CN1973037B

CN1973037B - 二肽或二肽衍生物的制造方法

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Publication number: CN1973037B
Application number: CN2005800207400A
Authority: CN
Inventors: 桥本信一; 池田创; 矢我崎诚
Original assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: JPWO2006001382A1; CN1973037A; US20050287627A1; EP1616963A3; ATE449183T1; EP1616963A2; WO2006001382A1; US8257943B2; US8709752B2; JP5424531B2; EP1616963B1; US20120258490A1; DE602005017707D1

Abstract

本发明提供特征如下的二肽或二肽衍生物的制造方法：使磷酸供与体、选自腺苷-5’-一磷酸、腺苷-5’-二磷酸和腺苷-5’-三磷酸中的物质、具有多磷酸激酶活性的蛋白质或具有生产该蛋白质能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、和1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物在水性介质中共存，使二肽或二肽衍生物在该水性介质中生成、蓄积，从该水性介质回收该二肽或二肽衍生物。

Description

二肽或二肽衍生物的制造方法

【技术领域】

本发明涉及到由氨基酸和氨基酸衍生物有效制造二肽或二肽衍生物的方法。

【背景技术】

有关肽的大量合成法已知有化学合成法(液相法、固相法)、酶促合成法和使用DNA重组法的生物合成法。现在，对于50残基以上的长链肽使用酶促合成法或生物合成法，对于二肽主要使用化学合成法和酶促合成法。

使用化学合成法合成二肽需要对官能团进行保护和去保护等操作，由于也合成消旋体，化学合成法不能说是经济、有效的方法。另外由于化学合成法使用大量的有机溶剂等，从环境卫生方面看也不是一个好的方法。

通过酶法合成二肽已知有利用使用蛋白分解酶(蛋白水解酶)的逆反应的方法(参照非专利文献1)、利用耐热性氨酰t-RNA合成酶的方法(参照专利文献1～4)、利用非核糖体肽合成酶(以下，称为NRPS)的方法(参照非专利文献2、3和专利文献5、6)。

然而，就利用蛋白水解酶的逆反应的方法来说，需要对底物氨基酸的官能团进行保护和去保护，存在着难于提高肽形成反应效率和阻止肽分解反应的问题。至于利用耐热性氨酰t-RNA合成酶的方法，存在着酶的表达、阻止目的产物以外的副生物反应困难的问题。NRPs由于该反应需要腺苷-5’一三磷酸(以下，略为ATP)，必须要向反应系添加大量ATP，所以制造效率低。

而作为具有二肽合成活性的蛋白质，已知有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase)、谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase)、D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)连接酶(D-Ala-D-Ala ligase)、聚-γ-谷氨酸合成酶(poly-y-glutamatesynthetase)等一组肽合成酶。然而几乎所有这些酶由于都具有作为底物使用D-氨基酸或催化在γ位羧基形成肽键等特征，所以不能用于在L-氨基酸的α位羧基形成肽键的二肽的合成。

已知通过在L-氨基酸的α位羧基形成肽键活性生成二肽只有作为来自属于芽孢杆菌属的微生物的二肽抗生物质的杆菌溶素合成酶。已知杆菌溶素合成酶具有合成杆菌溶素(L-丙氨酰-L-anticapsin、L-Ala-L-anticapsin)和L-丙氨酰-L-丙氨酸(L-Ala-L-Ala)的活性，但有关其它二肽的合成活性还不清楚(参照非专利文献4和5)。

另外，关于全基因组信息已阐明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168株(非专利文献6参照)中的杆菌溶素合成酶基因组，已知如果扩增含有ywfA～F的ORF的杆菌溶素操纵子，杆菌溶素的产率会增加(参照专利文献7)。然而，在这些ORF中是否含有编码具有通过肽键连接2种以上的氨基酸的活性的蛋白质的ORF，如果含有，也不知道哪个ORF编码该蛋白质。

另外，据报道已知作为抗生物质ァルホ·ノルシン(albonoursin)的生产株诺尔斯氏链霉菌(Streptomyces noursei)ATCC11455株中，与NRPS酶完全不相似蛋白质(albC基因产物)负责环(L-苯丙氨酰-L-亮氨酸)[cyclo(L-phenylalanyl-L-leucine)]结构的合成，如果使环二肽氧化酶作用于导入了albC基因的大肠杆菌(Escherichia coli)和浅青紫链霉菌(Streptomycesl ividans)的培养液，可以检测到albonoursin(参照非专利文献6)，但还没有albC基因产物生成直链状二肽的报告。

而作为各种酶反应能源的ATP的供给方法，已知有利用糖酵解途径由ADP生成ATP的再生法、利用多磷酸激酶和多磷酸由ADP生成ATP的再生法(参照非专利文献8～10)。利用糖酵解途径的由ADP生成ATP的再生法存在于具有糖酵解途径的所有微生物。另外，已知能够利用多磷酸由ADP再生ATP的多磷酸激酶也广泛存在于细菌(参照非专利文献11～14)、酵母(参照非专利文献15和16)、植物(参照非专利文献17)、动物(参照非专利文献18)中。

然而，还不清楚通过将需要ATP的二肽生成反应和利用多磷酸激酶和多磷酸的ATP再生反应组合，能否有效生产二肽。

【非专利文献1】

J.Biol.Chem.，119，707-720(1937)

【专利文献1】

特开昭58-146539号公报

【专利文献2】

特开昭58-209991号公报

【专利文献3】

特开昭58-209992号公报

【专利文献4】

特开昭59-106298号公报

【非专利文献2】

Chem.Biol.，7，373-384(2000)

【专利文献5】

美国专利第5795738号

【专利文献6】

美国专利第5652116号

【非专利文献3】

FEBS Lett.，498，42-45(2001)

【非专利文献4】

J.Ind.Microbiol.，2，201-208(1987)

【非专利文献5】

Enzyme.Microbial.Technol.，29，400-406(2001)

【非专利文献6】

Nature，390，249-256(1997)

【专利文献7】

国際公开专利第00-03009号小册子

【非专利文献7】

Chemistry & Biol.，9，1355-1364(2002)

【非专利文献8】

Agric.Biol.Chem.，52，1471-1477(1988)

【非专利文献9】

Biotech.Appl.Biochem.，10，107-117(1988)

【非专利文献10】

Biotech.Appl.Biochem.，15，125-133(1992)

【非专利文献11】

Agric.Biol.Chem.，52(6)，1471-1477(1988)

【非专利文献12】

Biotech.Appl.Biochem.，10，107-117(1988)

【非专利文献13】

Biotech.Appl.Biochem.，15，125-133(1992)

【非专利文献14】

J.Biol.Chem.，267，22556-22561(1992)

【非专利文献15】

J.Biol.Chem.，234，2595-2604(1959)

【非专利文献16】

Arch.Biochem.Biophys.，83，259-267(1959)

【非专利文献17】

Biochem.J.，124，407-417(1971)

【非专利文献18】

Biochem.J.，75，417-428(1960)

【发明内容】

【发明要解决的课题】

本发明的目的在于提供有效制造二肽或二肽衍生物的方法。

【用于解决课题的手段】

本发明涉及到以下(1)～(34)内容。

(1)二肽或二肽衍生物(PI)的制造方法，其特征是使i)磷酸供体、ii)选自腺苷-5’-一磷酸(以下，略为AMP)、腺苷-5’-二磷酸(以下，略为ADP)和腺苷-5’-三磷酸(以下，略为ATP)中的物质、iii)具有多磷酸激酶活性的蛋白质或具有生产该蛋白质能力的细胞培养物或该培养物的处理物、iv)具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、和v)1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物在水性介质中共存，使二肽或二肽衍生物[以下称为二肽或二肽衍生物(PI)]在该水性介质中生成、蓄积，从该水性介质回收该二肽或二肽衍生物(PI)。

(2)二肽或二肽衍生物(PII)的制造方法，其特征是使i)磷酸供体、ii)选自腺苷-5’-一磷酸(以下，略为AMP)、腺苷-5’-二磷酸(以下，略为ADP)和腺苷-5’-三磷酸(以下，略为ATP)中的物质、iii)具有多磷酸激酶活性的蛋白质或具有生产该蛋白质能力的细胞培养物或该培养物的处理物、iv)具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的细胞培养物或该培养物的处理物、和v)1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物在水性介质中共存，使二肽或二肽衍生物(PI)在该水性介质中生成、蓄积，直接进行修饰或从该水性介质回收该二肽或二肽衍生物(PI)后对该二肽或二肽衍生物(PI)进行修饰，使二肽或二肽衍生物[以下，称为二肽或二肽衍生物(PII)]生成，回收该二肽或二肽衍生物(PII)。

(3)上述(1)或(2)所述的制造方法，其中具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽的活性的蛋白质是选自以下[1]～[8]中的蛋白质。

具有序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质

由在序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽的活性的蛋白质

由与序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽的活性的蛋白质

具有与序列号27表示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质

具有由序列号47或48表示的氨基酸序列的蛋白质

由在序列号47或48表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质

由与序列号47或48表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质

具有非核糖体肽合成酶(以下称为NRPS)活性的蛋白质

(4)上述(1)～(3)中的任一种制造方法，其中具有生产ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质能力的细胞是具有选自以下[1]～[6]中的DNA的细胞。

具有序列号14～26和46中的任一个表示的碱基序列的DNA

与具有序列号14～26和46中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA

与具有序列号28表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA

具有序列号49或50表示的碱基序列的DNA

与具有序列号49或50表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA

编码具有NRPS活性的蛋白质的DNA

(5)上述(1)～(4)中的任一种制造方法，其中具有多磷酸激酶活性的蛋白质是选自以下[1]～[3]中的蛋白质。

具有序列号124～131中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质

由在序列号124～131中的任一个表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有多磷酸激酶活性的蛋白质

由与序列号124～131中的任一个表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有多磷酸激酶活性的蛋白质

(6)上述(1)～(5)中的任一种制造方法，其中具有生产具有多磷酸激酶活性的蛋白质能力的细胞是具有以下[1]或[2]所述的DNA的细胞。

具有序列号116～123中的任一个表示的碱基序列的DNA

与具有序列号116～123中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的、而且编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA

(7)上述(1)～(6)中的任一种制造方法，其中氨基酸或氨基酸衍生物是式(I)

(式中、n¹表示1～3的整数，

R^1a和R^1b可以相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷酰基、取代或未取代的低级烷氧羰基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳酰基，或R^1a和R^1b中的任一方也可以与邻接的氮原子、该氮原子邻接的碳原子以及该碳原子上的R^2a和R^2b的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，

R^2a和R^2b可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂环烷基，或与R^1aR^1bN邻接的碳原子上的R^2a和R^2b中的任一方也可以与邻接的碳原子、该碳原子邻接的氮原子以及R^1a和R^1b中的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，n¹为2或3时，2个或3个的R^2a和2个或3个的R^2b可分别相同，也可以不同)，或

式(II)

[式中、n²与上述n¹意义相同。

R^3a和R^3b可以相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂环烷基，或与R⁴HN邻接的碳原子上的R^3a和R^3b中的任一方与邻接的碳原子、与该碳原子邻接的氮原子和R⁴一起形成取代或未取代的杂环基，当n²为2或3时，2个或3个的R^3a和2个或3个的R^3b可分别相同，也可以不同，

R⁴代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷酰基、取代或未取代的低级烷氧羰基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳酰基，或与R⁴邻接的氮原子、与该氮原子邻接的碳原子以及该碳原子上的R^3a和R^3b中的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，

R⁵代表氨基、羟基、取代或未取代的低级烷氧基、一(取代或未取代的低级烷基)氨基、二(取代或未取代的低级烷基)氨基或脂环式杂环基]

表示的氨基酸或氨基酸衍生物[但当氨基酸或氨基酸衍生物只是式(I)表示的氨基酸或氨基酸衍生物时，R^1a和R^1b中至少有一方是氢原子，而当氨基酸或氨基酸衍生物只是式(II)表示的氨基酸或氨基酸衍生物时，R⁵为羟基]。

(8)上述(1)～(6)中的任一种制造方法，其中氨基酸或氨基酸衍生物是式(III)

(式中、R^1c和R^1d可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷酰基、取代或未取代的低级烷氧羰基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳酰基，

R^2c和R^2d可相同或不同，代表氢原子或取代或未取代的低级烷基)，或

式(IV)

(式中、R^3c和R^3d可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基或取代或未取代的芳基，

R⁵与上述意义相同)

表示的氨基酸或氨基酸衍生物[但当氨基酸或氨基酸衍生物只是式(III)表示的氨基酸或氨基酸衍生物时，R^1c和R^1d中至少有一方是氢原子，当氨基酸或氨基酸衍生物只是式(IV)表示的氨基酸或氨基酸衍生物时，R⁵为羟基]。

(9)上述(1)～(6)中的任一种制造方法，其中氨基酸或氨基酸衍生物是式(V)或式(VI)表示的氨基酸或氨基酸衍生物：

(式中、R^2e表示取代或未取代的甲基)

(式中、R^3e代表取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基或取代或未取代的芳基)。

(10)上述(1)～(6)中的任一种制造方法，其中氨基酸或氨基酸衍生物是选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的氨基酸或其衍生物。

(11)上述(10)的制造方法，其中L-氨基酸是选自L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-α-氨基丁酸、L-偶氮丝氨酸、L-茶氨酸、L-4-羟基脯氨酸、L-3-羟基脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-6-重氮-5-氧代正亮氨酸中的L-氨基酸。

(12)上述(1)～(7)中的任一种制造方法，其中二肽或二肽衍生物(PI)是式(VIIa)表示的二肽或二肽衍生物：

[式中、n^3a和n^4a分别与上述n¹具有相同意义，

R^6a和R^6b可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷酰基、取代或未取代的低级烷氧羰基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳酰基，或R^6a和R^6b中的任一方可以与邻接的氮原子、与该氮原子邻接的碳原子和该碳原子上的R^7a和R^7b中的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，

R^7a和R^7b可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂环烷基，或与R^6aR^6bN邻接的碳原子上的R^7a和R^7b中的任一方可以与邻接的碳原子、与该碳原子邻接的氮原子和R^6a和R^6b中的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，当n^3a为2或3时，2个或3个R^7a和2个或3个R^7b可分别相同，也可以不同，

R^8a代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷酰基、取代或未取代的低级烷氧羰基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳酰基，或R^8a与邻接的氮原子、与该氮原子邻接而且与R^9a和R^9b结合的碳原子和该碳原子上的R^9a和R^9b中的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，

R^9a和R^9b可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂环烷基，或与R^8aN邻接的碳原子上的R^9a和R^9b中的任一方可以与邻接的碳原子、与该碳原子邻接的氮原子和R^8a一起形成取代或未取代的杂环基，当n^4a为2或3时，2个或3个R^9a和2个或3个R^9b可分别相同，也可以不同，

R^10a代表氨基、羟基、取代或未取代的低级烷氧基、一(取代或未取代的低级烷基)氨基、二(取代或未取代的低级烷基)氨基或脂环式杂环基]。

(13)上述(2)～(7)中的任一种制造方法，其中二肽或二肽衍生物(PII)是式(VIIb)表示的二肽或二肽衍生物：

[式中、n^3A和n^4A分别与上述n¹具有相同意义，

R^6A和R^6B可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷酰基、取代或未取代的低级烷氧羰基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳酰基，或R^6A和R^6B中的任一方也可以与邻接的氮原子、与该氮原子邻接的碳原子和该碳原子上的R^7A和R^7B中的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，

R^7A和R^7B可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂环烷基，或与R^6AR^6BN邻接的碳原子上的R^7A和R^7B中的任一方也可以与邻接的碳原子、与该碳原子邻接的氮原子和R^6A和R^6B中的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，当n^3A为2或3时，2个或3个R^7A和2个或3个R^7B可分别相同，也可以不同，

R^8A代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷酰基、取代或未取代的低级烷氧羰基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳酰基，或R^8A与邻接的氮原子、与该氮原子邻接而且与R^9A和R^9B结合的碳原子以及该碳原子上的R^9A和R^9B中的任一方一起形成取代或未取代的杂环基，

R^10A与上述R^10a具有同样的意义]。

(14)上述(1)～(8)中的任一种制造方法，其中二肽或二肽衍生物(PI)是式(VIIIa)表示的二肽或二肽衍生物。

(式中、R^6c和R^6d可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的低级烯基、取代或未取代的低级炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的低级烷酰基、取代或未取代的低级烷氧羰基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳酰基，

R^7c和R^7d可相同或不同，代表氢原子或取代或未取代的低级烷基，

R^9c和R^9d可相同或不同，代表氢原子、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基或取代或未取代的芳基，

R^10a与上述同义)。

(15)上述(2)～(8)中的任一种制造方法，其中二肽或二肽衍生物(PII)是式(VIIIb)表示的二肽或二肽衍生物。

(式中、R^6C、R^6D、R^7C、R^7D、R^9C和R^9D分别与上述R^6c、R^6d、R^7c、R^7d、R^9c和R^9d具有同样意义，R^10A与上述同义)。

(16)上述(1)～(9)中的任一种制造方法，其中二肽或二肽衍生物(PI)是式(IXa)表示的二肽或二肽衍生物。

(式中、R^7e代表取代或未取代的甲基，R^9e代表取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的芳烷基或取代或未取代的芳基)。

(17)上述(2)～(9)中的任一种制造方法，其中二肽或二肽衍生物(PII)是式(IXb)表示的二肽或二肽衍生物。

(式中、R^7E和R^9E分别与上述R^7e和R^9e具有同样意义)。

(18)上述(1)～(10)中的任一种制造方法，其中二肽或二肽衍生物(PI)或二肽或二肽衍生物(PII)是从L-氨基酸、甘氨酸、和β-丙氨酸、以及它们的衍生物选出的相同或不同的氨基酸或氨基酸衍生物通过肽键形成的二肽或二肽衍生物。

(19)上述(18)的制造方法，其中L-氨基酸是选自L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-α-氨基丁酸、L-偶氮丝氨酸、L-茶氨酸、L-4-羟基脯氨酸、L-3-羟基脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-6-重氮-5-氧代正亮氨酸中的L-氨基酸。

(20)上述(1)～(19)中的任一种制造方法，其中细胞是微生物的细胞。

(21)上述(20)的制造方法，其中微生物是原核生物。

(22)上述(21)的制造方法，其中原核生物是1种以上的肽酶和1种以上的具有肽转运活性的蛋白质(以下，也称为肽转运蛋白质)的活性低下或丧失的微生物。

(23)上述(21)的制造方法，其中原核生物是3种以上的肽酶的活性低下或丧失的微生物。

(24)上述(22)或(23)的制造方法，其中肽酶是具有序列号55～58中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质、或具有与序列号55～58中的任一个表示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，而且具有肽酶活性的蛋白质。

(25)上述(22)或(24)的制造方法，其中肽转运蛋白质是具有序列号59～63中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质、或具有与序列号59～63中的任一个表示的氨基酸序列有80％以上同源性的蛋白质，而且具有肽转运活性的蛋白质。

(26)上述(21)～(25)中的任一种制造方法，其中原核生物是属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属或棒杆菌(Corynebacterium)属的微生物。

(27)上述(26)的制造方法，其中属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属或棒杆菌属的微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corymebac terium ammoniagenes)、乳酸发酵棒杆菌(Corynebacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、Corvnebacterium efficiens、枯草芽孢杆菌(Bacilluss ubtilis)或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

(28)上述(1)～(27)中的任一种制造方法，其中培养物的处理物是从培养物的热处理物、培养物的浓缩物、培养物的干燥物、对培养物进行离心分离得到的细胞、该细胞的热处理物、该细胞的干燥物、该细胞的冷冻干燥物、该细胞的表面活性剂处理物、该细胞的超声波处理物、该细胞的机械性磨碎处理物、该细胞的溶剂处理物、该细胞的酶处理物、该细胞的蛋白质分级物、该细胞的固定化物和从该细胞提取得到的酶标准品选出的处理物，而且具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性或多磷酸激酶活性的处理物。

(29)上述(28)的制造方法，其中热处理物是培养物或细胞的二肽分解酶活性减少或丧失的热处理物。

(30)具有序列号9～13表示的氨基酸序列的蛋白质。

(31)具有序列号22～26表示的碱基序列的DNA。

(32)将上述(31)的DNA和载体DNA连接后得到的重组DNA。

(33)带有上述(32)的重组DNA的细胞。

(34)蛋白质的制造方法，该方法是将上述(33)的细胞在培养基中进行培养，使上述(30)的蛋白质在培养物中生成、蓄积，从该培养物回收该蛋白质。

【发明的效果】

通过本发明可以提供由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物有效地制造二肽或二肽衍生物的方法。

【附图说明】

【图1】图1是表示质粒pPE43的构建过程的图。

【图2】图2是表示质粒pQE60ywfE的构建过程的图。

【图3】图3是表示具有直链二肽合成活性的蛋白质的表达质粒载体pAL-nou和pAL-alb的构建过程的图。

【图4】图4是表示ywfE基因表达强化型载体pPE56的构建过程的图。

【符号说明】

ywfE：来自枯草芽孢杆菌168株的ywfE基因

Ptrp：色氨酸启动子基因

PT5：T5启动子

Amp^r：氨苄青霉素抗性基因

lacI ^q：乳糖阻遏物基因

albC：albC基因或albC类似基因

【具体实施方式】

1.本发明使用的具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质

本发明使用的具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质(以下，略为具有二肽生成活性的蛋白质)只要是具有该活性的蛋白质，不管其来源、制备方法等都可以使用，例如以下[1]～[8]所述的蛋白质、

具有序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质

由在序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列缺失、置换或附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质

由与序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质

具有由序列号47或48表示的氨基酸序列的蛋白质

由与序列号47或48表示的氨基酸序列有65％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质

具有非核糖体肽合成酶(以下称为NRPS)活性的蛋白质。

作为具有NRPS活性的蛋白质，如具有序列号53表示的氨基酸序列的蛋白质、具有由在该氨基酸序列中缺失、置换或附加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有NRPS活性的蛋白质，以及具有与该氨基酸序列有65％以上同源性的氨基酸序列，而且具有NRPS活性的蛋白质等。

在上述中，由缺失、置换或附加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质可以通过使用Molecular Cloning，ALaboratoy Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2001)(以下，略为Moleeular Cloning第3版)、CurrentProtocols in Molecular Biology， John Wiley&Sons(1987-1997)(以下，略为Current Protocols in Molecular Biology)、Nucleic Acids Research，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等所述的定点突变导入法，例如可以通过在由编码序列号1～13、47、48或53中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA中导入定点突变取得。

缺失、置换或附加的氨基酸的数目没有特别限定，只要是通过上述的定点突变法等众所周知的方法能够缺失、置换或附加程度的数目，可以是从1个至数十个、优选1～20个、更优选1～10个、再优选1～5个。

所谓在序列号1～13、47、48或53中的任一个表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个以上的氨基酸指的是可以在同一序列中的任意位置缺失、置换或附加1个或多个氨基酸。

作为可置换的氨基酸，例如用众所周知的对比软件对序列号1～13、以及序列号47和48表示的氨基酸序列之间进行比较时，所有氨基酸序列中非保守的氨基酸。作为众所周知的对比软件，例如基因解析软件Genetyx(软件开发株式会社)中含有的序列对比解析软件。作为该解析软件的解析参数，可以使用default值。

另外作为可进行氨基酸缺失或附加的氨基酸位置，例如序列号1～13、47、48以及53中的任一个表示的氨基酸序列的N末端和C末端。

缺失、置换或附加可以同时出现，被置换或附加的氨基酸无论天然型，还是非天然型都可以。作为天然型氨基酸，如L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。

以下给出了可相互置换的氨基酸的例子。同一组中含有的氨基酸可相互置换。

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、0-甲基丝氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、环己基丙氨酸

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸

C组：天冬酰胺、谷氨酰胺

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸

F组：丝氨酸、苏氨酸、同型丝氨酸

G组：苯丙氨酸、酪氨酸

另外由在序列号1～13、47、48和53中的任一个表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质为了具有二肽生成活性，希望是序列号1～13、47、48和53中的任一个表示的氨基酸序列、优选与序列号1、47或53中的任一个表示的氨基酸序列的同源性具有65％以上、优选75％以上、更优选85％以上、再优选90％以上、特别优选95％以上、最好优选98％以上的序列。

氨基酸序列或碱基序列的同源性可以使用Karlin and Altschul提出的算法BLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]或FASTA[Methods Enzymol.，183，63(1990)]决定。根据这个算法BLAST开发了称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mo l.Biol.，215，403(1990)]。当根据BLAST通过BLASTN对碱基序列进行解析时，参数定为例如Score＝100、wordlength＝12。另外当根据BLAST通过BLASTX对氨基酸序列进行解析时，参数定为例如score＝50、wordlength＝3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的default参数。这些解析方法的具体手法众所周知(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。

另外，由与序列号1～13、47、48和53中的任一个表示的氨基酸序列、优选与序列号1、47或53中的任一个表示的氨基酸序列具有65％以上、优选75％以上、更优选85％以上、再优选90％以上、特别优选95％以上、最好优选98％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有二肽生成活性的蛋白质也是可在本发明中使用的蛋白质。氨基酸序列的同源性可以象上述那样使用BLAST或FASTA决定。

序列号27表示的氨基酸序列是被保存在具有序列号1～7表示的氨基酸序列的蛋白质中的区域，而且是对应于具有各种微生物的Ala-Ala连接酶活性的蛋白质的共有序列区域。

具有与序列号27表示的氨基酸序列有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上同源性的氨基酸序列，而且具有二肽生成活性的蛋白质也是可在本发明中使用的蛋白质。

为了使与序列号27表示的氨基酸序列有80％以上、优选90％以上、再优选95％以上同源性的氨基酸序列的蛋白质成为具有生成二肽的活性的蛋白质，希望该蛋白质的氨基酸序列与序列号1～8中的任一个表示的氨基酸序列的同源性至少具有80％以上、通常为90％以上、最好具有95％以上的同源性。

氨基酸序列的同源性可以象上述那样使用BLAST或FASTA决定。

作为确认本发明中可使用的蛋白质是具有二肽生成活性的蛋白质的手段，例如使用DNA重组法制作表达可用于本发明的蛋白质的转化体，使用该转化体制造在本发明中使用的蛋白质后，使该蛋白质、1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物、和ATP存在于水性介质中，通过HPLC等分析二肽或二肽衍生物是否在该水性介质中生成、蓄积的方法。

2.可用于本发明的具有多磷酸激酶活性的蛋白质

可用于本发明的具有多磷酸激酶活性的蛋白质只要是具有该活性的蛋白质，不管其来源、制备方法等，如下面的[1]～[3]中的任一项所述的蛋白质。

具有序列号124～131中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质、

由在序列号124～131中的任一个表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，而且具有多磷酸激酶活性的蛋白质、和

由与序列号124～131中的任一个表示的氨基酸序列有65％以上同源性的氨基酸序列构成、而且具有多磷酸激酶活性的蛋白质等。

上述之中，所谓在序列号124～131中的任一个表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列以及与序列号124～131中的任一个表示的氨基酸序列具有65％以上同源性的氨基酸序列指的是除了具有该氨基酸序列的蛋白质具有多磷酸激酶活性以外，还是与上述1同样定义的氨基酸序列。

作为确认本发明中使用的蛋白质是具有多磷酸激酶活性的蛋白质的手段，例如使用DNA重组法制作表达可用于本发明的蛋白质的转化体，使用该转化体制造本发明中使用的蛋白质后，使该蛋白质、ADP和多磷酸在水性介质中存在，通过HPLC等分析在该水性介质中是否有ATP生成、蓄积的方法。

3.可用于本发明的编码具有由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽的活性的蛋白质的DNA

作为编码可用于本发明的具有由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA(以下，略为编码具有二肽生成活性的蛋白质的DNA)，如以下[1]～[6]所述的DNA。

具有序列号14～26和46中的任一个表示的碱基序列的DNA、

与具有序列号14～26和46中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA、

与具有序列号28表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA、

具有序列号49或50表示的碱基序列的DNA、

与具有序列号49或50表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，而且编码具有ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA、

编码具有NRPS活性的蛋白质的DNA。

作为编码具有NRPS活性的蛋白质的DNA，如具有序列号54表示的碱基序列的DNA、和具有与该碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的、而且编码具有NRPS活性的蛋白质的DNA。

所谓上述的在严格条件下可杂交的DNA指的是以具有与序列号14～26、28、46、49、50和54中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA的一部分、或全部作为探针，通过使用茵落杂交法、噬斑杂交法或Southern blot杂交法等得到的DNA，具体来说，使用固定了来自菌落或噬斑的DNA的滤器，在0.7～1.0mol/L、优选0.9mol/L氯化钠存在下、于65℃下进行杂交后、使用0.1～2倍、优选0.1倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液组成由150mmol/l氯化钠、15mmol/l柠檬酸钠构成)，于65℃条件下，通过清洗滤器能够鉴定的DNA。杂交可以根据Molecular Cloning第3版、Current Protocols in MolecularBiology、DNA Cloning1：Core Techniques，APractical Approach，Second Edition，Oxford University(1995)等记载的方法进行。作为可杂交的DNA，具体而言使用上述的BLAST和FASTA等，在根据上述参数计算时，与序列号14～26、28、46、49、50和54中的任一个表示的碱基序列至少具有75％以上、优选85％以上、再优选90％以上、特别优选95％以上同源性的DNA。

和具有与序列号14～26、28、46、49、50和54中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA是编码具有二肽生成活性的蛋白质的DNA如上述所述那样，可以通过使用重组DNA法制造该DNA编码的蛋白质，测定该蛋白质的活性进行确认。

4.可用于本发明的编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA

作为可用于本发明的编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA，如以下的[1]和[2]所述的DNA。

具有序列号116～123中的任一个表示的碱基序列的DNA，和

和具有与序列号116～123中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交、而且编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA等。

所谓和具有与序列号116～123中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的、而且编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA除了该DNA具有多磷酸激酶活性以外，还有与上述3同样被定义的DNA。

和具有与序列号116～123中的任一个表示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA是编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA，如上所述可以通过使用重组DNA法，制造该DNA编码的蛋白质，测定该蛋白质的活性进行确认。

5.本发明的蛋白质

作为本发明的蛋白质，如具有序列号9～13中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质。

6.作为本发明的DNA如具有序列号22～26表示的碱基序列的DNA等。

7.编码具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA和编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA的制备

具有二肽生成活性的DNA可以通过使用能够根据序列号14～26、46、49、50和54中的任一个表示的碱基序列设计的探针，例如使用对芽孢杆菌(Bacillus)属或链霉菌(Streptomyces)属的微生物的染色体DNA文库进行Southern杂交、或可以根据序列号14～26、46、49、50和54中的任一个表示的碱基序列设计的引物DNA，以使用芽孢杆菌属或链霉菌属的微生物的染色体DNA作为模板的PCR[PCR Protocols，Academic Press(1990)]取得，编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA可以通过使用根据具有序列号116～123中的任一个表示的碱基序列的DNA设计的探针的对属于埃希氏菌属、红细菌(Rhodobaer)属、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、メソリソ·ヒ·ウム属Mesorhizobium)、链霉菌属、假单胞菌(Pseudomonus)属或中华根瘤菌(Sinorbizobium)属的微生物等的染色体DNA文库进行Southern杂交、或可根据序列号116～123中的任一个表示的碱基序列设计的引物DNA，以属于埃希氏菌属、红细菌属、绿屈挠菌属、Mesorhizobium属、链霉菌属、假单胞菌属或中华根瘤菌属的微生物等的染色体DNA为模板的PCR取得。

另外，对于各种基因序列数据库，检索与序列号14～26、46、49、50和54、或序列号116～123中的任一个编码氨基酸序列的DNA的碱基序列具有75％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上同源性的序列，根据通过该检索得到的碱基序列，使用上述的方法由具有该碱基序列的生物的染色体DNA、cDNA文库等也可以取得可用于本发明的DNA。

取得的DNA可以直接、或用适当的限制酶等进行酶切，通过常规方法转运到载体，然后将得到的的重组DNA导入宿主细胞后，通过使用通常用的碱基序列解析方法、例如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977)]或373A·DNA序列仪(Perkin-Elmer公司生产)等碱基序列分析仪进行分析，可以决定该DNA的碱基序列。

当决定碱基序列的结果发现取得的DNA为部分长时，通过使用该部分长DNA作为探针，对染色体DNA文库的Southern杂交法等可以取得全长DNA。

然后根据决定的DNA的碱基序列，通过使用PerSeptiveBiosystems公司制造的8905型DNA合成仪进行化学合成，也可以制备目的DNA。

作为象上述那样取得的DNA，其中作为编码具有二肽生成活性的蛋白质的DNA，例如具有序列号14～26、46、49、50和54表示的碱基序列的DNA、作为编码具有多磷酸激酶活性的蛋白质的DNA，例如具有序列号116～123表示的碱基序列的DNA。

作为本发明的制造方法中可使用的转运了DNA的载体，如pBluescriptIIKS(+)(Stratagene公司生产)、pDIRECT[NucleicAcids Res.，18,6069(1990)]、pCR-Script Amp SK(+)(Stratagene公司生产)、pT7Blue(Novagen公司生产)、pCRII(Invitrogen公司生产)和pCR-TRAP(Genhunter公司生产)等。

作为宿主细胞，如属于埃希氏茵属的微生物等。作为属于埃希氏茵属的微生物，例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49,大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌ME8415等。

作为重组DNA的导入方法，只要是将DNA导入到上述宿主细胞的方法，可以使用任一种方法，例如使用钙离子的方法[Proc.Nat1.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]等。

作为通过上述方法得到的带有可用于本发明的制造方法的DNA的微生物，例如带有含具有序列号14表示的碱基序列的DNA的重组DNA的微生物大肠杆菌NM522/pPE43、带有含具有序列号122表示的碱基序列的DNA的重组DNA的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Ecl。

8.可用于本发明的细胞的制备

(1)作为可用于本发明的细胞，如具有生产具有二肽生成活性的蛋白质能力的细胞、具有生产具有多磷酸激酶活性的蛋白质能力的细胞、和具有生产具有二肽生成活性的蛋白质和具有多磷酸激酶活性的蛋白质的两方蛋白质能力的细胞。

作为具有生产具有二肽生成活性的蛋白质能力的细胞，如属于在染色体DNA上含有上述3的DNA的芽孢杆菌属或链霉菌属的细菌、优选使用具有杆菌溶素合成活性的芽孢杆茵属的细菌或属于具有生产albonoursin能力的链霉菌属的细菌、更优选属于枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、微白链霉菌和诺尔斯氏链霉菌中任一种类的细菌、进一步优选枯草芽孢杆菌ATCC15245、枯草芽孢杆菌ATCC6633、枯草芽孢杆菌IAM1213、枯草芽孢杆菌IAM1107、枯草芽孢杆菌IAM1214、枯草芽孢杆菌ATCC9466、枯草芽孢杆菌IAM1033、枯草芽孢杆菌ATCC21555、解淀粉芽孢杆菌IFO3022、短小芽孢杆菌NRRLB-12025、诺尔斯氏链霉菌IFO15452和微白链霉菌IFO14147中任一菌株的细菌、和使用分子克隆第3版、Current Protocols in Molecular Biology等所述的方法等，例如通过以下的方法，通过将使用上述3的方法取得的DNA导入宿主细胞制备的转化体。

作为具有生产具有多磷酸激酶活性的蛋白质能力的细胞，如属于在染色体DNA上含有上述4的DNA的埃希氏菌属、红细菌属、绿屈挠茵属、Mesorhizobium属、链霉菌属、假单胞菌属或中华根瘤茵属的细菌、更优选大肠杆菌W3110、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)ATCC17023、橙色绿屈挠茵(Chloroflexus aurantiacus)ATCC29366、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)ATCC BAA-471、恶臭假单胞菌(Pseudominus putida)KT2440和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ATCC51124中任一茵属的细菌、以及属于分子克隆第3版、Current Protocols in Molecular Biology等所述的方法等，例如使用以下的方法，可通过将用上述4的方法取得的DNA导入宿主细胞制备的转化体。

