALYZING AND MARKING PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS
EP1493014A2 (en) 2001-04-11 2005-01-05 Burstein Technologies, Inc. Multi-parameter assays including analysis discs and methods relating thereto
GB0110476D0 (en) 2001-04-30 2001-06-20 Secr Defence Reagent delivery system
KR100917731B1 (ko) * 2001-05-11 2009-09-15 파나소닉 주식회사 생체분자 기판 및 그것을 이용한 검사 및 진단의 방법 및장치
AU2002310343A1 (en) * 2001-06-07 2002-12-16 University Of Pennsylvania-Center For Technology Transfer Multiplexing method
US20040166593A1 (en) * 2001-06-22 2004-08-26 Nolte David D. Adaptive interferometric multi-analyte high-speed biosensor
EA011415B1 (ru) * 2001-06-26 2009-02-27 Хай Трупут Дженомикс, Инк. Раствор для лизиса клеток или придания им проницаемости и способы детектирования нуклеиново-кислотной мишени
DK2461156T3 (da) * 2001-06-29 2020-08-03 Meso Scale Technologies Llc Indretning til luminescenstestmålinger
JP4291143B2 (ja) * 2001-08-31 2009-07-08 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 分析物ポリヌクレオチドを定量するためのアフィニティーシフトしたプローブ
US20030219800A1 (en) * 2001-10-18 2003-11-27 Beske Oren E. Multiplexed cell transfection using coded carriers
US20080187949A1 (en) * 2001-10-26 2008-08-07 Millipore Corporation Multiplexed assays of cell migration
US7381375B2 (en) * 2001-10-26 2008-06-03 Millipore Corporation Assay systems with adjustable fluid communication
AU2002363076A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-06 Virtual Arrays, Inc. Assay systems with adjustable fluid communication
US20040053264A1 (en) * 2002-02-01 2004-03-18 Park Sung Sup Clinical panel assay using DNA chips
US7504364B2 (en) 2002-03-01 2009-03-17 Receptors Llc Methods of making arrays and artificial receptors
AU2003228285A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-22 Virtual Arrays, Inc. Multiplexed analysis of cellular responses using endogenous reporter genes
US7655397B2 (en) * 2002-04-25 2010-02-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selections of genes and methods of using the same for diagnosis and for targeting the therapy of select cancers
US7774143B2 (en) 2002-04-25 2010-08-10 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for analyzing high dimensional data for classifying, diagnosing, prognosticating, and/or predicting diseases and other biological states
US20030207304A1 (en) * 2002-04-26 2003-11-06 Eric Black Glycerol-doped aerogel coatings as biological capture media
JP3641619B2 (ja) 2002-05-14 2005-04-27 株式会社日立製作所 生体試料検査装置
US6841379B2 (en) 2002-05-15 2005-01-11 Beckman Coulter, Inc. Conductive microplate
US20040126773A1 (en) * 2002-05-23 2004-07-01 Beske Oren E. Assays with coded sensor particles to sense assay conditions
US7115370B2 (en) * 2002-06-05 2006-10-03 Capital Genomix, Inc. Combinatorial oligonucleotide PCR
US20050153382A1 (en) * 2002-06-06 2005-07-14 Chengdu Kuachang Science And Technology Co., Ltd. Biochip kit comprising biochip based on antigen-antibody reactions, and its usage
WO2004011643A1 (ja) * 2002-07-26 2004-02-05 Kabushiki Kaisha Toshiba 核酸プローブ固定化基体およびそれを用いた標的核酸の存在を検出する方法
US7867754B1 (en) 2002-08-01 2011-01-11 Purdue Research Foundation Microarrays for analyte detection
US20040063124A1 (en) * 2002-08-15 2004-04-01 Proteoplex, Inc. Methods and apparatus for preparing and assaying biological samples to determine protein concentration
US6869333B2 (en) * 2002-09-11 2005-03-22 National Optronics, Inc. Lens blank alignment and blocking device and method
US20040054160A1 (en) * 2002-09-16 2004-03-18 Santona Pal Nucleic-acid ink compositions for arraying onto a solid support
US7469076B2 (en) 2003-09-03 2008-12-23 Receptors Llc Sensors employing combinatorial artificial receptors
US20040071605A1 (en) * 2002-10-10 2004-04-15 Coonan Everett W. Slide-based high-throughput microplate device
US20080207465A1 (en) * 2002-10-28 2008-08-28 Millipore Corporation Assay systems with adjustable fluid communication
AU2002952384A0 (en) * 2002-10-31 2002-11-14 Swinburne University Of Technology Structures
US20040137608A1 (en) * 2002-11-27 2004-07-15 Aaron Garzon Chemical microarrays and method for constructing same
EP1571210A4 (en) * 2002-12-10 2006-08-16 Olympus Corp METHOD FOR ANALYZING THE VARIATION OF NUCLEIC ACID MUTATION AND METHOD FOR GENE EXPRESSION ANALYSIS
US20040152083A1 (en) * 2003-01-31 2004-08-05 Leproust Eric M. Multiple arrays with surface energy transition to maintain separation of samples on the arrays
US20040152085A1 (en) * 2003-02-04 2004-08-05 Veridian Systems Division Surface for collection and/or purification of nucleic acids