上述转化体可以通过例如以下的方法制备。

以上述3和4的DNA作为基础，根据需要，制备含有可用于本发明的编码蛋白质的部分的适当长度的DNA片段。另外，通过置换碱基使编码该蛋白质的部分的碱基序列变成最适宿主表达的密码子，可以取得该蛋白质的产率提高的细胞。

通过将该DNA片段插入到适当的表达载体的启动子的下游，制作重组DNA。

通过将该重组DNA导入到适合该表达载体的宿主细胞，可以得到生产本发明的蛋白质的转化体。

作为宿主细胞，如原核生物和酵母等微生物的细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等只要是可以表达目的基因的都可以使用，优选微生物、更优选原核生物、进一步优选细菌。

作为表达载体，使用可在上述宿主细胞自我复制或可转运到染色体中，在能够转录本发明的DNA或可用于本发明的制造方法中的DNA的位置含有启动子的载体。

使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，含有本发明使用的DNA的重组DNA最好是可在原核生物中自我复制的同时，由启动子、核糖体结合序列、本发明的DNA或本发明的制造方法使用的DNA、转录终止序列构成的重组DNA。也可以含有调控启动子的基因。

作为表达载体，例如pBTrp2、pBTacl、pBTac2(都是BoehringerMannheim公司生产)、pHelixl(Roche Diagnostics公司生产)、pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotech 公司生产) 、pSE280(Invitrogen公司生产)、pGEMEX-1(Promega公司生产)、pQE-8(Qiagen公司生产)、pET-3(Novagen公司生产)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48 ，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Nat1.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII KS(-)(Stratagene公司生产)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERMBP-5408)制备]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(Takara Bio公司生产)、pUC118(Takara Bio公司生产)、pPA1(特开昭63-233798)、pWH1520(MoBiTec社制)、pCS299P(WO0 /63388)、pVLT31[Gene，123，17(1993)]和plJ702(Genetic Manipulation of Streptomyces：aLaboratory Manua1：John Innes Foundation)等。

作为启动子只要是可在大肠杆菌等宿主细胞内发挥功能的，无论那一种都可以，例如trp启动子(P_trp)、lac启动子(P_lac)、P_L启动子、P_R启动子、P_SE启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子、SP01启动子、SPO2启动子、penP启动子等。也可以使用人为设计使P_trp改变为两个串联的启动子、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子那样的启动子等。

另外也可以使用用于在属于杆菌属的微生物中表达的xylA启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，35，594-599(1991)]、用于在属于棒杆菌属的微生物中表达的P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，674-679(2000)]、用于在属于假单孢茵属的微生物中表达的tac启动子[Gene，123，17-24(1993)]、用于在属于链霉菌属的微生物中表达的xylA启动子(Genetic Manipulation ofStreptomyces：a Laboratory Manual：John Innes Foundation)等。

最好是使用将作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间调节到适当的距离(例如6～18碱基)的质粒。

在使本发明的制造方法中使用的DNA与表达载体结合的重组DNA中，不一定需要转录终止序列，但最好是在紧靠结构基因的下面配置转录终止序列。

作为这样的重组DNA，例如pPE43和pPK-Ecl。

作为原核生物，如属于埃希氏茵(Escherichia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、杆菌属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌(Anabaena)属、组囊蓝细菌(Anacystis)属、节杆菌(Arthrobacter)属、固氮菌(Azotobacter)属、着色菌(Chromatium)属、欧文氏茵(Erwinia)属、甲基杆菌(Methylobacterium)属、席蓝细菌(Phormidium)属、红细菌(Rhodobacter)属、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)属、红螺菌(RhodoSpirillum)属、セネテ·スムス(Scenedesmus)属、链霉菌(Streptomyces)属、聚球蓝细菌(Synechoccus)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属等的微生物，例如，大肠杆茵、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 、凝结芽孢杆菌(BacilluscoagUlans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、フ·レヒ·ハ·クテリウム·イマリオフイルム(Brevibacterium immariophilum)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)、无花果沙雷氏茵(Serratiaficaria)、居泉沙雷氏茵(Serratiafonticola)、液化沙雷氏茵(Serratia liquefacciens)、粘质沙雷氏茵(Serratia marcescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)、桶形鱼腥蓝细菌(Anabaena doliolum)、水华鱼腥蓝细菌(Anabaenaflos-aquae)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globformis)、ァ—スロハ·クタ—·ヒト·ロカ一木·ク·ルタミカス(Arthrobacter hydrocarboglutamcus)、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)、原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)、玫瑰色石蜡节杆菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)、产尿节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、巴氏着色菌(Chromatium buderi)、微温着色菌(Chromatium tepidum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、沃氏着色茵(Chromatium warmingii)、クロマチウム·フルヒ·ァタテイレ(Chromatium fluviatile)、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、波萝欧文氏茵(Erwinia ananas)、草生欧文氏茵(Erwinia herbicola)、ェルヒ·二ァ·ハ °ンクタタ(Erwinia punctata)、ェルヒ·ニァ·テレウス(Erwinia terreus)、罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭脱甲基杆茵(Methylobacterium extorquens)、フ才ルミテ·イウム·エスヒ° 一(Phormidium sp.) ATCC29409、夹膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、生芽红细菌(Rhodopseudomonas blastica)、海红菌(Rhodopseudomonas marina)、血色红假单胞茵(Rhodopseudomonas palustris)、深红红螺茵(Rhodospirillum rubrum)、需盐红螺茵(Rhodospirillum salexigens)、盐场红螺菌(Rhodospirillum salinarum)、产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)、运动发酵单胞茵(Zymomonas mobilis)等、作为理想的原核生物，如属于埃希氏茵属、沙雷氏茵属、杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、假单孢菌属或链霉菌属等的细菌、例如上述的属于埃希氏茵属、沙雷氏菌属、杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、假单孢茵属或链霉菌属等细菌，作为更理想的细菌，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌、乳酸发酵棒杆菌、黄色棒杆菌、Corynebacterium efficiens、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、天蓝色链霉菌或浅青紫链霉菌，特别优选大肠杆菌。

作为重组DNA的导入方法，只要是将DNA导入到上述宿主细胞的方法，可以使用任一种方法，例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69,2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]等。

当使用酵母菌株作为宿主细胞时，作为表达载体可以使用例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。

作为启动子，只要是在酵母菌株中发挥作用的启动子，可以使用任一种，例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。

作为宿主细胞，如属于酵母(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、许旺酵母(Schwanniomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、或假丝酵母(Candida)属等的酵母菌株，具体的例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、シソ·サツカロマイセス·ホ°ンヘ· (Schizosaccharomyces pombe)、クルイヘ·ロマイセス·ラクテイス(Kluyveromyces lactis)、トリコス木°ロン·フ°ルランス(Trichosporon pullulans)、シワニ才マイセス·アルヒ·ウス(Schwanniomyces alluvius)、ヒ°チァ·ハ°ストリス(Pichia Dastoris)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等。

作为重组DNA的导入方法，只要是将DNA导入酵母的方法，可以使用任一种，例如电穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、原生质体法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，4889(1984)]、乙酸锂法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]等。

当使用动物细胞作为宿主时，作为表达载体，可以使用例如pcDNAI、pcDM8(由Funakoshi公司销售)、pAGE107(特开平3-22979)、DAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8[Nature，329，840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司生产)、pREP4(Invitrogen公司生产)、pAGE103[J.Biochem，101，1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等。

作为启动子，只要是在动物细胞中行使功能的，可以使用任一种，例如巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early)基因的启动子、SV40的初期启动子或金属硫因的启动子、逆病毒的启动子、热休克启动子、SRα启动子等。另外也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。

作为宿主细胞，如小鼠骨髓瘤细胞、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠杂交瘤细胞、人的细胞Namalwa细胞或Namalwa KJM-1细胞、人胎儿肾脏细胞、人白血病细胞、AfRican greenmonkey肾脏细胞、中国仓鼠细胞的CHO细胞、HBT5637(特开昭63-299)等。

作为小鼠骨髓瘤细胞，如SP2/0、NSO等、作为大鼠骨髓瘤细胞，如YB2/0等、作为人胎儿肾脏细胞，如HEK293(ATCC CRL-1573)、作为人白血病细胞，如BALL-1等、作为African green monkey肾脏细胞，如COS-1、COS-7等。

作为重组DNA的导入方法，只要是可将DNA导入动物细胞的方法，可以使用任一种，例如电穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂质转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)]、Virology，52，456(1973)所述的方法等。

当使用昆虫细胞作为宿主时，通过例如Baculovirus ExpRessionVectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，NewYork(1992)、Current protocols in Molecular Biology、MolecularBiology，A Laboratory Manual、Bio/Technology，6，47(1988)等所述的方法可以生产蛋白质。

即，将重组基因导入载体和杆状病毒一起导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养上清中得到重组病毒后，再使重组病毒感染昆虫细胞，可以生产蛋白质。

作为在该方法可使用的基因导入载体，例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(都是Invitrogen公司生产)等。

作为杆状病毒，可以使用例如感染夜盗蛾科昆虫的病毒Autographa californica nuclar polyhedrosis virus等。

作为昆虫细胞，可以使用Spodoptera frugiperda的卵巢细胞、Trichoplusia ni的卵巢细胞、来自蚕卵巢的培养细胞等。

作为Spodoptera frugiperda的卵巢细胞，如Sf9、Sf21(杆状病毒表达载体实验手册)等、作为Trichoplusia ni的卵巢细胞，如High5、BTI-TN-5B1-4(Invitrogen公司生产)等、作为来自蚕卵巢的培养细胞，如Bombyx mori N4等。

作为用于制备重组病毒，将上述重组基因导入载体与上述杆状病毒一起导入昆虫细胞的导入方法，例如磷酸钙法(特开平2-227075)、脂质转染法[Proc.Nat1.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)]等。

当使用植物细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，例如Ti质粒、烟草花叶病毒载体等。

作为启动子，只要是可在植物细胞中行使功能的，可以使用任一种，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、水稻肌动蛋白1启动子等。

作为宿主细胞，如烟草、马铃薯、西红柿、人参、大豆、油菜、紫花苜蓿、水稻、小麦、大麦等植物细胞等。

作为重组载体的导入方法，只要是可将DNA导入植物细胞的方法，可使用任一种，例如使用土壤杆菌(Agrobacterium)的方法(特开昭59-140885、特开昭60-70080.WO94/00977)、电穿孔法(特开昭60-251887)、使用基因枪(particlegun)的方法(日本专利第2606856、日本专利第2517813)等。

当通过酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞进行表达时，可以获得生产附加了糖或糖链的蛋白质的细胞。

(2)作为本发明的制造方法中使用的微生物，如在通过上述(1)的方法制备的微生物中，1种以上的肽酶和1种以上的具有肽转运活性的蛋白质(以下，略为肽转运蛋白质)的活性低下或丧失的微生物、或3种以上的肽酶的活性低下或丧失的微生物。

该微生物例如可以(a)通过上述(1)的方法赋予1种以上肽酶和1种以上肽转运蛋白质的功能低下或丧失的微生物、或3种以上肽酶的功能低下或丧失的微生物具有生产具有生成二肽活性的蛋白质能力或生产具有多磷酸激酶活性的蛋白质的能力的方法，或(b)使通过上述(1)的方法能够制备的具有生产具有生成二肽活性的蛋白质能力或生产具有多磷酸激酶活性的蛋白质能力的微生物的a)1种以上的肽酶和1种以上肽转运蛋白质、或b)3种以上肽酶的功能低下或丧失的方法等也可取得。

作为1种以上的肽酶和1种以上的肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物，只要是该微生物能正常生长繁殖，如任意1种以上的肽酶和任意1种以上的肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物，优选1种以上9种以下，更优选1种以上7种以下，再优选1种以上4种以下的肽酶的活性低下或丧失，而且优选1种以上5种以下，更优选1种以上3种以下，再优选1种以上2种以下，特别优选1种的肽转运蛋白质活性低下或丧失的微生物。

作为该微生物，更具体讲，在该微生物的基因组DNA上存在的编码肽酶的基因(以下，略为肽酶基因)和编码肽转运蛋白质的基因(以下，略为肽转运蛋白质基因)中，如在1种以上的肽酶基因的碱基序列和1种以上肽转运蛋白质基因的碱基序列中，由于缺失该碱基序列的全部或一部，或由于在该碱基序列中存在碱基的置换或附加，该肽酶和该肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物。

所谓肽酶的活性低下指的是与上述的碱基没有缺失、置换或附加的基因编码的肽酶相比，肽分解活性变低，通常低至80％以下，优选50％以下，更优选30％以下，再优选20％以下，特别优选10％以下，最好优选5％以下。

微生物的肽分解活性可以使作为底物的肽和微生物菌体在水性介质中共存，进行肽分解反应后，通过众所周知的方法、例如使用HPLC等的分析法对残存的肽量进行定量测定。

作为上述肽酶，只要是具有肽分解活性的蛋白质就可以，优选二肽分解活性高的蛋白质、更优选二肽酶。

作为更具体的肽酶，例如存在于大肠杆菌的具有序列号55表示的氨基酸序列的PepA、具有序列号56表示的氨基酸序列的PepB、具有序列号57表示的氨基酸序列的PepD、具有序列号58表示的氨基酸序列的PepN、PepP[GenBank accession no.(以下，略为GenBank)AAC75946]、PepQ(GenBank AAC76850)、PepE(GenBank AAC76991)、PepT(GenBank AAC74211)、Dcp(GenBank AAC74611)和IadA(GenBankAAC77284)等、存在于枯草芽孢杆菌的AmpS(GenBank AFO12285)、PepT(GenBank X99339)、YbaC(GenBank Z99104)、YcdD(GenBankZ99105)、YjbG(GenBank Z99110)、YkvY(GenBank Z99111)、YqjE(GenBank Z99116)、YwaD(GenBank Z99123)等、存在于谷氨酸棒杆菌的具有BAB97732、BAB97858、BAB98080、BAB98880、BAB98892、BAB99013、BAB99598和BAB99819(都是日本DNA数据库的登录号)表示的氨基酸序列的蛋白质等，作为二肽酶，如具有序列号55～58表示的氨基酸序列的PepA、PepB、PepD和PepN、以及PepQ、PepE、IadA。另外与序列号55～58中的任一个氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上同源性，而且具有肽酶活性的蛋白质也可以作为二肽分解活性高的蛋白质。氨基酸序列或碱基序列的同源性可以使用上述的BLAST和FASTA等决定。

而所谓肽转运蛋白质的活性低下指的是与由上述的没有缺失、置换或附加碱基的基因编码的肽转运蛋白质相比，肽转运活性变低，通常指的是降低到80％以下，优选50％以下，更优选30％以下，再优选20％以下，特别优选10％以下，最好优选5％以下。

微生物的肽转运活性可以通过使作为底物的肽和微生物菌体共存于水性介质中进行肽转运反应后，利用众所周知的方法，例如使用HPLC等分析法对残存于水性介质中的肽量进行定量进行测定。

上述肽转运蛋白质是由染色体DNA上形成操纵子的基因编码的蛋白质，只要是在细胞膜上形成复合体后表达肽转运活性的蛋白质，以及作为单独的蛋白质具有肽转运活性的蛋白质等参与微生物的肽转运的任一种蛋白质都可以，优选二肽转运活性高的蛋白质。

作为更具体的肽转运蛋白质，例如存在于大肠杆菌的具有序列号59表示的氨基酸序列的DppA、具有序列号60表示的氨基酸序列的DppB、具有序列号61表示的氨基酸序列的DppC、具有序列号62表示的氨基酸序列的DppD、具有序列号63表示的氨基酸序列的DppF、OppA(GenBank AAC76569)、OppB(GenBank AAC76568)、OppC(GenBankAAC 76567)、OppD(GenBank AAC76566)、OppF(GenBank AAC76565)、YddO(GenBank AAC74556)、YddP(GenBank AAC74557)、YddQ(GenBankAAC74558)、YddR(GenBank AAC74559)、YddS(GenBank AAC74560)、YbiK(GenBank AAC73915)、MppA(GenBank AAC74411)、SapA(GenBankAAC74376)、SapB(GenBank AAC74375)、SapC(GenBank AAC74374)、SapD(GenBank AAC74373)、和SapF(GenBank AAC74372)等、存在于枯草芽孢杆菌的DppA(GenBank CAA40002)、DppB(GenBank CAA40003)、DppC(GenBank CAA40004)、DppD(GenBank CAA40005)、DppE(GenBankCAA40006)、OppA(GenBank CAA39787)、OppB(GenBank CAA39788)、OppC(GenBank CAA39789)、OppD(GenBank CAA39790)、OppF(GenBankCAA39791)、AppA(GenBank CAA62358)、AppB(GenBank CAA62359)、AppC(GenBank CAA62360)、AppD(GenBank CAA62356)、AppF(GenBankCAA62357)、Yc1F(GenBank CAB12175)YkfD(GenBank CAB1357)等、存在于谷氨酸棒杆菌的具有BAB99048、BAB99383、BAB99384、BAB99385、BAB99713、BAB99714、BAB99715、BAB99830、BAB99831、BAB99832(都是日本DNA数据库的登录号)表示的氨基酸序列的蛋白质等，另外作为肽转运活性高的蛋白质，如具有序列号59～63表示的氨基酸序列的DppA、DppB、DppC、DppD、DppF和与它们中的任一个表示的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上同源性的蛋白质也可作为肽转运活性高的肽转运蛋白质。

上述氨基酸序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序决定。

作为3种以上肽酶的活性低下或丧失的微生物，只要是该微生物能正常生长繁殖，如任意3种以上肽酶的活性低下或丧失的微生物，优选3种以上9种以下，更优选3种以上6种以下，再优选3种或4种肽酶的活性低下或丧失的微生物。

作为具体的肽酶，如存在于上述的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌的肽酶和二肽酶。而由与序列号55~58中的任一个氨基酸序列有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上同源性的氨基酸序列构成、而且具有肽酶活性的蛋白质也可以作为二肽分解活性高的蛋白质。

肽酶和肽转运蛋白质的活性低下或丧失的微生物只要是能够取得该微生物的方法，其取得方法没有限制，例如通过在以下所示的微生物的染色体DNA的肽酶基因或肽转运蛋白质基因导入碱基的缺失、置换或附加的方法可以取得。

作为在微生物的染色体DNA的基因导入碱基缺失、置换或附加的方法，如利用同源重组的方法。作为利用一般的同源重组的方法，如使用将导入了碱基缺失、置换或附加的突变基因与在希望导入碱基缺失等的宿主细胞内含有不能自我复制的抗药(性)基因的质粒DNA连接制作的同源重组用质粒的方法。

通过常规方法将该同源重组用质粒导入宿主细胞后，以抗药(性)作为指标选择通过同源重组在染色体DNA上转运了该同源重组用质粒的转化株。通过将得到的转化株于不含有该药物的培养基中培养数小时～1天后，涂布于含有该药物的琼脂培养基和不含有该药物的琼脂培养基，选择在前者培养基中不生长发育，而在后者培养基能够繁殖株，可以取得在染色体DNA上发生第2次同源重组的株。通过决定染色体DNA上的导入了缺失等的基因存在区域的碱基序列，可以确认染色体DNA上目的基因中导入了碱基的缺失、置换或附加。

作为能够通过上述方法在染色体DNA上的目的基因导入碱基的缺失、置换或附加的微生物，例如属于埃希氏菌属、杆菌属或棒杆菌属的微生物。

而作为利用同源重组向多个基因有效导入碱基的缺失、置换或附加的方法，如使用直链DNA的方法。

具体来说，是使含有希望导入碱基缺失、置换或附加的基因的直链DNA转运到细胞内，在染色体DNA与导入的直链DNA之间发生同源重组的方法。本方法只要是可有效转运直链DNA的微生物，也可以适用于任一种微生物，作为理想的微生物，如属于埃希氏菌属或杆菌属的微生物、更优选大肠杆菌、再优选表达来自λ噬茵体的重组蛋白质组(Red重组系)的大肠杆菌。

作为表达λRed重组系的大肠杆菌，如带有含λRed重组系基因的质粒DNA pKD46[可从大肠杆菌基因储备中心(美国耶鲁大学)获得]的大肠杆菌JM101株等。

作为可用于同源重组的DNA，如

(a)在抗药(性)基因的两端含有与位于作为碱基的缺失、置换或附加的导入对象的染色体DNA上区域两端外侧的DNA具有同源性的DNA的直链DNA、

(b)直接连接了与位于作为碱基的缺失、置换或附加的导入对象的染色体DNA上区域两端外侧的DNA具有同源性的DNA的直链DNA、

(c)在含有抗药(性)基因和能够用于负选择的基因的DNA的两端含有与位于作为碱基的缺失、置换或附加的导入对象的染色体DNA上区域的两端外侧的DNA具有同源性的DNA的直链DNA、和

(d)在上述(a)的直链DNA中，在位于抗药(性)基因和与作为缺失等的导入对象的染色体DNA上区域的两端外侧的DNA具有同源性的DNA之间，还含有来自酵母的Flp重组酶〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，82，5875(1985)〕识别的碱基序列的DNA。

作为抗药(性)基因，只要是对于宿主微生物表现出敏感性的药物，赋予抗药(性)的抗药(性)基因，也可以使用任一种抗药(性)基因。作为宿主微生物使用大肠杆菌时，作为抗药(性)基因，例如，卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、大观霉素抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因等。

所谓能够用于负选择的基因指的是当在宿主微生物中使该基因表达时，在一定培养条件下，使该微生物致死的基因，作为该基因，例如来自属于杆菌属的微生物的sacB基因〔Appl.Environ.Microbiol.，59，1361-1366(1993)〕、和来自属于埃希氏茵属的微生物的rpsL基因〔Genomics，72,99-104(2001)〕等。

与存在于上述的直链DNA的两末端的位于成为染色体DNA上置换或缺失的导入对象的区域两端外侧的DNA具有同源性的DNA在直链DNA中被配置在与染色体DNA上的方向相同的方向，其长度优选10bp～100bp左右，更有效优选bp～50bp左右、进一步优选30～40bp左右。

所谓来自酵母的Flp重组酶识别的碱基序列只要是该蛋白质识别、催化同源重组的碱基序列，没有特别限定，优选具有序列号64表示的碱基序列的DNA、和具有在该DNA中缺失、置换或附加了1个～数个碱基的碱基序列、而且来自酵母的Flp重组酶识别、催化同源重组的碱基序列的DNA。

所谓具有同源性是上述直链DNA在染色体DNA上的目的区域具有同源重组发生程度的同源性，作为具体的同源性，如80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、再优选100％的同源性。

上述碱基序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序决定。

上述直链DNA片段可以通过PCR制作。另外在质粒上构建了含有上述直链DNA的DNA后，经限制酶处理也可以得到目的直链DNA。

作为在微生物的染色体DNA中导入碱基的缺失、置换或附加的方法，如以下的方法1～4。

方法1：将上述(a)或(d)的直链DNA导入宿主微生物，以抗药(性)为指标选择通过同源重组该直链DNA被插入到染色体DNA上的转化株的方法。

方法2：向通过上述方法1取得的转化株导入上述(b)的直链DNA，通过消除经该方法插入到染色体DNA上的药物基因，使微生物的染色体DNA上的区域置换或缺失的方法。

方法3：

将上述(c)的直链DNA导入宿主微生物，以抗药(性)为指标选择通过同源重组该直链DNA被插入到染色体DNA上的转化株、

合成在与染色体DNA上的方向同一方向连接了与位于作为染色体DNA上的置换或缺失对象区域两端外侧的DNA具有同源性的DNA的DNA，导入到上述[1]中得到的转化株，

在可用于负选择的基因表达的条件下，对进行了上述[2]操作的转化株进行培养，选择在该培养条件下可生长繁殖的株作为从染色体DNA上削除抗药(性)基因和可用于负选择的基因的菌株的方法。

方法4：

将上述(d)的直链DNA导入宿主微生物，以抗药(性)为指标选择通过同源重组该直链DNA被插入到染色体DNA上的转化株、

向上述[1]中得到的转化株导入Flp重组酶基因表达质粒，使该基因表达后，取得对上述[1]中使用的药物有敏感性的菌株的方法。

作为将在上述方法中使用的直链DNA导入宿主微生物的方法，只要是将DNA导入该微生物的方法，可以使用任一种方法，例如使用钙离子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)〕、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法〔Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)〕等。

通过使用转运希望插入到在方法2或方法3[2]中使用的直链DNA中的该DNA的中央部附近染色体DNA上的任意基因的直链DNA，在削除抗药(性)基因等的同时，可以将任意基因插入到染色体DNA上。

就上述方法2～4来说，由于是在最终得到的转化株的染色体DNA上不保留抗药(性)基因和可用于负选择的基因等外来基因的方法，所以通过使用同一抗药(性)基因和可用于负选择的基因，反复进行该方法的操作，容易制造在染色体DNA上的位置不同的2个以上区域带有碱基的缺失、置换或附加的微生物。

9.本发明的蛋白质和可用于本发明的蛋白质的制备

所谓本发明的蛋白质和可用于本发明的蛋白质(以下，称为可用于本发明的蛋白质)可以通过将用上述8的方法得到的转化体在培养基中进行培养，使可用于本发明的蛋白质在培养物中生成、蓄积，从该培养物回收该蛋白质，制造该蛋白质。

作为用于制造可用于本发明的蛋白质的上述转化体的宿主，可以是原核生物和酵母等微生物、动物细胞、昆虫细胞等或植物细胞等中的任一种，优选微生物、更优选原核生物、进一步优选细菌、特别优选属于埃希氏菌属的细菌、最好优选大肠杆菌。

将上述转化体在培养基中进行培养的方法可以根据宿主细胞的培养中使用的通常的方法进行。

将大肠杆菌等原核生物和酵母等真核生物作为宿主细胞，对得到的微生物的转化体进行培养的培养基，只要是含有该微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等、可有效进行转化体的培养的培养基，可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。

作为碳源，只要是该微生物可利用的就可以，可以使用葡萄糖、乳糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类等

作为氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其它的含氮化合物、以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸渍液、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各种发酵茵体和其它消化物等。

作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸銅、碳酸钙等。

培养在通常振荡培养或深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度为15～40℃比较好、培养时间通常为5小时～7日间。培养中pH保持3.0～9.0。pH的调整使用无机或有机的酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。

另外根据培养中需要，也可以向培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。

当对用使用诱导性的启动子作为启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，根据需要，也可以向培养基中添加诱导物。例如，对用使用lac启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，当用使用trp启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，也可以向培养基添加吲哚丙烯酸等。

作为对以动物细胞作为宿主得到的转化体进行培养的培养基，可以使用一般使用的RPMI1640培养基[J.Am.Med.Assoc.，199，519(1967)]、Eagle的MEM培养基[Science，122，501(1952)]、DMEM培养基[Virology，8，396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Biol.Med.，73，1(1950)]或在这些培养基中添加了胎牛血清等的培养基等。

培养通常在pH 6～8、25～40℃、5％CO₂存在下等的条件下进行1～7天。

另外根据培养中需要，也可以在培养基中添加卡那霉素、青霉素、链霉素等抗生素。

作为对以昆虫细胞作为宿主得到的转化体进行培养的培养基，可以使用一般使用的TNM-FH培养基(PharMingen公司生产)、Sf-900IISFM培养基(Life Technologies公司生产)、ExCe11400、ExCel1405[都是JRH BIOSCIENCES公司生产]、Grace＇sInsect Medium[Nature，195，788(1962)]等。

培养通常在pH 6～7、25～30℃等的条件下进行1～5天。

另外根据培养中需要，也可以在培养基中添加庆大霉素等抗生素。

以植物细胞作为宿主得到的转化体，可以以细胞的形式，或使其分化为植物的细胞或器官后培养。作为培养该转化体的培养基，可以使用通常使用的Murashige-Skoog(MS)培养基、White培养基、或向这些培养基中添加了生长素、细胞激动素等植物激素的培养基等。

培养通常在pH5～9、20～40℃条件下进行3～60天。

另外根据培养中需要，也可以在培养基中添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。

作为本发明中可使用的蛋白质的生产方法，有使蛋白质在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法、或在宿主细胞外膜上生产的方法，可以根据使用的宿主细胞不同和使生产的蛋白质的构造发生不同变化选择上述方法。

当本发明中使用的蛋白质在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产时，通过利用Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.，264，17619(1989)]、Lowe等人的方法[Proc.Nat l.Acad.Sci.，USA，868,227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)]、或特开平05-336963、WO94/23021等所述的方法，可以使该蛋白质有效地分泌在宿主细胞外。

即，通过使用基因重组的手法，以在紧接在含有本发明使用的蛋白质的活性部位的蛋白质前面附加信号肽的形式使该蛋白质生产，可以有效地使该蛋白质分泌到宿主细胞外。

另外根据特开平2-227075所述的方法，利用使用了二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系也可以使产量上升。

另外，通过使导入基因的动物或植物的细胞再分化，制造导入了基因的动物个体(转基因非人动物)或植物个体(转基因植物)，使用这些个体也可以制造本发明的蛋白质。

当生产本发明使用的蛋白质的转化体为动物个体或植物个体时，根据通常的方法，通过进行饲养或栽培使该蛋白质生成、蓄积，从该动物个体或植物个体回收该蛋白质，可以制造该蛋白质。

作为使用动物个体制造可用于本发明的蛋白质的方法，例如根据众所周知的方法[Am.J.Clin.Nutr.，63，639S(1996)、Am.J.Clin.Nutr.，63，627S(1996)、Bio/Technology，9，830(1991)]在导入基因制造的动物中生产该蛋白质的方法。

对于动物个体的情况，例如通过对导入本发明使用的DNA的转基因的非人动物进行饲养，使可用于本发明的蛋白质在该动物中生成、蓄积，从该动物中回收该蛋白质，可以制造该蛋白质。作为该动物中使该蛋白质生成、蓄积的场所，例如该动物的奶(特开昭63-309192)、卵等。作为此时可使用的启动子，只要是可在动物中行使功能的启动子，可以使用任一个，最好使用例如乳腺细胞特异的启动子α酪蛋白启动子、β酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子等。

作为使用植物个体制造本发明的蛋白质的方法，例如根据众所周知的方法[组织培养，20(1994)、组织培养，21(1995)、TrendsBiotechnol.，15，45(1997)]通过对导入了编码可用于本发明的蛋白质的DNA的转基因植物进行栽培，使该蛋白质在该植物中生成、蓄积，从该植物中回收该蛋白质，生产该蛋白质的方法。

作为对使用生产可用于本发明的蛋白质的转化体制造的该蛋白质进行分离纯化的方法，可以使用通常的酶的分离纯化法。

例如，当可用于本发明的蛋白质以在细胞内溶解状态生产时，培养结束后，通过对细胞离心分离，进行回收，悬浮于水系缓冲液后，通过超声波破碎机、弗氏细胞压碎器、Manton-Gaulin匀浆器、Dynomill等将细胞破碎，得到无细胞提取液。

从通过对该无细胞提取液离心分离得到的上清通过单独或组合使用通常的酶的分离纯化法、即溶剂提取法、通过硫铵等的盐析法、脱盐法、通过有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、DIAION HPA-75(三菱化成公司生产)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司生产)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基纤维素、苯基纤维素等的树脂的疏水层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚集法、等电聚焦电泳等的电泳法等的手法，可以得到纯化标准品。

另外当该蛋白质以在细胞内形成包涵体形式生产时，同样回收细胞进行破碎，使用通常的方法从通过离心分离得到的沉淀级分回收该蛋白质后，将该蛋白质的包涵体用蛋白质变性剂溶化。

将该溶化液稀释、或透析到不含有蛋白质变性剂或蛋白质变性剂的浓度稀到蛋白质不变性的程度的溶液，使该蛋白质构成正常的立体构造后，通过与上述同样的分离纯化法可以得到纯化标准品。

当可用于本发明的蛋白质或其糖修饰体等衍生物分泌到细胞外时，可以在培养上清回收该蛋白质或它的糖附加体等衍生物。

即，通过与上述同样的离心分离等手法对该培养物进行处理，取得可溶性级分，使用与上述同样的分离纯化法从该可溶性级分可以得到纯化标准品。

作为象上述那样取得的蛋白质，例如由序列号1～13、47、48、53和124～131中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质。

另外，当可用于本发明的蛋白质以与其它蛋白质的融合蛋白质形式生产时，利用使用对融合的蛋白质具有亲和性的物质的亲和层析也可以进行纯化。

作为使其融合的蛋白质，如β-半乳糖苷酶、蛋白A、蛋白A的免疫球蛋白G结合区域、氯霉素·转乙酰酶、聚(Arg)、聚(Glu)、蛋白G、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽S-转移酶、聚组氨酸链(His-tag)、S肽、DNA结合蛋白质结构域、Tac抗原、硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、FLAG肽、和任意的抗体的表位等〔山川彰夫，实验医学，13，469-474(1995)〕。

作为对上述可用于融合的蛋白质具有亲和性的物质，如识别β-半乳糖苷酶、蛋白A、蛋白A的免疫球蛋白G结合区域、氯霉素·转乙酰酶、聚(Arg)、聚(Glu)、蛋白G、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽S-转移酶、聚组氨酸链(His-tag)、S肽、DNA结合蛋白质结构域、Tac抗原、硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、FLAG肽或任意抗体表位的抗体、例如免疫球蛋白G等。

具体来讲，当可用于本发明的蛋白质以与蛋白A的融合蛋白质进行生产时，根据Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86，8227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)]、特开平5-336963、WO94/23021所述的方法等，当以与Flag肽的融合蛋白质形式生产时，根据proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86，8227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)等所述的方法可以纯化融合蛋白质。另外也可以通过使用对该蛋白质自身的抗体的亲和层析进行纯化。

以上述取得的蛋白质的氨基酸序列情报为基础通过Fmoc法(9-笏甲氧羰基法)、tBoc法(t-丁氧羰基法)等化学合成法可以制造本发明的蛋白质。另外也可以利用Advanc ed ChemTech社、Perkin-Elmer公司、Pharmacia 社、 Protein Technology Instrument 社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、岛津制作所等肽合成仪进行化学合成。

10.本发明的二肽和二肽衍生物的制造方法

作为本发明的制造方法，如(1)特征如下的二肽或二肽衍生物(PI)的制造方法：使i)磷酸供体、ii)选自AMP、ADP和ATP中的物质、iii)具有多磷酸激酶活性的蛋白质或具有生产该蛋白质能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、iv)具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、和v)1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物在水性介质中共存，使二肽或二肽衍生物(PI)在该水性介质中生成、蓄积，从该水性介质回收该二肽或二肽衍生物(PI)，和

(2)特征如下的二肽或二肽衍生物(PII)的制造方法：使i)磷酸供体、ii)选自AMP、ADP和ATP中的物质、iii)具有多磷酸激酶活性的蛋白质或具有生产该蛋白质能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、iv)具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、和v)1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物在水性介质中共存，使二肽或二肽衍生物(PI)在该水性介质中生成、蓄积，直接进行修饰或从该水性介质回收该二肽或二肽衍生物(PI)后对该二肽或二肽衍生物(PI)进行修饰，使二肽或二肽衍生物[以下，称为二肽或二肽衍生物(PII)]生成，回收该二肽或二肽衍生物(PII)。

通过众所周知的有机合成的手法等对二肽或二肽衍生物(PI)进行修饰可以制造二肽或二肽衍生物(PII)。

作为上述氨基酸或氨基酸衍生物，如式(I)

(式中、n¹、R^1a、R^1b、R^2a和R^2b分别与上述同义)，或式(II)

(式中、n²、R^3a、R^3b、R⁴和R⁵分别与上述同义)

表示的氨基酸或氨基酸衍生物[但当1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物只是式(I)时，R^1a和R^1b中至少有一方是氢原子，当1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物只是式(II)时，R⁵为羟基]，

优选式(III)

(式中、R^1c、R^1d、R^2c和R^2d分别与上述同义)，或式(IV)

(式中、R^3c、R^3d及び R⁵分别与上述同义)

表示的氨基酸或氨基酸衍生物[但当氨基酸或氨基酸衍生物只是式(III)时，R^1c和R^1d中至少有一方是氢原子，当氨基酸或氨基酸衍生物只是式(IV)时，R⁵为羟基]，