US20040185481A1 (en) * 2003-02-06 2004-09-23 Canon Kabushiki Kaisha Testing method using DNA microarray
US7223851B2 (en) * 2003-02-06 2007-05-29 General Dynamics Advanced Information Systems, Inc. Nucleic acid-binding polymers
US20050130174A1 (en) * 2003-02-27 2005-06-16 Nanosphere, Inc. Label-free gene expression profiling with universal nanoparticle probes in microarray assay format
US20040185499A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-23 Jolley Michael E. Method of epitope scanning using fluorescence polarization
EP1613737A4 (en) 2003-03-28 2008-12-03 Receptors Llc ARTIFICIAL RECEPTORS COMPRISING REVERSIBLE IMMOBILIZED CONSTRUCTION BLOCKS AND METHODS
WO2004097371A2 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System System and method for the detection of analytes
DE10325098B3 (de) * 2003-06-03 2004-12-02 IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Verfahren zur SNP-Analyse auf Biochips mit Oligonukleotid-Arealen
US20050064462A1 (en) * 2003-06-17 2005-03-24 Bernd Stein Methods, compositions, and kits for predicting the effect of compounds on hot flash symptoms
CA2537264A1 (en) * 2003-09-03 2005-03-17 Receptors Llc Building blocks for artificial receptors
CN1875277B (zh) * 2003-09-03 2011-12-21 受体有限责任公司 使用组合人工受体的方法
CN1879020B (zh) * 2003-09-03 2010-11-03 受体有限责任公司 使用组合的人工受体的传感器
JP4716990B2 (ja) * 2003-09-03 2011-07-06 レセプターズ エルエルシー コンビナトーリアル人工受容体を使用する方法
ATE461292T1 (de) * 2003-09-10 2010-04-15 Althea Technologies Inc Erstellung von expressionsprofilen unter verwendung von mikroarrays
US7488451B2 (en) * 2003-09-15 2009-02-10 Millipore Corporation Systems for particle manipulation
WO2005028621A2 (en) * 2003-09-15 2005-03-31 Vitra Bioscience, Inc. Assays with primary cells
WO2005042763A2 (en) * 2003-10-28 2005-05-12 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
US7981362B2 (en) 2003-11-04 2011-07-19 Meso Scale Technologies, Llc Modular assay plates, reader systems and methods for test measurements
US20050094807A1 (en) * 2003-11-04 2005-05-05 John Silzel Accuracy array assay system and method
WO2005059086A1 (en) 2003-12-16 2005-06-30 Canon Kabushiki Kaisha Biologically active substance transfer sheet, cell culture kit constituted of cell culture plate and biologically active substance transfer sheet, producing method thereof and method for screening cell culture conditions utilizing the same
JP4344624B2 (ja) * 2004-02-02 2009-10-14 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 ビーズ位置情報識別方法
US20050181513A1 (en) * 2004-02-18 2005-08-18 Viorica Lopez-Avila Methods and compositions for assessing a sample by MAILDI mass spectrometry
WO2005118855A1 (en) * 2004-05-20 2005-12-15 Beckman Coulter, Inc. Assay system using labeled oligonucleotides
AU2005250432B2 (en) 2004-05-28 2011-09-15 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
US7338763B2 (en) * 2004-06-02 2008-03-04 Eppendorf Array Technologies S.A. Method and kit for the detection and/or quantification of homologous nucleotide sequences on arrays
US7884052B2 (en) 2004-09-03 2011-02-08 Receptors Llc Combinatorial artificial receptors including tether building blocks on scaffolds
EP1789792A2 (en) 2004-09-11 2007-05-30 Receptors LLC Combinatorial artificial receptors including peptide building blocks
US20060078894A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Winkler Matthew M Methods and compositions for analyzing nucleic acids
DE102004056735A1 (de) 2004-11-09 2006-07-20 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung für die Durchführung und Analyse von Mikroarray-Experimenten
CA2857881A1 (en) 2004-11-12 2006-12-28 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
WO2008073922A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Functions and targets of let-7 micro rnas
JP2006158276A (ja) * 2004-12-06 2006-06-22 Institute Of Physical & Chemical Research Ｄｎａコンジュゲート、ｄｎａコンジュゲートの作製方法、及びｄｎａ検出方法
US20060292586A1 (en) * 2004-12-17 2006-12-28 Schroth Gary P ID-tag complexes, arrays, and methods of use thereof
US7663092B2 (en) * 2005-02-01 2010-02-16 Purdue Research Foundation Method and apparatus for phase contrast quadrature interferometric detection of an immunoassay
US20070023643A1 (en) * 2005-02-01 2007-02-01 Nolte David D Differentially encoded biological analyzer planar array apparatus and methods
US7910356B2 (en) * 2005-02-01 2011-03-22 Purdue Research Foundation Multiplexed biological analyzer planar array apparatus and methods
US7229769B2 (en) * 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
CN101495650B (zh) * 2005-06-20 2015-02-04 领先细胞医疗诊断有限公司 检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法
WO2007070553A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 The Johns Hopkins University Double-tiled and multi-tiled arrays and methods thereof
JPWO2007074747A1 (ja) * 2005-12-26 2009-06-04 株式会社クラレ 細胞培養用材料
US20090176208A1 (en) * 2006-01-04 2009-07-09 Simon Brodie Methods for detecting, identifying and reporting the presence of animal pathological agents
US20070259366A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-08 Greg Lawrence Direct printing of patterned hydrophobic wells
WO2008036776A2 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir -31,mir -145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216 mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US7522282B2 (en) * 2006-11-30 2009-04-21 Purdue Research Foundation Molecular interferometric imaging process and apparatus
US20080230605A1 (en) * 2006-11-30 2008-09-25 Brian Weichel Process and apparatus for maintaining data integrity
US20080144899A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-19 Manoj Varma Process for extracting periodic features from images by template matching
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
CN101622349A (zh) * 2006-12-08 2010-01-06 奥斯瑞根公司 作为治疗性干预靶标的miR-21调节的基因和途径
WO2008073920A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Mir-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
AU2007333106A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090175827A1 (en) * 2006-12-29 2009-07-09 Byrom Mike W miR-16 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
US7659968B2 (en) 2007-01-19 2010-02-09 Purdue Research Foundation System with extended range of molecular sensing through integrated multi-modal data acquisition
US7787126B2 (en) * 2007-03-26 2010-08-31 Purdue Research Foundation Method and apparatus for conjugate quadrature interferometric detection of an immunoassay
US20090232893A1 (en) * 2007-05-22 2009-09-17 Bader Andreas G miR-143 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
JP2010529966A (ja) * 2007-06-08 2010-09-02 アシュラジェン インコーポレイテッド 治療的介入の標的としてｍｉＲ−３４によって調節される遺伝子および経路
DE102007041657A1 (de) * 2007-09-03 2009-03-05 Protagen Ag Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren Verwendung
WO2009036332A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090186015A1 (en) * 2007-10-18 2009-07-23 Latham Gary J Micrornas differentially expressed in lung diseases and uses thereof
WO2009070805A2 (en) * 2007-12-01 2009-06-04 Asuragen, Inc. Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2009086156A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Asuragen, Inc. Mir-10 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090263803A1 (en) * 2008-02-08 2009-10-22 Sylvie Beaudenon Mirnas differentially expressed in lymph nodes from cancer patients
WO2009154835A2 (en) * 2008-03-26 2009-12-23 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mir-16 and therapy of prostate cancer
US20090258928A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-15 Asuragen, Inc. Methods and compositions for diagnosing and modulating human papillomavirus (hpv)
EP2990487A1 (en) * 2008-05-08 2016-03-02 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
CA2726426A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 The Arizona Board Of Regents, On Behalf Of The University Of Arizona Diffuse large b-cell lymphoma markers and uses therefor
US9393566B2 (en) 2008-06-23 2016-07-19 Canon U.S. Life Sciences, Inc. System and method for temperature referencing for melt curve data collection
WO2010056737A2 (en) * 2008-11-11 2010-05-20 Mirna Therapeutics, Inc. Methods and compositions involving mirnas in cancer stem cells
CA2768391C (en) 2009-07-21 2016-09-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for quantitative detection of nucleic acid sequences over an extended dynamic range
AU2010315303B2 (en) * 2009-11-03 2015-08-06 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative Nuclease Protection Sequencing (qNPS)
JP6087293B2 (ja) 2011-01-06 2017-03-01 メソ スケール テクノロジーズ エルエルシー アッセイカートリッジ及びその使用方法
US9828696B2 (en) 2011-03-23 2017-11-28 Nanohmics, Inc. Method for assembly of analyte filter arrays using biomolecules
AU2012239943B2 (en) * 2011-04-07 2016-09-22 The Scripps Research Institute High-throughput screening for compounds modulating expression of cellular macromolecules