更优选式(V)或式(VI)表示的氨基酸或氨基酸衍生物：

(式中、R^2e与上述同义)，

(式中、R^3e与上述同义)。

作为用上述制造方法制造的肽或二肽衍生物(PI)，如式(VIIa)

表示的二肽衍生物，

(式中、n^3a、n^4a、R^6a、R^6b、R^7a、R^7b、R^8a、R^9a、R^9b和R^10a分别与上述同义)

优选式(VIIIa)表示的二肽衍生物，

(式中、R^6c、R^6d、R^7c、R^7d、R^9c、R^9d和R^10a分别与上述同义)

更优选式(IXa)表示的二肽衍生物。

(式中、R^7e和R^9e分别与上述同义)

作为用上述制造方法制造的二肽或二肽衍生物(PII)，如式(VIIb)表示的二肽衍生物，

优选式(VIIIb)表示的二肽衍生物，

(式中、R^6C、R^6D、R^7C、R^7D、R^9C、R^9D和R^10A分别与上述同义)，

更优选式(IXb)表示的二肽衍生物。

(式中、R^7E和R^9E分别与上述同义)。

但该二肽衍生物不包括由从L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-α-氨基酪酸、L-偶氮丝氨酸、L-茶氨酸、L-4-羟基脯氨酸、L-3-羟基脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-6-重氮-5-氧代正亮氨酸、甘氨酸和β-丙氨酸选出的相同的或不同的氨基酸通过肽键形成的化合物。

在式(I)～(VI)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIIa)、(VIIIb)、(IXa)和(IXb)的各基团的定义中，作为低级烷基、低级烷氧基、低级烷酰基、低级烷氧羰基、一(低级烷基)氨基和二(低级烷基)氨基的低级烷基部分，例如碳原子数1至10的直链状、支链状、环状或由它们的组合组成的烷基，更具体讲，作为直链或支链状的烷基，例如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、新戊基、n-己基、n-庚基、n-辛基、n-壬基、n-癸基等，作为环状的烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、去甲金刚烷基、金刚烷基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.3.0]辛基、双环[3.3.1]壬基等，作为由直链或支链状和环状的组合构成的烷基，例如环丙基甲基、环庚基甲基、环辛基乙基等。而二(低级烷基)氨基中的2个低级烷基部分可以相同，也可以不同。

作为低级烯基，例如碳原子数2至10的直链或支链状的烯基，更具体的例子如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、1-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、4-戊烯基、2-己烯基、5-己烯基、2-癸烯基、9-癸烯基等。

作为低级炔基，例如碳原子数2至10的直链或支链状的炔基，更具体的例子如乙炔、2-丙炔、3-丁炔、4-戊炔、5-己炔、9-癸炔等。

作为芳基、芳烷基和芳酰基的芳基部分，例如单环性或2个以上的环缩合的缩环性的芳基，更具体讲如环构成碳原子数从6至14的芳基、例如苯基、萘、茚基、蒽基等。

作为脂环式杂环基，例如单环性或2个以上的环缩合的缩环性的脂环式杂环基，脂环式杂环基中含有的杂原子的种类以及个数没有特别限定，例如可以含有1或2个以上从氮原子、硫原子和氧原子选出的杂原子，更具体的例子，例如吡咯烷基、2，5-二氧吡咯烷基、噻唑烷基、唑烷基、哌啶基、1，2-二氢吡啶基、哌嗪基、同型哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、吡唑啉基、噁唑啉基、二氧戊环基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、四氢呋喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、四氢喹喔啉基、八氢喹啉基、二氢吲哚基、1，3-二氧异吲哚基等。

作为杂环烷基的杂环基部分，例如芳香族杂环基、脂环式杂环基等，作为芳香族杂环基，例如单环性或2个以上的环缩合的缩环性的芳香族杂环基，芳香族杂环基中含有的杂原子的种类以及个数没有特别限定，例如可以含有1或2个以上从氮原子、硫原子和氧原子选出的杂原子，更具体讲，从构成环的原子数5至14的芳香族杂环基、例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑、吡唑基、三唑基、四唑基、六唑基、噁二唑基、噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、2，3-二氮杂萘基、1，5-二氮杂萘基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、嘌呤基、香豆酸基等。而脂环式杂环基与上述同义。

芳烷基和杂环烷基的亚烷基部分在上述低级烷基之中与从一个直链或支链状的烷基除去氢原子后的部分相同含义。

作为邻接的氮原子和与该氮原子邻接的碳原子一起形成的杂环基、以及邻接的碳原子和与该碳原子邻接的氮原子一起形成的杂环基，例如至少含有1个氮原子的5元或6元的单环性脂环式杂环基(该单环性脂环式杂环基也可以含有其它的氮原子、氧原子或硫原子)、在3～8元的环缩合的二环或三环性中至少含有1个氮原子的缩环性杂环基(该缩环性杂环基也可以含有其它的氮原子、氧原子或硫原子)等，更具体的例子，如吡咯烷、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、同型哌啶基、同型哌嗪基、四氢吡啶基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基等。

作为取代低级烷基、取代低级烯基、取代低级炔基、取代低级烷氧基、取代低级烷酰基、取代低级烷氧羰基、取代芳烷基、取代芳基、取代芳酰基、取代杂环烷基、一(取代低级烷基)氨基、低级烷基(取代低级烷基)氨基、二(取代低级烷基)氨基以及邻接的氮原子和与该氮原子邻接的碳原子一起形成的取代杂环基、和邻接的碳原子和与该碳原子邻接的氮原子一起形成的取代杂环基中的取代基，可以相同或不同，从取代数1起始的可取代数，优选取代数1～3的、例如卤素、氨基、硝基、羟基、巯基、胍基、脲基、氰基、甲酰基、羧基、氨羰基、重氮乙酰基、低级烷基、低级烷氧基、低级烷酰基、低级烷氧羰基、一或二(低级烷基)氨羰基、低级烷基巯基、芳基、芳烷基、芳酰基、杂环羰基等。其中低级烷基、低级烷氧基、低级烷酰基和低级烷氧羰基的低级烷基部分、芳基、芳烷基和芳酰基的芳基部分以及芳烷基的烯基部分分别与上述同样含义，一或二(低级烷基)氨羰基和低级烷硫基中的低级烷基部分与上述低级烷基同样含义，杂环羰基中的杂环基部分与上述杂环烷基中的杂环基部分相同含义。卤素表示氟、氯、溴、碘各原子。而二(低级烷基)氨羰基中的2个低级烷基部分可以相同，也可以不同。

另外，作为理想的氨基酸或氨基酸衍生物，如由L-氨基酸、甘氨酸(Gly)和β-丙氨酸(β-Ala)和它们的衍生物选出的氨基酸或氨基酸衍生物。作为L-氨基酸，例如L-丙氨酸(L-Ala)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-缬氨酸(L-Val)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-异亮氨酸(L-Ile)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-色氨酸(L-Trp)、L-蛋氨酸(L-Met)、L-丝氨酸(L-Ser)、L-苏氨酸(L-Thr)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-精氨酸(L-Arg)、L-组氨酸(L-His)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-α-氨基酪酸(L-α-AB)、L-氮丝氨酸(L-Azaserine)、L-茶氨酸(L-theanine)、L-4-羟基脯氨酸(L-4-HYP)、L-3-羟基脯氨酸(L-3-HYP)、L-鸟氨酸(L-Orn)、L-瓜氨酸(L-Cit)和L-6-重氮-5-氧代正亮氨酸(L-6-diazo-5-oxo-norleucine)等。

作为上述制造方法中可使用的氨基酸或氨基酸衍生物的组合，如选自L-Ala、Gly、L-Met、L-Ser、L-Thr和β-Ala中的一种氨基酸或它的衍生物与选自L-Ala、L-Gln、L-G l u、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Me t、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、β-Ala、L-Azaserine、L-theanine、L-4-HYP、L-3-HYP、L-Orn、L-Cit 及L-6-diazo--oxo-norleucine中的一种氨基酸或它的衍生物的组合、L-Gln或它的衍生物与L-Phe或它的衍生物的组合、和L-α-AB或它的衍生物与选自L-Gln、L-Arg和-α-AB中的一种氨基酸或它的衍生物的组合，更优选L-Ala或它的衍生物与选自L-Gln、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB、L-Azaserine、L-Cit和L-theanine中的一种氨基酸或它的衍生物的组合、Gly或它的衍生物与选自L-Gln、Gly、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-α-AB和L-Cit中的一种氨基酸或它的衍生物的组合、L-Met或它的衍生物与选自L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Tyr、L-Lys和L-His中的一种氨基酸或它的衍生物的组合、L-Ser或它的衍生物与选自L-Gln、L-Phe、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-His和L-α-AB中的一种氨基酸或它的衍生物的组合、L-Thr或它的衍生物与选自L-Gln、L-Phe、L-Leu、L-Thr和L-α-AB中的一种氨基酸或它的衍生物的组合、L-Gln或它的衍生物与L-Phe或它的衍生物的组合、β-Ala或它的衍生物与选自L-Phe、L-Met、L-His和L-Git中的一种氨基酸或它的衍生物的组合、和L-α-AB或它的衍生物与L-Gln、L-Arg和L-α-AB中的一种氨基酸或它的衍生物的组合。

在上述制造方法中，使用蛋白质本身作为酶源时，水性介质中的该蛋白质的量相对于每1mg用作底物的氨基酸或氨基酸衍生物为0.01～100mg、优选0.1mg～10mg，当使用具有生产具有二肽生成活性的蛋白质能力的细胞或具有生产具有多磷酸激酶活性的蛋白质能力的细胞的培养物或该培养物的处理物作为酶源时，该酶源的量因该酶源的比活性等不同而有所差异，例如，对于每1mg用作底物的氨基酸或氨基酸衍生物，添加作为湿菌体重量5～1000mg、优选10～400mg。

作为培养物的处理物，如培养物的热处理物、培养物的浓缩物、培养物的干燥物、培养物离心分离后得到的细胞、该细胞的热处理物、该细胞的干燥物、该细胞的冷冻干燥物、该细胞的表面活性剂处理物、该细胞的超声波处理物、该细胞的机械磨碎处理物、该细胞的溶剂处理物、该细胞的酶处理物、该细胞的蛋白质分级物、该细胞的固定化物和从该细胞提取得到的酶标准品选出的处理物，而且具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性、或具有多磷酸激酶活性的处理物等，优选热处理物。作为热处理的条件，只要是热处理的培养物或细胞具有生成反应需要的二肽或二肽衍生物的活性和多磷酸激酶活性，而且使二肽或二肽衍生物的分解活性低下或丧失的条件，没有特别限制，如40℃～90℃下5～120分钟、优选45℃～70℃下10～60分钟的条件。

另外，当使用上述的培养物或细胞的热处理物作为酶源时，最好使用热稳定的具有二肽生成活性的蛋白质和具有多磷酸激酶活性的蛋白质。具有生产热稳定的具有二肽生成活性的蛋白质和具有多磷酸激酶活性的蛋白质的细胞可以通过使用易错PCR[Technique，1，11-15(1989)]等手法，在例如具有序列号14或117表示的碱基序列的DNA中导入突变，通过上述3的方法制备生产该DNA编码的蛋白质的转化体，使该蛋白质生产，选择在上述条件的热处理后也生产保持二肽生成活性或多磷酸激酶活性的蛋白质的转化体取得。具体来讲，通过易错PCR在具有序列号14表示的碱基序列的DNA中导入突变后得到的带有具有序列号22～26中的任一个表示碱基序列的DNA的细胞。

在上述制造方法中，用作底物的氨基酸或氨基酸衍生物按照浓度达到0.1～500g/L、优选0.2～200g/L的浓度在开始或反应途中添加到水性介质中。

上述制造方法中可使用的选自AMP、ADP和ATP的物质只要是ATP消耗反应(二肽或二肽衍生物的生成反应)和ATP再生反应(通过多磷酸激酶催化的ATP生成反应)偶联反应开始的浓度，可以是任意浓度，通常使用0.1mmol～100mol/L、优选1mmol～10mol/L、更优选2mmol～5mol/L的浓度。

另外当在上述制造方法中使用细胞的培养物或该培养物的处理物作为酶源时，取代AMP、ADP和ATP，可以使用通过细胞的代谢能力能够变换为AMP、ADP或ATP的AMP、ADP或ATP的前体物质、或作为AMP、ADP或ATP的供给源的葡萄糖那样的糖类、乙醇那样的醇类、醋酸那样的有机酸类等。

作为可用于上述制造方法中的磷酸供体，只要是可成为多磷酸激酶底物的磷酸供体，可以使用任意物质，优选多磷酸。作为多磷酸，只要是可作为多磷酸激酶底物的多磷酸，没有特别限制，聚合度为8～1000、优选聚合度为10～75的多磷酸。该多磷酸按照浓度达到0.5g/L～200g/L、优选5g/L～100g/L的浓度添加到水性介质中。

作为可在上述制造方法中使用的水性介质，只要不抑制二肽衍生物的生成反应，可以是任意成分、组成的水性介质，例如，水、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液等。另外也可以含有甲醇、乙醇等醇类、乙酸乙酯等酯类、丙酮等酮类、乙酰胺等酰胺类。另外当使用细胞的培养物或该培养物的处理物作为酶源时，作为水性介质，也可以使用该细胞的培养中使用的培养液作为水性介质。

另外，在上述制造方法中当使用细胞的培养物或该培养物的处理物作为酶源时，根据需要，也可以在水性介质中添加表面活性剂或有机溶剂。作为表面活性剂，polyoxyethylene cotadecylamine(例如Nymeen S-215、日本油脂社制)等非离子表面活性剂、cetyltrimethylammonium bromide和alkyldimethylbenzyIammoniumchloride(例如Cation F2-40E、日本油脂社制)等阳离子系表面活性剂、lauroyl sarcosinate 等阴离子系表面活性剂、alkyldimethylamine(例如Tertiary AmineFB、日本油脂社制)等的Tertiary Amine类等；作为有机溶剂，如二甲苯、甲苯、脂(肪)族醇、丙酮、醋酸乙酯等，本发明的制造方法中使用的细胞只要是具有由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性，可以使用任一种，也可以将1种或数种混合后使用。表面活性剂和有机溶剂的种类和浓度可以在可用于本发明的细胞具有上述活性的范围中的任意选择，例如表面活性剂通常在0.1～50g/l的浓度范围使用，有机溶剂通常在0.1～50ml/l的浓度范围使用。

另外根据需要，可以在水性介质中添加EDTA、EGTA、植酸等螯合剂、PMSF(Phenylmethylsulfonylfluoride)、--4-Amidinophenylbenzoate等蛋白酶抑制剂和Actinonin、DiprotinA等肽酶抑制剂、或镉、铬等金属离子，也可以抑制生成的二肽或二肽衍生物的分解，螯合剂可以在0.01～100mmol/L的浓度范围使用，蛋白酶或肽酶抑制剂在0.01～10mmol/L的浓度范围内使用，金属离子在0.1～100mg/L的浓度范围内使用。

二肽或二肽衍生物的生成反应在水性介质中、在pH5～11、优选pH 6～10、20～50℃、优选25～45℃的条件进行2～150小时、优选进行6～120小时。

在上述制造方法中，在水性介质中生成、蓄积的二肽或二肽衍生物的采取可以通过使用活性炭或离子交换树脂等通常的方法，或利用有机溶剂的提取、结晶、薄层层析、高效液相层析等进行。

以下给出了实验例，对可用于本发明的DNA、蛋白质和细胞的制备方法进行了说明，但该制备方法并不限定于下面实验例。

实验例1 利用数据库检索具有二肽合成活性的蛋白质

以来自枯草芽孢杆菌168株的D-Ala-D-Ala连接酶基因的氨基酸序列[Nature，390，249-256(1997)]作为质询，使用作为枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA数据库的Subtilist(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/)的同源性检索功能，对编码存在于枯草芽孢杆菌168株基因组DNA序列中的具有同源性的蛋白质的基因进行检索。

结果在提取的序列中，选择编码作为D-Ala-D-Ala连接酶基序[Biochemistry，30，1673(1991)]的序列号43、44或45表示的氨基酸序列，而且去除掉编码其功能已经被鉴定的蛋白质的基因后，表现出与D-Ala-D-Ala连接酶基序最高同源性(29.1％)的序列作为功能未知基因ywfE。

ywfE的碱基序列如序列号14所示，由该碱基序列编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号1所示。

实验例2 ywfE基因表达株的构建

根据实验例1得到的碱基序列情报，象以下那样操作可以取得枯草芽孢杆菌的ywfE基因片段。

首先将枯草芽孢杆菌168株(ATCC 23857)接种于LB培养基[10g/l细菌培养用胰化蛋白胨(Difco公司生产)、5g/l酵母提取物(Difco公司生产)、5g/l氯化钠]，于30℃下静置培养过夜。培养后通过使用Current Protocolsin Molecular Biology所述的饱和酚方法，对该微生物的染色体DNA进行分离纯化。

使用Perseptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号29～32表示的碱基序列的DNA(以下，分别称之为引物A、引物B、引物C和引物D)。引物A是附加在枯草芽孢杆菌染色体DNA的含有ywfE起始密码子区域的5＇端的含有XhoI识别序列的碱基序列。引物B是附加在与含有ywfE的终止密码子的序列互补的碱基序列的5＇端的含有BamHI识别序列的碱基序列。而引物C是附加在含有trp启动子的表达载体pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]的trp启动子区域的碱基序列号5＇端的含有EcoRI识别序列的碱基序列。引物D是附加在与含有trp启动子的表达载体pTrS30的trp启动子区域的序列互补的序列的5＇端的含有XhoI识别序列的碱基序列。

在ywfE基因片段的扩增中使用上述引物A和引物B，作为模板使用枯草芽孢杆菌染色体DNA，在trp启动子区域的片段扩增中使用引物C和引物D、作为模板使用pTrS30进行PCR。PCR通过制备含有作为模板的0.1μg染色体DNA或10ng的pTrS30、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司生产)、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液(Stratagene公司生产)、各200μmol/L的dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)的反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，反复进行30次循环来实施。

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认在使用引物A和引物B的PCR中扩增了相当于ywfE基因片段的约1.4kb，在使用引物C和引物D的反应中扩增了相当于trp启动子区域的DNA片段约0.3kbDNA 片段后，添加与剩下反应液等量的TE[10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA]饱和酚/氯仿(lvol/lvol)溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃ 下放置30分钟。将该溶液离心分离使DNA沉淀后，将该DNA溶解于20μL的TE。

使用各个该溶解液各5μL，将用引物A和引物B扩增的DNA用限制酶XhoI和BamHI进行酶切，而使用引物C和引物D扩增的DNA用限制酶EcoRI和XhoI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用genecleanII试剂盒(GENECLEANIIkit、BIO101社制)，分别回收含有ywfE的1.4kb和含有trp启动子区域的0.3kb的DNA片段。

将含有trp启动子的表达载体pTrS30[由大肠杆菌JM09/pTrS30(FERM BP-5407)制备]0.2μg用限制酶EcoRI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，通过与上述同样的方法，回收4.5kb的DNA片段。

使用连接试剂盒(Takara Bio公司生产)，使上述得到的含有ywfE的1.4kb片段、含有trp启动子区域的0.3kb片段和4.5kb的片段于16℃下反应16小时，进行连接。

通过使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]用该反应液转化大肠杆菌NM522株(Stratagene公司生产)后涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过使用限制酶解析其构造，确认取得了在trp启动子下游连接了ywfE的表达载体pPE43(图1)。

实验例3 二肽的生产

将实验例2得到的带有pPE43的大肠杆菌NM522(大肠杆菌NM522/pPE 43株)接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8ml LB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。对该培养液进行离心分离、取得湿茵体。

制备由终浓度60mg/ml的该湿茵体、120mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH7.4)、60mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP、30mmol/L的L-Ala、30mmol/L的L-Gln.0.4％的NymeenS-215构成的0.1ml反应液，于37℃下反应3分钟。

反应结束后，将反应生成物用二硝基酚法进行衍生化后通过HPLC法进行分析。用HPLC法进行分析，分离柱使用关东化学社制的Lichrosorb-RP-18柱，洗脱液使用1％(v/v)磷酸、25％(v/v)乙腈，以0.7ml/分钟的流速进行。其结果确认反应液中生成蓄积120mg/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)。

在作为对照菌株只含有载体的大肠杆菌NM522/pTrS30株的茵体中没有能确认到L-Ala-L-Gln的生成。

实验例4 C末端附加His-tag型重组型二肽合成酶的纯化

使用上述DNA合成仪，合成具有序列号33和34表示的碱基序列的DNA(以下，分别称为引物E、引物F)。引物E是含有将^ywfE的起始密码子(atg)置换为NcoI识别序列(ccatgg)的区域的碱基序列。引物F是含有将ywfE的终止密码子置换为BamH I识别序列(ggatcc)的区域的碱基序列。

以枯草芽孢杆菌168株(ATCC23857)的染色体DNA作为模板，使用上述引物E和引物F作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Pfu DNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一次循环，反复进行30次来实施。

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增了相当于ywfE基因片段的约1.4kb后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。

使用各个该溶解液各5μL，将扩增的DNA用限制酶NcoI和BamHI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用genecleanII试剂盒回收含有ywfE的1.4kb的DNA片段。

将C末端附加His-tag型重组体表达载体pQE60(Qiagen公司生产)0.2g用限制酶NcoI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用与上述同样的方法回收3.4kb的DNA片段。

使用连接试剂盒，使上述得到的含有ywfE的1.4kb的DNA片段和3.4kb的DNA片段于16℃下反应16小时，进行连接。

通过使用钙离子的方法用该连接反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。

通过众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，使用限制酶对其构造进行解析，确认取得了作为C末端附加His-tag型ywfE表达载体的pQE60ywfE(图2)。

将带有pQE60ywfE的大肠杆菌NM522(大肠杆菌NM522/pQE60ywfE株)接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8mlLB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的50mlLB培养基的250ml容量三角烧瓶，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加异丙醇-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再于30℃下培养4小时。对该培养液进行离心分离取得湿茵体，使用HisTrap(附加His-tag蛋白质纯化试剂盒、Amersham Pharmasia Biotech社制)，根据说明书从该湿茵体纯化附加His-tag重组型酶。

实验例5 使用附加His-tag重组型酶进行二肽的生产(1)

(i)制备由实验例4中取得的纯化的附加His-tag重组型酶0.04mg、100mmo l/L的Tris-HCl(pH8.0)、60mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP、3Dmmol/L的L-Ala、30mmol/L的L-Gln构成的0.1ml的反应液，于37℃进行16小时反应。

反应结束后，通过与上述实验例3同样的方法分析反应生成物，确认反应液中生成蓄积3.7g/L的L-Ala-L-Gln和0.3g/L的L-丙氨酰-L-丙氨酸(L-Ala-L-Ala)。

(ii)除了酶为0.01mg、用L-Phe、L-Met、L-Leu或L-Val取代L-Gln以外，制备与上述(i)的反应液组成相同的反应液，于上述(i)的反应条件下进行反应。

反应结束后，通过与上述实验例3同样的方法对反应生成物进行分析，确认反应液中分别生成蓄积：只有7.0g/L的L-丙氨酰-L-苯丙氨酸(L-Ala-L-Phe)、7.0g/L的L-丙氨酰-L-蛋氨酸(L-Ala-L-Met)和0.03g/L的L-Ala-L-Ala、5.0g/L的L-丙氨酰-L-亮氨酸(L-Ala-L-Leu)和0.2g/L的L-Ala-L-Ala、或1.6g/L的L-丙氨酰-L-缬氨酸(L-Ala-L-Val)和0.3g/L的L-Ala-L-Ala。

(iii)除了酶为0.01mg、用Gly取代L-Ala、用L-Phe或L-Met取代L-Gln以外，制备与上述(i)的反应液的组成相同的反应液，在上述(i)的反应条件使其反应。

反应结束后，通过与上述实验例3同样的方法对反应生成物进行分析，确认反应液中分别生成蓄积5.2g/L的甘氨酰-L-苯丙氨酸(Gly-L-Phe)或1.1g/L的甘氨酰-L-蛋氨酸(Gly-L-Met)。

如果从上述反应液组成中去除ATP，完全不能生成二肽。

以上结果表明ywfE基因产物在ATP存在下具有生成由L-Ala和L-Gln、L-Phe、L-Met、L-Leu或L-Val生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala、L-Ala-L-Phe、L-Ala-L-Met 和L-Ala-L-Ala、L-Ala-L-Leu和L-Ala-L-Ala、或L-Ala-L-Val和L-Ala-L-Ala的活性，由Gly和L-Phe或L-Met生成Gly-L-Phe或Gly-L-Met的活性。

实验例6 使用附加His-tag重组型酶的二肽的生产(2)

制备由实验例4中得到的纯化的附加His-tag重组型酶0.04mg、100mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、60mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP构成的0.1ml反应液，按照分别达到30mmol/L那样向反应液中添加由表1的第1行和最左列的氨基酸的组合构成的各种L-氨基酸、Gly或β-Ala，于37℃下进行16小时反应。反应结束后，对反应生成物进行HPLC分析，确认生成表1所示的二肽。

【表1-1】

[表1-2】

【表1-3】

将以表1的第1行和最左列所述的2种(或1种)L-氨基酸、Gly或β-Ala作为底物反应时生成的二肽记在表格内。○表示生成了二肽，但序列未确定，×表示不能确认二肽的生成，而空栏表示未实施。

实验例7 使用附加His-tag重组型酶表达株的二肽的生产

将实验例4得到的大肠杆菌NM522/pQE60ywfE株接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8mlLB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的50mlLB培养基的250ml容量三角烧瓶，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加IPTG，再于30℃下培养4小时。对该培养液进行离心分离取得湿菌体。

将由200g/L的湿茵体、50g/L的葡萄糖、5g/L的肌醇六磷酸(使用33％的浓氢氧化钠溶液稀释成中性)、15g/L的磷酸二氢钾、5g/L的硫酸镁·7水合物、4g/L的NymeenS-215、10ml/L的二甲苯、200mmol/L的L-Ala、200mmol/L的L-Gln构成的20ml反应液(pH7.2)加入到50ml容量的烧杯、于32℃、900rpm的条件下进行2小时反应。反应中使用2mol/L的氢氧化钾将反应液的pH保持在7.2。

将反应生成物用与实验例3所述方法同样的方法进行分析，确认25mg/L的L-Ala-L-Gln蓄积。

实验例8 相当于来自属于杆菌属的各种微生物的ywfE基因的基因的克隆和该基因的解析

根据序列号9表示的碱基序列，象以下那样操作取得相当于存在于枯草芽孢杆菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、解淀粉芽孢杆菌IFO3022和短小芽孢杆菌NRRL B-12025的ywfE基因的基因。

首先，将枯草芽孢杆菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、解淀粉芽孢杆菌IFO3022和短小芽孢杆菌NRRL B-12025分别接种于LB培养基，于30℃下静置培养过夜。培养后，通过使用Current Protocols in MolecularBiology所述的饱和酚方法，对于各个微生物的染色体DNA分别进行分离纯化。

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号25和26表示的碱基序列的DNA(以下，分别称为引物G、引物H)。引物G是含有从枯草芽孢杆菌168株的染色体DNA的ywfE的起始密码子开始的上游区域的序列。引物H是与含有从ywfE的终止密码子开始的下游序列互补的序列。

以枯草芽孢杆菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555或解淀粉芽孢杆茵IFO3022的染色体DNA作为模板，使用上述引物G和引物H作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一次循环，反复进行30次来实施。

使用连接试剂盒，将上述得到的来自各菌株染色体DNA的1.4kb片段和pCR-blunt(Invitrogen公司生产)于16℃下反应16小时，进行连接。

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌NM522株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。

通过根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体菌落提取质粒，用限制酶对各个构造进行解析，确认取得含有相当于ywfE基因的基因的

质粒pYWFE1(来自ATCC15245株，具有序列号46表示的碱基序列的

DNA)、pYWFE2(来自ATCC6633株，具有序列号15表示的碱基序列的

DNA)、pYWFE3(来自IAM1213株，具有序列号16表示的碱基序列的

DNA)、pYWFE4(来自IAM1107株，具有序列号17表示的碱基序列的

DNA)、pYWFE5(来自IAM1214株，具有序列号18表示的碱基序列的

DNA)、pYWFE6(来自ATCC9466株，具有序列号14表示的碱基序列的

DNA)、pYWFE7(来自IAM1033株，具有序列号46表示的碱基序列的

DNA)、pYWFE8(来自ATCC21555株，具有序列号19表示的碱基序列的

DNA)、pYWFE9(来自IFO3022株，具有序列号20表示的碱基序列的

DNA)。

另外相当于来自短小芽孢杆菌NRRL B-12025的ywfE的基因(具有序列号21表示的碱基序列的DNA)象以下那样取得。

以上述制备的NRRL B-12025株的染色体DNA作为模板，使用序列号37和38表示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的Z-taq聚合酶(Takara Bio公司生产)、5μL的Z-taq聚合酶用×10缓冲液(Takara Bio公司生产)、200μmol/L的各dNTP的反应液50μL，按照98℃下5秒钟、55℃下30秒钟、72℃下1分钟为一次循环，反复进行30次来实施。

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认约0.8kb的片段扩增后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。

使用连接试剂盒将上述得到的0.8kb片段和pGEM T-easy(Promega公司生产)于16℃下反应16小时，进行连接。

通过使用钙离子的方法用该反应液转化大肠杆菌DH5α株后，涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。

从上述得到的转化体提取质粒，决定约0.8kb的插DNA片段的碱基序列，确认由序列号21表示的碱基序列中的第358～1160位碱基构成的碱基序列。

然后将该质粒用EcoRI进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离。使用genecleanII试剂盒纯化该DNA片段。使用DIG-HighPrime DNA Labeling&Detection Starter KitI(Roche Diagnostics公司生产)对约0.5μg该纯化DNA片段进行DIG标记。DIG标记根据该试剂盒附带的说明书进行。

使用上述得到的DIG标记的DNA，进行NRRLB-12025株的染色体DNA的Southern解析。

将NRRL B-12025株的染色体DNA分别使用BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、SalI和SphI完全消化，通过琼脂糖电泳将DNA片段分离后，根据常规方法转移到nylon membrane pluscharge(Roche Diagnostics公司生产)。

通过照射UV，将DNA片段固定在该尼龙膜后，使用上述探针DNA和该尼龙膜进行Southern杂交。

杂交通过使该探针DNA和该尼龙膜在65℃下接触16小时，然后使用0.1％SDS和2×SSC构成的溶液将该尼龙膜于室温下清洗5分钟，清洗2次，再用0.1％SDS和0.5×SSC构成的溶液，于65℃下15分钟、清洗2次进行，其它操作、条件和杂交的DNA的检测根据上述的DIG-High Prime DNA Labeling&Detection Starter KitI附带的说明书进行。

该结果表明在HindIII和PstI完全消化片段的3.5kbp附近看到发色。

然后，将NRRLB-12025株的染色体DNA使用HindIII和PstI分别完全消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。使用genecleanII试剂盒从来自各个限制酶消化DNA中纯化3-4kbp的片段，使用连接试剂盒使其自环化。

根据上述决定的0.8kb的DNA片段的碱基序列，设计、合成序列号39和340表示的碱基序列，以上述取得的环化DNA作为模板进行PCR。PCR通过制备含有10ng的环化DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的pyrobest聚合酶(Takara Bio公司生产)、5μL的pyrobest聚合酶用×10缓冲液(Takara Bio公司生产)、200μmol/L的各dNTP的反应液50μL，按照98℃下5秒钟、55℃下30秒钟、72℃下3分30秒钟为一次循环，反复进行30次来实施。

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认约3.0kb片段扩增后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。

使用连接试剂盒对上述得到的DNA片段和Zero Blunt PCRCloning Kit(Invitrogen公司生产)进行连接。

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体菌落提取质粒，通过使用限制酶对其构造进行解析，确认得到了含有相当于ywfE基因的基因的质粒pYWFE10(来自NRRL B-12025株、具有序列号21表示的碱基序列的DNA)。

使用碱基序列分析装置373A·DNA序列仪决定上述得到的分别相当于pYWFE1～pYWFE10含有的ywfE基因各基因的碱基序列。

虽然由pYWFE1、pYWFE6和pYWFE7含有的基因编码的蛋白质的氨基酸序列与ywfE基因编码的蛋白质的氨基酸序列相同，但由pYWFE2、pYWFE3、pYWFE4、pYWFE5、pYWFE8、pYWFE9和pYWFE10含有的基因编码的蛋白质的氨基酸序列与ywfE基因编码的蛋白质的氨基酸序列不同。

由相当于pYWFE2、pYWFE3、pYWFE4、pYWFE5、pYWFE8、pYWFE9、pYWFE10以及pYWFE1和pYWFE7中含有的ywfE基因的基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号2～8以及1所示，而该基因的碱基序列分别如序列号14～21和46所示。

实验例9C末端附加His-tag型重组型二肽合成酶的纯化

以枯草芽孢杆菌ATCC15245、ATCC6633、IAM1213、IAM1107、IAM1214、ATCC9466、IAM1033、ATCC21555、或解淀粉芽孢杆菌IFO3022的染色体DNA为模板，使用实验例2所述的引物A和引物B作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的反应液40μL，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一次循环，反复进行30次来实施。

以短小芽孢杆菌NRRL B-12025的染色体DNA作为模板时，使用具有序列号41和42表示的碱基序列的DNA作为引物组，在与上述同样条件下进行PCR。

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认相当于ywfE基因片段的约1.4kb分别扩增后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。

使用各个该溶解液5μL，将扩增的DNA用限制酶NcoI和BamHI酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，使用genecleanII试剂盒，回收含有相当于ywfE基因的基因的1.4kb DNA片段。

然后将C末端附加His-tag型重组体表达载体pQE600.2μg用限制酶NcoI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，通过与上述同样的方法回收3.4kb的DNA片段。

使用连接试剂盒使上述得到的含有相当于枯草芽孢杆菌168株的ywfE基因的基因的1.4kb DNA片段和3.4kb的DNA片段于16℃下反应16小时进行连接。

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体菌落提取质粒，通过使用限制酶对它们的构造进行解析，确认取得了作为C末端附加His-tag型基因表达载体的pQE60ywfE1(含有来自ATCC15245的基因的载体)、pQE60ywfE2(含有来自ATCC6633的基因的载体)、pQE60ywfE3(含有来自IAM1213的基因的载体)、pQE60ywfE4(含有来自IAM1107的基因的载体)、pQE60ywfE5(含有来自IAM1214的基因的载体)、pQE60ywfE6(含有来自ATCC9466的基因的载体)、pQE60ywfE7(含有来自IAM1033的基因的载体)、pQE60ywfE8(含有来自ATCC21555的基因的载体)、pQE60ywfE9(含有来自IFO3022的基因的载体)、和pQE60ywfE10(含有来自NRRLB-12025的基因的载体)。

将上述得到的大肠杆菌NM522/pQE60ywfE1-NM522/pQE60ywfE10株分别接种在加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8mlLB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的50ml的LB培养基的250ml容量的三角烧瓶，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加IPTG，再于30℃下培养4小时。使用HisTrap，根据其使用说明书，从对该培养液进行离心分离得到的湿菌体纯化附加His-tag重组型酶。

实验例10 使用纯化酶生产二肽

制备由实验例9得到的重组型酶0.04mg、100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、60mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP、30mmol/L的L-Ala和30mmol/L的L-Gln构成的0.1ml的反应液，于37℃下进行16小时反应。

反应结束后，通过实验例3所述的方法对反应液进行分析，结果确认3.0～3.5g/L的L-Ala-L-Gln和0.25～0.3g/L的L-Ala-L-Ala生成蓄积。

而如果从上述反应液组成除去ATP，完全不能生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala。

以上结果表明实验例8得到的基因产物无论那一个都具有在ATP存在下由L-Ala和L-Gln生成L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala的活性。

实验例11albC基因和其类似基因的取得

根据诺尔斯氏链霉菌的albC基因的碱基序列[Chemistry&Biol.，9，1355(2002)]，通过以下方法从诺尔斯氏链霉菌和小白链霉菌取得albC基因和其类似基因。

首先将诺尔斯氏链霉菌IFO15452株和小白链霉菌IFO14147株分别接种于添加了1％甘氨酸的KM73培养基[2g/1酵母提取液(Difco公司生产)、10g/l可溶性淀粉(和光纯药工业社制)]、KP培养基[15g/l葡萄糖、10g/1甘油、10g/l多胨(日本制药株式会社制)、10g/l肉浸渍液(极东制药工业株式会社生产)、4g/l碳酸钙]，于28℃下振荡培养过夜。而诺尔斯氏链霉菌IFO15452株和小白链霉菌IFO14147株由独立行政法人制品评价技术基盘机构生物资源部门[NationalInstitute of Technology and Evalution(NITE)BiologicalResource Center(BRC)](292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)慧赠。

培养后，根据Genetic Manipulation of Streptomyces：aLaboratory Manual：John Innes Foundation所述的方法对该微生物的染色体DNA进行分离纯化。

根据albC基因的碱基序列，使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成具有序列号51和52表示的碱基序列的DNA(以下，分别称为引物J、引物K)。引物J是附加在含有诺尔斯氏链霉菌的染色体DNA的albC基因起始密码子的区域5＇端的含有NcoI识别序列的碱基序列。引物K是附加在与含有albC基因的终止密码子的序列互补的碱基序列的5＇端的含有BglII识别序列的碱基序列。

使用上述的引物J和引物K作为引物组，作为模板使用诺尔斯氏链霉菌或小白链霉菌的染色体DNA进行PCR。PCR通过制备含有作为模板的0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的ExTaqDNA聚合酶(Takara Bio公司生产)、5μL的ExTaqDNA聚合酶用×10缓冲液(Takara Bio公司生产)、各200μmol/L的dNTP、5μL的二甲基亚砜的反应液50μL，按照94℃下1分钟、55℃下30秒钟、72℃下1分钟为一次循环，反复进行30次来实施。

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认约0.7kb的DNA片段扩增后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加 2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离得到的DNA沉淀溶解于20μL的TE。

使用各个该溶解液各5μL，将扩增的DNA用限制酶NcoI和BglII进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用genecleanII试剂盒分别回收700bp的DNA片段。

将0.2g含有噬菌体T5启动子的表达载体pQE60用限制酶NcoI和BglII酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用与上述同样的方法回收3.4kb的DNA片段。

使用连接试剂盒，使含有上述得到的来自各放线茵的0.7kb片段和来自pQE60的3.4kb片段于16℃下反应16小时，进行连接。

通过众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，使用限制酶对其构造进行解析，确认取得了作为在噬茵体T5启动子下游连接了来自诺尔斯氏链霉菌的DNA的表达载体pAL-nou、和连接了来自小白链霉菌的DNA的表达载体pAL-alb(图3)。

当使用碱基序列决定装置373A·DNA序列仪决定插入到各个质粒的来自放线茵的DNA部分的碱基序列时，确认pAL-alb中含有编码具有序列号47表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA、即含有序列号49表示的碱基序列的DNA，在pAL-nou含有编码具有序列号48表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA、即具有序列号50表示的碱基序列的DNA

实验例12 使用菌体作为酶源的二肽的制造

将实验例11得到的带有pAL-nou或pAL-alb的大肠杆菌NM522(大肠杆菌NM522/pAL-nou株或NM522/pAL-alb株)和不带有质粒的NM522株接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的10mlLB培养基的试管(对于不带有质粒的株的情况不添加氨苄青霉素，以下同样)，于30℃下培养17小时。将该培养液0.5ml分别接种于加入了50ml的LB培养基的250ml容量的三角烧瓶，于30℃下振荡培养1小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加IPTG，再继续培养4小时。对该培养液进行离心分离，取得湿茵体。

制备由终浓度100mg/ml的该湿茵体、60mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH7.2)、10mmol/L的氯化镁、10mmol/L的ATP、1g/L的L-Leu、1g/L的L-Phe构成的3.0ml反应液，于30℃下进行反应。反应1小时后取样，按照浓度达到20％(v/v)那样加乙腈后，使用HPLC分析反应生成物。通过HPLC进行分析，分离柱使用ODS-HA柱(YMC社制)、作为洗脱液使用30％(v/v)乙腈，以流速0.6ml/min、测定215nm的紫外吸收的条件进行。

分析结果确认在大肠杆菌NM522/pAL-nou株的反应液中有36.7mg/l的环(L-亮氨酰-L-苯丙氨酸)[cyclo(L-Leu-L-Phe)]的蓄积，但在大肠杆菌NM522株的反应液中完全没有检测到cyclo(L-Leu-L-Phe)。将同样反应液在以下的条件下用HPLC进行分析，测定到作为直链二肽(以下，“直链二肽”简称为“二肽”)的L-亮氨酰-L-苯丙氨酸(L-Leu-L-Phe)和L-苯丙氨酰-L-亮氨酸(L-Phe-L-Leu)。

两二肽用F-moc化法进行衍生化后，使用HPLC进行分析。通过HPLC进行分析，分离柱使用ODS-HG5(野村化学社制)、作为洗脱液使用A液(醋酸6ml/l、20％(v/v)乙腈、用三乙胺调整到pH4.8)和B液(醋酸6ml/1、70％(v/v)乙腈、用三乙胺调整到pH4.8)，按照分析开始后头5分钟洗脱，按照A液∶B液＝8∶2进行，5分钟～20分钟之前进行线性梯度洗脱，在20分钟时A液∶B液＝1∶1，流速0.6ml/分钟、激发波长254nm、荧光波长630nm检测二肽的条件下进行。

结果确认在大肠杆菌NM522/pAL-nou株的反应液中有21.9mg/L的L-Leu-L-Phe和12.0mg/L的L-Phe-L-Leu蓄积。而在作为对照株使用的大肠杆菌NM522株的反应液中没有检测到任何二肽。

这表明实验例11中取得的环二肽合成酶具有合成直链二肽的能力。

实验例13 使用纯化酶制造二肽(1)

与实验例12同样培养大肠杆菌NM522/pAL-nou株。培养结束后通过离心分离取得湿茵体，用60mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH7.2)清洗后，悬浮于含有10mmol/L咪唑的20mmol/L磷酸钾缓冲液。将该悬浮液于4℃下进行超声波处理，取得菌体裂解液。将该茵体裂解液(10ml、含蛋白质0.863mg)加到Amersham公司生产的His-tag纯化柱，通过加含有10mmol/L的咪唑的20mmol/L的磷酸钾缓冲液15ml进行清洗，于柱内对附带His-tag的albC蛋白质进行纯化。然后向保持这个附带His-tag的albC蛋白质的柱加与实验例12同组成的反应液(反应液组成：60mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH7.2)、10mmol/L的氯化镁、10mmol/L的ATP、1g/L的L-Leu、1g/L的L-Phe构成的反应液)2ml，在柱内保持底物的状态下，于30℃进行温育。24小时后用同组成的反应液3ml对柱内的反应液进行洗脱，通过与实验例12同样的方法对反应液中的环二肽和二肽进行定量。

从结果可知生成了cyclo(L-Leu-L-Phe)6.8mg/L、L-Leu-L-Phe28.7mg/L和L-Phe-L-Leu 18.5mg/L。在用不含有ATP的反应液进行同样温育时，环二肽、肽都没有检测到。

实验例14 使用纯化酶制造二肽(2)

除了将底物氨基酸换成其它的氨基酸以外，用与实验例13同样的方法进行酶反应，对生成物进行分析。反应液除了将底物氨基酸换成为1g/L的L-Ala、L-Leu或L-Phe以外，使用与实验例13同样组成的溶液。

从该结果可知在反应开始后24小时内，分别生成了9.41mg/L的L-Ala-L-Ala、7.85mg/L的L-Leu-L-Leu、或5.20mg/L 的L-Phe-L-Phe。

实验例15 强化ywfE基因表达的大肠杆菌的制作

使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成分别具有序列号94～97表示的序列的DNA(以下，分别称为引物L、引物M、引物N、引物0)。序列号94是附加在含有作为质粒pQE60ywfE的vwfE基因的核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列区域5’端的含有XhoI识别序列的序列。序列号95的序列是附加在与含有ywfE基因的终止密码子的序列互补的序列的5’端的含有BamHI识别序列的序列。而序列号96是附加在含有trp启动子的表达载体pTrS30的trp启动子区域序列的5’端的含有EcoRI识别序列的序列。序列号97是附加在与含有trp启动子的表达载体pTrS30的trp启动子区域的序列互补的序列号5’端的含有XhoI识别序列的序列。

以质粒pQE60ywfE作为模板，在ywfE基因片段的扩增中，使用上述的引物L和引物M，在trp启动子区域的片段的扩增中使用引物N和引物0作为引物组进行PCR。PCR通过制备含有10ng的pQE60ywfE、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各dNTP的40μL的反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一次循环，反复进行30次来实施。

将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认在使用引物L和引物M的PCR中相当于ywfE基因片段的约1.4kb、在使用引物N和引物0的反应中相当于trp启动子区域的DNA片段的约0.3kb DNA片段分别扩增后，添加与剩下反应液等量的TE饱和酚/氯仿溶液，并混合。向该溶液经离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离使DNA沉淀后，将该DNA溶解于20μL的TE。

使用上述得到的各个DNA溶液5μL，将用引物L和引物M扩增的DNA用限制酶XhoI和BamHI进行酶切，而使用引物N和引物0扩增的DNA用限制酶EcoRI和XhoI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，使用genecleanII试剂盒，分别回收含有ywfE的1.4kb和含有trp启动子区域的0.3kb的DNA片段。

将含有0.2μg的trp启动子的表达载体pTrS30用限制酶EcoRI和BamHI酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样回收4.5kb的DNA片段。

使用连接试剂盒，使上述得到的含有ywfE的1.4kb片段、含有trp启动子区域的0.3kb片段和4.5 kb的片段于16℃下进行16小时连接反应。

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，得到在trp启动子下游含有ywfE基因的表达载体pPE56。通过限制酶消化确认了该载体的构造(图4)。

实验例16pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操纵子缺失株的制作

大肠杆菌染色体DNA上的特定基因缺失的菌株根据利用λ噬茵体的同源重组系的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6641-6645(2000)]进行制作。

以下所述的质粒pKD46、pKD3和pCP20使用通过从大肠杆菌基因贮存中心(美国耶鲁大学)获得保持该质粒的大肠杆菌株，通过众所周知的方法从该株提取的。

(1)基因缺失用DNA片段的克隆

以使存在于大肠杆菌K12株的染色体DNA上的具有序列号65表示的碱基序列的pepD基因、具有序列号66表示的碱基序列的pepN基因、具有序列号67表示的碱基序列的pepB基因、具有序列号68表示的碱基序列的pepA基因和具有序列号69表示的碱基序列的dppA基因、具有序列号70表示的碱基序列的dppB、具有序列号71表示的碱基序列的dppC基因、具有序列号72表示的碱基序列的dppD基因和具有序列号73表示的碱基序列的dppF基因缺失为目的，使用PerSeptive Biosystems公司制造8905型DNA合成仪，合成与位于大肠杆菌K12株的染色体DNA上的各个缺失靶基因的上游和下游的由36bp构成的碱基序列同源的碱基序列、和具有序列号64表示的来自酵母的Flp重组酶识别的碱基序列的DNA。但是dppA基因、dppB基因、dppC基因、dppD基因和dppF基因因为形成操纵子，合成与位于该操纵子的上游和下游的碱基序列同源的碱基序列的DNA。

即，分别合成由作为pepD基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号74和75、作为pepN基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号76和77、作为pepA基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号78和79、作为pepB基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号80和81、作为dpp操纵子缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号82和83表示的碱基序列构成的DNA。

然后使用上述合成DNA作为引物组，pKD 3DNA作为模板进行PCR。PCR通过使用含有l0ng的质粒DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一次循环，反复进行30次来实施。

将各个反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并进行混合。

将该混合液离心分离后，向得到的上层加 2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。对该溶液进行离心分离，取得含有pepD基因、DeDN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操纵子缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段。

(2)pepD基因缺失大肠杆菌JM101的制作

用pKD46转化大肠杆菌JM101株后，涂布于含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，通过于30℃下进行培养，选择带有pKD46的大肠杆菌JM101株(以下，称为大肠杆菌JM101/pKD46)。

质粒pKD46含有λRed重组酶基因，该基因的表达可以通过L-阿拉伯糖诱导。因此如果将在L-阿拉伯糖存在下能够生长繁殖的带有pKD46的大肠杆菌用直链状DNA进行转化，会高频率地发生同源重组。另外pKD46由于具有温度敏感性的复制起点，通过在42℃下使其生长繁殖，可以很容易地使质粒脱落。

通过电脉冲法将上述取得的含有pepD基因缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段导入在10mmol/L的L-阿拉伯糖和50μg/ml的氨苄青霉素存在下培养得到的大肠杆菌JM101/pKD46，将通过同源重组在大肠杆菌JM101的染色体DNA中转运了pepD基因缺失用含有氯霉素抗性基因的DNA片段的转化株涂布于含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基(细菌培养用胰化蛋白胨10g/L、细菌培养用酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L)，通过于30℃下培养进行选择。

将选择的氯霉素抗性株接种于含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基，于42℃下培养14小时后，进行单茵落分离。将得到的各茵落影印在含有25mg/L的氯霉素的LB琼脂培养基、以及含有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于37℃培养，通过选择表现出氯霉素抗性，而且表现出氨苄青霉素敏感性的菌落，取得pKD46脱落株。

然后使用pCP20转化上述得到的pKD46脱落株，通过在含有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行选择，取得保持pCP20的pKD46脱落株。

质粒pCP20具有来自酵母的Flp重组酶基因，该基因的表达可以在42℃下进行诱导。

另外由于在上述制作的含有pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操纵子缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段的氯霉素抗性基因的两端存在Flp重组酶识别的碱基序列，通过Flp重组酶催化的同源重组可以很容易地使该抗性基因脱落。

另外由于pCP20含有温度敏感性的复制起点，通过使pCP20保持株在42℃下生长繁殖，可以同时诱导Flp重组酶的表达和pCP20的脱落。

将上述取得的带有pCP20的pKD46脱落株接种于没有添加药物的LB琼脂培养基，于42℃下培养14小时后，进行单茵落分离。将得到的各茵落影印在没有添加药物的LB琼脂培养基、含有25mg/L氯霉素的LB琼脂培养基和含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养，选择表现出氯霉素敏感性，而且表现出氨苄青霉素敏感性的菌落。

根据常规方法(生物工学实验书、日本生物工学会编97～98页、培风馆、1992年)从上述选择的各株制备各个染色体DNA。使用根据缺失靶基因pepD基因的内部碱基序列设计的具有序列号84和85表示的碱基序列的DNA作为引物组，以染色体DNA作为模板进行PCR。PCR通过使用含有0.1g的染色体DNA、0.5μmol/L的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μL的Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L的各deoxyNTP的40μL反应液，按照94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一次循环，反复进行30次来实施。

在上述PCR中，将没有检测到扩增DNA片段的株作为pepD基因缺失株，命名为大肠杆菌JPD1株。

(3)大肠杆菌JM101的染色体DNA上的pepD基因和pepN基因缺失株的制作

将上述(2)得到的大肠杆菌JPD1株用pKD46转化后，涂布于含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基，通过于30℃下进行培养，选择保持pKD46的大肠杆菌JPD1(以下，称为大肠杆菌JPD1/pKD46)。通过电脉冲法将含有pepN基因缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段导入大肠杆菌JPD1/pKD46，通过同源重组取得在大肠杆菌JPD1/pKD46的染色体DNA上转运了含有pepN基因缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段的转化株。

然后通过进行与上述(2)同样的操作，取得从染色体DNA上氯霉素抗性基因脱落的株，将该株命名为大肠杆菌JPDN2。

(4)大肠杆菌JM101的染色体DNA上的pepN基因、pepA基因、pepB基因或dpp操纵子缺失株和多重基因缺失株的制作

pepN基因、peppA基因、pepB基因或dpp操纵子的缺失株使用上述(1)制作的含有各基因或操纵子缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段，通过与上述(2)同样的方法进行制作。

通过上述方法取得的各个基因缺失株可以通过使用根据各个缺失基因的内部碱基序列设计、合成的具有序列号86～93表示的碱基序列的DNA作为引物组，通过与上述(2)同样的PCR确认。其中由序列号86和87表示的碱基序列构成的DNA为pepN缺失确认用、由序列号88和89表示的碱基序列构成的DNA为pepA缺失确认用、由序列号90和91表示的碱基序列构成的DNA为pepB缺失确认用、由序列号92和93表示的碱基序列构成的DNA为dpp操纵子缺失确认用引物组。

将上述方法取得的dpp操纵子缺失株取名为大肠杆菌JDPP1株、pepN基因缺失株取名为大肠杆菌JPN1株、pepA基因缺失株取名为大肠杆菌JPA1株、pepB基因缺失株取名为大肠杆菌JPB7株。

另外根据上述(3)的方法，制作由pepD基因、pepN基因、pepA基因、pepB基因和dpp操纵子中选择的2个以上基因或操纵子的多重缺失株。多重缺失株能够取得的确认通过与上述(2)同样的PCR确认。将用上述方法取得的pepD基因和dpp操纵子缺失的二重基因缺失株命名为大肠杆菌JPDP49株，将pepB基因、pepD基因和pepN基因缺失的三重基因缺失株命名为大肠杆菌JPDNB43株，将pepD基因、DepN基因和dpp操纵子缺失的三重基因缺失株命名为大肠杆菌JPNDDP36株，将pepA基因、pepD基因、pepN基因和dpp操纵子缺失的四重基因缺失株命名为大肠杆菌JPNDAP5株，将pepB基因、pepD基因、pepN基因和dpp操纵子缺失的四重基因缺失株命名为大肠杆菌JPNDBP7株。

表2给出了各基因缺失株中缺失基因名。

【表2】

菌株名	缺失基因
		JM101	无
JDPP1	dpp操纵子
		JPN1	pepN
JPA1	pepA
		JPB7	pepB
JPD1	PepD
		JPDN2	pepD，pepN

JPNDB43	PepB，pepD，pepN
		JPDP49	pepD，dpp操纵子
JPNDDP36	pepD，pepN，dpp操纵子
		JPNDAP5	pepA，pepD，pepN，dpp操纵子
JPNDBP7	pepB，pepD，pepN，dpp操纵子

实验例17 使用肽酶和二肽转运活性丧失的大肠杆菌的L-Ala-L-Gln和L-Ala-L-Ala产率的评价

用实验例15制作的质粒pPE56转化实验例16得到的编码各种肽酶和二肽转运蛋白质的基因的缺失株，取得表现出氨苄青霉素抗性的转化株。

将得到的转化株接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8mlLB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将1％该培养液添加到加入了含有100μg/ml的氨苄青霉素的8ml水性介质(磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸铵5g/L、柠檬酸(无水)1g/L、Casamino acid(Difco社制)0.5g/L、L-Pro1g/L、L-Ala2.5g/L、L-Gln 2.5g/L、葡萄糖10g/l、维生素B₁10mg/L、硫酸镁·7水合物25mg/l、硫酸铁7水合物50mg/l、使用10mol/l的氢氧化钠溶液调整到pH7.2。L-Gln为10倍浓缩液经滤膜过滤灭菌后添加、葡萄糖、维生素B₁、硫酸镁·7水合物、硫酸铁·7水合物分别蒸气灭菌后添加)的试管中，于30℃下反应24小时。将该水性介质进行离心分离，取得上清。

该上清中的产物用F-moc化法进行衍生化后，使用HPLC进行分析。通过HPLC进行分析，分离柱使用ODS-HG5(野村化学社制)、作为洗脱液使用A液(醋酸6ml/l、20％(v/v)乙腈、用三乙胺调整到pH4.8)和B液(醋酸6ml/l、70％(v/v)乙腈、用三乙胺调整到pH4.8)，在分析开始后头5分钟，A液∶B液＝8∶2，在5分～20分钟进行线性梯度洗脱，当20分钟时，使A液∶B液＝1∶1的条件下进行。分析结果如表3所示。

【表3】

菌株名	缺失基因	AlaGln(g/l)	AlaAla(g/l)
				JM101	无	0	0
JDPP1	dpp操纵子	0.02	0.01
				JPN1	pepN	0.01	0.01
JPA1	pepA	0.01	0.01
				JPB7	pepB	0.01	0.01

JPD1	pepD	0.01	0.011
				JPDN2	pepD，pepN	0.02	0.03
JPNDB43	pepB，pepD，pepN	0.05	0.12
				JPDP49	PepD，dpp操纵子	0.11	0.08
JPNDDP36	pepD，pepN，dpp操纵子	0.16	0.21
				JPNDAP5	pepA，pepD，pepN，dpp操纵子	0.28	0.26
JPNDBP7	pepB，pepD，pepN，dpp操纵子	0.43	0.22

由表3可知在2种以下肽酶基因缺失的微生物、仅1种肽转运蛋白质缺失的微生物中，二肽的生成、蓄积量低，而在1种以上肽酶基因和1种肽转运蛋白质缺失的微生物、或3种以上肽酶活性丧失的微生物中，二肽的生成、蓄积量大幅度增加。

实验例18使用肽酶和肽转运蛋白质活性丧失的大肠杆菌株的L-丙氨酰-L-缬氨酸(以下，称为L-Ala-L-Val)产率的评价

与实验例17同样，用pPE56转化编码各种肽酶的基因和编码肽转运蛋白质的操纵子缺失的大肠杆菌株。将得到的转化株接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8mlLB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％添加到加入了含100μg/ml氨苄青霉素的8ml水性介质(磷酸氢二钾16g/l、磷酸二氢钾14g/l、硫酸铵5g/l、柠檬酸(无水)1g/l、Casaminoacid(Difco社制)0.5g/l、L-Pro1g/l、L-Ala2.5g/l、L-Val2.5g/l、葡萄糖10g/l、维生素B₁10mg/l、硫酸镁·7水合物25mg/l、硫酸铁·7水合物50mg/l、用10mol/l的氢氧化钠溶液调整到pH7.2。葡萄糖、维生素B₁、硫酸镁·7水合物、硫酸铁·7水合物分别蒸煮后添加)的试管，于30℃下反应24小时。对该水性介质进行离心分离，取得上清。

通过实验例17所述的方法对该上清中的生成物进行分析。结果如表4所示。

【表4】

菌株名	缺失基因	AlaGln(g/l)
			JM101	无	0
JDPP1	dpp操纵子	0
			JPN1	pepN	0
JPA1	pepA	0
			JPB7	pepB	0

JPD1	pepD	0
			JPDN2	pepD，pepN	0
JPNDB43	pepB，pepD，pepN	0.04
			JPDP49	pepD，dpp操纵子	0.11
JPNDDP36	pepD，pepN，dpp操纵子	0.22
			JPNDBP7	pepB，pepD，pepN，dpp操纵子	0.20

由表4可知2种以下肽酶基因缺失的微生物和只1种肽转运蛋白质缺失的微生物不生产二肽，3种以上肽酶基因缺失的微生物、或1种以上肽酶基因和1种肽转运蛋白质缺失的微生物生产二肽。

实验例19使用肽酶和二肽转运系蛋白质的活性丧失的大肠杆菌株的甘氨酰-L-谷氨酰胺(以下，称为Gly-L-Gln)产率的评价

与实验例17同样，用pPE56转化编码各种肽酶的基因和编码二肽转运蛋白质的操纵子缺失株。将得到的转化株接种于加入了含有50μg/ml的氨苄青霉素的8mlLB培养基的试管，于28℃下培养17小时。将该培养液1％添加到加入了含100μg/ml氨苄青霉素的8ml水性介质(磷酸氢二钾16g/l、磷酸二氢钾14g/l、硫酸铵5g/l、柠檬酸(无水)1g/l、Casaminoacid(Difco社制)05g/L、L-Pro1g/L、Gly2.5g/L、L-Gln2.5g/L、葡萄糖10g/l、维生素B₁10mg/l、硫酸镁·7水合物25mg/l、硫酸铁·7水合物50mg/l、用10mol/l的氢氧化钠溶液调整到pH7.2。L-Gln为10倍浓缩液经滤膜过滤灭菌后添加、葡萄糖、维生素B₁、硫酸镁·7水合物、硫酸铁·7水合物分别经蒸气灭菌后添加)的试管，于30℃下反应24小时。对该水性介质进行离心分离，取得上清。

通过实验例17所述的方法对该该上清中的生成物进行分析。结果如表5所示。

【表5】

菌株名	缺失基因	AlaGln(g/l)
			JM101	无	0
JDPP1	dpp操纵子	0
			JPDN2	pepD，pepN	0
JPNDB43	pepB，pepD，pepN	0.01
			JPNDDP36	pepD，pepN，dpp操纵子	0.02
JPNDBP7	pepB，pepD，pepN，dpp操纵子	0.03

由表5可知2种以下肽酶基因缺失的微生物、和只1种肽转运蛋白质缺失的微生物不生产二肽，3种以上肽酶缺失的微生物、或2种以上肽酶基因和1种肽转运蛋白质缺失的微生物生产二肽。

实验例20 使用氨基酸和氨基酸衍生物作为底物的二肽或二肽衍生物的酶催化制造方法

制备由实验例4中取得的纯化的附加His-tag重组型酶40mg/L、100mmol/L的Tris-HCl(pH9.0)、30mmol/L的氯化镁、10mmol/L的ATP、各10mmol/L的表6记载的氨基酸或氨基酸衍生物组成的0.1ml反应液，于37℃下反应2小时。

反应结束后，向反应液中加反应液的100倍量的停止缓冲液(4mol/L尿素、100mmol/LEDTA·2钠盐)，停止反应，通过使用HPLC对因酶反应消耗ATP时生成的ADP量进行分析，确认反应进行。利用HPLC分析，柱子使用Develosil C30-UG-5(150×4.6mm、野村化学公司生产)、移动相使用由200mmol/L的醋酸和200mmol/L的三乙基胺构成的溶液(pH6.6)，流速1.0ml/分钟、室温、测定254nm的紫外吸收的条件下进行。结果如表6所示。

【表6-1】

添加氨基酸	生成ADP量(mmol/L)
		不添加	0.05
仅是Ala	0.13
		Ala+cyc(5)Ala	5.67
Ala+cyc(3)Ala	3.64
		Ala+cyc(6)Ala	3.78

【表6-2】

添加氨基酸	生成ADP量(mmol/L)
		不添加	0.05
仅是Ala	0.13
		仅是Phe	0.02
Ala+Phe	5.84
		Cl-Ala+Phc	2.75
CN-Ala+Phe	1.11

Ala+Cl-Phe	4.78
		Ala+F-Phc	4.44
Ala+Ni-Phe	4.42
		Ala+NII2-Phe	1.89
Ala+Kynurenin	2.11

【表6-3】

添加氨基酸	生成ADP量(mmol/L)
		不添加	0.05
仅是Ala	0.13
		仅是Glu	0.13
Ala+Glu(OMe)	2.60
		Ala+Glu(OEt)	3.93
Ala+Glu(OtBu)	6.43
		Ala+Glu(OBz1)	6.01

【表6-4】

添加氨基酸	生成ADP量(mmol/L)
		不添加	0.05
仅是Ala	0.13
		仅是Asp	0.16
Ala+Asp(OMe)	0.54
		Ala+Asp(OtBu)	4.42
Ala+Asp(OBz1)	3.23

【表6-5】

添加氨基酸	生成ADP量(mmol/L)
		不添加	0.05
仅是Ala	0.13
		仅是Lys	0.17
Ala+Lys(Ac)	0.75
		Ala+Lys(Boc)	3.64

表6-1是使用L-Ala和L-Ala衍生物、表6-2是使用L-Ala和L-Phe衍生物、表6-3是使用L-Ala和L-Glu衍生物、表6-4是使用L-Ala和L-Asp衍生物、表6-5是使用L-Ala和L-Lys衍生物作为底物的实验结果，作为底物使用的氨基酸和氨基酸衍生物的简称如下所示。

Ala：L-丙氨酸

Phe：L-苯丙氨酸

Glu：L-谷氨酸

Asp：L-天冬氨酸

Lys：L-赖氨酸

Cl-Ala：β-氯-L-丙氨酸

CN-Ala：β-氰-L-丙氨酸

cyc(5)Ala：β-环五-DL-丙氨酸

cyc(3)Ala：β-环三丙氨酸

cyc(6)Ala：β-环六丙氨酸

Cl-Phe：4-氯苯丙氨酸

F-Phe：4-氟苯丙氨酸

Ni-Phe：p-镍苯丙氨酸

NH₂-Phe：p-氨基苯丙氨酸

Phe-NH₂：苯丙氨酸酰胺

Kynurenin：L-犬尿氨酸

Glu(OMe)：谷氨酸-γ-甲酯

Glu(OEt)：谷氨酸-γ-乙酯

Glu(OtBu)：谷氨酸-γ-t丁酯

Glu(OBz1)：谷氨酸-γ-苄酯

Asp(OMe)：天冬氨酸-β-甲酯

Asp(OtBu)：天冬氨酸-β-t丁酯

Asp(OBz1)：天冬氨酸-β-苄酯

Lys(Ac)：乙酰赖氨酸

Lys(Boc)：Boc-赖氨酸

就象表6表示的那样，作为对照的没有添加底物区和在分别仅使用L-Ala、L-Phe、L-Glu、L-Asp、L-Lys作为单独底物的试验区的ADP生成量为0.02～0.16mmol/L，而相反在表6给出的氨基酸和氨基酸衍生物的组合中，生成了0.54～6.43mmol/L的ADP。

另外，通过质子NMR分析，对在与上述同样反应条件反应的存在于反应液中的化合物的构造进行解析。但反应中使用的底物氨基酸和氨基酸衍生物的浓度，在反应液1、4、10和11中为20mmol/L、其它的反应液用10mmol/L的浓度。

质子NMR分析使用Bruker公司生产的DMX500，在以下的条件下进行。

温度：303K

标准物质：1mmpl/L的3-(Trimethylsily1)-Propionicacid-D4sodium salt(TSP)

介质：反应液4、10和11为轻水、其它的反应液为重水

反应液中化合物的构造根据α位的质子化学位移进行鉴定。各化合物的浓度以TSP的面积作为内部标准，以α位的质子的信号面积为基础算出的(表7)。但是L-Ala-L-Ala由于浓度低、α位的质子的信号重合，所以以β位的质子的信号面积为基础算出。另外括弧内表示各化合物的α位质子化学位移(单位为ppm)。

使用Cl-Ala和Phe作为底物的反应液(反应液1)

Cl-Ala(4.20)、Phe(4.02)、Cl-Ala-Phe(3.93，4.50)、Aziridine-2-carboxylic acid[Azc](2.73)、Azc-Phe(2.59，4.47)

使用CN-Ala和Phe作为底物的反应液(反应液2)

CN-Ala(3.87)、Phe(4.00)、CN-Ala-Phe(3.71，4.48)

使用Ala和Cl-Phe作为底物的反应液(反应液3)

Ala(3.79)、Cl-Phe(3.97)、Ala-Cl-Phe(3.90，4.43)

使用Ala和NH₂-Phe作为底物的反应液(反应液4)

Ala(3.78)、NH₂-Phe(3.9 3)、Ala-NH₂-Phe(3.95，4.39)、Ala-Ala(β；1.55，1.36)

使用Ala和Kinurenine作为底物的反应液(反应液5)

Ala(3.79)、Kinurenine(4.16)、Ala-Kinurenine(3.96，4.64)

使用Ala和Phe-NH₂作为底物的反应液(反应液6)

Ala(3.79)、Phe-NH₂(4.02)、Ala-Phe-NH₂(3.90，4.60)

使用Ala和Glu(OMe)作为底物的反应液(反应液7)

Ala(3.79)、Glu(OMe)(3.76)、Ala-Glu(OMe)(4.05，4.18)、Ala-Ala(β；1.55，1.36)

使用Ala和Glu(OtBu)作为底物的反应液(反应液8)

Ala(3.79)、Glu(OtBu)(3.76)、Ala-Glu(OtBu)(4.04，4.18)

使用Ala和Asp(OtBu)作为底物的反应液(反应液9)

Ala(3.81)、Asp(OtBu)(3.98)、Ala-Asp(OtBu)(4.04，4.46)

使用Ala和Lys(Boc)作为底物的反应液(反应液10)

Ala(3.78)、Lys(Boc)(3.73)、Ala-Lys(Boc)(4.02，4.14)

使用Ala和cyc(3)Ala作为底物的反应液(反应液11)

Ala(3.78)、cyc(3)Ala(3.82)、Ala-cyc(3)Ala(4.08，4.24)

使用Ala和cyc(6)Ala作为底物的反应液(反应液12)

Ala(3.79)、cyc(6)Ala(3.76)、Ala-cyc(6)Ala(4.02，4.22)

【表7】

表中的“oVer1ap"表示由于信号重合，不能进行正确定量。

上述结果表明通过本发明的制造方法以氨基酸和氨基酸衍生物作为底物，可以直接制造由氨基酸和氨基酸衍生物通过肽键形成的二肽衍生物。

实验例21 N一[2一(乙酰氨基)丙酰]苯丙氨酸的制造

将实验例6中得到的L-A1a-L-phe(100mg，0．423mmo1)悬浮于二氯甲烷(10mL)，于室温下加吡啶(10mL)和无水醋酸(1mL，11mmo1)。室温下搅拌24小时后，加水，用氯仿萃取3次。将有机层用饱和盐水清洗，用无水磷酸镁干燥后，通过减压下对溶剂进行蒸馏，得到N-[2-(乙酰氨基)丙酰]苯丙氨酸。

实验例221-{2-[N-(2-(乙酰氨基)丙酰)氨基]-3-苯丙酰}哌啶的制造

将实验例21得到的N-[2-(乙酰氨基)丙酰]苯丙氨酸(10mg，0.036mmol)悬浮于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)，于室温下加1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(14mg，0.073mmol)、1-羟基苯并三唑基(15mg，0.11mmol)和哌啶(40μL，0.40mmol)，在50℃下搅拌24小时。向反应混合物中加水，用氯仿萃取3次。将有机层用10％盐酸和饱和盐水清洗，用无水磷酸镁干燥后，在减压下将溶剂蒸馏。通过将得到的残留物用硅胶柱层析进行纯化，得到1-{2-[N-(2-(乙酰氨基)丙酰)氨基]-3-苯丙酰}哌啶。

以下给出了实施例，但本发明并不限于下面实施例。

在以下的实施例中，二肽和氨基酸在用二硝基苯酚法进行衍生化后通过HPLC法进行分析。在利用HPLC法分析中，分离柱使用Lichrosorb-RP-18柱(关东化学公司生产)、作为洗脱液使用1％(v/v)磷酸、25％(v/v)乙腈，以0.7ml/分钟的流速进行。

ATP、ADP、AMP的分析、定量法

ATP、ADP和AMP的分析通过使用终止溶液[4mol/L尿素、100mmol/L EDTA·2Na(pH 8.0)]将反应液稀释400倍后，用HPLC法进行。在利用HPLC法分析中，通过分离柱使用DevelosilC30-UG-5(150×4.6mm、野村科学公司生产)，作为洗脱液使用200mmol/L醋酸、200mmol/L三乙基胺(pH6.6)、流速为1.0ml/分钟、测定波长254nm的吸收来进行。