WO2012151111A1 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection assay (qnpa) and sequencing (qnps) improvements
WO2013006195A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Methods of detecting gene fusions
JP6041154B2 (ja) * 2011-08-12 2016-12-07 国立大学法人 筑波大学 並列反応方法およびスクリーニング方法
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
DE102011055247A1 (de) 2011-11-10 2013-05-16 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Multianalyt-Reportersystem
WO2013105679A1 (ko) * 2012-01-11 2013-07-18 엘지전자 주식회사 프라이머를 포함하는 핵산 증폭 장치와 이것의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법
CN104603291B (zh) 2012-06-22 2018-04-06 Htg分子诊断有限公司 黑素细胞病变中的分子恶性肿瘤
BR112014032911A2 (pt) * 2012-06-28 2017-06-27 Fluoresentric Inc dispositivo indicador químico
SG11201505618XA (en) * 2013-01-22 2015-08-28 Centre Nat Rech Scient Process for detection of dna modifications and protein binding by single molecule manipulation
WO2015026873A1 (en) 2013-08-19 2015-02-26 Singular Bio, Inc. Assays for single molecule detection and use thereof
AU2016219943A1 (en) 2015-02-18 2017-10-12 Singular Bio, Inc. Assays for single molecule detection and use thereof
US10379046B2 (en) * 2015-04-08 2019-08-13 Molecular Devices, Llc Method and system for multiplexed time-resolved fluorescence detection
US11971354B2 (en) 2015-04-08 2024-04-30 Molecular Devices, Llc Methods and systems for fluorescence detection using infrared dyes
CN108368554B (zh) 2015-09-29 2022-09-09 Htg分子诊断有限公司 弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)亚型分型的方法
US11988662B2 (en) 2015-12-07 2024-05-21 Nanohmics, Inc. Methods for detecting and quantifying gas species analytes using differential gas species diffusion
US10386365B2 (en) 2015-12-07 2019-08-20 Nanohmics, Inc. Methods for detecting and quantifying analytes using ionic species diffusion
US10386351B2 (en) 2015-12-07 2019-08-20 Nanohmics, Inc. Methods for detecting and quantifying analytes using gas species diffusion
EP4050112A1 (en) * 2016-06-21 2022-08-31 10X Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing
US10415080B2 (en) 2016-11-21 2019-09-17 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
WO2018217689A1 (en) 2017-05-22 2018-11-29 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Modified template-independent dna polymerase
US20190009240A1 (en) * 2017-07-10 2019-01-10 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Apparatus Enabling High Density Information Storage in Molecular Chains
CA3093451A1 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Pathogendx, Inc. Microarray based multiplex pathogen analysis and uses thereof
KR102893736B1 (ko) 2018-05-14 2025-11-28 브루커 스페이셜 바이올로지, 인크. 화학 조성물 및 이의 사용 방법
WO2019222650A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Apparatus for high density information storage in molecular chains
JP7209270B2 (ja) * 2019-02-06 2023-01-20 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 厚み計測方法及び厚み計測装置、並びに欠陥検出方法及び欠陥検出装置

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228237A (en) 1978-09-21 1980-10-14 Calbiochem-Behring Corp. Methods for the detection and determination of ligands
FI63596C (fi) 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
US5241060A (en) * 1982-06-23 1993-08-31 Enzo Diagnostics, Inc. Base moiety-labeled detectable nucleatide
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
GB8405437D0 (en) * 1984-03-01 1984-04-04 Amersham Int Plc Detecting polynucleotide sequences
US5288609A (en) 1984-04-27 1994-02-22 Enzo Diagnostics, Inc. Capture sandwich hybridization method and composition
US4751177A (en) 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4925785A (en) 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5175270A (en) 1986-09-10 1992-12-29 Polyprobe, Inc. Reagents for detecting and assaying nucleic acid sequences
US5374524A (en) 1988-05-10 1994-12-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Solution sandwich hybridization, capture and detection of amplified nucleic acids
WO1989011548A1 (en) 1988-05-20 1989-11-30 Cetus Corporation Immobilized sequence-specific probes
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5252743A (en) 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
JPH05502585A (ja) * 1989-12-04 1993-05-13 ベクトン　ディッキンソン　アンド　カンパニー ポリマーに共有結合したオリゴヌクレオチドの利用により向上される標的核酸の捕獲
ES2103795T3 (es) * 1989-12-04 1997-10-01 Microprobe Corp Mejora de la captura de un acido nucleico diana mediante el uso de oligonucleotidos unidos covalentemente a polimeros.