【实施例1】

编码耐热性ywfE蛋白质基因的取得

使用在实验例4取得的含有ywfE基因的质粒pQE60ywfE上，位于编码ywfE蛋白质的DNA5’端上游的具有序列号98表示的碱基序列的DNA和位于3’下游的具有序列号99表示的碱基序列的DNA作为引物组、以质粒pQEE0ywfE作为模板、进行易错PCR[Technique，1，11-15，(1989)]。PCR通过使用含有模板DNA 0.1μg、引物各0.5μmol/L、Taq DNA聚合酶(Takara Bio公司生产)2.5units、TaqDNA聚合酶用×10缓冲液5μl、deoxyNTP各200μmol/L、和氯化锰0.075mmol/L的反应液50μl，按照94℃下30秒钟、57℃下30秒钟、72℃下1分30秒钟为一个循环，反复进行30循环，最后在72℃下温育3分钟来实施。将扩增片段用限制酶NcoI和BamHI酶切后，象实验例1那样进行回收，与经限制酶NcoI和BamHI酶切的载体质粒pQE60连接，做成表达质粒，用该质粒和pQE60ywfE转化大肠杆菌DH5α/pREP4[用pREP4(Qiagen公司生产)转化大肠杆菌DH5α取得的菌株]，取得转化体。将各转化体分别命名为大肠杆菌DH5α/pBTS1～pBTS5和大肠杆菌DH5α/pQE60ywfE。根据常规方法，从大肠杆菌DH 5α/pBTS1～pBTS5提取各个质粒，决定碱基序列。pBTS1中含有的DNA的碱基序列如序列号22所示、该DNA编码的氨基酸序列如序列号9所示，pBTS2中含有的DNA的碱基序列如序列号23所示，该DNA编码的氨基酸序列如序列号10所示，pBTS3中含有的DNA的碱基序列如序列号24所示，该DNA编码的氨基酸序列如序列号11，pBTS4中含有的DNA的碱基序列如序列号25所示，该DNA编码的氨基酸序列如序列号12所示，pBTS5中含有的DNA的碱基序列如序列号26所示，该DNA编码的氨基酸序列如序列号13所示。

将大肠杆菌DH5α/pBTS1～pBTS5和大肠杆菌DH5α/pQE60ywfE(在下面表1中，略为pBTS1～pBTS5和pQE60ywfE)生产的各个蛋白质根据实验例4所述的方法进行纯化，将该蛋白质于55℃下保温15分钟进行热处理后，供二肽生成反应。

制备由上述得到的纯化的各蛋白质50mg/L、100mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、30mmol/L的氯化镁、60mmol/L的ATP构成的0.1ml反应液，向反应液添加使浓度各达到30mmol/L的L-Ala和L-Gln，于37℃下进行1小时二肽生成反应。将使用热处理蛋白质时的L-Ala-L-Gln生成量表示为相对于不进行热处理使用大肠杆菌DH5α/pQE60ywfE生产的蛋白质时的L-Ala-L-Gln生成量的剩余活性(％)。结果如表8所示。

【表8】

菌株名	剩余活性(％)
		pQE60ywfE	0
pBTS1	45
		pBTS2	40
pBTS3	8
		pBTS4	37
pBTS5	37

就象表8表示的那样，可知可以取得与作为野生型的蛋白质由序列号1表示的氨基酸序列构成的ywfE蛋白质(二肽合成酶)相比，耐热性提高的突变型二肽合成酶。

【实施例2】

生产多磷酸激酶的细胞的制作

(1)各种细菌的染色体DNA的制备

大肠杆菌W3110、类球红细菌ATCC17023、恶臭假单胞菌KT2440(ATCC47054)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ATCC51124使用LB培养基，橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)ATCC29366使用ATCC medium920培养基[相对于1L培养基分别含有1ml0.1g/l次氮基三乙酸、0.06g/l硫酸钙·二水合物、0.1g/l硫酸镁·七水合物、0.008g/l氯化钠、0.103g/l硝酸钾、0.689g/l硝酸钠、0.111g/l磷酸氢二钠、0.2g/l氯化铵、0.5g/l酵母提取物、0.5g/l甘氨酰甘氨酸、0.5g/l硫酸钠、微量金属溶液(0.5ml/l浓硫酸、2.28g/l硫酸锰·七水合物、0.5g/l硫酸锌·七水合物、0.5g/l硼酸、0.025g/l硫酸銅·二水合物、0.025g/l钼酸钠·二水合物(Na₂MoO₄·2H₂O)、0.045g/l氯化钴·六水合物)和0.2905g/l的氯化铁(FeCl₃)溶液。pH8.2～8.4]，メソ·リソ·ヒ·ウム·ロテイ(Mesorhizobiumloti)MAFF303099(由Kazusa DNA研究所提供)使用由1g/l酵母提取物、5g/l甘露醇、0.7g/l磷酸氢二钾、0.1g/l磷酸二氢钾和1g/l硫酸镁·七水合物构成的培养基(pH7.0～7.2)，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)ATCC BAA-471株使用由5g/l胰蛋白胨(Difco公司生产)、3g/l酵母提取物(Difco公司生产)构成的培养基(pH7.0～7.2)，分别于30℃下培养24小时，将培养物离心分离得到茵体。

使用Current Protocols in Molecular Biology所述方法从各个该茵体分别分离纯化各个细菌的染色体DNA。

(2)编码来自各种细菌的多磷酸激酶的基因的扩增

编码大肠杆菌W3110的多磷酸激酶的基因(以下，略为ppk基因)通过使用具有序列号100和101表示的碱基序列的DNA、类球红细菌ATCC17023的ppk基因通过使用具有序列号102和103表示的碱基序列的DNA、橙色绿屈挠菌ATCC29366的ppk基因通过使用具有序列号104和105表示的碱基序列的DNA、Mesorhizobiumloti MAFF303099的ppk基因通过使用具有序列号106和107表示的碱基序列的DNA、天蓝色链霉菌ATCC BAA-471的ppk基因通过使用具有序列号108和109表示的碱基序列的DNA、恶臭假单胞茵KT2440的ppk基因通过使用具有序列号110和111表示的碱基序列的DNA、苜蓿中华根瘤茵ATCC51124的ppk基因通过使用具有序列号112和113或序列号114和115表示的碱基序列的DNA作为引物组，以上述(1)的各细菌的染色体DNA作为模板通过PCR法取得。

PCR通过使用含有各细菌的染色体DNA 0.1μg、引物各0.5μmol/L、Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio公司生产)2.5units、Pyrobest DNA聚合酶用×l0缓冲液5μl、deoxyNTP各200μmol/L的反应液50μl，按照由98℃下5秒钟、59℃下40秒钟、72℃下2分钟构成的一个循环，反复进行30次，最后于72℃下温育2分钟来实施。

添加与该反应液等量的TE饱和酚/氯仿，并进行混合。

将该混合液离心分离后，向得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃放置30分钟。将该溶液离心分离，得到的DNA溶解于TE。

(3)编码多磷酸激酶的DNA的克隆

将以上述2取得的大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板扩增的DNA片段经NcoI和BamHI消化后，通过琼脂糖凝胶电泳分离约1.4kb的DNA片段，用geneclean试剂盒回收后，溶解于TE。使用连接试剂盒将得到的DNA片段与经NcoI和BamHI消化的pET-28a(+)载体(Novagen公司生产)于16℃下连接1小时，取得重组DNA。

用该重组DNA转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司生产)后，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB寒天培养基，于30℃下培养过夜。

根据分子克隆第3版所述的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，通过限制酶处理解析其构造，确认取得了具有序列号116表示的碱基序列的来自大肠杆菌的ppk基因表达质粒pPK-Ecl。

根据Invitrogen公司的程序将以类球红细菌ATCC17023、橙色绿屈挠菌ATCC29366、Mesorhizobiumloti MAFF303099、天蓝色链霉菌ATCC BAA-471、恶臭假单胞菌 KT2440和苜蓿中华根瘤菌ATCC51124的染色体DNA作为模板扩增的DNA片段分别与pCR-Blunt载体(Invitrogen公司生产)连接。

用该重组DNA转化大肠杆菌TOP10后，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB寒天培养基，于30℃下培养过夜。

根据分子克隆第3版所述的方法从生长繁殖的转化体茵落提取质粒，带有来自类球红细菌ATCC17023的DNA的质粒和带有来自橙色绿屈挠菌ATCC29366的DNA的质粒用NdeI和SalI、带有来自Mesorhizobiumloti MAFF303099的DNA的质粒和带有来自恶臭假单胞菌KT2440的DNA的质粒用NdeI和HindIII、带有来自天蓝色链霉菌ATCC BAA-471的DNA的质粒分别用NcoI和SalI、带有来自苜蓿中华根瘤茵ATCC51124的DNA的质粒(使用含有由序列号112和113表示的碱基序列构成的引物DNA扩增的DNA的质粒)用NdeI和SalI、而对于含有使用由序列号114和115表示的碱基序列构成的引物DNA扩增的DNA的质粒用NdeI和BamHI分别消化后，通过琼脂糖凝胶电泳分离各DNA片段，使用geneclean试剂盒进行回收，溶解于TE。

使用连接试剂盒将得到的DNA片段与用于制备各个DNA片段使用的上述限制酶消化的pET-27b(+)载体(Novagen公司生产)于16℃下连接1小时。

使用得到的各个重组DNA转化大肠杆菌TOP10后，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB寒天培养基，于30℃下培养过夜。

根据分子克隆第3版所述的方法从生长繁殖的转化体菌落提取质粒，通过限制酶处理解析其构造，确认取得了目的ppk基因表达质粒。将具有序列号117表示的碱基序列的来自类球红细菌的ppk基因的表达质粒命名为pPK-Rs-21、将具有序列号118表示的碱基序列的来自橙色绿屈挠菌ATCC29366的ppk基因的表达质粒命名为pPK-Ca-2、将具有序列号119表示的碱基序列的来自Mesorhizobiumloti MAFF303099的ppk基因的表达质粒命名为pPK-M12-1、将具有序列号120表示的碱基序列的来自天蓝色链霉菌ATCC BAA-471的ppk基因的表达质粒命名为pPK-Sc2、将具有序列号121表示的碱基序列的来自恶臭假单胞菌KT2440的ppk基因的表达质粒命名为pPK-Pp2-2、将具有序列号122表示的碱基序列的来自苜蓿中华根瘤茵ATCC51124的ppk基因的表达质粒命名为pPK-Sm2-1、将具有序列号123表示的碱基序列的来自苜蓿中华根瘤菌ATCC51124的ppk基因的表达质粒命名为pPK-Sm2-2。由序列号116～123表示的碱基序列构成的DNA编码的多磷酸激酶的氨基酸序列分别如序列号124～131所示。

(4)多磷酸激酶生产株的制作

使用上述(3)中取得的各表达质粒转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)(Stratagene公司生产)后，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基，于30℃下培养过夜。

根据众所周知的方法从生长繁殖的转化体菌落提取质粒，确认上述(3)中取得的保持各表达质粒的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)，分别命名为大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Ec1、大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Rs-21、大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Ca-2、大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-M12-1、大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Sc2、大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Pp2-2、大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Sm2-1、大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Sm2-2。

【实施例3】

多磷酸激酶的生产

将实施例2中取得的生产多磷酸激酶的大肠杆菌转化体使用LB培养基于30℃下进行培养。在0D(660nm)达到3.0～5.0时，按照浓度达到2mmol/L那样添加 IPTG，培养至0D(660nm)达到8.0。将得到的培养物离心分离后得到的茵体按照终浓度达到50g/L那样悬浮于反应液[5mmol/L多磷酸(Sigma公司生产P8510)、5mmol/LAMP、1mmol/LADP、20mmol/L氯化镁、100mmol/L硫酸铵、60mmol/LHEPES-KOH、pH7.2]，于37℃下反应1小时。

反应结束后，通过上述的HPLC法对反应液的上清进行分析，在使用任一种茵体的反应中，根据反应液中依赖于多磷酸生成ATP，确认实施例2中取得的转化体无论那一个都生产多磷酸激酶。

【实施例4】

使用细胞作为酶源生产二肽(1)

将在实施例1中取得的表达具有生成序列号1表示的二肽的活性的蛋白质的大肠杆菌DH5α/pQE60ywfE接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素8mlLB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的50mlLB培养基的250ml容量的三角烧瓶，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加IPTG，再于30℃下培养4小时。将该培养液离心分离后取得湿菌体。

将实施例2中取得的生产来自大肠杆菌W3110的多磷酸激酶的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Ec1接种在加入了含有50μg/ml卡那霉素的8mlLB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种在加入了含有50μg/ml卡那霉素的50mlLB培养基的250ml容量的三角烧瓶，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再于30℃下培养4小时后，将该培养液离心分离后取得湿菌体。

将大肠杆菌DH5α/pQE60ywfE的湿茵体和大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Ec1的湿菌体分别按照浓度达到30g/L和20g/L那样添加到反应液[100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)、50g/L多磷酸、100mmol/L硫酸镁、5mmol/LATP、各50mmol/L底物氨基酸]中，于37℃下反应1小时。结果如表9所示。

【表9】

底物氨基酸	L-AlaL-Met	L-AlaL-Leu	L-AlaL-Val	L-AlaL-Ile
					生成二肽	L-Ala-L-Met	L-Ala-L-Leu	L-Ala-L-Val	L-Ala-L-Ile
二肽生成量(g/L)	0.5	0.7	0.4	0.4

就象表9表示的那样，可知即使只有5mmol/L的少量的ATP存在，通过二肽合成酶的ATP消耗反应(ADP生成反应)和利用多磷酸激酶的ATP再生反应(以ADP作为底物的反应)的偶联反应，可以更有效地生产二肽。

【实施例5】

使用细胞作为酶源生产二肽(2)

将实施例3中取得的生产来自类球红细菌ATCC17023的多磷酸激酶的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Rs2-1接种在加入了含有50μg/ml卡那霉素的8mlLB培养基的大型试管，于28℃下培养17小时。将该培养液接种在加入了含有50μg/ml卡那霉素的50mlLB培养基的250ml容量的三角烧瓶中，于30℃下培养3小时后，按照终浓度达到1mmol/L那样添加IPTG，再于30℃下培养4小时后，将该培养液离心分离，取得湿茵体。

将实施例4中制备的大肠杆菌DH5α/pQE60ywfE的湿菌体和大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Rs2-1的湿菌体分别按照浓度达到30g/L和20g/l那样添加到实施例4所述的反应液中，于37℃下反应1小时。结果如表10所示。

【表10】

底物氨基酸	L-AlaL-Met	L-AlaL-Leu	L-AlaL-Val	L-AlaL-IIe	GlvL-Met
						生成二肽	L-Ala-L-Met	L-Ala-L-Leu	L-Ala-L-Val	L-Ala-L-IIe	Gly-L-Met
二肽生成量(g/L)	3.0	3.2	1.1	1.2	0.2

就象表10表示的那样，可知通过使用来自类球红细菌的多磷酸激酶，可以更有效生产二肽。

【实施例6]

使用细胞作为酶源生产二肽(3)

使用与实验例4同样的方法，制备大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Ec1的湿菌体。将该湿菌体按照最终达到20g/L那样加到含有50g/L的多磷酸和100mmol/L的硫酸镁的100mmol/L的磷酸缓冲液(pH8.0)中，于45℃下加热处理1小时。将该溶液冷却到37℃后，按照终浓度分别达到30g/L、5mmol/L和各200mmol/L那样添加实施例4中制备的大肠杆菌DH5α/pQE60ywfE的湿菌体、ATP和底物氨基酸，于37℃下进行2小时反应。而作为对照使用没有进行加热处理的BL21-Gold(DE3)/pPK-Ec1的湿茵体，与上述同样进行二肽生成反应。结果如表11所示。

[表11】

底物氨基酸		L-AlaL-Met	L-AlaL-Leu	L-AlaL-Val	L-AlaL-Ile
						生成二肽		L-Ala-L-Met	L-Ala-L-Leu	L-Ala-L-Val	L-Ala-L-Ile
二肽生成量(g/L)	没有加热处理	0.5	0.4	0.3	0.5
						进行加热处理	1.5	1.3	0.7	0.8

就象表11表示的那样，可知当使用进行了加热处理的细胞时，与使用没有进行加热处理的细胞时相比，二肽生成量显著提高。

【实施例7】

使用细胞作为酶源生产二肽(4)

将实施例4中制备的大肠杆菌DH5α/pQE60ywfE的湿茵体和实施例5中制备的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Rs-21的湿菌体按照最终分别达到30g/L和20g/L那样加到含有50g/L的多磷酸和100mmol/L的硫酸镁的100mmol/L的磷酸缓冲液(pH8.0)中，于45℃下加热处理1小时。将该溶液冷却到37℃后，按照终浓度分别达到5mmol/L和各200mmol/L那样添加ATP和底物氨基酸后，于37℃下反应2小时。作为对照使用没有进行加热处理的湿菌体作为酶源，与上述同样进行二肽生成反应。结果如表12所示。

【表12】

底物氨基酸		L-AlaL-Met	L-AlaL-Leu
				生成二肽		L-Ala-L-Met	L-Ala-L-Leu
二肽生成量(g/L)	没有加热处理	2.8	3.8
				进行加热处理	4.5	4.2

就象表12表示的那样，可知当使用进行了加热处理的湿菌体时，与使用没有进行加热处理的该湿菌体时相比，二肽生成量显著提高。

【实施例8】

使用耐热二肽合成酶生产二肽

使用与实验例4同样的方法，制备生产实施例1中取得的耐热的突变型二肽合成酶的大肠杆菌DH5α/pBTS2湿菌体。将该湿菌体和实施例5中制备的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)/pPK-Rs-21的湿菌体按照最终分别达到30g/L和20g/L那样加到含有50g/L的多磷酸和100mmol/L的硫酸镁的100mmol/L的磷酸缓冲液(pH8.0)中，于52℃下进行30分钟加热处理。将该溶液冷却到37℃后，按照终浓度分别达到5mmol/L和各200mmol/L那样添加ATP和底物氨基酸后进行反应。反应中适当添加2mol/L氢氧化钠，将pH调到7.5～8.0。结果如表13所示。

【表13】

底物氨基酸	生成二肽	二肽生成量(g/L)	反应时间(小时)
				L-Ala、L-Met	L-Ala-L-Met	28.6	27
L-Ala、L-Phe	L-Ala-L-Phe	8.1	27
				L-Ala、L-Leu	L-Ala-L-Leu	16.0	27
L-Ala、L-Val	L-Ala-L-Val	15.8	27
				L-Ala、L-Ile	L-Ala-L-Ile	13.2	27
L-Thr、L-Met	L-Thr-L-Met	8.7	19
				L-Thr、L-Phe	L-Thr-L-Phe	8.5	24
Glv、L-Met	Glv-L-Met	13.2	27
				Glv、L-Phe	Glv-L-Phe	10.6	24

就象表13表示的那样，可知通过使用进行了加热处理的耐热的生产突变型二肽合成酶的细胞作为酶源，可以更显著提高二肽生成量。

【产业上利用的可能性】

通过本发明可以有效地制造各种二肽和二肽衍生物。

【序列表Free Text】

序列号9-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号10-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号11-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号12-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号13-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号22-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号23-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号24-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号25-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号26-人工序列的说明：突变蛋白质

序列号29-人工序列的说明：合成DNA

序列号30-人工序列的说明：合成DNA

序列号31-人工序列的说明：合成DNA

序列号32-人工序列的说明：合成DNA

序列号33-人工序列的说明：合成DNA

序列号34-人工序列的说明：合成DNA

序列号35-人工序列的说明：合成DNA

序列号36-人工序列的说明：合成DNA

序列号37-人工序列的说明：合成DNA

序列号38-人工序列的说明：合成DNA

序列号39-人工序列的说明：合成DNA

序列号40-人工序列的说明：合成DNA

序列号41-人工序列的说明：合成DNA

序列号42-人工序列的说明：合成DNA

序列号43-人工序列的说明：数据库检索中使用的氨基酸序列

序列号44-人工序列的说明：数据库检索中使用的氨基酸序列

序列号45-人工序列的说明：数据库检索中使用的氨基酸序列

序列号51-人工序列的说明：合成DNA

序列号52-人工序列的说明：合成DNA

序列号64-人工序列的说明：合成DNA

序列号74-人工序列的说明：合成DNA

序列号75-人工序列的说明：合成DNA

序列号76-人工序列的说明：合成DNA

序列号77-人工序列的说明：合成DNA

序列号78-人工序列的说明：合成DNA

序列号79-人工序列的说明：合成DNA

序列号80-人工序列的说明：合成DNA

序列号81-人工序列的说明：合成DNA

序列号82-人工序列的说明：合成DNA

序列号83-人工序列的说明：合成DNA

序列号84-人工序列的说明：合成DNA

序列号85-人工序列的说明：合成DNA

序列号86-人工序列的说明：合成DNA

序列号87-人工序列的说明：合成DNA

序列号88-人工序列的说明：合成DNA

序列号89-人工序列的说明：合成DNA

序列号90-人工序列的说明：合成DNA

序列号91-人工序列的说明：合成DNA

序列号92-人工序列的说明：合成DNA

序列号93-人工序列的说明：合成DNA

序列号94-人工序列的说明：合成DNA

序列号95-人工序列的说明：合成DNA

序列号96-人工序列的说明：合成DNA

序列号97-人工序列的说明：合成DNA

序列号98-人工序列的说明：合成DNA

序列号99-人工序列的说明：合成DNA

序列号100-人工序列的说明：合成DNA

序列号101-人工序列的说明：合成DNA

序列号102-人工序列的说明：合成DNA

序列号103-人工序列的说明：合成DNA

序列号104-人工序列的说明：合成DNA

列号105-人工序列的说明：合成DNA

序列号106-人工序列的说明：合成DNA

序列号107-人工序列的说明：合成DNA

序列号108-人工序列的说明：合成DNA

序列号109-人工序列的说明：合成DNA

序列号110-人工序列的说明：合成DNA

序列号111-人工序列的说明：合成DNA

序列号112-人工序列的说明：合成DNA

序列号113-人工序列的说明：合成DNA

序列号114-人工序列的说明：合成DNA

序列号115-人工序列的说明：合成DNA

序列表

<110>协和发酵工业株式会社

<120>二肽或二肽衍生物的制造方法

<130>1000P11697WO0

<150>JP2004-189007

<151>2004-06-25

<160>131

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)

<400>1

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

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Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

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420 425 430

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Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465 470

<210>2

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌ATCC6633

<400>2

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Gln Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Gln Met Phe Glu Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

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145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

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Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

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370 375 380

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Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

Thr Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

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Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

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465 470

<210>3

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌IAM1213

<400>3

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

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65 70 75 80

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100 105 110

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145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

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Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

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Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

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Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

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Ala Ile Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

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465 470

<210>4

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌IAM1107

<400>4

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Val Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Val Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Phe

405 410 415

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

420 425 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

435 440 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

450 455 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465 470

<210>5

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌IAM1214

<400>5

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Gln Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Gln Met Phe Glu Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Tle Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

Thr Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

420 425 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

435 440 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

450 455 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465 470

<210>6

<211>472

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌ATCC21555

<400>6

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Ile Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Glu Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Asp Met Phe Gly Val Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Lys Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Ala Ala

130 135 140

Phe Asn Arg Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Gln Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Lys

180 185 190

Glu Met Glu Thr Ala Glu Ala Glu Phe Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Asp Asp Trp Tyr Glu Thr Ser

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Val Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ala His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Asp Asp Ala Lys Arg

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Glu

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Ala

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Tyr Gly Lys Glu Ala Asp Leu Pro Lys Gly Leu Leu Glu

355 360 365

Gln Glu Pro Cys Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

Lys Glu Asn Gly Gln Leu Pro Glu Thr Val Val Asp Phe Val Ile Glu

385 390 395 400

Ser Ile Glu Ile Pro Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Thr Glu Leu Val

405 410 415

Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu Arg Leu Phe

420 425 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

435 440 445

Asn Asp Val Ala Glu Ser Ile Lys Gln Ile Gln Gln Gln Ala Lys Leu

450 455 460

Thr Ala Lys Tyr Ala Leu Ser Val

465 470

<210>7

<211>472

<212>PRT

<213>解淀粉芽孢杆菌IF03022(Bacillus amyloliquefaciens IF03022)

<400>7

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Glu Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Gly Met Phe Ala Val Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Ala Ala

130 135 140

Phe Asn Arg Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Arg Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Gln Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Lys

180 185 190

Glu Arg Glu Thr Ala Glu Ala Glu Phe Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Asp Asp Trp Tyr Glu Thr Ser

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Val Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Asp Asp Ala Lys Arg

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Glu

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Ala

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Glu Ala Asp Leu Pro Lys Gly Leu Leu Glu

355 360 365

Gln Glu Pro Cys Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

Lys Glu Asn Gly Gln Leu Pro Glu Thr Ala Val Asp Phe Val Ile Glu

385 390 395 400

Ser Ile Asp Ile Pro Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu Arg Leu Phe

420 425 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

435 440 445

Gly Asp Val Ala Glu Ser Ile Lys Gln Ile Gln Gln Gln Ala Lys Leu

450 455 460

Thr Ala Lys Tyr Ala Leu Pro Val

465 470

<210>8

<211>476

<212>PRT

<213>短小芽孢杆菌NRRL B-12025(Bacillus pumilus NRRL B-12025)

<400>8

Val Leu Ser Leu Ser Lys Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly

1 5 10 15

Gly Cys Pro Pro His Met Phe Tyr Glu Ser Val Ala Ala Ser Tyr His

20 25 30

Ile Val Ser Tyr Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Lys Gly His Ala

35 40 45

Glu Leu Ile Glu Lys Tyr Ser Ile Ala Val Ile Lys Asp Arg Asp Tyr

50 55 60

Phe Glu Thr His Pro Ser Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala

65 70 75 80

His Asp Asp Tyr Pro Lys Ser Glu Glu Glu Val Val Glu Asp Phe Ile

85 90 95

Arg Val Ala Ser Phe Phe Lys Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu

100 105 110

Leu Phe Ile Ala Pro Met Ala Lys Ala Ala Glu Arg Leu Gly Leu Arg

115 120 125

Gly Ala Gly Val Lys Ala Ala Glu Met Ala Arg Asp Lys Ser Gln Met

130 135 140

Arg Ala Ala Phe Asn Ala Ser Gly Val Lys Ala Val Lys Thr Gln Pro

145 150 155 160

Val Thr Thr Leu Ser Asp Phe Gln Gln Ala Ile Glu Ser Ile Gly Thr

165 170 175

Pro Leu Ile Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr

180 185 190

Leu Phe His Asp Lys Ala Gly Ser Asp Asp Leu Phe Leu Gln Val Gln

195 200 205

Ser Tyr Leu Glu Thr Ile Pro Val Pro Asp Ala Val Thr Tyr Glu Ala

210 215 220

Pro Phe Val Ala Glu Thr Tyr Leu Glu Gly Ala Tyr Glu Asp Trp Tyr

225 230 235 240

Glu Asp Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Ser Val Glu Gly Leu Val Val

245 250 255

Glu Gly Glu Tyr Leu Pro Phe Val Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile

260 265 270

Gly Phe Thr Glu Thr Ala His Ile Thr Pro Thr Ile Leu Asp Asn Glu

275 280 285

Ala Lys Gln Ile Ile Ile Glu Ala Ala Arg Lys Ala Asn Glu Gly Leu

290 295 300

Gly Leu Glu His Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn

305 310 315 320

Arg Glu Thr Gly Leu Ile Glu Ala Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn

325 330 335

Met Ile Pro Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Lys Leu

340 345 350

Leu Ile Asp Val Leu Val Asp Gly Lys Lys Ala Val Leu Pro Lys Gln

355 360 365

Leu Leu Ser Gly His Thr Phe Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro

370 375 380

Gln His Phe Lys Glu Ser Gly Leu Ile Pro Pro Glu Ala Thr His Tle

385 390 395 400

Thr Ile Asp His Val Ser Ile Pro Gln Glu Ala Phe Val Gly Asp Thr

405 410 415

Ala Ile Val Ser Gln Ser Phe Pro Ala Lys Gly Thr Ile Val Asp Leu

420 425 430

Glu Leu Phe Glu Ala Phe Asn Gly Ile Val Ser Leu Glu Leu Lys Gly

435 440 445

Ser Ser Ser Gln Asp Val Ala Ala Ser Ile Arg Asn Ile Gln Lys Gln

450 455 460

Ala Thr Ile Gln Leu Met Asp Glu Leu Val Lys Gly

465 470 475

<210>9

<211>472

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Mutant PRT

<400>9

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Pro Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Val Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys Arg Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

420 425 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

435 440 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

450 455 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465 470

<210>10

<211>472

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Mutant PRT

<400>l0

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Pro Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Tle Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Val Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys Arg Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

420 425 430

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

435 440 445

Gln Asp Val Val Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

450 455 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465 470

<210>11

<211>472

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Mutant PRT

<400>11

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Pro Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Val Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys Arg Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

420 425 430

Glu Ala Phe Asn Pro Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

435 440 445

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

450 455 460

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465 470

<210>12

<211>472

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Mutant PRT

<400>12

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Mutant PRT

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<213>枯草芽孢杆菌IAM1107

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<212>DNA

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<220>

<223>人工序列的描述：Mutant DNA

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<211>1416

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210 215 220

gct gaa gaa ttt tta cag ggt gag tac gga gac tgg tat caa aca gaa 720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

ggg tac tcc gac tat atc agt ata gaa ggc atc atg gct gac ggt gag 768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

tat ttc ccg atc gcc att cat gat aaa acg ccg caa atc ggg ttt aca 816

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

gag aca tcc cac att acg ccg tcc att ctg gat gaa gag gca aaa aag 864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

aaa att gtc gaa gct gcc aaa aag gca aat gaa ggg ctt gga ctg caa 912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

aat tgc gca aca cat aca gag atc aag cta atg aaa aac aga gaa ccg 960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

ggt tta ata gag tcg gca gcc aga ttt gcc ggc tgg aat atg atc ccc 1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

aat att aaa aag gtc ttt ggc ctt gat atg gtg caa tta tta tta gat 1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Val Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

gtc ctc tgc ttc gga aaa gac gcc gat ctg ccg gac gga tta ttg gat 1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

caa gag cct tat tat gtt gcc gac tgc cgt ttg tac ccg cag cat ttc 1152

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys Arg Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

aaa caa aat ggc caa att cct gaa act gct gag gat ttg gtc att gaa 1200

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

gcg atc gat att ccg gac ggg ctt tta aaa ggg gat act gaa atc gtt 1248

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

tct ttt tcg gcc gca gca cca ggc act tca gtt gat ttg aca ttg ttt 1296

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

420 425 430

gaa gct ttc aat tcc att gct gca ttt gaa ctg aaa ggc agt aat tca 1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser

435 440 445

cag gat gtg gct gaa tca alc aga caa att cag cag cat gcg aag ctg 1392

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

450 455 460

acg gca aag tat gtg ctg cca gta 1416

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465 470

<210>26

<211>1416

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Mutant DNA

<400>26

atg gag aga aaa aca gta ttg gtc atc gct gat ctt gga ggc tgc ccg 48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

ccg cac atg ttt tat aaa agc gct gct gaa aaa tat aac ctg gtc agc 96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

ttt att cca aga cct ttt gca att aca gcc tcc cat gca gca ttg att 144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc ata aaa gat aaa gac tat ttt aag agt 192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

tta gct gat ttt gaa cac cct gat ccc att tat tgg gcg cat gaa gat 240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Pro Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

cat aac aag cct gag gaa gag gtc gtc gag caa atc gtc aag gtt gcc 288

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

gaa atg ttt ggg gcg gat gcc atc aca aca aac aac gaa tta ttc att 336

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

gct ccg atg gcg aaa gcc tgt gaa cgt ctg ggc ttg aga ggt gcc ggc 384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

gtg cag gca gcc gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg agg gac gct 432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

130 135 140

ttt aat aag gcc gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga gtc aca act 480

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

ctt gaa gat ttc cgt gct gct ctt gaa gag atc ggc aca cct ctt atc 528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

tta aag cct gca tac tta gcg agt tct atc ggt gta acg ctg att acg 576

Leu Lys Pro Ala Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

gac act gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat gac tat ctg 624

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

aaa tca att aac gtg cca aag gcg gtt acg ttt gaa gcg ccg ttt atc 672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

gct gaa gaa ttt tta cag ggt gag tac gga gac tgg tat caa aca gaa 720

Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu

225 230 235 240

ggg tac tcc gac tat atc agt ata gaa ggc atc atg gct gac ggt gag 768

Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

tat ttc ccg atc gcc att cat gat aaa acg ccg caa atc ggg ttt aca 816

Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr

260 265 270

gag aca tcc cac att acg ccg tcc att ctg gat gaa gag gca aaa aag 864

Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys

275 280 285

aaa att gtc gaa gct gcc aaa aag gca aat gaa ggg ctt gga ctg caa 912

Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln

290 295 300

aat tgc gca aca cat aca gag atc aag cta atg aaa aac aga gaa ccg 960

Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro

305 310 315 320

ggt tta ata gag tcg gca gcc aga ttt gcc ggc tgg aat atg atc ccc 1008

Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro

325 330 335

aat att aaa aag gtc ttt ggc ctt gat atg gtg caa tta tta tta gat 1056

Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Val Gln Leu Leu Leu Asp

340 345 350

gtc ctc tgc ttc gga aaa gac gcc gat ctg ccg gac gga tta ttg gat 1104

Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp

355 360 365

caa gag cct tat tat gtt gcc gac tgc cgt ttg tac ccg cag cat ttc 1152

Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys Arg Leu Tyr Pro Gln His Phe

370 375 380

aaa caa aat ggc caa att cct gaa act gct gag gat ttg gtc att gaa 1200

Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

gcg atc gat att ccg gac ggg ctt tta aaa ggg gat act gaa atc gtt 1248

Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val

405 410 415

tct ttt tcg gcc gca gca cca ggc act tca gtt gat ttg aca ttg ttt 1296

Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe

420 425 430

gaa gct ttc aat tcc att gct gca ttt gaa ctg aaa ggc agt att tca 1344

Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Ile Ser

435 440 445

cag gat gtg gct gaa tca atc aga caa att cag cag cat gcg aag ctg 1392

Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu

450 455 460

acg gca aag tat gtg ctg cca gta 1416

Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val

465 470

<210>27

<211>93

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌168

<400>27

Gly Ala Gly Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met

1 5 10 15

Arg Asp Ala Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg

20 25 30

Val Thr Thr Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr

35 40 45

Pro Leu Ile Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr

50 55 60

Leu Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn

65 70 75 80

Asp Tyr Leu Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr

85 90

<210>28

<211>279

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌168

<400>28

ggt gcc ggc gtg cag gca gcc gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg 48

Gly Ala Gly Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met

1 5 10 15

agg gac gct ttt aat aag gcc gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga 96

Arg Asp Ala Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg

20 25 30

gtc aca act ctt gaa gat ttc cgt gct gct ctt gaa gag atc ggc aca 144

Val Thr Thr Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr

35 40 45

cct ctt atc tta aag cct aca tac tta gcg agt tct atc ggt gta acg 192

Pro Leu Ile Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr

50 55 60

ctg att acg gac act gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat 240

Leu Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn

65 70 75 80

gac tat ctg aaa tca att aac gtg cca aag gcg gtt acg 279

Asp Tyr Leu Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr

85 90

<210>29

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>29

attctcgagt agagaaggag tgttttacat 30

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>30

ttaggatcct catactggca gcacatactt 30

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>31

caagaattct catgtttgac agct 24

<210>32

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>32

taactcgaga ttcccttttt acgtgaac 28

<210>33

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>33

ttaaccatgg agagaaaaac agtattg 27

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>34

atatggatcc tactggcagc acatactttg 30

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>35

caccgcagac ggaggataca c 21

<210>36

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>36

cggacgtcac ccaataatcg tg 22

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>37

ccgatggcra aagcstgtra acg 23

<210>38

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>38

cggcagatcr gcdtcttttc c 21

<210>39

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>39

gctaggtctt gaacattgtg caaccc 26

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>40

ggtgttccga tagactcaat ggc 23

<210>41

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>41

catgccatgg agaaaaaaac tgtacttgtc attgctgact tagg 44

<210>42

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>42

cgcggatccc ttcactaatt catccattaa ctgaatcg 38

<210>43

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>UNSURE

<222>(3)

<223>Xaa表示选自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val中的任一氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(4)

<220>

<221>UNSURE

<222>(9)

<220>

<221>UNSURE

<222>(10)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Met和Ala中的任一氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(11)

<223>Xaa表示Glu，Ser或Ala

<220>

<221>UNSURE

<222>(12)

<223>Xaa表示Gly，Ser或Ala

<220>

<223>人工序列的描述：用于数据库检索的氨基酸序列

<400>43

His Gly Xaa Xaa Gly Gln Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa

5 10

<210>44

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>UNSURE

<222>(1)

<223>Xaa表示Leu Ile或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(2)

<223>Xaa表示选自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val中的任一个氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(3)

<220>

<221>UNSURE

<222>(4)

<220>

<221>UNSURE

<222>(5)

<223>Xaa表示Gly或Ala

<220>

<221>UNSURE

<222>(6)

<220>

<221>UNSURE

<222>(7)

<223>Xaa表示选自Gly，Ser，Ala，Ile和Val中的任一个氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(9)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Met，Cys和Ala中的任一个氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(11)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Met，Phe和Ala中的任一个氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(12)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Met，Phe和Ala中的任一个氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(13)

<220>

<221>UNSURE

<222>(14)

<220>

<221>UNSURE

<222>(15)

<220>

<221>UNSURE

<222>(16)

<220>

<221>UNSURE

<222>(17)

<220>

<221>UNSURE

<222>(18)

<220>

<221>UNSURE

<222>(19)

<220>

<221>UNSURE

<222>(20)

<223>Xaa表示Leu，Ile或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(21)

<220>

<221>UNSURE

<222>(23)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Ala和Pro中的任一个氨基酸

<220>

<221>UNSURE

<222>(25)

<223>Xaa表示Ser，Thr或Pro

<220>

<221>UNSURE

<222>(26)

<220>

<221>UNSURE

<222>(28)

<223>Xaa表示Gly或Ala

<220>

<223>人工序列的描述：用于数据库检索的氨基酸序列

<400>44

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Asn Xaa Xaa Pro Xaa

20 25

<210>45

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>UNSURE

<222>(1)

<223>Xaa表示Leu Ile或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(2)

<223>Xaa表示选自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val中的任一个氨基的

<220>

<221>UNSURE

<222>(3)

<220>

<221>UNSURE

<222>(4)

<220>

<221>UNSURE

<222>(5)

<223>Xaa表示Gly或Ala

<220>

<221>UNSURE

<222>(6)

<220>

<221>UNSURE

<222>(7)

<223>Xaa表示选自Gly，Ser，Ala，Ile和Val中的任一个氨基的

<220>

<221>UNSURE

<222>(9)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Met，Cys和Ala中的任一个氨基的

<220>

<221>UNSURE

<222>(11)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Met，Phe和Ala中的任一个氨基的

<220>

<221>UNSURE

<222>(12)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Met，Phe和Ala中的任一个氨基的

<220>

<221>UNSURE

<222>(13)

<220>

<221>UNSURE

<222>(14)

<220>

<221>UNSURE

<222>(15)

<220>

<221>UNSURE

<222>(16)

<220>

<221>UNSURE

<222>(17)

<220>

<221>UNSURE

<222>(18)

<220>

<221>UNSURE

<222>(19)

<220>

<221>UNSURE

<222>(20)

<220>

<221>UNSURE

<222>(21)

<220>

<221>UNSURE

<222>(22)

<223>Xaa表示Leu，Ile或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(23)

<220>

<221>UNSURE

<222>(25)

<223>Xaa表示选自Leu，Ile，Val，Ala和Pro中的任一个氨基的

<220>

<221>UNSURE

<222>(27)

<223>Xaa表示Ser，Thr或Pro

<220>

<221>UNSURE

<222>(28)

<220>

<221>UNSURE

<222>(30)

<223>Xaa表示Gly或Ala

<220>

<223>人工序列的描述：用于数据库检索的氨基酸序列

<400>45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Asn Xaa Xaa Pro Xaa

20 25 30

<210>46

<211>1416

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌ATCC 15245和枯草芽孢杆菌IAM 1033

<400>46

atg gag aga aaa aca gta ttg gtc atc gct gat ctt gga ggc tgc ccg 48

Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro

1 5 10 15

ccg cac atg ttt tat aaa agc gct gct gaa aaa tat aac ctg gtc agc 96

Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser

20 25 30

ttt att cca aga cct ttt gca att aca gcc tcc cat gca gca ttg att 144

Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile

35 40 45

gaa aaa tac tcg gtc gcg gtc ata aaa gat aaa gac tat ttt aag agt 192

Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser

50 55 60

tta gct gat ttt gag cat cct gat tcc att tat tgg gcg cat gag gat 240

Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp

65 70 75 80

cat aac aag cct gag gaa gag gtc gtc gag caa atc gtc aag gtt gcc 288

His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala

85 90 95

gaa atg ttt ggg gcg gat gcc atc aca aca aac aat gaa tta ttc att 336

Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile

100 105 110

gct ccg atg gcg aaa gcc tgt gaa cgt ctg ggc ctg aga ggt gcc ggc 384

Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly

115 120 125

gtg cag gca gcc gaa aat gcc aga gat aaa aat aaa atg agg gac gct 432

Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala

130 135 140

ttt aat aag gcc gga gtc aaa tcg atc aaa aac aaa cga gtc aca act 480

Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr

145 150 155 160

ctt gaa gat ttc cgt gct gct ctt gaa gag atc ggc aca cct ctt atc 528

Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile

165 170 175

tta aag cct aca tac tta gcg agt tca atc ggt gta acg ctg att acg 576

Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr

180 185 190

gac act gag acg gca gaa gat gaa ttt aac aga gtc aat gac tat ctg 624

Asp Thr Glu Thr Ala Glu Asp Glu Phe Asn Arg Val Asn Asp Tyr Leu

195 200 205

aaa tca att aac gtg cca aag gcg gtt acg ttt gaa gcg ccg ttt atc 672

Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile

210 215 220

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225 230 235 240

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Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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450 455 460

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<212>PRT

<213>Streptomyces noursei IFO15452

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65 70 75 80

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<212>PRT

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Gln Ala Tyr Val Val Val Arg Pro Gln Glu Leu Ala Asp Ala Ala

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<212>DNA

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20 25 30

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35 40 45

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65 70 75 80

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<212>DNA

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85 90 95

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100 105 110

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180 185 190

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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580 585 590

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Glu Ser Tyr Phe Val Leu Asn Ile Asn Gly Phe Ile Glu Glu Gly Lys

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<211>3234

<212>DNA

<213>Brevibacillus brevis

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180 185 190

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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340 345 350

ggt gaa ttg tgt att ggt gga gaa ggg tta gca agg gga tat tgg aag 1104

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355 360 365

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370 375 380

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Gly Glu Lys Leu Tyr Lys Thr Gly Asp Gln Ala Arg Trp Leu Ser Asp

385 390 395 400

gga aat att gaa tat ctc gga aga ata gat aac cag gta aag att aga 1248

Gly Asn Ile Glu Tyr Leu Gly Arg Ile Asp Asn Gln Val Lys Ile Arg

405 410 415

ggt cac cga gtt gaa cta gaa gaa gtt gag tct att ctt cta aag cat 1296

Gly His Arg Val Glu Leu Glu Glu Val Glu Ser Ile Leu Leu Lys His

420 425 430

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Met Tyr Ile Ser Glu Thr Ala Val Ser Val His Lys Asp His Gln Glu

435 440 445

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Gln Pro Tyr Leu Cys Ala Tyr Phe Val Ser Glu Lys His Ile Pro Leu

450 455 460

gaa cag tta aga caa ttc tca tca gaa gaa ctg cca acg tat atg atc 1440

Glu Gln Leu Arg Gln Phe Ser Ser Glu Glu Leu Pro Thr Tyr Met Ile

465 470 475 480

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Pro Ser Tyr Phe Ile Gln Leu Asp Lys Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly

485 490 495

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Lys Ile Asp Arg Lys Gln Leu Pro Glu Pro Asp Leu Thr Phe Gly Met

500 505 510

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Arg Val Asp Tyr Glu Ala Pro Arg Asn Glu Ile Glu Glu Thr Leu Val

515 520 525

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Thr Ile Trp Gln Asp Val Leu Gly Ile Glu Lys Ile Gly Ile Lys Asp

530 535 540

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Asn Phe Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ser Ile Lys Ala Ile Gln Val Ala

545 550 555 560

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Ala Arg Leu His Ser Tyr Gln Leu Lys Leu Glu Thr Lys Asp Leu Leu

565 570 575

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Lys Tyr Pro Thr Ile Asp Gln Leu Val His Tyr Ile Lys Asp Ser Lys

580 585 590

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Arg Arg Ser Glu Gln Gly Ile Val Glu Gly Glu Ile Gly Leu Thr Pro

595 600 605

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Ile Gln His Trp Phe Phe Glu Gln Gln Phe Thr Asn Met His His Trp

610 615 620

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Asn Gln Ser Tyr Met Leu Tyr Arg Pro Asn Gly Phe Asp Lys Glu Ile

625 630 635 640

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Leu Leu Arg Val Phe Asn Lys Ile Val Glu His His Asp Ala Leu Arg

645 650 655

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Met Ile Tyr Lys His His Asn Gly Lys Ile Val Gln Ile Asn Arg Gly

660 665 670

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Leu Glu Gly Thr Leu Phe Asp Phe Tyr Thr Phe Asp Leu Thr Ala Asn

675 680 685

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Asp Asn Glu Gln Gln Val Ile Cys Glu Glu Ser Ala Arg Leu Glr Asn

690 695 700

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Ser Ile Asn Leu Glu Val Gly Pro Leu Val Lys Ile Ala Leu Phe His

705 710 715 720

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Thr Gln Asn Gly Asp His Leu Phe Met Ala Ile His His Leu Val Val

725 730 735

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Asp Gly Ile Ser Trp Arg Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ala Thr Ala Tyr

740 745 750

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Glu Gln Ala Met His Gln Gln Thr Ile Ala Leu Pro Glu Lys Thr Asp

755 760 765

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Ser Phe Lys Asp Trp Ser Ile Glu Leu Glu Lys Tyr Ala Asn Ser Glu

770 775 780

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Leu Phe Leu Glu Glu Ala Glu Tyr Trp His His Leu Asn Tyr Tyr Thr

785 790 795 800

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Glu Asn Val Gln Ile Lys Lys Asp Tyr Val Thr Met Asn Asn Lys Gln

805 810 815

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Lys Asn Ile Arg Tyr Val Gly Met Glu Leu Thr Ile Glu Glu Thr Glu

820 825 830

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Lys Leu Leu Lys Asn Val Asn Lys Ala Tyr Arg Thr Glu Ile Asn Asp

835 840 845

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850 855 860

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Asp Lys Ile Val Ile Asn Leu Glu Gly His Gly Arg Glu Glu Ile Leu

865 870 875 880

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Glu Gln Met Asn Ile Ala Arg Thr Val Gly Trp Phe Thr Ser Gln Tyr

885 890 895

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Pro Val Val Leu Asp Met Gln Lys Ser Asp Asp Leu Ser Tyr Gln Ile

900 905 910

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Lys Leu Met Lys Glu Asn Leu Arg Arg Ile Pro Asn Lys Gly Ile Gly

915 920 925

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930 935 940

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945 950 955 960

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Asp Thr Asp Val Lys Thr Glu Leu Phe Thr Arg Ser Pro Tyr Ser Met

965 970 975

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Gly Asn Ser Leu Gly Pro Asp Gly Lys Asn Asn Leu Ser Pro Glu Gly

980 985 990

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Glu Ser Tyr Phe Val Leu Asn Ile Asn Gly Phe Ile Glu Glu Gly Lys

995 1000 1005

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1010 1015 1020

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Ile Gln Gln Leu Ser Arg Ser Tyr Lys Gln His Leu Leu Ala Ile Ile

1025 1030 1035 1040

gaa cat tgt gta cag aag gaa gat act gag tta act cca agt gat ttc 3168

Glu His Cys Val Gln Lys Glu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ser Asp Phe

1045 1050 1055

agt ttc aag gaa ctt gaa tta gaa gag atg gat gat att ttc gat ttg 3216

Ser Phe Lys Glu Leu Glu Leu Glu Glu Met Asp Asp Ile Phe Asp Leu

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ttg gcc gat tca tta acg 3234

Leu Ala Asp Ser Leu Thr

1075

<210>55

<211>503

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>55

Met Glu Phe Ser Val Lys Ser Gly Ser Pro Glu Lys GIn Arg Ser Ala

1 5 10 15

Cys Ile Val Val Gly Val Phe Glu Pro Arg Arg Leu Ser Pro Ile Ala

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Glu Gln Leu Asp Lys Ile Ser Asp Gly Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Arg

35 40 45

Arg Gly Glu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Gln Thr Leu Leu Leu His His

50 55 60

Val Pro Asn Val Leu Ser Glu Arg Ile Leu Leu Ile Gly Cys Gly Lys

65 70 75 80

Glu Arg Glu Leu Asp Glu Arg Gln Tyr Lys Gln Val Ile Gln Lys Thr

85 90 95

Ile Asn Thr Leu Asn Asp Thr Gly Ser Met Glu Ala Val Cys Phe Leu

100 105 110

Thr Glu Leu His Val Lys Gly Arg Asn Asn Tyr Trp Lys Val Arg Gln

115 120 125

Ala Val Glu Thr Ala Lys Glu Thr Leu Tyr Ser Phe Asp Gln Leu Lys

130 135 140

Thr Asn Lys Ser Glu Pro Arg Arg Pro Leu Arg Lys Met Val Phe Asn

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Val Pro Thr Arg Arg Glu Leu Thr Ser Gly Glu Arg Ala Ile Gln His

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Gly Leu Ala Ile Ala Ala Gly Ile Lys Ala Ala Lys Asp Leu Gly Asn

180 185 190

Met Pro Pro Asn Ile Cys Asn Ala Ala Tyr Leu Ala Ser Gln Ala Arg

195 200 205

Gln Leu Ala Asp Ser Tyr Ser Lys Asn Val Ile Thr Arg Val Ile Gly

210 215 220

Glu Gln Gln Met Lys Glu Leu Gly Met His Ser Tyr Leu Ala Val Gly

225 230 235 240

Gln Gly Ser Gln Asn Glu Ser Leu Met Ser Val Ile Glu Tyr Lys Gly

245 250 255

Asn Ala Ser Glu Asp Ala Arg Pro Ile Val Leu Val Gly Lys Gly Leu

260 265 270

Thr Phe Asp Ser Gly Gly Ile Ser Ile Lys Pro Ser Glu Gly Met Asp

275 280 285

Glu Met Lys Tyr Asp Met Cys Gly Ala Ala Ala Val Tyr Gly Val Met

290 295 300

Arg Met Val Ala Glu Leu Gln Leu Pro Ile Asn Val Ile Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Gly Cys Glu Asn Met Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Arg Pro Gly Asp

325 330 335

Val Leu Thr Thr Met Ser Gly Gln Thr Val Glu Val Leu Asn Thr Asp

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Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Cys Asp Val Leu Thr Tyr Val Glu Arg

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Phe Glu Pro Glu Ala Val Ile Asp Val Ala Thr Leu Thr Gly Ala Cys

370 375 380

Val Ile Ala Leu Gly His His Ile Thr Gly Leu Met Ala Asn His Asn

385 390 395 400

Pro Leu Ala His Glu Leu Ile Ala Ala Ser Glu Gln Ser Gly Asp Arg

405 410 415

Ala Trp Arg Leu Pro Leu Gly Asp Glu Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Ser

420 425 430

Asn Phe Ala Asp Met Ala Asn Ile Gly Gly Arg Pro Gly Gly Ala Ile

435 440 445

Thr Ala Gly Cys Phe Leu Ser Arg Phe Thr Arg Lys Tyr Asn Trp Ala

450 455 460

His Leu Asp Ile Ala Gly Thr Ala Trp Arg Ser Gly Lys Ala Lys Gly

465 470 475 480

Ala Thr Gly Arg Pro Val Ala Leu Leu Ala Gln Phe Leu Leu Asn Arg

485 490 495

Ala Gly Phe Asn Gly Glu Glu

500

<210>56

<211>427

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>56

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1 5 10 15

Arg Trp Gly Glu Lys Ala Thr Tyr Ser Ile Asn Asn Asp Gly Ile Thr

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Leu His Leu Asn Gly Ala Asp Asp Leu Gly Leu Ile Gln Arg Ala Ala

35 40 45

Arg Lys Ile Asp Gly Leu Gly Ile Lys His Val Gln Leu Ser Gly Glu

50 55 60

Gly Trp Asp Ala Asp Arg Cys Trp Ala Phe Trp Gln Gly Tyr Lys Ala

65 70 75 80

Pro Lys Gly Thr Arg Lys Val Val Trp Pro Asp Leu Asp Asp Ala Gln

85 90 95

Arg Gln Glu Leu Asp Asn Arg Leu Met Ile Ile Asp Trp Val Arg Asp

100 105 110

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Arg Ala Val Asp Leu Ile Ser Asn Val Ala Gly Asp Arg Val Thr Tyr

130 135 140

Arg Ile Thr Lys Gly Glu Asp Leu Arg Glu Gln Gly Tyr Met Gly Leu

145 150 155 160

His Thr Val Gly Arg Gly Ser Glu Arg Ser Pro Val Leu Leu Ala Leu

165 170 175

Asp Tyr Asn Pro Thr Gly Asp Lys Glu Ala Pro Val Tyr Ala Cys Leu

180 185 190

Val Gly Lys Gly Ile Thr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Ser Ile Lys Gln

195 200 205

Thr Ala Phe Met Asp Ser Met Lys Ser Asp Met Gly Gly Ala Ala Thr

210 215 220

Val Thr Gly Ala Leu Ala Phe Ala Ile Thr Arg Gly Leu Asn Lys Arg

225 230 235 240

Val Lys Leu Phe Leu Cys Cys Ala Asp Asn Leu Ile Ser Gly Asn Ala

245 250 255

Phe Lys Leu Gly Asp Ile Ile Thr Tyr Arg Asn Gly Lys Lys Val Glu

260 265 270

Val Met Asn Thr Asp Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Ala Asp Gly Leu

275 280 285

Ile Asp Ala Ser Ala Gln Lys Pro Glu Met Ile Ile Asp Ala Ala Thr

290 295 300

Leu Thr Gly Ala Ala Lys Thr Ala Leu Gly Asn Asp Tyr His Ala Leu

305 310 315 320

Phe Ser Phe Asp Asp Ala Leu Ala Gly Arg Leu Leu Ala Ser Ala Ala

325 330 335

Gln Glu Asn Glu Pro Phe Trp Arg Leu Pro Leu Ala Glu Phe His Arg

340 345 350

Ser Gln Leu Pro Ser Asn Phe Ala Glu Leu Asn Asn Thr Gly Ser Ala

355 360 365

Ala Tyr Pro Ala Gly Ala Ser Thr Ala Ala Gly Phe Leu Ser His Phe

370 375 380

Val Glu Asn Tyr Gln Gln Gly Trp Leu His Ile Asp Cys Ser Ala Thr

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ala Pro Val Glu Gln Trp Ser Ala Gly Ala Thr Gly Leu

405 410 415

Gly Val Arg Thr Ile Ala Asn Leu Leu Thr Ala

420 425

<210>57

<211>485

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>57

Met Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Pro Gln Pro Leu Trp Asp Ile Phe

1 5 10 15

Ala Lys Ile Cys Ser Ile Pro His Pro Ser Tyr His Glu Glu Gln Leu

20 25 30

Ala Glu Tyr Ile Val Gly Trp Ala Lys Glu Lys Gly Phe His Val Glu

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Arg Asp Gln Val Gly Asn Ile Leu Ile Arg Lys Pro Ala Thr Ala Gly

50 55 60

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Pro Gln Lys Asn Asn Asp Thr Val His Asp Phe Thr Lys Asp Pro Ile

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Gln Pro Tyr Ile Asp Gly Glu Trp Val Lys Ala Arg Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Gly Ala Asp Asn Gly Ile Gly Met Ala Ser Ala Leu Ala Val Leu Ala

115 120 125

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Glu Glu Ala Gly Met Asp Gly Ala Phe Gly Leu Gln Gly Asn Trp Leu

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Gln Ala Asp Ile Leu Ile Asn Thr Asp Ser Glu Glu Glu Gly Glu Ile

165 170 175

Tyr Met Gly Cys Ala Gly Gly Ile Asp Phe Thr Ser Asn Leu His Leu

180 185 190

Asp Arg Glu Ala Val Pro Ala Gly Phe Glu Thr Phe Lys Leu Thr Leu

195 200 205

Lys Gly Leu Lys Gly Gly His Ser Gly Gly Glu Ile His Val Gly Leu

210 215 220

Gly Asn Ala Asn Lys Leu Leu Val Arg Phe Leu Ala Gly His Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Asp Leu Arg Leu Ile Asp Phe Asn Gly Gly Thr Leu Arg Asn

245 250 255

Ala Ile Pro Arg Glu Ala Phe Ala Thr Ile Ala Val Ala Ala Asp Lys

260 265 270

Val Asp Val Leu Lys Ser Leu Val Asn Thr Tyr Gln Glu Ile Leu Lys

275 280 285

Asn Glu Leu Ala Glu Lys Glu Lys Asn Leu Ala Leu Leu Leu Asp Ser

290 295 300

Val Ala Asn Asp Lys Ala Ala Leu Ile Ala Lys Ser Arg Asp Thr Phe

305 310 315 320

Ile Arg Leu Leu Asn Ala Thr Pro Asn Gly Val Ile Arg Asn Ser Asp

325 330 335

Val Ala Lys Gly Val Val Glu Thr Ser Leu Asn Val Gly Val Val Thr

340 345 350

Met Thr Asp Asn Asn Val Glu Ile His Cys Leu Ile Arg Ser Leu Ile

355 360 365

Asp Ser Gly Lys Asp Tyr Val Val Ser Met Leu Asp Ser Leu Gly Lys

370 375 380

Leu Ala Gly Ala Lys Thr Glu Ala Lys Gly Ala Tyr Pro Gly Trp Gln

385 390 395 400

Pro Asp Ala Asn Ser Pro Val Met His Leu Val Arg Glu Thr Tyr Gln

405 410 415

Arg Leu Phe Asn Lys Thr Pro Asn Ile Gln Ile Ile His Ala Gly Leu

420 425 430

Glu Cys Gly Leu Phe Lys Lys Pro Tyr Pro Glu Met Asp Met Val Ser

435 440 445

Ile Gly Pro Thr Ile Thr Gly Pro His Ser Pro Asp Glu Gln Val His

450 455 460

Ile Glu Ser Val Gly His Tyr Trp Thr Leu Leu Thr Glu Leu Leu Lys

465 470 475 480

Glu Ile Pro Ala Lys

485

<210>58

<211>870

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>58

Met Thr Gln Gln Pro Gln Ala Lys Tyr Arg His Asp Tyr Arg Ala Pro

1 5 10 15

Asp Tyr Gln Ile Thr Asp Ile Asp Leu Thr Phe Asp Leu Asp Ala Gln

20 25 30

Lys Thr Val Val Thr Ala Val Ser Gln Ala Val Arg His Gly Ala Ser

35 40 45

Asp Ala Pro Leu Arg Leu Asn Gly Glu Asp Leu Lys Leu Val Ser Val

50 55 60

His Ile Asn Asp Glu Pro Trp Thr Ala Trp Lys Glu Glu Glu Gly Ala

65 70 75 80

Leu Val Ile Ser Asn Leu Pro Glu Arg Phe Thr Leu Lys Ile Ile Asn

85 90 95

Glu Ile Ser Pro Ala Ala Asn Thr Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Gln Ser

100 105 110

Gly Asp Ala Leu Cys Thr Gln Cys Glu Ala Glu Gly Phe Arg His Ile

115 120 125

Thr Tyr Tyr Leu Asp Arg Pro Asp Val Leu Ala Arg Phe Thr Thr Lys

130 135 140

Ile Ile Ala Asp Lys Ile Lys Tyr Pro Phe Leu Leu Ser Asn Gly Asn

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Arg Val Ala Gln Gly Glu Leu Glu Asn Gly Arg His Trp Val Gln Trp

165 170 175

Gln Asp Pro Phe Pro Lys Pro Cys Tyr Leu Phe Ala Leu Val Ala Gly

180 185 190

Asp Phe Asp Val Leu Arg Asp Thr Phe Thr Thr Arg Ser Gly Arg Glu

195 200 205

Val Ala Leu Glu Leu Tyr Val Asp Arg Gly Asn Leu Asp Arg Ala Pro

210 215 220

Trp Ala Met Thr Ser Leu Lys Asn Ser Met Lys Trp Asp Glu Glu Arg

225 230 235 240

Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Leu Asp Ile Tyr Met Ile Val Ala Val Asp

245 250 255

Phe Phe Asn Met Gly Ala Met Glu Asn Lys Gly Leu Asn Ile Phe Asn

260 265 270

Ser Lys Tyr Val Leu Ala Arg Thr Asp Thr Ala Thr Asp Lys Asp Tyr

275 280 285

Leu Asp Ile Glu Arg Val Ile Gly His Glu Tyr Phe His Asn Trp Thr

290 295 300

Gly Asn Arg Val Thr Cys Arg Asp Trp Phe Gln Leu Ser Leu Lys Glu

305 310 315 320

Gly Leu Thr Val Phe Arg Asp Gln Glu Phe Ser Ser Asp Leu Gly Ser

325 330 335

Arg Ala Val Asn Arg Ile Asn Asn Val Arg Thr Met Arg Gly Leu Gln

340 345 350

Phe Ala Glu Asp Ala Ser Pro Met Ala His Pro Ile Arg Pro Asp Met

355 360 365

Val Ile Glu Met Asn Asn Phe Tyr Thr Leu Thr Val Tyr Glu Lys Gly

370 375 380

Ala Glu Val Ile Arg Met Ile His Thr Leu Leu Gly Glu Glu Asn Phe

385 390 395 400

Gln Lys Gly Met Gln Leu Tyr Phe Glu Arg His Asp Gly Ser Ala Ala

405 410 415

Thr Cys Asp Asp Phe Val Gln Ala Met Glu Asp Ala Ser Asn Val Asp

420 425 430

Leu Ser His Phe Arg Arg Trp Tyr Ser Gln Ser Gly Thr Pro Ile Val

435 440 445

Thr Val Lys Asp Asp Tyr Asn Pro Glu Thr Glu Gln Tyr Thr Leu Thr

450 455 460

Ile Ser Gln Arg Thr Pro Ala Thr Pro Asp Gln Ala Glu Lys Gln Pro

465 470 475 480

Leu His Ile Pro Phe Ala Ile Glu Leu Tyr Asp Asn Glu Gly Lys Val

485 490 495

Ile Pro Leu Gln Lys Gly Gly His Pro Val Asn Ser Val Leu Asn Val

500 505 510

Thr Gln Ala Glu Gln Thr Phe Val Phe Asp Asn Val Tyr Phe Gln Pro

515 520 525

Val Pro Ala Leu Leu Cys Glu Phe Ser Ala Pro Val Lys Leu Glu Tyr

530 535 540

Lys Trp Ser Asp Gln Gln Leu Thr Phe Leu Met Arg His Ala Arg Asn

545 550 555 560

Asp Phe Ser Arg Trp Asp Ala Ala Gln Ser Leu Leu Ala Thr Tyr Ile

565 570 575

Lys Leu Asn Val Ala Arg His Gln Gln Gly Gln Pro Leu Ser Leu Pro

580 585 590

Val His Val Ala Asp Ala Phe Arg Ala Val Leu Leu Asp Glu Lys Tle

595 600 605

Asp Pro Ala Leu Ala Ala Glu Ile Leu Thr Leu Pro Ser Val Asn Glu

610 615 620

Met Ala Glu Leu Phe Asp Ile Ile Asp Pro Ile Ala Ile Ala Glu Val

625 630 635 640

Arg Glu Ala Leu Thr Arg Thr Leu Ala Thr Glu Leu Ala Asp Glu Leu

645 650 655

Leu Ala Ile Tyr Asn Ala Asn Tyr Gln Ser Glu Tyr Arg Val Glu His

660 665 670

Glu Asp Ile Ala Lys Arg Thr Leu Arg Asn Ala Cys Leu Arg Phe Leu

675 680 685

Ala Phe Gly Glu Thr His Leu Ala Asp Val Leu Val Ser Lys Gln Phe

690 695 700

His Glu Ala Asn Asn Met Thr Asp Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Ala

705 710 715 720

Val Ala Ala Gln Leu Pro Cys Arg Asp Ala Leu Met Gln Glu Tyr Asp

725 730 735

Asp Lys Trp His Gln Asn Gly Leu Val Met Asp Lys Trp Phe Ile Leu

740 745 750

Gln Ala Thr Ser Pro Ala Ala Asn Val Leu Glu Thr Val Arg Gly Leu

755 760 765

Leu Gln His Arg Ser Phe Thr Met Ser Asn Pro Asn Arg Ile Arg Ser

770 775 780

Leu Ile Gly Ala Phe Ala Gly Ser Asn Pro Ala Ala Phe His Ala Glu

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Asp Gly Ser Gly Tyr Leu Phe Leu Val Glu Met Leu Thr Asp Leu Asn

805 810 815

Ser Arg Asn Pro Gln Val Ala Ser Arg Leu Ile Glu Pro Leu Ile Arg

820 825 830

Leu Lys Arg Tyr Asp Ala Lys Arg Gln Glu Lys Met Arg Ala Ala Leu

835 840 845

Glu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asn Leu Ser Gly Asp Leu Tyr Glu Lys

850 855 860

Ile Thr Lys Ala Leu Ala

865 870

<210>59

<211>535

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>59

Met Arg Ile Ser Leu Lys Lys Ser Gly Met Leu Lys Leu Gly Leu Ser

1 5 10 15

Leu Val Ala Met Thr Val Ala Ala Ser Val Gln Ala Lys Thr Leu Val

20 25 30

Tyr Cys Ser Glu Gly Ser Pro Glu Gly Phe Asn Pro Gln Leu Phe Thr

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Ser Gly Thr Thr Tyr Asp Ala Ser Ser Val Pro Leu Tyr Asn Arg Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Lys Trp Glu Val Ser Glu Asp Gly Lys Thr Tyr Thr Phe His Leu Arg

85 90 95

Lys Gly Val Lys Trp His Asp Asn Lys Glu Phe Lys Pro Thr Arg Glu

100 105 110

Leu Asn Ala Asp Asp Val Val Phe Ser Phe Asp Arg Gln Lys Asn Ala

115 120 125

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130 135 140

Gly Met Gly Leu Pro Glu Leu Ile Ser Glu Val Lys Lys Val Asp Asp

145 150 155 160

Asn Thr Val Gln Phe Val Leu Thr Arg Pro Glu Ala Pro Phe Leu Ala

165 170 175

Asp Leu Ala Met Asp Phe Ala Ser Ile Leu Ser Lys Glu Tyr Ala Asp

180 185 190

Ala Met Met Lys Ala Gly Thr Pro Glu Lys Leu Asp Leu Asn Pro Ile

195 200 205

Gly Thr Gly Pro Phe Gln Leu Gln Gln Tyr Gln Lys Asp Ser Arg Ile

210 215 220

Arg Tyr Lys Ala Phe Asp Gly Tyr Trp Gly Thr Lys Pro Gln Ile Asp

225 230 235 240

Thr Leu Val Phe Ser Ile Thr Pro Asp Ala Ser Val Arg Tyr Ala Lys

245 250 255

Leu Gln Lys Asn Glu Cys Gln Val Met Pro Tyr Pro Asn Pro Ala Asp

260 265 270

Ile Ala Arg Met Lys Gln Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Glu Met Pro

275 280 285

Gly Leu Asn Val Gly Tyr Leu Ser Tyr Asn Val Gln Lys Lys Pro Leu

290 295 300

Asp Asp Val Lys Val Arg Gln Ala Leu Thr Tyr Ala Val Asn Lys Asp

305 310 315 320

Ala Ile Ile Lys Ala Val Tyr Gln Gly Ala Gly Val Ser Ala Lys Asn

325 330 335

Leu Ile Pro Pro Thr Met Trp Gly Tyr Asn Asp Asp Val Gln Asp Tyr

340 345 350

Thr Tyr Asp Pro Glu Lys Ala Lys Ala Leu Leu Lys Glu Ala Gly Leu

355 360 365

Glu Lys Gly Phe Ser Ile Asp Leu Trp Ala Met Pro Val Gln Arg Pro

370 375 380

Tyr Asn Pro Asn Ala Arg Arg Met Ala Glu Met Ile Gln Ala Asp Trp

385 390 395 400

Ala Lys Val Gly Val Gln Ala Lys Ile Val Thr Tyr Glu Trp Gly Glu

405 410 415

Tyr Leu Lys Arg Ala Lys Asp Gly Glu His Gln Thr Val Met Met Gly

420 425 430

Trp Thr Gly Asp Asn Gly Asp Pro Asp Asn Phe Phe Ala Thr Leu Phe

435 440 445

Ser Cys Ala Ala Ser Glu Gln Gly Ser Asn Tyr Ser Lys Trp Cys Tyr

450 455 460

Lys Pro Phe Glu Asp Leu Ile Gln Pro Ala Arg Ala Thr Asp Asp His

465 470 475 480

Asn Lys Arg Val Glu Leu Tyr Lys Gln Ala Gln Val Val Met His Asp

485 490 495

Gln Ala Pro Ala Leu Ile Ile Ala His Ser Thr Val Phe Glu Pro Val

500 505 510

Arg Lys Glu Val Lys Gly Tyr Val Val Asp Pro Leu Gly Lys His His

515 520 525

Phe Glu Asn Val Ser Ile Glu

530 535

<210>60

<211>339

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>60

Met Leu Gln Phe Ile Leu Arg Arg Leu Gly Leu Val Ile Pro Thr Phe

1 5 10 15

Ile Gly Ile Thr Leu Leu Thr Phe Ala Phe Val His Met Ile Pro Gly

20 25 30

Asp Pro Val Met Ile Met Ala Gly Glu Arg Gly Ile Ser Pro Glu Arg

35 40 45

His Ala Gln Leu Leu Ala Glu Leu Gly Leu Asp Lys Pro Met Trp Gln

50 55 60

Gln Tyr Leu His Tyr Ile Trp Gly Val Met His Gly Asp Leu Gly Ile

65 70 75 80

Ser Met Lys Ser Arg Ile Pro Val Trp Glu Glu Phe Val Pro Arg Phe

85 90 95

Gln Ala Thr Leu Glu Leu Gly Val Cys Ala Met Ile Phe Ala Thr Ala

100 105 110

Val Gly Ile Pro Val Gly Val Leu Ala Ala Val Lys Arg Gly Ser Ile

115 120 125

Phe Asp His Thr Ala Val Gly Leu Ala Leu Thr Gly Tyr Ser Met Pro

130 135 140

Ile Phe Trp Trp Gly Met Met Leu Ile Met Leu Val Ser Val His Trp

145 150 155 160

Asn Leu Thr Pro Val Ser Gly Arg Val Ser Asp Met Val Phe Leu Asp

165 170 175

Asp Ser Asn Pro Leu Thr Gly Phe Met Leu Ile Asp Thr Ala Ile Trp

180 185 190

Gly Glu Asp Gly Asn Phe Ile Asp Ala Val Ala His Met Ile Leu Pro

195 200 205

Ala Ile Val Leu Gly Thr Ile Pro Leu Ala Val Ile Val Arg Met Thr

210 215 220

Arg Ser Ser Met Leu Glu Val Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Arg Thr Ala