WO1991015600A1 (en) 1990-03-30 1991-10-17 City Of Hope Detection of minimal residual disease in lymphoid malignancies
US5556748A (en) 1991-07-30 1996-09-17 Xenopore Corporation Methods of sandwich hybridization for the quantitative analysis of oligonucleotides
EP0534640B1 (en) 1991-09-23 1996-10-02 Pfizer Inc. Process for detecting specific mRNA and DNA in cells
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
US5985583A (en) * 1992-06-23 1999-11-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of gonadotropin-releasing hormone receptor
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
DE4311460A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels Benzylalkoholdehydrogenase und einem chromogenen Redoxindikator
CA2162568C (en) 1993-05-10 2001-10-30 Yuichi Oku Method and reagent for simultaneously assaying one or more ligands in a group of preselected ligands
US6974666B1 (en) 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
CA2219770A1 (en) * 1995-05-11 1996-11-14 Craig A. Rosen Human uridine diphosphate galactose-4-epimerase
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
FR2737502B1 (fr) 1995-07-31 1997-10-24 Genset Sa Procede de detection d'acides nucleiques utilisant des sondes nucleotidiques permettant a la fois une capture specifique et une detection
AU6898296A (en) 1995-08-14 1997-03-12 Ely Michael Rabani Methods and devices for parallel multiplex polynucleotide sequencing
US5661028A (en) 1995-09-29 1997-08-26 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Large scale DNA microsequencing device
AU2253397A (en) 1996-01-23 1997-08-20 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis techniques
EP2574617B1 (en) 1996-02-09 2016-04-20 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
AU2069597A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
US5770370A (en) * 1996-06-14 1998-06-23 David Sarnoff Research Center, Inc. Nuclease protection assays
US5804384A (en) * 1996-12-06 1998-09-08 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting multiple analytes in samples
JP4663824B2 (ja) 1996-12-31 2011-04-06 ハイ スループット ジェノミクス インコーポレイテッド 多重化分子分析装置および方法
AU1623899A (en) * 1997-12-04 1999-06-16 Packard Bioscience Company Methods of using probes for analyzing polynucleotide sequence
US6232066B1 (en) 1997-12-19 2001-05-15 Neogen, Inc. High throughput assay system
WO2000037684A1 (en) * 1998-12-22 2000-06-29 Kris Richard M High throughput assay system using mass spectrometry

Also Published As

Publication number Publication date
KR100749185B1 (ko) 2007-08-13
CN1390263B (zh) 2012-09-05
WO2000079008A2 (en) 2000-12-28
EA200200062A1 (ru) 2002-06-27
CN1390263A (zh) 2003-01-08
EP1190095A2 (en) 2002-03-27
EA007338B1 (ru) 2006-08-25
EP1847619A2 (en) 2007-10-24
CZ301618B6 (cs) 2010-05-05
WO2000079008A9 (en) 2002-06-13
JP2010046071A (ja) 2010-03-04
AU5498000A (en) 2001-01-09
KR20020011443A (ko) 2002-02-08
WO2000079008B1 (en) 2001-11-08
HK1052536A1 (zh) 2003-09-19
EP1847619A3 (en) 2007-12-05
NO20016261D0 (no) 2001-12-20
JP2003504011A (ja) 2003-02-04
MXPA01013355A (es) 2002-11-04
NO20016261L (no) 2002-02-21
US6238869B1 (en) 2001-05-29
JP2011135883A (ja) 2011-07-14
WO2000079008A3 (en) 2001-08-16
AU775659B2 (en) 2004-08-12
CA2377567A1 (en) 2000-12-28
CA2377567C (en) 2011-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20014582A3 (cs) Vysoce výkonný testovací systém
US6232066B1 (en) High throughput assay system
US7659063B2 (en) High throughput assay system
WO2000037683A9 (en) HIGH THROUGHPUT ASSAY SYSTEM FOR MONITORING ESTs
WO2000037684A1 (en) High throughput assay system using mass spectrometry
US20100105572A1 (en) High throughput assay system
US20030039967A1 (en) High throughput assay system using mass spectrometry
US20040185464A1 (en) High throughput assay system
AU2007231625B2 (en) High Throughput Assay System
AU2006201464B2 (en) High Throughput Assay System

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20110621