225 230 235 240

Arg Ala Lys Gly Leu Thr Arg Met Arg Val Ile Ile Val His Ala Leu

245 250 255

Arg Asn Ala Met Leu Pro Val Val Thr Val Ile Gly Leu Gln Val Gly

260 265 270

Thr Leu Leu Ala Gly Ala Ile Leu Thr Glu Thr Ile Phe Ser Trp Pro

275 280 285

Gly Leu Gly Arg Trp Leu Ile Asp Ala Leu Gln Arg Arg Asp Tyr Pro

290 295 300

Val Val Gln Gly Gly Val Leu Leu Val Ala Thr Met Ile Ile Leu Val

305 310 315 320

Asn Leu Leu Val Asp Leu Leu Tyr Gly Val Val Asn Pro Arg Ile Arg

325 330 335

His Lys Lys

<210>61

<211>300

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>61

Met Ser Gln Val Thr Glu Asn Lys Val Ile Ser Ala Pro Val Pro Met

1 5 10 15

Thr Pro Leu Gln Glu Phe Trp His Tyr Phe Lys Arg Asn Lys Gly Ala

20 25 30

Val Val Gly Leu Val Tyr Val Val Ile Val Leu Phe Ile Ala Ile Phe

35 40 45

Ala Asn Trp Ile Ala Pro Tyr Asn Pro Ala Glu Gln Phe Arg Asp Ala

50 55 60

Leu Leu Ala Pro Pro Ala Trp Gln Glu Gly Gly Ser Met Ala His Leu

65 70 75 80

Leu Gly Thr Asp Asp Val Gly Arg Asp Val Leu Ser Arg Leu Met Tyr

85 90 95

Gly Ala Arg Leu Ser Leu Leu Val Gly Cys Leu Val Val Val Leu Ser

100 105 110

Leu Ile Met Gly Val Ile Leu Gly Leu Ile Ala Gly Tyr Phe Gly Gly

115 120 125

Leu Val Asp Asn Ile Ile Met Arg Val Val Asp Ile Met Leu Ala Leu

130 135 140

Pro Ser Leu Leu Leu Ala Leu Val Leu Val Ala Ile Phe Gly Pro Ser

145 150 155 160

Ile Gly Asn Ala Ala Leu Ala Leu Thr Phe Val Ala Leu Pro His Tyr

165 170 175

Val Arg Leu Thr Arg Ala Ala Val Leu Val Glu Val Asn Arg Asp Tyr

180 185 190

Val Thr Ala Ser Arg Val Ala Gly Ala Gly Ala Met Arg Gln Met Phe

195 200 205

Ile Asn Ile Phe Pro Asn Cys Leu Ala Pro Leu Tle Val Gln Ala Ser

210 215 220

Leu Gly Phe Ser Asn Ala Ile Leu Asp Met Ala Ala Leu Gly Phe Leu

225 230 235 240

Gly Met Gly Ala Gln Pro Pro Thr Pro Glu Trp Gly Thr Met Leu Ser

245 250 255

Asp Val Leu Gln Phe Ala Gln Ser Ala Trp Trp Val Val Thr Phe Pro

260 265 270

Gly Leu Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu Ala Phe Asn Leu Met Gly Asp

275 280 285

Gly Leu Arg Asp Ala Leu Asp Pro Lys Leu Lys Gln

290 295 300

<210>62

<211>327

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>62

Met Ala Leu Leu Asn Val Asp Lys Leu Ser Val His Phe Gly Asp Glu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Phe Arg Ala Val Asp Arg Ile Ser Tyr Ser Val Lys Gln

20 25 30

Gly Tlu Val Val Gly Ile Val Gly Glu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Val

35 40 45

Ser Ser Leu Ala Ile Met Gly Leu Ile Asp Tyr Pro Gly Arg Val Met

50 55 60

Ala Glu Lys Leu Glu Phe Asn Gly Gln Asp Leu Gln Arg Ile Ser Glu

65 70 75 80

Lys Glu Arg Arg Asn Leu Val Gly Ala Glu Val Ala Met Ile Phe Gln

85 90 95

Asp Pro Met Thr Ser Leu Asn Pro Cys Tyr Thr Val Gly Phe Gln Ile

100 105 110

Met Glu Ala Ile Lys Val His Gln Gly Gly Asn Lys Ser Thr Arg Arg

115 120 125

Gln Arg Ala Ile Asp Leu Leu Asn Gln Val Gly Ile Pro Asp Pro Ala

130 135 140

Ser Arg Leu Asp Val Tyr Pro His Gln Leu Ser Gly Gly Met Ser Gln

145 150 155 160

Arg Val Met Ile Ala Met Ala Ile Ala Cys Arg Pro Lys Leu Leu Ile

165 170 175

Ala Asp Glu Pro Thr Thr Ala Leu Asp Val Thr Ile Gln Ala Gln Ile

180 185 190

Ile Glu Leu Leu Leu Glu Leu Gln Gln Lys Glu Asn Met Ala Leu Val

195 200 205

Leu Ile Thr His Asp Leu Ala Leu Val Ala Glu Ala Ala His Lys Ile

210 215 220

Ile Val Met Tyr Ala Gly Gln Val Val Glu Thr Gly Asp Ala His Ala

225 230 235 240

Ile Phe His Ala Pro Arg His Pro Tyr Thr Gln Ala Leu Leu Arg Ala

245 250 255

Leu Pro Glu Phe Ala Gln Asp Lys Glu Arg Leu Ala Ser Leu Pro Gly

260 265 270

Val Val Pro Gly Lys Tyr Asp Arg Pro Asn Gly Cys Leu Leu Asn Pro

275 280 285

Arg Cys Pro Tyr Ala Thr Asp Arg Cys Arg Ala Glu Glu Pro Ala Leu

290 295 300

Asn Met Leu Ala Asp Gly Arg Gln Ser Lys Cys His Tyr Pro Leu Asp

305 310 315 320

Asp Ala Gly Arg Pro Thr Leu

325

<210>63

<211>334

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>63

Met Ser Thr Gln Glu Ala Thr Leu Gln Gln Pro Leu Leu Gln Ala Ile

1 5 10 15

Asp Leu Lys Lys His Tyr Pro Val Lys Lys Gly Met Phe Ala Pro Glu

20 25 30

Arg Leu Val Lys Ala Leu Asp Gly Val Ser Phe Asn Leu Glu Arg Gly

35 40 45

Lys Thr Leu Ala Val Val Gly Glu Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr Leu

50 55 60

Gly Arg Leu Leu Thr Met Ile Glu Met Pro Thr Gly Gly Glu Leu Tyr

65 70 75 80

Tyr Gln Gly Gln Asp Leu Leu Lys His Asp Pro Gln Ala Gln Lys Leu

85 90 95

Arg Arg Gln Lys Ile Gln Ile Val Phe Gln Asn Pro Tyr Gly Ser Leu

100 105 110

Asn Pro Arg Lys Lys Val Gly Gln Ile Leu Glu Glu Pro Leu Leu Ile

115 120 125

Asn Thr Ser Leu Ser Lys Glu Gln Arg Arg Glu Lys Ala Leu Ser Met

130 135 140

Met Ala Lys Val Gly Leu Lys Thr Glu His Tyr Asp Arg Tyr Pro His

145 150 155 160

Met Phe Ser Gly Gly Gln Arg Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Gly Leu

165 170 175

Met Leu Asp Pro Asp Val Val Ile Ala Asp Glu Pro Val Ser Ala Leu

180 185 190

Asp Val Ser Val Arg Ala Gln Val Leu Asn Leu Met Met Asp Leu Gln

195 200 205

Gln Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Val Phe Ile Ser His Asp Leu Ser Val

210 215 220

Val Glu His Ile Ala Asp Glu Val Met Val Met Tyr Leu Gly Arg Cys

225 230 235 240

Val Glu Lys Gly Thr Lys Asp Gln Ile Phe Asn Asn Pro Arg His Pro

245 250 255

Tyr Thr Gln Ala Leu Leu Ser Ala Thr Pro Ara Leu Asn Pro Asp Asp

260 265 270

Arg Arg Glu Arg Ile Lys Leu Ser Gly Glu Leu Pro Ser Pro Leu Asn

275 280 285

Pro Pro Pro Gly Cys Ala Phe Asn Ala Arg Cys Arg Arg Arg Phe Gly

290 295 300

Pro Cys Thr Gln Leu Gln Pro Gln Leu Lys Asp Tyr Gly Gly Gln Leu

305 310 315 320

Val Ala Cys Phe Ala Val Asp Gln Asp Glu Asn Pro Gln Arg

325 330

<210>64

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>64

gaagttccta tactttctag agaataggaa cttc 34

<210>65

<211>1509

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>65

atg gag ttt agt gta aaa agc ggt agc ccg gag aaa cag cgg agt gcc 48

Met Glu Phe Ser Val Lys Ser Gly Ser Pro Glu Lys Gln Arg Ser Ala

1 5 10 15

tgc atc gtc gtg ggc gtc ttc gaa cca cgt cgc ctt tct ccg att gca 96

Cys Ile Val Val Gly Val Phe Glu Pro Arg Arg Leu Ser Pro Ile Ala

20 25 30

gaa cag ctc gat aaa atc agc gat ggg tac atc agc gcc ctg cta cgt 144

Glu Gln Leu Asp Lys Ile Ser Asp Gly Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Arg

35 40 45

cgg ggc gaa ctg gaa gga aaa ccg ggg cag aca ttg ttg ctg cac cat 192

Arg Gly Glu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Gln Thr Leu Leu Leu His His

50 55 60

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65 70 75 80

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Glu Arg Glu Leu Asp Glu Arg Gln Tyr Lys Gln Val Ile Gln Lys Thr

85 90 95

att aat acg ctg aat gat act ggc tca atg gaa gcg gtc tgc ttt ctg 336

Ile Asn Thr Leu Asn Asp Thr Gly Ser Met Glu Ala Val Cys Phe Leu

100 105 110

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115 120 125

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Ala Val Glu Thr Ala Lys Glu Thr Leu Tyr Ser Phe Asp Gln Leu Lys

130 135 140

acg aac aag agc gaa ccg cgt cgt ccg ctg cgt aag atg gtg ttc aac 480

Thr Asn Lys Ser Glu Pro Arg Arg Pro Leu Arg Lys Met Val Phe Asn

145 150 155 160

gtg ccg acc cgc cgt gaa ctg acc agc ggt gag cgc gcg atc cag cac 528

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165 170 175

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Gly Leu Ala Ile Ala Ala Gly Ile Lys Ala Ala Lys Asp Leu Gly Asn

180 185 190

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195 200 205

cag ctg gct gac agc tac agc aag aat gtc atc acc cgc gtt atc ggc 672

Gln Leu Ala Asp Ser Tyr Ser Lys Asn Val Ile Thr Arg Val Ile Gly

210 215 220

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Glu Gln Gln Met Lys Glu Leu Gly Met His Ser Tyr Leu Ala Val Gly

225 230 235 240

cag ggt tcg caa aac gaa tcg ctg atg tcg gtg att gag tac aaa ggc 768

Gln Gly Ser Gln Asn Glu Ser Leu Met Ser Val Ile Glu Tyr Lys Gly

245 250 255

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Asn Ala Scr Glu Asp Ala Arg Pro Ile Val Leu Val Gly Lys Gly Leu

260 265 270

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Thr Phe Asp Ser Gly Gly Ile Ser Ile Lys Pro Ser Glu Gly Met Asp

275 280 285

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Glu Met Lys Tyr Asp Met Cys Gly Ala Ala Ala Val Tyr Gly Val Met

290 295 300

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305 310 315 320

gca ggc tgc gaa aac atg cct ggc gga cga gcc tat cgt ccg ggc gat 1008

Ala Gly Cys Glu Asn Met Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Arg Pro Gly Asp

325 330 335

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Val Leu Thr Thr Met Ser Gly Gln Thr Val Glu Val Leu Asn Thr Asp

340 345 350

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Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Cys Asp Val Leu Thr Tyr Val Glu Arg

355 360 365

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Phe Glu Pro Glu Ala Val Ile Asp Val Ala Thr Leu Thr Gly Ala Cys

370 375 380

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Val Ile Ala Leu Gly His His Ile Thr Gly Leu Met Ala Asn His Asn

385 390 395 400

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405 410 415

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Ala Trp Arg Leu Pro Leu Gly Asp Glu Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Ser

420 425 430

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Asn Phe Ala Asp Met Ala Asn Ile Gly Gly Arg Pro Gly Gly Ala Ile

435 440 445

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Thr Ala Gly Cys Phe Leu Ser Arg Phe Thr Arg Lys Tyr Asn Trp Ala

450 455 460

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His Leu Asp Ile Ala Gly Thr Ala Trp Arg Ser Gly Lys Ala Lys Gly

465 470 475 480

gcc acc ggt cgt ccg gta gcg ttg ctg gca cag ttc ctg tta aac cgc 1488

Ala Thr Gly Arg Pro Val Ala Leu Leu Ala Gln Phe Leu Leu Asn Arg

485 490 495

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Ala Gly Phe Asn Gly Glu Glu

500

<210>66

<211>1281

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>66

atg aca gaa gcg atg aag att acc ctc tct acc caa cct gcc gac gcg 48

Met Thr Glu Ala Met Lys Ile Thr Leu Ser Thr Gln Pro Ala Asp Ala

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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Arg Lys Ile Asp Gly Leu Gly Ile Lys His Val Gln Leu Ser Gly Glu

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

gtg aag ctg ttc ctc tgc tgt gcg gat aac ctg att agc ggc aat gcg 768

Val Lys Leu Phe Leu Cys Cys Ala Asp Asn Leu Ile Ser Gly Asn Ala

245 250 255

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Phe Lys Leu Gly Asp Ile Ile Thr Tyr Arg Asn Gly Lys Lys Val Glu

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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Gly Val Arg Thr Ile Ala Asn Leu Leu Thr Ala

420 425

<210>67

<211>1455

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>67

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Glu Glu Ala Gly Met Asp Gly Ala Phe Gly Leu Gln Gly Asn Trp Leu

145 150 155 160

cag gct gat att ctg att aac acc gac tcc gaa gaa gaa ggt gaa atc 528

Gln Ala Asp Ile Leu Ile Asn Thr Asp Ser Glu Glu Glu Gly Glu Ile

165 170 175

tac atg ggt tgt gcg ggg ggt atc gac ttc acc tcc aac ctg cat tta 576

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180 185 190

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Arg Ala Lys Gly Leu Thr Arg Met Arg Val Ile Ile Val His Ala Leu

245 250 255

cgt aac gcg atg ctg ccg gtg gtg acc gtt atc ggc ctg cag gtg gga 816

Arg Asn Ala Met Leu Pro Val Val Thr Val Ile Gly Leu Gln Val Gly

260 265 270

aca ttg ctg gcg ggg gcg att ctg acc gaa acc atc ttc tcg tgg ccc 864

Thr Leu Leu Ala Gly Ala Ile Leu Thr Glu Thr Ile Phe Ser Trp Pro

275 280 285

ggt ctg gga cgc tgg ttg att gac gca ctg caa cgc cgc gac tat ccg 912

Gly Leu Gly Arg Trp Leu Ile Asp Ala Leu Gln Arg Arg Asp Tyr Pro

290 295 300

gta gtg cag ggc ggc gta ttg ctg gtg gcg acg atg att atc ctc gtc 960

Val Val Gln Gly Gly Val Leu Leu Val Ala Thr Met Ile Ile Leu Val

305 310 315 320

aac ttg ctg gtc gat ctg ctg tac ggc gtg gtg aac ccg cgt att cgt 1008

Asn Leu Leu Val Asp Leu Leu Tyr Gly Val Val Asn Pro Arg Ile Arg

325 330 335

cat aag aag 1017

His Lys Lys

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<211>900

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>71

atg tca cag gtt act gaa aat aaa gtg att agc gca ccg gtg ccg atg 48

Met Ser Gln Val Thr Glu Asn Lys Val Ile Ser Ala Pro Val Pro Met

1 5 10 15

acc ccg tta cag gag ttc tgg cac tat ttt aaa cgc aac aaa ggc gcg 96

Thr Pro Leu Gln Glu Phe Trp His Tyr Phe Lys Arg Asn Lys Gly Ala

20 25 30

gtc gtc ggg ctg gtt tac gtc gtc atc gtg ctg ttc atc gcg atc ttt 144

Val Val Gly Leu Val Tyr Val Val Ile Val Leu Phe Ile Ala Ile Phe

35 40 45

gcc aac tgg att gca ccc tat aac ccg gcg gaa cag ttc cgc gat gca 192

Ala Asn Trp Ile Ala Pro Pyr Asn Pro Ala Glu Gln Phe Arg Asp Ala

50 55 60

ctg ctc gcc ccg cca gcc tgg cag gaa ggc ggc agc atg gcg cac ttg 240

Leu Leu Ala Pro Pro Ala Trp Gln Glu Gly Gly Ser Met Ala His Leu

65 70 75 80

ctg ggc acc gat gac gta ggc cgt gat gtg ctg tcg cgc ctg atg tac 288

Leu Gly Thr Asp Asp Val Gly Arg Asp Val Leu Ser Arg Leu Met Tyr

85 90 95

ggt gcg cgc ctg tcg ctg ctg gtt ggc tgt ctg gta gtt gtg tta tcg 336

Gly Ala Arg Leu Ser Leu Leu Val Gly Cys Leu Val Val Val Leu Ser

100 105 110

ctg att atg ggc gtt att ctc ggc ctg atc gcc ggt tac ttt ggc ggc 384

Leu Ile Met Gly Val Ile Leu Gly Leu Ile Ala Gly Tyr Phe Gly Gly

115 120 125

ctg gtc gat aac atc att atg cgc gtg gtc gat atc atg ctg gcg ctg 432

Leu Val Asp Asn Ile Ile Met Arg Val Val Asp Ile Met Leu Ala Leu

130 135 140

cca agt ctg ctg ctg gcg ctg gtg ctg gtg gca att ttc ggc ccg tcg 480

Pro Ser Leu Leu Leu Ala Leu Val Leu Val Ala Ile Phe Gly Pro Ser

145 150 155 160

att ggt aac gcc gcg ctg gca ctg acc ttc gtt gcc ttg ccg cac tat 528

Ile Gly Asn Ala Ala Leu Ala Leu Thr Phe Val Ala Leu Pro His Tyr

165 170 175

gtg cgc tta acc cgc gcc gcc gtg ctg gtg gaa gtt aac cgc gat tac 576

Val Arg Leu Thr Arg Ala Ala Val Leu Val Glu Val Asn Arg Asp Tyr

180 185 190

gtc acc gcg tct cgc gtg gcg ggt gcc ggg gcg atg cgt cag atg ttt 624

Val Thr Ala Ser Arg Val Ala Gly Ala Gly Ala Met Arg Gln Met Phe

195 200 205

att aac atc ttc ccg aac tgc ctt gcg ccg ctg att gtt cag gcg tcg 672

Ile Asn Ile Phe Pro Asn Cys Leu Ala Pro Leu Ile Val Gln Ala Ser

210 215 220

ctc ggt ttc tct aac gcc att ctc gat atg gct gct ctt ggt ttc ctc 720

Leu Gly Phe Ser Asn Ala Ile Leu Asp Met Ala Ala Leu Gly Phe Leu

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ggc atg ggg gca cag ccg cca acg cct gag tgg ggc acc atg ctc tcc 768

Gly Met Gly Ala Gln Pro Pro Thr Pro Glu Trp Gly Thr Met Leu Ser

245 250 255

gac gtg ttg cag ttc gcg caa agc gcc tgg tgg gtc gtg acc ttc ccg 816

Asp Val Leu Gln Phe Ala Gln Ser Ala Trp Trp Val Val Thr Phe Pro

260 265 270

ggt ctg gcg atc ctg ctg acg gtg ctg gca ttt aac ctg atg ggt gac 864

Gly Leu Ala Ile Leu Leu Thr Val Leu Ala Phe Asn Leu Met Gly Asp

275 280 285

ggt ctg cgt gac gcg ctc gat ccc aaa ctg aag cag 900

Gly Leu Arg Asp Ala Leu Asp Pro Lys Leu Lys Gln

290 295 300

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<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>72

atg gcg tta tta aat gta gat aaa tta tcg gtg cat ttc ggc gac gaa 48

Met Ala Leu Leu Asn Val Asp Lys Leu Ser Val His Phe Gly Asp Glu

1 5 10 15

agc gcg ccg ttc cgc gcc gta gac cgc atc agc tac agc gta aaa cag 96

Ser Ala Pro Phe Arg Ala Val Asp Arg Ile Ser Tyr Ser Val Lys Gln

20 25 30

ggc gaa gtg gtc ggg att gtg ggt gag tcc ggc tcc ggt aag tcg gtc 144

Gly Glu Val Val Gly Ile Val Gly Glu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Val

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agt tca ctg gcg att atg ggg ctg att gat tat ccg ggc cgc gta atg 192

Ser Ser Leu Ala Ile Met Gly Leu Ile Asp Tyr Pro Gly Arg Val Met

50 55 60

gca gaa aaa ctg gag ttt aac ggc cag gat ttg cag cgt atc tca gaa 240

Ala Glu Lys Leu Glu Phe Asn Gly Gln Asp Leu Gln Arg Ile Ser Glu

65 70 75 80

aaa gag cgc cgc aac ctg gtg ggt gcc gaa gtg gcg atg atc ttc cag 288

Lys Glu Arg Arg Asn Leu Val Gly Ala Glu Val Ala Met Ile Phe Gln

85 90 95

gac ccg atg acc agc ctt aac ccg tgc tac acc gtg ggt ttc cag att 336

Asp Pro Met Thr Ser Leu Asn Pro Cys Tyr Thr Val Gly Phe Gln Ile

100 105 110

atg gaa gcg att aag gtg cat cag ggc ggc aac aaa agt acc cgc cgt 384

Met Glu Ala Ile Lys Val His Gln Gly Gly Asn Lys Ser Thr Arg Arg

115 120 125

cag cga gcg att gac ctg ctg aat cag gtc ggt att ccc gat ccg gca 432

Gln Arg Ala Ile Asp Leu Leu Asn Gln Val Gly Ile Pro Asp Pro Ala

130 135 140

tcg cgt ctg gat gtt tac ccg cat cag ctt tcc ggc ggc atg agc cag 480

Ser Arg Leu Asp Val Tyr Pro His Gln Leu Ser Gly Gly Met Ser Gln

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Arg Val Met Ile Ala Met Ala Ile Ala Cys Arg Pro Lys Leu Leu Ile

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gcc gat gaa ccg acc acc gcg ctg gac gtg acc att cag gcg caa atc 576

Ala Asp Glu Pro Thr Thr Ala Leu Asp Val Thr Ile Gln Ala Gln Ile

180 185 190

atc gaa cta ctg ctg gag cta cag cag aaa gag aac atg gcg ctg gtg 624

Ile Glu Leu Leu Leu Glu Leu Gln Gln Lys Glu Asn Met Ala Leu Val

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tta att acc cat gac ctg gcg ctg gtg gcg gaa gcg gca cat aaa atc 672

Leu Ile Thr His Asp Leu Ala Leu Val Ala Glu Ala Ala His Lys Ile

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Ile Val Met Tyr Ala Gly Gln Val Val Glu Thr Gly Asp Ala His Ala

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atc ttc cat gcg ccg cgt cac ccg tat act cag gca ttg ctg cgt gcg 768

Ile Phe His Ala Pro Arg His Pro Tyr Thr Gln Ala Leu Leu Arg Ala

245 250 255

ctg cca gaa ttt gct cag gac aaa gaa cgt ctg gcg tcg ttg cca ggt 816

Leu Pro Glu Phe Ala Gln Asp Lys Glu Arg Leu Ala Ser Leu Pro Gly

260 265 270

gtc gtt ccc ggc aag tac gac cgc ccg aac ggc tgc ctg ctt aac ccg 864

Val Val Pro Gly Lys Tyr Asp Arg Pro Asn Gly Cys Leu Leu Asn Pro

275 280 285

cgc tgc ccc tat gcc act gac aga tgt cgc gct gaa gaa ccg gcg ctg 912

Arg Cys Pro Tyr Ala Thr Asp Arg Cys Arg Ala Glu Glu Pro Ala Leu

290 295 300

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Asn Met Leu Ala Asp Gly Arg Gln Ser Lys Cys His Tyr Pro Leu Asp

305 310 315 320

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Asp Ala Gly Arg Pro Thr Leu

325

<210>73

<211>1002

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>73

atg agt acg caa gag gcc acc ctg caa caa ccg ctg ttg cag gct atc 48

Met Ser Thr Gln Glu Ala Thr Leu Gln Gln Pro Leu Leu Gln Ala Ile

1 5 10 15

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Asp Leu Lys Lys His Tyr Pro Val Lys Lys Gly Met Phe Ala Pro Glu

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cgt ctg gtt aaa gcg ctg gat ggc gtt tcg ttt aac ctt gaa cgt ggc 144

Arg Leu Val Lys Ala Leu Asp Gly Val Ser Phe Asn Leu Glu Arg Gly

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aaa acg ctg gca gta gtg ggc gaa tct ggc tgc ggt aaa tcg acc ctc 192

Lys Thr Leu Ala Val Val Gly Glu Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr Leu

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ggt cgg ttg ctg acg atg att gaa atg ccc acc ggt ggc gag ctg tat 240

Gly Arg Leu Leu Thr Met Ile Glu Met Pro Thr Gly Gly Glu Leu Tyr

65 70 75 80

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Tyr Gln Gly Gln Asp Leu Leu Lys His Asp Pro Gln Ala Gln Lys Leu

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Arg Arg Gln Lys Ile Gln Ile Val Phe Gln Asn Pro Tyr Gly Ser Leu

100 105 110

aat ccg cgt aaa aaa gtc ggg caa att ctt gaa gag ccg ctg ctg atc 384

Asn Pro Arg Lys Lys Val Gly Gln Ile Leu Glu Glu Pro Leu Leu Ile

115 120 125

aac acc agc tta agc aaa gaa cag cgt cgg gaa aaa gcc ctg tcg atg 432

Asn Thr Ser Leu Ser Lys Glu Gln Arg Arg Glu Lys Ala Leu Ser Met

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atg gcg aaa gtc ggc ctg aaa acc gag cac tat gac cgc tat ccg cat 480

Met Ala Lys Val Gly Leu Lys Thr Glu His Tyr Asp Arg Tyr Pro His

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atg ttc tcc ggc ggt cag cgt cag cgt atc gcc atc gcc cgt ggt ctg 528

Met Phe Ser Gly Gly Gln Arg Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Gly Leu

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Met Lcu Asp Pro Asp Val Val Ile Ala Asp Glu Pro Val Ser Ala Leu

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gat gtt tca gtg cgc gcg cag gtg ctg aat ctg atg atg gat ttg cag 624

Asp Val Ser Val Arg Ala Gln Val Leu Asn Leu Met Met Asp Leu Gln

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cag gag ttg ggg ctg tct tat gtc ttt atc tcc cac gac ctg tcg gtg 672

Gln Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Val Phe Ile Ser His Asp Leu Ser Val

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gtg gag cac att gct gat gaa gtg atg gtg atg tac ctg ggc cgc tgc 720

Val Glu His Ile Ala Asp Glu Val Met Val Met Tyr Leu Gly Arg Cys

225 230 235 240

gtg gag aag gga acg aaa gac caa atc ttc aat aac ccg cgc cat ccg 768

Val Glu Lys Gly Thr Lys Asp Gln Ile Phe Asn Asn Pro Arg His Pro

245 250 255

tac act cag gcg cta ctt tcc gcg acg ccg cgc ctg aac ccg gac gat 816

Tyr Thr Gln Ala Leu Leu Ser Ala Thr Pro Arg Leu Asn Pro Asp Asp

260 265 270

cgc cgc gag cgc atc aag ctc agc ggt gaa cta cca agc cca ctg aat 864

Arg Arg Glu Arg Ile Lys Leu Ser Gly Glu Leu Pro Ser Pro Leu Asn

275 280 285

cca ccg ccg ggt tgc gcc ttc aac gcc cgc tgt cgt cgg cgc ttc ggc 912

Pro Pro Pro Gly Cys Ala Phe Asn Ala Arg Cys Arg Arg Arg Phe Gly

290 295 300

ccc tgc acc cag ttg cag ccg cag cta aaa gac tac ggc ggt caa ctg 960

Pro Cys Thr Gln Leu Gln Pro Gln Leu Lys Asp Tyr Gly Gly Gln Leu

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<212>DNA

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<220>

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<220>

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<210>76

<211>56

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<220>

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<220>

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<211>28

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<210>116

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<213>Eschierichia coli W3110

<400>116

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1 5 10 15

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50 55 60

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65 70 75 80

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610 615 620

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645 650 655

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Ala Gln Leu Ala Ile Tyr Asp Tyr Ile Lys Ser Leu Glu Gln Pro Glu

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<212>DNA

<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides ATCC17023)

<400>117

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Ala Arg Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys Val Gln Ile Trp Ala Gln Glu

85 90 95

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100 105 110

aag ggt ggc acg atc aag cgc ttc atg gag cat ctc aat ccg cgc tat 384

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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245 250 255

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260 265 270

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290 295 300

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atc ctc gac agc gcc acg ccg ccc gcg ctg cgc aag ccg cgt cag gga 1008

Ile Leu Asp Ser Ala Thr Pro Pro Ala Leu Arg Lys Pro Arg Gln Gly

325 330 335

<210>118

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<212>DNA

<213>橙色绿屈挠菌ATCC29366(橙色绿屈挠菌ATCC29366)

<400>118

atg ctt gaa cgc tgt att acc gat gta aag ctc agc aag gaa gag tac 48

Met Leu Glu Arg Cys Ile Thr Asp Val Lys Leu Ser Lys Glu Glu Tyr

1 5 10 15

acg caa ctg gct ccg ggg ttg cag gcg cgg ctc ttt gat ctc gaa caa 96

Thr Gln Leu Ala Pro Gly Leu Gln Ala Arg Leu Phe Asp Leu Glu Gln

20 25 30

atg ctg ctg gaa gcg cgc att ccg acc atc ttt gta ttt gaa ggc tgg 144

Met Leu Leu Glu Ala Arg Ile Pro Thr Ile Phe Val Phe Glu Gly Trp

35 40 45

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Ala Gly Thr Ala Lys Ala Arg Thr Ile Ala Thr Leu Thr Arg Arg Leu

50 55 60

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65 70 75 80

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Glu Gln Gln Tyr Pro Trp Leu Tyr Arg Phe Trp Leu Lys Ile Pro Ser

85 90 95

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Tyr Gly Gln Met Ser Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Arg Glu Leu Leu

100 105 110

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Ala Ala Tyr Thr Thr Gly Gly Ser Arg Asp Glu Trp Arg Thr His Cys

115 120 125

gaa gat gcc gtc att ttc gag cgg caa ctg gcc gat gat ggt gcg ctc 432

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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225 230 235 240

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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Asp Pro Arg Ala Tyr Thr Val His Ala Ile Ala Ala Pro Ala Gly Asp

370 375 380

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Asp Lys Ala Arg His Tyr Leu Tyr Arg Phe Trp Arg Arg Leu Pro Pro

385 390 395 400

cgt ggt cag ttt gcg atc ttc gac cgc tcg tgg tac ggt cgc gtg tta 1248

Arg Gly Gln Phe Ala Ile Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Gly Arg Val Leu

405 410 415

gtt gaa cgg gtg gaa ggg ttt gcc cgc ccc gac gaa tgg cgt cgt gcc 1296

Val Glu Arg Val Glu Gly Phe Ala Arg Pro Asp Glu Trp Arg Arg Ala

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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515 520 525

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Thr Ala Val Glu Val Leu Glu Ala Glu Leu Gly Pro Val Lys Leu Asp

530 535 540

<210>119

<211>906

<212>DNA

<213>Mesorhixobium loti MAFF303099

<400>119

atg aaa aag gcc aag gaa aat ccc gca acg cca acg tca ggt ccg ctg 48

Met Lys Lys Ala Lys Glu Asn Pro Ala Thr Pro Thr Ser Gly Pro Leu

1 5 10 15

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Lys Ile Arg Ile Gly Gly Lys Glu Arg Glu Phe Asp Ile Glu Asn Pro

20 25 30

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50 55 60

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Lys Leu Gln Ile Glu Leu Val Lys Ala Gln Ala Trp Leu Gln Ala Thr

65 70 75 80

ggc aaa cgg gtg atg gcg ttg ttc gag ggc cgc gac gcc gcc ggc aag 288

Gly Lys Arg Val Met Ala Leu Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys

85 90 95

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Gly Gly Thr Ile Phe Val Val Arg Gln Tyr Leu Asn Pro Arg Thr Ala

100 105 110

cgc aac gtg gcg ctg acc aag ccg acc ccc act gaa ctg ggg caa tgg 384

Arg Asn Val Ala Leu Thr Lys Pro Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gln Trp

115 120 125

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Tyr Tyr Gln Arg Tyr Val Asp His Phe Pro Thr Ala Gly Glu Phe Val

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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Trp Leu Asn Ile Gly Arg Glu Thr Gln Leu Glu Arg Phe His Asp Arg

195 200 205

cgc tac agc ccg ctg aag agc tgg aag ttc tcg ccc atc gat gtc gcc 672

Arg Tyr Ser Pro Leu Lys Ser Trp Lys Phe Ser Pro Ile Asp Val Ala

210 215 220

ggc atc acc aaa tgg gac gat tac acc aag gca cgc gac agc atg ttc 720

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225 230 235 240

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Lys Arg Thr His Lys Glu Phe Ala Pro Trp Ile Ile Val Arg Ala Asn

245 250 255

gac aag cgc cgc gcg cgg ctg gcg gtg atg cgg cgt atc ctg ttg tcg 816

Asp Lys Arg Arg Ala Arg Leu Ala Val Met Arg Arg Ile Leu Leu Ser

260 265 270

ctg ccc tat gag ggg cgc gat ctc gat atc gtc ggc aag gaa gac aag 864

Leu Pro Tyr Glu Gly Arg Asp Leu Asp Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys

275 280 285

aag atc atc ggc gaa ggg ccg tca ttc ctc ggc aag gaa ggc 906

Lys Ile Ile Gly Glu Gly Pro Ser Phe Leu Gly Lys Glu Gly

290 295 300

<210>120

<211>1020

<212>DNA

<213>天蓝色链霉菌ATCC BAA-471(Streptomyces coelicolor ATCC BAA-471)

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1 5 10 15

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Arg Asn Ser Val Glu Ala Gly Gly Arg Met Ala Gly Thr Glu Leu Arg

65 70 75 80

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Lys Ile Ser Gly Lys Val Tyr Glu Lys Glu Leu Arg Arg Leu Gln Ile

85 90 95

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Glu Leu Val Asn Leu Gln Glu Trp Val Leu Thr Glu Lys Lys Arg Val

100 105 110

gcc gtg gtg ttc gaa gga cgg gac gcg gcc gga aag ggc ggc acc atc 384

Ala Val Val Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile

115 120 125

aag cgg ctc acg gaa cac ctc aac ccg cgg gtg acg cgg atc gtg gcg 432

Lys Arg Leu Thr Glu His Leu Asn Pro Arg Val Thr Arg Ile Val Ala

130 135 140

ctg ccc aga ccg acc gaa cga gaa cgg aca cag tgg tat ttc caa cgg 480

Leu Pro Arg Pro Thr Glu Arg Glu Arg Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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325 330 335

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Ala Ala Arg Leu

340

<210>121

<211>1491

<212>DNA

<213>恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)

<400>121

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

ggc aag cac cag ggc aac gtg gct cca ttg ggc cgc agc atc gac gac 768

Gly Lys His Gln Gly Asn Val Ala Pro Leu Gly Arg Ser Ile Asp Asp

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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Leu Arg Asp Lys Arg Met Arg Arg His Ala Leu Val Ala Val Phe Glu

290 295 300

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Gly Asn Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Arg Arg Val Ala Ala

305 310 315 320

gcg ctg gac ccg cgt cag tac cgt atc gta ccg att gcc gcg ccg acc 1008

Ala Leu Asp Pro Arg Gln Tyr Arg Ile Val Pro Ile Ala Ala Pro Thr

325 330 335

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Glu Glu Glu Arg Ala Gln Pro Tyr Leu Trp Arg Phe Trp Arg His Ile

340 345 350

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355 360 365

gtg ctg gtg gag cgg gtg gaa ggc ttc tgc agc ccc gct gac tgg atg 1152

Val Leu Val Glu Arg Val Glu Gly Phe Cys Ser Pro Ala Asp Trp Met

370 375 380

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Arg Ala Tyr Ser Glu Ile Asn Asp Phe Glu Glu Gln Leu Val Asp Ala

385 390 395 400

ggc gtg gtg gtg gtc aag ttc tgg ctg gcg atc gac cag cag acc caa 1248

Gly Val Val Val Val Lys Phe Trp Leu Ala Ile Asp Gln Gln Thr Gln

405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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Val Arg Thr Ile Asn Gln Ala Leu Glu Ala Ala Phe Ala Lys His Lys

485 490 495

aaa 1491

Lys

<210>122

<211>900

<212>DNA

<213>苜蓿中华根瘤菌ATCC51124(Sinorhizobium meliloti ATCC51124)

<400>122

atg gca ctc gac gaa gca ccg gcc gaa gca agg ccg ggg agc cgg gcg 48

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

acc ggc aag cgc gtg atg gcg gtc ttc gag gga cgc gac gct gcc ggc 288

Thr Gly Lys Arg Val Met Ala Val Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly

85 90 95

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100 105 110

gcg cgc gtc gtc gca ctg acg aaa ccg acg gag acc gaa cgg ggc cag 384

Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro Thr Glu Thr Glu Arg Gly Gln

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Ala Ala Leu Ser Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Gly Lys Arg Asp Arg Met

225 230 235 240

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Leu Lys Glu Thr His Thr Glu His Gly Pro Trp Ala Val Ile Arg Gly

245 250 255

aac gac aag cgc cgc tcg cgg atc aac gtg atc cgc cac atg ctg acg 816

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260 265 270

aag ctc gac tat gac ggc aag gac gag gcg gcg atc gga gag gtc gac 864

Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Lys Asp Glu Ala Ala Ile Gly Glu Val Asp

275 280 285

gaa aag atc ctc ggc tcc ggc ccc ggt ttt ctc agg 900

Glu Lys Ile Leu Gly Ser Gly Pro Gly Phe Leu Arg

290 295 300

<210>123

<211>918

<212>DNA

<213>苜蓿中华根瘤菌ATCC51124

<400>123

atg agt aac tcg aaa gac gag gta gaa cgc atc gat tgg ctc gaa gcg 48

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1 5 10 15

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Glu Leu Ala Asp Thr Ile Asp Glu Asp Tyr Glu Leu Glu Leu Ser Glu

20 25 30

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35 40 45

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Pro Ala Leu Pro Arg Met Asp Tyr Phe Arg Ala Leu Leu Ala Leu Gln

50 55 60

gcg gag cta atc aag ctg cag gac tgg gtc gtc tac cac aag cag aag 240

Ala Glu Leu Ile Lys Leu Gln Asp Trp Val Val Tyr His Lys Gln Lys

65 70 75 80

gtc gtt gtg atc ttc gag gga cgc gac gcg gct gga aag ggc ggc gtc 288

Val Val Val Ile Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Val

85 90 95

atc aag cgc atc acc cag cga ctc aat ccg cgc atc gtt aga acg gtg 336

Ile Lys Arg Ile Thr Gln Arg Leu Asn Pro Arg Ile Val Arg Thr Val

100 105 110

gcg ctg ccg gcg ccg tcc gat cgc gaa aag acc caa tgg tat ttc cag 384

Ala Leu Pro Ala Pro Ser Asp Arg Glu Lys Thr Gln Trp Tyr Phe Gln

115 120 125

cgt tac gta cca cat ctg ccg gcg ggc ggc gaa atc gtc ctc ttc gac 432

Arg Tyr Val Pro His Leu Pro Ala Gly Gly Glu Ile Val Leu Phe Asp

130 135 140

cgc tcc tgg tac aat cgc tgc ggc gtc gaa cgc gtc atg ggc ttt gcg 480

Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Cys Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Ala

145 150 155 160

acc gag gag gag gtc gag cag ttc ttc gac gac gtg ccg gaa ttc gaa 528

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165 170 175

cgc atg ctg gtg cgc tcc ggc gtt cgg ctg gtt aag tac tgg ttc tcg 576

Arg Met Leu Val Arg Ser Gly Val Arg Leu Val Lys Tyr Trp Phe Ser

180 185 190

atc acc gac gag gaa cag cag ctg cgc ttt ctg acg cgc atc cac gac 624

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195 200 205

ccg ttg aaa cag tgg aag ctc tcg ccg atg gac ctg caa tcg cgc gtc 672

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210 215 220

cgt tgg gaa gcg tac acc aag gcc aag gaa gag acc ttc gcc cgt acc 720

Arg Trp Glu Ala Tyr Thr Lys Ala Lys Glu Glu Thr Phe Ala Arg Thr

225 230 235 240

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Asn Ilc Arg Glu Ala Pro Trp His Ile Val Glu Ala Asn Asp Lys Lys

245 250 255

cgg gcc cgg ctc aac tgc atc gac cat ctc ttg aag caa atc ccc tat 816

Arg Ala Arg Leu Asn Cys Ile Asp His Leu Leu Lys Gln Ile Pro Tyr

260 265 270

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Glu Asp Val Pro His Glu Asp Ile Thr Leu Pro Glu Arg Ile Phe Asn

275 280 285

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Pro Asn Tyr Glu Arg Lys Val Leu Pro Pro Glu Leu Tyr Val Pro Ala

290 295 300

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Lys Tyr

305

<210>124

<211>688

<212>DNA

<213>Eschierichia coli W3110

<400>124

Met Gly Gln Glu Lys Leu Tyr Ile Glu Lys Glu Leu Ser Trp Leu Ser

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Ile Glu Arg Met Arg Phe Leu Gly Ile Tyr Ser Asn Asn Leu Asp Glu

35 40 45

Phe Tyr Lys Val Arg Phe Ala Glu Leu Lys Arg Arg Ile Ile Ile Ser

50 55 60

Glu Glu Gln Gly Ser Asn Ser His Ser Arg His Leu Leu Gly Lys Ile

65 70 75 80

Gln Ser Arg Val Leu Lys Ala Asp Gln Glu Phe Asp Gly Leu Tyr Asn

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Met Ala Arg Asn Gln Ile Phe Leu Ile Asn Glu

100 105 110

Arg Gln Leu Ser Val Asn Gln Gln Asn Trp Leu Arg His Tyr Phe Lys

115 120 125

Gln Tyr Leu Arg Gln His Ile Thr Pro Ile Leu Ile Asn Pro Asp Thr

130 135 140

Asp Leu Val Gln Phe Leu Lys Asp Asp Tyr Thr Tyr Leu Ala Val Glu

145 150 155 160

Ile Ile Arg Gly Asp Thr Ile Arg Tyr Ala Leu Leu Glu Ile Pro Ser

165 170 175

Asp Lys Val Pro Arg Phe Val Asn Leu Pro Pro Glu Ala Pro Arg Arg

180 185 190

Arg Lys Pro Met Ile Leu Leu Asp Asn Ile Leu Arg Tyr Cys Leu Asp

195 200 205

Asp Ile Phe Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Asp Ala Leu Asn Ala Tyr Ser

210 215 220

Met Lys Met Thr Arg Asp Ala Glu Tyr Asp Leu Val His Glu Met Glu

225 230 235 240

Ala Ser Leu Met Glu Leu Met Ser Ser Ser Leu Lys Gln Arg Leu Thr

245 250 255

Ala Glu Pro Val Arg Phe Val Tyr Gln Arg Asp Met Pro Asn Ala Leu

260 265 270

Val Glu Val Leu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Ser Arg Tyr Asp Ser Ile

275 280 285

Val Pro Gly Gly Arg Tyr His Asn Phe Lys Asp Phe Ile Asn Phe Pro

290 295 300

Asn Val Gly Lys Ala Asn Leu Val Asn Lys Pro Leu Pro Arg Leu Arg

305 310 315 320

His Ile Trp Phe Asp Lys Ala Gln Phe Arg Asn Gly Phe Asp Ala Ile

325 330 335

Arg Glu Arg Asp Val Leu Leu Tyr Tyr Pro Tyr His Thr Phe Glu His

340 345 350

Val Leu Glu Leu Leu Arg Gln Ala Ser Phe Asp Pro Ser Val Leu Ala

355 360 365

Ile Lys Ile Asn Ile Tyr Arg Val Ala Lys Asp Ser Arg Ile Ile Asp

370 375 380

Ser Met Ile His Ala Ala His Asn Gly Lys Lys Val Thr Val Val Val

385 390 395 400

Glu Leu Gln Ala Arg Phe Asp Glu Glu Ala Asn Ile His Trp Ala Lys

405 410 415

Arg Leu Thr Glu Ala Gly Val His Val Ile Phe Ser Ala Pro Gly Leu

420 425 430

Lys Ile His Ala Lys Leu Phe Leu Ile Ser Arg Lys Glu Asn Gly Glu

435 440 445

Val Val Arg Tyr Ala His Ile Gly Thr Gly Asn Phe Asn Glu Lys Thr

450 455 460

Ala Arg Leu Tyr Thr Asp Tyr Ser Leu Leu Thr Ala Asp Ala Arg Ile

465 470 475 480

Thr Asn Glu Val Arg Arg Val Phe Asn Phe Ile Glu Asn Pro Tyr Arg

485 490 495

Pro Val Thr Phe Asp Tyr Leu Met Val Ser Pro Gln Asn Ser Arg Arg

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Met Val Asp Arg Glu Ile Ala Asn Ala Gln Gln Gly

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Leu Pro Ser Gly Ile Thr Leu Lys Leu Asn Asn Leu Val Asp Lys Gly

530 535 540

Leu Val Asp Arg Leu Tyr Ala Ala Ser Ser Ser Gly Val Pro Val Asn

545 550 555 560

Leu Leu Val Arg Gly Met Cys Ser Leu Ile Pro Asn Leu Glu Gly Ile

565 570 575

Ser Asp Asn Ile Arg Ala Ile Ser Ile Val Asp Arg Tyr Leu Glu His

580 585 590

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595 600 605

Ser Ser Ala Asp Trp Met Thr Arg Asn Ile Asp Tyr Arg Ile Glu Val

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Ala Thr Pro Leu Leu Asp Pro Arg Leu Lys Gln Arg Val Leu Asp Ile

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645 650 655

Glu Leu Ser Asn Arg Tyr Val Pro Arg Gly Asn Arg Arg Lys Val Arg

660 665 670

Ala Gln Leu Ala Ile Tyr Asp Tyr Ile Lys Ser Leu Glu Gln Pro Glu

675 680 685

<210>125

<211>336

<212>PRT

<213>类球红细菌ATCC17023

<400>125

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20 25 30

Ala Gly Pro Glu Ala Pro Leu Gln Thr Leu His Gly Pro Arg His Phe

35 40 45

Pro Ala Val Asp Ala Asn Ala Ile Arg Gln Ala Phe Glu Gly Gly His

50 55 60

Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Leu Gly Arg Val Val Tyr Glu Ala Glu Lys

65 70 75 80

Ala Arg Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys Val Gln Ile Trp Ala Gln Glu

85 90 95

Thr Gly Gln Lys Phe Val Ile Leu Met Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly

100 105 110

Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met Glu His Leu Asn Pro Arg Tyr

115 120 125

Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro Gly Glu Arg Glu Arg Gly Gln

130 135 140

Trp Phe Phe Gln Arg Tyr Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Gly Glu Ile

145 150 155 160

Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val

165 170 175

Met Gly Phe Cys Thr Pro Ser Glu Tyr Leu Glu Phe Met Arg Gln Ala

180 185 190

Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Val Arg Ser Gly Ile Arg Leu Tyr Lys

195 200 205

Tyr Trp Phe Ser Val Thr Arg Asp Glu Gln Arg Ala Arg Phe Leu Ala

210 215 220

Arg Glu Thr Asp Pro Leu Lys Arg Trp Lys Leu Ser Pro Ile Asp Lys

225 230 235 240

Ala Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Glu Ala Lys Glu Ala Met

245 250 255

Phe Phe Tyr Thr Asp Thr Ala Asp Ala Pro Trp Thr Ile Val Lys Ser

260 265 270

Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Met Arg His Phe Leu Ser

275 280 285

Ser Leu Asp Tyr Pro Gly Lys Asp Pro Glu Val Val Gly Val Pro Asp

290 295 300

Pro Leu Ile Val Gly Arg Ala Ala Gln Val Ile Gly Thr Ala Ala Asp

305 310 315 320

Ile Leu Asp Ser Ala Thr Pro Pro Ala Leu Arg Lys Pro Arg Gln Gly

325 330 335

<210>126

<211>544

<212>PRT

<213>橙色绿屈挠菌ATCC29366

<400>126

Met Leu Glu Arg Cys Ile Thr Asp Val Lys Leu Ser Lys Glu Glu Tyr

1 5 10 15

Thr Gln Leu Ala Pro Gly Leu Gln Ala Arg Leu Phe Asp Leu Glu Gln

20 25 30

Met Leu Leu Glu Ala Arg Ile Pro Thr Ile Phe Val Phe Glu Gly Trp

35 40 45

Ala Gly Thr Ala Lys Ala Arg Thr Ile Ala Thr Leu Thr Arg Arg Leu

50 55 60

Asp Pro Arg Gly Phe Arg Val His Ser Ile Thr Pro Pro Arg Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Gln Gln Tyr Pro Trp Leu Tyr Arg Phe Trp Leu Lys Ile Pro Ser

85 90 95

Tyr Gly Gln Met Ser Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Arg Glu Leu Leu

100 105 110

Ala Ala Tyr Thr Thr Gly Gly Ser Arg Asp Glu Trp Arg Thr His Cys

115 120 125

Glu Asp Ala Val Ile Phe Glu Arg Gln Leu Ala Asp Asp Gly Ala Leu

130 135 140

Ile Leu Lys Phe Trp Leu His Ile Thr Lys Lys Gln Gln Ala Arg Arg

145 150 155 160

Phe Ala Lys Leu Leu Ala Asp Pro Leu Asn Ala Trp Arg Val Thr Glu

165 170 175

Glu Asp Leu Trp Gln His Arg His Tyr Lys Lys Val Tyr Leu Ala Val

180 185 190

Glu Glu Met Leu Ser Arg Thr Asp Thr Ala Phe Ala Pro Trp His Ile

195 200 205

Ile Pro Ala Ala Asp Lys Arg Tyr Ala Arg Leu Thr Val Leu Gln Ile

210 215 220

Ile Val Gly Ala Leu Glu Ser Arg Leu Gly Ile Thr Ala Ser Asp Arg

225 230 235 240

Glu Ala Ser Leu Asp Asp Ser Gly Leu Ala Leu Arg Arg Tyr Tyr Leu

245 250 255

Asp Leu Arg Thr Pro Val Val Ala Thr Pro Arg Ala Ala Pro Val Asp

260 265 270

Ala Gly Asn Ser Ser Thr Met Thr Leu Gln Gln Ala Glu Pro Ile Thr

275 280 285

Thr Pro Val Val Val Thr Pro Val Ala Pro Leu Leu Arg Ala Ala Ser

290 295 300

Pro Leu Gln Arg Val Asp Leu Ser Leu Arg Leu Asp Asp Asp Thr Tyr

305 310 315 320

His Arg Glu Leu Lys Arg Leu Gln Ala Arg Met Tyr Leu Leu Gly Leu

325 330 335

Gln Val Tyr His Gln Lys Arg Pro Val Val Phe Val Phe Glu Gly Trp

340 345 350

Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Gln Arg Leu Thr Ala Glu Leu

355 360 365

Asp Pro Arg Ala Tyr Thr Val His Ala Ile Ala Ala Pro Ala Gly Asp

370 375 380

Asp Lys Ala Arg His Tyr Leu Tyr Arg Phe Trp Arg Arg Leu Pro Pro

385 390 395 400

Arg Gly Gln Phe Ala Ile Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Gly Arg Val Leu

405 410 415

Val Glu Arg Val Glu Gly Phe Ala Arg Pro Asp Glu Trp Arg Arg Ala

420 425 430

Tyr Ala Glu Ile Asn Gln Phe Glu Arg Gln Leu Val Asp Phe Gly Ala

435 440 445

Ile Ile Ala Lys Phe Trp Leu His Ile Ser Pro Glu Glu Gln Leu Arg

450 455 460

Arg Phe Glu Glu Arg Gln His Val Pro Tyr Lys Ala Trp Lys Leu Thr

465 470 475 480

Asp Glu Asp Trp Arg Asn Arg Glu Lys Trp Pro Ala Tyr Leu Glu Ala

485 490 495

Ala Asp Glu Met Leu Leu Arg Thr Ser Thr Pro Tyr Ala Pro Trp Thr

500 505 510

Ile Val Glu Ala Glu Asp Lys Lys Tyr Ala Arg Ile Lys Ile Leu Arg

515 520 525

Thr Ala Val Glu Val Leu Glu Ala Glu Leu Gly Pro Val Lys Leu Asp

530 535 540

<210>127

<211>302

<212>PRT

<213>Mesorhixobium loti MAFF303099

<400>127

Met Lys Lys Ala Lys Glu Asn Pro Ala Thr Pro Thr Ser Gly Pro Leu

1 5 10 15

Lys Ile Arg Ile Gly Gly Lys Glu Arg Glu Phe Asp Ile Glu Asn Pro

20 25 30

Glu Leu Pro Asp Trp Val Glu Asp Asn Lys Leu Thr Ala Gly Gly Tyr

35 40 45

Pro Tyr Asp Lys Lys Met Asn Ser Asp Glu Tyr Asp Glu Thr Leu Glu

50 55 60

Lys Leu Gln Ile Glu Leu Val Lys Ala Gln Ala Trp Leu Gln Ala Thr

65 70 75 80

Gly Lys Arg Val Met Ala Leu Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys

85 90 95

Gly Gly Thr Ile Phc Val Val Arg Gln Tyr Leu Asn Pro Arg Thr Ala

100 105 110

Arg Asn Val Ala Leu Thr Lys Pro Thr Pro Thr Glu Leu Gly Gln Trp

115 120 125

Tyr Tyr Gln Arg Tyr Val Asp His Phe Pro Thr Ala Gly Glu Phe Val

130 135 140

Thr Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Pro Val Met

145 150 155 160

Gly Phe Cys Thr Pro Glu Gln His Glu Lys Phe Leu Asp Glu Thr Pro

165 170 175

His Phe Glu Arg Met Ile Val Asn Asp Asp Ile His Phe Phe Lys Phe

180 185 190

Trp Leu Asn Ile Gly Arg Glu Thr Gln Leu Glu Arg Phe His Asp Arg

195 200 205

Arg Tyr Ser Pro Leu Lys Ser Trp Lys Phe Ser Pro Ile Asp Val Ala

210 215 220

Gly Ile Thr Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Lys Ala Arg Asp Ser Met Phe

225 230 235 240

Lys Arg Thr His Lys Glu Phe Ala Pro Trp Ile Ile Val Arg Ala Asn

245 250 255

Asp Lys Arg Arg Ala Arg Leu Ala Val Met Arg Arg Ile Leu Leu Ser

260 265 270

Leu Pro Tyr Glu Gly Arg Asp Leu Asp Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys

275 280 285

Lys Ile Ile Gly Glu Gly Pro Ser Phe Leu Gly Lys Glu Gly

290 295 300

<210>128

<211>340

<212>PRT

<213>Streptomyces coelicolor ATCC BAA-471

<400>128

Met Gly Phe Leu Pro Ile Ser Glu Val Ser Gly Val Pro Gly Arg Glu

1 5 10 15

His Ser Ser His Glu Ala Pro Trp Glu Ser Thr Thr Thr Asp Thr Pro

20 25 30

Phe Arg Pro Ser Gly Ser Arg Pro Gly Thr Gly Thr Arg Ser Thr Arg

35 40 45

Ile Cys Ala Ala Arg Ala Arg Thr Val Pro Cys Arg His Gly Thr His

50 55 60

Arg Asn Ser Val Glu Ala Gly Gly Arg Met Ala Gly Thr Glu Leu Arg

65 70 75 80

Lys Ile Ser Gly Lys Val Tyr Glu Lys Glu Leu Arg Arg Leu Gln Ile

85 90 95

Glu Leu Val Asn Leu Gln Glu Trp Val Leu Thr Glu Lys Lys Arg Val

100 105 110

Ala Val Val Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile

115 120 125

Lys Arg Leu Thr Glu His Leu Asn Pro Arg Val Thr Arg Ile Val Ala

130 135 140

Leu Pro Arg Pro Thr Glu Arg Glu Arg Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg

145 150 155 160

Tyr Val Glu Gln Leu Pro Ala Gly Gly Glu Ile Val Leu Phe Asp Arg

165 170 175

Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu His Val Met Gly Phe Cys Thr

180 185 190

Asp Asp Glu Tyr Arg Arg Phe Leu Arg His Cys Pro Val Phe Glu Arg

195 200 205

Met Leu Val Glu Asp Gly Leu Leu Leu Arg Lys Tyr Trp Phe Ser Val

210 215 220

Ser Asp Val Glu Gln Gln Glu Arg Phe Arg Arg Arg Leu Gln Asp Pro

225 230 235 240

Leu Lys Arg Trp Lys Leu Ser Thr Met Asp Leu Glu Ser Ile Thr Arg

245 250 255

Trp Glu Ala Tyr Ser Arg Ala Lys Asp Glu Met Met Ala Ala Thr Asp

260 265 270

Thr Pro Glu Ser Pro Trp Tyr Val Val Glu Ser Asp Asp Lys Arg Arg

275 280 285

Ala Arg Leu Asn Met Ile Ala His Leu Leu Asp Ser Leu Pro His His

290 295 300

Arg Val Pro Pro Pro Ser Leu Arg Leu Pro Glu Arg Pro Pro Pro Thr

305 310 315 320

Gly Tyr Thr Arg Ser Pro Arg Asp Arg Gln Thr Tyr Val Pro Asp His

325 330 335

Ala Ala Arg Leu

340

<210>129

<211>497

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌KT2440

<400>129

Met Phe Glu Ser Ala Glu Ile Gly His Ser Ile Asp Lys Glu Ala Tyr

1 5 10 15

Asp Ala Glu Val Pro Ala Leu Arg Glu Ala Leu Leu Glu Ala Gln Tyr

20 25 30

Glu Leu Lys Gln Gln Ala Arg Phe Pro Val Ile Val Leu Ile Asn Gly

35 40 45

Ile Glu Gly Ala Gly Lys Gly Glu Thr Val Lys Leu Leu Asn Glu Trp

50 55 60

Met Asp Pro Arg Met Ile Asp Val Leu Thr Phe Asp Gln Gln Thr Asp

65 70 75 80

Glu Glu Leu Ala Arg Pro Pro Ala Trp Arg Tyr Trp Arg Ala Leu Pro

85 90 95

Pro Lys Gly Arg Met Gly Val Phe Phe Gly Asn Trp Tyr Ser Gln Met

100 105 110

Leu Gln Gly Arg Val His Gly Val Phe Lys Asp Ala Val Leu Asp Gln

115 120 125

Ala Ile Thr Gly Ala Glu Arg Leu Glu Glu Met Leu Cys Asp Glu Gly

130 135 140

Ala Leu Ile Ile Lys Phe Trp Phe His Leu Ser Lys Lys Gln Met Lys

145 150 155 160

Ala Arg Leu Lys Ser Leu Lys Asp Asp Pro Leu His Ser Trp Lys Ile

165 170 175

Ser Pro Leu Asp Trp Gln Gln Ser Gln Thr Tyr Asp Arg Phe Val Arg

180 185 190

Phe Gly Glu Arg Va Leu Arg Arg Thr Ser Arg Asp Tyr Ala Pro Trp

195 200 205

His Ile Ile Glu Gly Val Asp Pro Asn Tyr Arg Ser Leu Ala Val Gly

210 215 220

Arg Ile Leu Leu Glu Ser Leu Gln Ala Ala Leu Ala His Asn Pro Lys

225 230 235 240

Gly Lys His Gln Gly Asn Val Ala Pro Leu Gly Arg Ser Ile Asp Asp

245 250 255

Arg Ser Leu Leu Gly Ala Leu Asp Met Thr Leu Arg Leu Asp Lys Ala

260 265 270

Asp Tyr Gln Glu Gln Leu Ile Thr Glu Gln Ala Arg Leu Ala Gly Leu

275 280 285

Leu Arg Asp Lys Arg Met Arg Arg His Ala Leu Val Ala Val Phe Glu

290 295 300

Gly Asn Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Arg Arg Val Ala Ala

305 310 315 320

Ala Leu Asp Pro Arg Gln Tyr Arg Ile Val Pro Ile Ala Ala Pro Thr

325 330 335

Glu Glu Glu Arg Ala Gln Pro Tyr Leu Trp Arg Phe Trp Arg His Ile

340 345 350

Pro Ala Arg Gly Lys Phe Thr Ile Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Gly Arg

355 360 365

Val Leu Val Glu Arg Val Glu Gly Phe Cys Ser Pro Ala Asp Trp Met

370 375 380

Arg Ala Tyr Ser Glu IIe Asn Asp Phe Glu Glu Gln Leu Val Asp Ala

385 390 395 400

Gly Val Val Val Val Lys Phe Trp Leu Ala Ile Asp Gln Gln Thr Gln

405 410 415

Leu Glu Arg Phe Glu Glu Arg Glu Gln Ile Pro Phe Lys Arg Tyr Lys

420 425 430

Ile Thr Glu Asp Asp Trp Arg Asn Arg Asp Lys Trp Asp Glu Tyr Ser

435 440 445

Gln Ala Val Gly Asp Met Val Asp Arg Thr Ser Ser Glu Ile Ala Pro

450 455 460

Trp Thr Leu Val Glu Ala Asn Asp Lys Arg Trp Ala Arg Val Lys Val

465 470 475 480

Val Arg Thr Ile Asn Gln Ala Leu Glu Ala Ala Phe Ala Lys His Lys

485 490 495

Lys

<210>130

<211>330

<212>PRT

<213>苜蓿中华根瘤菌ATCC51124

<400>130

Met Ala Leu Asp Glu Ala Pro Ala Glu Ala Arg Pro Gly Ser Arg Ala

1 5 10 15

Val Glu Leu Glu Ile Asp Gly Arg Ser Arg Ile Phe Asp Ile Asp Asp

20 25 30

Pro Asp Leu Pro Lys Trp Ile Asp Glu Glu Ala Phe Arg Ser Asp Asp

35 40 45

Tyr Pro Tyr Lys Lys Lys Leu Asp Arg Glu Glu Tyr Glu Glu Thr Leu

50 55 60

Thr Lys Leu Gln Ile Glu Leu Val Lys Val Gln Phe Trp Met Gln Ala

65 70 75 80

Thr Gly Lys Arg Val Met Ala Val Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly

85 90 95

Lys Gly Gly Ala Ile His Ala Thr Thr Ala Asn Met Asn Pro Arg Ser

100 105 110

Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro Thr Glu Thr Glu Arg Gly Gln

115 120 125

Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Val Ala Thr Phe Pro Thr Ala Gly Glu Phe

130 135 140

Val Leu Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Pro Val

145 150 155 160

Met Gly Phe Cys Thr Pro Asp Gln Tyr Glu Gln Phe Leu Lys Glu Ala

165 170 175

Pro Arg Phe Glu Glu Met Ile Ala Asn Glu Gly Ile His Leu Phe Lys

180 185 190

Phe Trp Ile Asn Ile Gly Arg Glu Met Gln Leu Lys Arg Phe His Asp

195 200 205

Arg Arg His Asp Pro Leu Lys Ile Trp Lys Leu Ser Pro Met Asp Ile

210 215 220

Ala Ala Leu Ser Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Gly Lys Arg Asp Arg Met

225 230 235 240

Leu Lys Glu Thr His Thr Glu His Gly Pro Trp Ala Val Ile Arg Gly

245 250 255

Asn Asp Lys Arg Arg Ser Arg Ile Asn Val Ile Arg His Met Leu Thr

260 265 270

Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Lys Asp Glu Ala Ala Ile Gly Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Ile Leu Gly Ser Gly Pro Gly Phe Leu Arg

290 295 330

<210>131

<211>306

<212>PRT

<213>苜蓿中华根瘤菌ATCC51124

<400>131

Met Ser Asn Ser Lys Asp Glu Val Glu Arg Ile Asp Trp Leu Glu Ala

1 5 10 15

Glu Leu Ala Asp Thr Ile Asp Glu Asp Tyr Glu Leu Glu Leu Ser Glu

20 25 30

Pro Thr Leu Ser Glu Lys Ile Arg Glu Ile Tyr Arg Lys Ala His Pro

35 40 45

Pro Ala Leu Pro Arg Met Asp Tyr Phe Arg Ala Leu Leu Ala Leu Gln

50 55 60

Ala Glu Leu Ile Lys Leu Gln Asp Trp Val Val Tyr His Lys Gln Lys

65 70 75 80

Val Val Val Ile Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Val

85 90 95

Ile Lys Arg Ile Thr Gln Arg Leu Asn Pro Arg Ile Val Arg Thr Val

100 105 110

Ala Leu Pro Ala Pro Ser Asp Arg Glu Lys Thr Gln Trp Tyr Phe Gln

115 120 125

Arg Tyr Val Pro His Leu Pro Ala Gly Gly Glu Ile Val Leu Phe Asp

130 135 140

Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Cys Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Ala

145 150 155 160

Thr Glu Glu Glu Val Glu Gln Phe Phe Asp Asp Val Pro Glu Phe Glu

165 170 175

Arg Met Leu Val Arg Ser Gly Val Arg Leu Val Lys Tyr Trp Phe Ser

180 185 190

Ile Thr Asp Glu Glu Gln Gln Leu Arg Phe Leu Thr Arg Ile His Asp

195 200 205

Pro Leu Lys Gln Trp Lys Leu Ser Pro Met Asp Leu Gln Ser Arg Val

210 215 220

Arg Trp Glu Ala Tyr Thr Lys Ala Lys Glu Glu Thr Phe Ala Arg Thr

225 230 235 240

Asn Ile Arg Glu Ala Pro Trp His Ile Val Glu Ala Asn Asp Lys Lys

245 250 255

Arg Ala Arg Leu Asn Cys Ile Asp His Leu Leu Lys Gln Ile Pro Tyr

260 265 270

Glu Asp Val Pro His Glu Asp Ile Thr Leu Pro Glu Arg Ile Phe Asn

275 280 285

Pro Asn Tyr Glu Arg Lys Val Leu Pro Pro Glu Leu Tyr Val Pro Ala

290 295 300

Lys Tyr

305

Claims

1.二肽或二肽衍生物I的制造方法，其特征是使i)磷酸供体、ii)选自腺苷-5’-一磷酸(以下，略为AMP)、腺苷-5’-二磷酸(以下，略为ADP)和腺苷-5’-三磷酸(以下，略为ATP)中的物质、iii)具有多磷酸激酶活性的蛋白质或具有生产该蛋白质能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、iv)具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、和v)1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物在水性介质中共存，使二肽或二肽衍生物[以下，称为二肽或二肽衍生物I]在该水性介质中生成、蓄积，从该水性介质回收该二肽或二肽衍生物I，其中：

(1)具有多磷酸激酶活性的蛋白质是下述[1]的蛋白质：

[1]由序列号124～131中的任一个表示氨基酸序列构成的蛋白质，

(2)具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽的活性的蛋白质是选自以下[3]～[4]、[6]和[8]中的蛋白质：

[3]由序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质，

[4]由与序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列构成，而且具有ATP依赖性的、由氨基酸和氨基酸衍生物生成二肽的活性的蛋白质，

[6]由序列号47或48表示的氨基酸序列构成的蛋白质，

[8]由序列号53表示的氨基酸序列构成的蛋白质，

(3)1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物是选自L-丙氨酸、甘氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-α-氨基丁酸和β-丙氨酸中的一种氨基酸或其衍生物，与选自L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-α-氨基丁酸、β-丙氨酸、L-偶氮丝氨酸、L-茶氨酸、L-4-羟基脯氨酸、L-3-羟基脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-6-重氮-5-氧代正亮氨酸中的一种氨基酸或其衍生物的组合。

2.二肽或二肽衍生物II的制造方法，其特征是使i)磷酸供体、ii)选自腺苷-5’-一磷酸(以下，略为AMP)、腺苷-5’-二磷酸(以下，略为ADP)和腺苷-5’-三磷酸(以下，略为ATP)中的物质、iii)具有多磷酸激酶活性的蛋白质或具有生产该蛋白质能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、iv)具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的细胞的培养物或该培养物的处理物、和v)1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物在水性介质中共存，使二肽或二肽衍生物I在该水性介质中生成、蓄积，直接进行修饰或从该水性介质回收该二肽或二肽衍生物I后对该二肽或二肽衍生物I进行修饰，使二肽或二肽衍生物[以下，称为二肽或二肽衍生物II]生成，回收该二肽或二肽衍生物II，其中：

(1)具有多磷酸激酶活性的蛋白质是下述[1]的蛋白质：

[3]序列号1～13中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质，

[6]由序列号47或48表示的氨基酸序列构成的蛋白质，

[8]由序列号53表示的氨基酸序列构成的蛋白质，

3.权利要求1或2中的任一项所述的制造方法，其中具有生产ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质能力的细胞是具有选自以下的[1]、[2]、[4]和[6]中的DNA的细胞：

[1]由序列号14～26和46中的任一个表示的碱基序列构成的DNA，

[2]与序列号14～26和46中的任一个表示的碱基序列具有95％以上的同源性，而且编码具有ATP依赖性的、由氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性的蛋白质的DNA，

[4]由序列号49或50表示的碱基序列构成的DNA，

[6]由序列号54表示的碱基序列构成的DNA。

4.权利要求1～3中的任一项所述的制造方法，其中具有生产具有多磷酸激酶活性的蛋白质能力的细胞是具有以下的[1]所述的DNA的细胞：

[1]由序列号116～123中的任一个表示的碱基序列构成的DNA。

5.权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中所述氨基酸衍生物选自：β-氯-L-丙氨酸、β-氰基-L-丙氨酸、β-环戊基-DL-丙氨酸、β-环丙基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、p-硝基苯丙氨酸、p-氨基苯丙氨酸、苯丙氨酸酰胺、L-犬尿氨酸、谷氨酸-γ-甲酯、谷氨酸-γ-乙酯、谷氨酸-γ-t丁酯、谷氨酸-γ-苄酯、天冬氨酸-β-甲酯、天冬氨酸-β-t丁酯、天冬氨酸-β-苄酯、乙酰赖氨酸、Boc-赖氨酸。

6.权利要求2～5中任一项所述的制造方法，其中所述二肽衍生物II是N-[2-(乙酰氨基)丙酰基]苯丙氨酸或1-{2-[N-(2-(乙酰氨基)丙酰基)氨基]-3-苯丙酰}哌啶。

7.权利要求1～5中的任一项所述的制造方法，其中二肽或二肽衍生物I或二肽或二肽衍生物II是从选自L-丙氨酸、L-蛋氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-α-氨基丁酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-偶氮丝氨酸、L-茶氨酸、L-4-羟基脯氨酸、L-3-羟基脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-6-重氮-5-氧代正亮氨酸的L-氨基酸、甘氨酸、和β-丙氨酸选出的相同或不同的氨基酸通过肽键形成的二肽或二肽衍生物。

8.权利要求1～7中的任一项所述的制造方法，其中细胞是微生物的细胞。

9.权利要求8所述的制造方法，其中微生物是原核生物。

10.权利要求9所述的制造方法，其中原核生物是1种以上的肽酶和1种以上的具有肽转运活性的蛋白质(以下，也称为肽转运蛋白质)的活性低下或丧失的微生物。

11.权利要求9所述的制造方法，其中原核生物是3种以上的肽酶的活性低下或丧失的微生物。

12.权利要求10或11所述的制造方法，其中肽酶是由序列号55～58任一项所示的氨基酸序列构成的蛋白质。

13.权利要求10或12所述的制造方法，其中肽转运蛋白质是由序列号59～63中的任一个表示的氨基酸序列构成的蛋白质。

14.权利要求9～13中的任一项所述的制造方法，其中原核生物是属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属或棒杆菌(Corynebacterium)属的微生物。

15.权利要求14所述的制造方法，其中属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属或棒杆菌属的微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corymebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵棒杆菌(Corynebacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、Corynebacterium efficiens、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

16.权利要求1～15中的任一项所述的制造方法，其中培养物的处理物是从培养物的热处理物、培养物的浓缩物、培养物的干燥物、对培养物进行离心分离得到的细胞、该细胞的热处理物、该细胞的干燥物、该细胞的冷冻干燥物、该细胞的表面活性剂处理物、该细胞的超声波处理物、该细胞的机械性磨碎处理物、该细胞的溶剂处理物、该细胞的酶处理物、该细胞的蛋白质分级物、该细胞的固定化物和从该细胞提取得到的酶标准品中选出的处理物，而且具有ATP依赖性的、由1种以上的氨基酸或氨基酸衍生物生成二肽或二肽衍生物的活性或多磷酸激酶活性的处理物。